AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE UMA CULTURA MISTA DE BACTÉRIAS FERMENTATIVAS POTENCIALMENTE PRODUTORAS DE HIDROGÊNIO

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1 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE UMA CULTURA MISTA DE BACTÉRIAS FERMENTATIVAS POTENCIALMENTE PRODUTORAS DE HIDROGÊNIO 1 Fábio Silva Oliveira, 2 Betânia Braz Romão, 3 Juliana de Souza Ferreira, 3 Vicelma Luiz Cardoso, 3 Fabiana Regina Xavier Batista 1 Bolsista de iniciação Científica PIBIC/FAPEMIG/UFU, discente do curso de Engenharia Química 2 Bolsista de Doutorado CAPES/UFU, doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química 3 Professor da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG) 1,2,3 Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP ) frxbatista@feq.ufu.br RESUMO-. A escassez de reservas de combustíveis fósseis tem fomentado o desenvolvimento de processos alternativos para a obtenção de energia. Neste contexto, destacam-se os estudos direcionados ao aperfeiçoamento de processos dedicados a produção de biocombustíveis como o H 2. Convencionalmente este biocombustível é produzido através da reforma de vapor, bem como através de rota biológica. Nos últimos anos, os microrganismos como as bactérias fermentativas, capazes de produzir H2 quando em condições específicas de cultura, tem sido fortemente empregados em bioprocessos com esta finalidade. Salienta-se que tais microrganismos em sua rota metabólica, através de processo fermentativo anaeróbico realizado no escuro, convertem os substratos do meio em ácidos orgânicos, dióxido de carbono e H 2. Para que esta conversão seja eficiente é necessária que elevada viabilidade celular se verifique. Este estudo tem por objetivo avaliar a viabilidade de células oriundas de lodo biológico, obtido de reator de manta de lodo. Para tal, a contagem das células viáveis através da metodologia pour plate foi empregada. Neste procedimento o crescimento das células amostradas em diferentes tempos de fermentação foi observado através de plaqueamento. Inicialmente, uma pequena quantidade de inóculo celular foi diluída de forma seriada em tubos de ensaio, utilizando uma solução cloreto de sódio (8,5g/L). Após isso 1mL de cada tubo foi adicionado a uma placa de Petri que recebeu em seguida tioglicolato de sódio (30g/L), triptona (10g/L) e extrato de levedura (5g/L). Ágar foi adicionado na sequencia e após o resfriamento e a solidificação do material as placas foram invertidas em um dessecador contendo uma vela acesa para que a condição de anaerobicidade fosse alcançada. Os resultados mostraram que após um período de 168 horas, colônias de bactérias foram observadas nas placas de Petri, fato que demonstrou a capacidade reprodutiva do consórcio microbiológico utilizado, conferindo viabilidade às células. Palavras-Chave: biohidrogênio, fermentação escura, viabilidade celular INTRODUÇÃO Os combustíveis derivados do petróleo se tornaram a fonte principal para o mercado de transporte desde o século XX e o crescente consumo destes combustíveis leva a um aumento na emissão de CO 2 na atmosfera e, consequentemente, às alterações climáticas como o aquecimento global (Balat e Kirlay, 2010). Além disso, as reservas de combustível fóssil são limitadas, concentradas em certas regiões e, em vista disso, o seu custo tende a se elevar (Bartels et al, 2010). Portanto, há uma necessidade urgente de se obter uma fonte de energia sustentável como alternativa para a redução do consumo desses combustíveis, e que deve seguir os seguintes critérios: emissão zero de CO 2, ser de fonte renovável, a- tender a elevada demanda de energia e apresentar um custo comparável ao do atual preço do petróleo (Rupprechet et al., 2009) As fontes de energia renováveis incluem a energia solar, eólica, hidroeletricidade e a biomassa. Os biocombustíveis obtidos da biomassa podem ser líquidos (bioetanol e biodiesel) ou gasosos (biogás e biohidrogênio) sendo que o bioetanol e o biodiesel são os principais atualmente produzidos apresentando desenvolvimento em

2 termos de qualidade e produção de escala industrial. O biohidrogênio também se mostra uma alternativa promissora devido à alta eficiência de conversão em potência útil, por ser renovável e não contribuir para o efeito estufa, sendo que ao sofrer a combustão fornece somente água como subproduto. O hidrogênio possui o mais alto teor de energia por unidade em peso do que qualquer outro combustível (142kJ/L) e é facilmente convertido em eletricidade por células combustíveis (Jegannathan et al, 2009). Atualmente, 90% da produção de hidrogênio são provenientes de processos como a reforma a vapor de hidrocarbonetos e a gaseificação do carvão, que dependem de combustível fóssil e requerem condições de altas temperaturas e pressões. No entanto, os métodos biológicos a- presentam grande potencial para a obtenção de hidrogênio sem causar danos ambientais (Kim e Kim, 2011). A produção biológica do hidrogênio pode seguir três rotas: (i) biofotólise da água por microalgas ou cianobactérias, que possui como vantagens a utilização de água e energia solar que são fontes abundantes e a formação de produtos simples (H 2 e CO 2 ), (ii) decomposição de compostos orgânicos por bactérias fotossintéticas, denominada fotofermentação, que pode ter conversão completa de resíduos de ácidos orgânicos a H 2 e CO 2, e (iii) a produção por fermentação de resíduos orgânicos por microrganismos anaeróbios ou facultativos, também denominada como fermentação escura, que pode degradar uma ampla variedade de substratos com o emprego de reatores de simples tecnologia e sem a necessidade do fornecimento de luz (Allakhverdiev et al., 2009, Hallenbeck e Ghosh, 2009). A fermentação escura se mostra como um processo que emprega uma ampla variedade de efluentes, subprodutos e resíduos de indústrias de alimentos ou agrícolas, ricos em carboidratos, celulose e óleos, sem exigir configurações especiais de reatores como os processos fotossintéticos e podendo usar culturas puras ou mistas para a fermentação. Apesar das vantagens deste processo, estudos recentes indicaram baixos índices para a conversão de substrato, eficiência e taxa de produção de hidrogênio, causados principalmente pela queda de ph devido ao acúmulo de ácidos orgânicos, produzidos na etapa de acidogênese e pelo consumo de H 2 por bactérias do tipo metanogênicas. Portanto, é evidente a necessidade de obter avanços para a síntese biohidrogênio, e tornar o processo técnica e economicamente viável (Valdez-Vazquez e Poggi-Varaldo, 2009, Venkata Mohan, 2009). Estudo de cinética e viabilidade celular O estudo de cinética é fundamental para se avaliar os efeitos dos parâmetros em um processo de fermentação, como ph, tipo de substratos e microrganismos, temperatura (Wang e Wan, 2009). No caso particular da fermentação escura, empregando-se cultura mista de bactérias, faz-se necessário definir uma metodologia adequada para realizar a contagem de células viáveis durante o processo e o isolamento. Com isso, pode-se determinar o gênero predominante no consórcio, que pode variar dependendo de sua origem, unidades de tratamento, esterco, solos (Valdez- Vazquez e Poggi-Varaldo, 2009). Há métodos usados para a contagem de células viáveis que dispensam o preparo e o a- companhamento de culturas em período de incubação, que se mostram ser mais rápidos, como é o caso da técnica de SPC (solid phase cytometry) (Vermis et al., 2002). Os métodos baseados em preparo de cultura em meio de crescimento anaeróbico se baseiam em: Meio contendo tioglicolato de sódio: que é um agente que reduz o O 2 em água, criando a condição de anaerobiose. Este meio ainda pode conter corantes como resazurina e azul de metileno que auxiliam na indicação visual da presença de oxigênio, sendo usados, portanto, para distinção de bactérias aeróbicas ou anaeróbicas (Karakashev et al., 2003). Jarra anaeróbica: que consiste em uma câmara onde há remoção de O 2 pela reação com H 2 formando água. A adição de H 2 à câmara ocorre devido à presença de uma catalisador (alumina-paladium) posicionado na tampa da jarra ou em sacolas geradoras de gás (Gas-Pak) (Vinderola e Reinheimer, 1999). Recipientes com vela: dispensam o uso das jarras anaeróbicas. As placas com meio e inóculo são colocadas em um recipiente junto com uma vela acesa. À medida que ocorre a queima da vela, a concentração de O 2 é reduzida e aumentase a concentração de CO 2. Esta condição pode favorecer o crescimento de microrganismos microaerófilos (Vinderola e Reinheimer, 1999, Malik, 1992). A proposta deste trabalho foi avaliar a cinética de fermentação escura, usando cultura mista proveniente de um reator UASB. Foram verificadas as evoluções de consumo de substrato e de crescimento celular. Para o estudo de viabilidade celular, foram feitas adaptações na composição do meio de cultura para a contagem de células viáveis. MATERIAIS E MÉTODOS Matéria-prima e cultura mista de bactérias anaeróbicas

3 O soro permeado usado como substrato neste trabalho foi gentilmente concedido pela Sooro Concentrado Indústria de Produtos Lácteos Ltda (Marechal Cândido Rondon, PR). O soro de leite permeado foi avaliado como sugestão para se evitar oscilações de concentração durante os futuros ensaios, em virtude de diferentes lotes de amostras soro de leite in natura. De acordo com a informação do fabricante o soro de leite permeado possui 92,97% de lactose, 0% de gordura e 1,42 %de proteína. Em trabalho preliminares desenvolvidos paralelamente, também realizado pelos pesquisadores do Núcleo de Processos Biotecnológicos da FEQ/UFU, em que foi usado o soro permeado não enriquecido com compostos minerais, houve uma maior conversão de H 2 por açúcar consumido, visto pelo rendimento de 25,37 mmolh 2 /g substrato consumido. A produtividade de 4,56 mmol H 2 /L dia foi menor do que para o soro de leite in natura, registrada como 7,75 mmol H 2 /L dia. Com base no alto rendimento, neste trabalho foi utilizado o soro permeado com complementação no meio, com a seguinte composição de nutrientes em g/l: 3 KH 2 PO 4, 7 K 2 HPO 4, 1 MgSO 4, 4 extrato de levedura, 1 (NH 4 ) 2 SO 4, e 0,5 de extrato de carne O consórcio microbiano foi proveniente de um reator UASB, fornecido pela Cooperativa A- gropecuária LTDA de Uberlândia CALU (Uberlândia, MG). Ensaios de Fermentação escura O processo fermentativo foi conduzido em batelada, em frasco de penicilina de 100 ml, sendo o volume reacional de 75 ml e headspace de 25 ml, sendo que o volume de inóculo utilizado foi de 1,2 ml e a concentração de lactose de 30 g/l, a temperatura ambiente. O ph inicial foi ajustado para 6 com NaOH (1M) e nitrogênio foi insuflado ao frasco para garantir a condição de anaerobiose do meio. Uma seringa foi adaptada ao frasco para que o biogás produzido fosse liberado, conforme mostrado na Figura 1 Figura 1 Fermentação batelada anaeróbica escura. Substrato: soro de leite permeado. A partir do terceiro dia, amostras do meio foram coletadas para a determinação de açúcares redutores totais (ART) e para a contagem de células viáveis, de modo a se obter as curvas de consumo do substrato e de crescimento celular. A evolução do processo de fermentação escura foi acompanhada até a depleção do substrato. Os ensaios foram realizados em replicatas. A medida de açúcares redutores totais (ART) foi determinada pelo método colorimétrico de DNS (Miller, 1959). Viabilidade Celular Para a contagem de células viáveis foi adotado a técnica de pour plate. Nessa técnica, o crescimento celular é realizado em plaqueamento, sendo que a inoculação do ágar é feita antes da sua solidificação. O meio anaeróbico foi garantido preparando-se o meio com tioglicolato de sódio em um dessecador contendo uma vela acesa (Karakashev et al., 2003, Vinderola e Reinheimer, 1999, Malik, 1992). Procedimento: Inicialmente, para a preparação do meio de cultura utilizou-se: ágar bacteriológico (15g/L); tioglicolato de sódio (30g/L), sendo que a solução usada na diluição seriada do inóculo foi constituída de cloreto de sódio 8,5g/L. O meio de cultura, as placas de Petri e os tubos de ensaio contendo 9 ml de solução salina, foram autoclavados a 121 C por 20 min. O meio de cultura autoclavado foi colocado em um banho termostatizado a 45 C. Para as diluições, 1 ml de inóculo foi transferido para um tubo de ensaio contendo 9 ml da solução salina, obtendo uma diluição 1:10. Após homogeneização retirou-se 1 ml desse tudo e colocou em outro tubo contendo a solução salina obtendo assim uma diluição 1:100, esse procedimento foi realizado até se obter uma diluição 1: O volume correspondente a 1 ml de cada tudo de ensaio, das seguintes diluições 10 2, 10 4,

4 10 6, 10 8, 10 10, 10 12, foi transferido para as placas de Petri. Em seguida, adicionou-se o meio de cultura realizando um movimento em oito para homogeneização da amostra. Após o resfriamento as placas foram colocadas invertidas em um dessecador contendo uma vela acesa para dar condição anaeróbica ao ambiente. O dessecador foi colocado em uma estufa a 37 C. Inicialmente, a contagem foi realizada após o período de incubação de cerca de 48 horas. No entanto, adotando a metodologia descrita acima, com o período de incubação por apenas 2 dias, não se observou crescimento de colônias. Portanto, o meio para contagem de células viáveis usado para avaliação da cinética de crescimento celular durante o processo de fermentação em batelada, foi enriquecido com triptona (10g/L) e extrato de levedura (5g/L) e o período de incubação foi ampliado para 5 dias (120 h). RESULTADOS E DISCUSSÃO A literatura nos mostra que além do monitoramento do teor de substrato, ph e temperatura, a manutenção de elevada viabilidade dos microrganismos utilizados deve ser garantida para que condições ótimas de processo sejam verificadas na síntese do produto-alvo, o hidrogênio (Antonine 2004). É neste contexto que a técnica de pour plate se destaca para a avaliação da viabilidade celular. É importante se salientar que esta metodologia pode ser empregada com os mais diversificados objetivos, como a identificação de contaminação microbiana em fermentações alcoólicas (Antonine, 2004) e na determinação de viabilidade de celular de probióticos (Hungria e Longo, 2009). Considerando o potencial desta técnica, pode-se avaliar a viabilidade do lodo oriundo de um reator UASB para a produção de hidrogênio através do monitoramento de colônias viáveis como descrito a seguir. Na Figura 1 observam-se as colônias de bactérias do consórcio microbiano utilizado como inóculo. Figura 1: Imagem da colônia de bactérias do consórcio microbiano proveniente do reator UASB. Microscopia ótica: 1000X. O primeiro ensaio de fermentação indicou que o meio de cultura para contagem de células viáveis não foi adequado para o crescimento das bactérias durante a incubação de 2 dias. Após o enriquecimento do meio com triptona (10g/L) e extrato de levedura (5g/L) e aumento do período de incubação para 5 dias, foi possível a contagem de células. O composto antifúngico (Nystatina) foi adicionado ao meio para se evitar o crescimento de fungos. A necessidade para a alteração do tempo de incubação e da composição do meio de cultura pode ser justificada pelo uso de uma cultura mista de microrganismos como agentes da fermentação, pois o consórcio microbiano pode exigir um período maior de adaptação ao meio e há a competição dos microrganismos pelo substrato. Após a adaptação da metodologia para a análise microbiológica, foi possível a contagem das células. Os resultados de consumo de substrato, apresentado como concentração de açúcares redutores totais (ART) (g/l) e de crescimento celular (UFC/mL) são apresentados na Figura 2 e na Tabela 1, respectivamente.

5 Através deste trabalho foi possível se verificar a necessidade de adaptação do meio de cultura para realizar a análise microbiológica, a fermentação escura em batelada por um consórcio microbiano. O aumento do tempo de incubação e o enriquecimento com triptona e extrato de levedura foram primordiais para a contagem de células viáveis. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Figura 2: Dados da cinética de crescimento celular e consumo de substrato durante a fermentação escura. Concentração inicial de lactose: 30 g/l). Tempo(h) Célula (UFC*/mL) ART**(g/L) 0 3, , , , , , , , , , , , , ,40 *UFC: unidade formadora de colônia **ART: açúcares redutores totais Tabela 1: Dados da cinética de crescimento celular e consumo de substrato durante a fermentação escura. Concentração inicial de lactose: 30 g/l) Pela análise da Figura 2, verifica-se que após o 8º dia de experimento, o crescimento celular se encontra na fase estacionária, sendo que o número de células permanece constante em, a- proximadamente, 3, UFC/mL. Pode-se observar pela Tabela 1 que o concentração de ART sofreu um decréscimo de 31 g/l para 5,40 g/l, enquanto o número de células sofreu um aumento de 10 7 vezes, em 168h de fermentação. Tal comportamento revela que as células oriundas do lodo do reator UASB encontram-se viáveis metabolicamente, uma vez que apresentam plena capacidade de proliferação, e, portanto estão aptas a ser empregada em bioprocessos dedicados a produção de H 2. CONCLUSÃO ALLAKHVERDIEV, S.I., KRESLAVSKI, V.D., THAVASI, V., ZHARMUKHAMEDOV, S.K., KLIMOV, V.V., NAGATA, T., NISHIHARA, H., RAMAKRISHNA, S Hydrogen photoproduction by use of photosynthetic organisms and biomimetic systems. Photochemical and Photobiological Sciences. 8, ANTONINE, S. R. C Métodos de análise e monitoramento microbiológico em laboratório de destilaria Apostila. Universidade Federal de São Carlos. APHA Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20º ed. Americam Public Health Association, D.C. BALAT, H., KIRTAY, E Hydrogen from biomass Present scenario and future prospects. International Journal of Hydrogen Energy. 35 (14), BARTELS, J.R., PATE, M.B., OLSON, N.K An economic survey of hydrogen production from conventional and alternative energy source. International Journal of Hydrogen Energy. 35 (16), BLIGH E G, DYER W J A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol, 37, BRADFORD, M. M A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein dye binding. Analytical Biochemistry. 72, HALLENBECK, P., GHOSH, D Advances in fermentative biohydrogen production: the way forward? Trends in Biotechnology. 27 (5), HUNGRIA, T. D., LONGO, P. L Viabilidade de lactobacillus Casei em alimento probiótico infantil relacionada à vida de prateleira. Revista Saúde, 3 (10-15). JEGANNATHAN, K. R., CHAN, E.S., RAVINDRA, P Harnessing biofuels: a global Renaissance in energy production. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 13, KARAKASHEV, D., GALABOVA, D., SIMEONOV, I A simple and rapid test for differentiation of aerobic from anaerobic bactéria. Journal of Microbiology and Biotechnology. 19,

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