ESTUDO DA DEGRADAÇÃO HIDROLÍTICA DE ARCABOUÇOS FIBROSOS DE POLI (ε-caprolactona) (PCL) E POLI (HIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO) (PHBV)
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- Leila de Sintra Campelo
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1 ESTUDO DA DEGRADAÇÃO HIDROLÍTICA DE ARCABOUÇOS FIBROSOS DE POLI (ε-caprolactona) (PCL) E POLI (HIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO) (PHBV) Alessandra F. Hell, Sônia M. Malmonge Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas, Universidade Federal do ABC, São Bernardo do Campo (SP), Brasil alessandrafhell@gmail.com Resumo. Este trabalho teve como objetivo estudar a degradação hidrolítica em meio fisiológico simulado de arcabouços produzidos com os polímeros PCL e PHBV. Arcabouços fibrosos obtidos por fiação por sopro em solução foram caracterizados quanto à microestrutura, densidade e porosidade aparentes. Os arcabouços foram submetidos ao ensaio de degradação hidrolítica in vitro por 30, 60 e 90 dias e avaliados quanto à perda de massa, comportamento mecânico, térmico e alterações na morfologia. O presente trabalho possibilitou a obtenção de arcabouços fibrosos de PCL com diâmetro de fibras da ordem de 0,315 µm. Os resultados indicaram alteração das propriedades térmicas o que é um indicativo de degradação hidrolítica. Foi verificado aumento do grau de cristalinidade dos polímeros estudados indicando que houve degradação preferencialmente na fase amorfa e também foi observado aumento das propriedades mecânicas dos arcabouços de PCL ao longo do tempo de contato com meio fisiológico simulado devido, provavelmente, a compactação das fibras. Palavras-chave: Biomateriais, Polímeros biorreabsorvíveis, Arcabouços fibrosos, Degradação hidrolítica in vitro. 1. INTRODUÇÃO A Engenharia Tecidual (ET) consiste na regeneração de órgãos e tecidos vivos, através do desenvolvimento e manipulação de moléculas, células, tecidos ou órgãos obtendo substitutos biológicos que restauram, mantêm e melhoram a função de partes danificados do corpo humano. Na ET as células do tecido doador são dissociadas, cultivadas e expandidas em um arcabouço na presença de fatores de crescimento, as células secretarão componentes da matriz extracelular criando um neotecido vivo que poderá ser reinserido no local lesionado [ROCHA; QUINTELLA; TORRES, 2012]. É imprescindível que os arcabouços tenham microestrutura e superfície adequadas para possibilitar adesão e crescimento celular e também propriedades mecânicas necessárias para dar o suporte ao crescimento do neotecido. Enquanto o neotecido é formado, o arcabouço sofre degradação e é metabolizado pelo próprio organismo, permitindo que o órgão vital ou tecido em questão seja restabelecido. Um dos desafios da ET é o desenvolvimento de bioamateriais adaptados que devem ser completamente biocompatíveis e degradados (absorvidos) no tempo requerido [ROCHA; QUINTELLA; TORRES, 2012]. Portanto, o estudo da microestrutura dos arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis é importante para que possamos compreender a influência na degradação e consequentes alterações nas propriedades dos dispositivos para que se possa desenvolver e aprimorar arcabouços a fim de atender os requisitos de sua aplicação. Um novo método de fiação de fibras na escala nano e micrométrica foi desenvolvido onde é empregado elementos conceituais da eletrofiação e fiação convencional a partir do polímero no estado fundido, o método é denominado fiação por sopro em solução [OLIVEIRA et al., 2010]. A técnica tem como vantagem a alta taxa de produtividade sem a 849
2 necessidade de uso de altas voltagens como no caso da eletrofiação, o método consiste basicamente em bombear uma solução polimérica através de um bico interno em uma corrente de gás pressurizado no bico externo, durante o trajeto do bico ao coletor o solvente é evaporado formando as fibras [SILVA; OLIVEIRA; MEDEIROS, 2015]. Este trabalho envolve o estudo da degradação hidrolítica em meio fisiológico simulado (solução tampão fosfato) de arcabouços fibrosos produzidos com os polímeros biorreabsorvíveis poli(ɛ-caprolactona) (PCL) e poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) através do método de fiação por sopro em solução. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Materiais. PHBV (18% de hidroxivalerato, lote FE132, PHB do Brasil) e PCL (Aldrich G, Mn ), triclorometano (clorofórmio) (Synth) e solução tampão fosfato (ph 7,4 ± 0,2). Todos os materiais foram utilizados como recebidos. Preparação dos arcabouços. Para preparação dos arcabouços foi utilizado um compressor conectado através de uma mangueira ao kit do aerográfo da Sagyna (SW130K). Foram preparadas soluções de 4% m/v para o PCL e 6% m/v para o PHBV em clorofórmio (CHCl3) (Synth) através de agitação magnética. Como coletor utilizou-se uma lixa fixada em uma placa de petri recoberta com papel alumínio, a lixa teve a função de criar rugosidades que impedem o escoamento das fibras do polímero, aumentando o rendimento do processo e o papel alumínio facilita a remoção do arcabouço após secagem. As soluções foram vertidas no aerógrafo com bico de 0,8 mm e foi utilizada pressão de trabalho de psi, para os arcabouços de PHBV foi utilizada uma distância entre o coletor e o aerógrafo de 12 cm, já para os arcabouços de PCL optou-se por utilizar uma distância de 15 cm, pois nestas distâncias foram verificados maiores rendimentos na formação e deposição de fibras. Degradação in vitro. Foi utilizada a norma F ASTM (2011) para avaliação da degradação hidrolítica in vitro. Os corpos-de-prova (CPs) foram cortados de forma retangular com dimensões de 50mm x 10mm. A solução tampão e os instrumentos de manuseio foram esterilizados, os CPs foram levados à capela de fluxo laminar e foram desinfectados em álcool 95% para serem inoculados em recipientes plásticos contendo solução tampão fosfato, os recipientes foram previamente desinfectados. Após decorrido o tempo de seguimento, os CPs foram incubados a temperatura de 37 C ± 2 C para os tempos de seguimento de 30, 60 e 90 dias. Foram preparados seis CPs para cada tempo de seguimento. Após, os CPs foram lavados em água destilada em abundância, foram imersos em álcool 95% para desidratação e foram colocados na incubadora na temperatura de 37 C ± 2 C para secagem até que sua massa permanecesse constante. Picnometria. A densidade e a porosidade aparente dos arcabouços foram determinadas utilizando a técnica de picnometria descrita por LeBlon et al. (2013), porém optou-se por utilizar álcool etílico absoluto 99,5% ao invés de água destilada devido as amostras serem menos densas do que a água e também por suas características hidrofóbicas. Para a realização do ensaio utilizou-se 4 amostras para cada tipo de polímero e para o cálculo foram utilizadas as densidades teóricas fornecidas pelos fabricantes dos polímeros, para o PHBV foi utilizada ρphbv = 1,30 g/cm 3 e para o PCL ρpcl = 1,145 g/cm 3. Estereomicroscopia e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para caracterizar a superfície dos arcabouços utilizou-se o estereomicroscópio Physis (SZ40) que possui faixa de ampliação de 10 a 40x e o software de aquisição de imagens TS View. Para as análises de 850
3 MEV foi utilizado o microscópio eletrônico de varredura JEOL (JSM-6010LA). As amostras foram fixadas em suportes metálicos com auxílio de fita adesiva de carbono. Foi utilizado feixe de elétrons de 3kV e as amostras não foram recobertas. Perda de massa. Mediu-se a massa antes da imersão na solução tampão fosfato (m1) e após o processo de secagem depois de completar os tempos de seguimento (m2). A porcentagem de perda de massa foi determinada através da Eq. (1): % perda = [(m1 - m2)/m1]. 100% (1) Comportamento mecânico. Foi utilizada à norma ASTM D (2012) e o equipamento MTS Tytron 250 para realizar os ensaios de tensão x deformação sob tração dos arcabouços. O ensaio foi realizado sob tração com velocidade de 1 mm/min e distância entre as garras de 20 mm com o auxílio do software MTS Flex Test. Foram preparados 5 CPs para cada tipo de arcabouço polimérico com dimensões aproximadas de 50 mm x 10 mm. A espessura e largura dos CPs foram medidos antes do teste com o auxílio do micrômetro e paquímetro digital, para cada parâmetro foram realizadas 3 medições para obtenção de valores médio. Comportamento térmico. As análises de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) foram realizadas utilizando o equipamento DSC Q series (TA Instruments) em atmosfera inerte, empregando vazão de 50 ml/min de nitrogênio. Foram utilizadas amostras em panelinhas de alumínio tampadas e como referência utilizou-se panelinha de alumínio tampada vazia. As amostras foram submetidas à varredura de temperatura de -50 o C a 250 o C com velocidade de 10 o C/min. O grau de cristalinidade (GC) para polímeros semicristalinos é calculado a partir do valor da entalpia de fusão (ΔHm) que é obtida da curva de DSC para o aquecimento, através da integração do pico de fusão, do valor da entalpia de cristalização (ΔHc) quando houver e conhecendo o valor teórico do polímero hipoteticamente 100% cristalino ( Hm100%). Foram utilizados os valores de Hm100% obtidos na literatura, para o PCL utilizou-se o valor de Hm100%=136 J/g e para o PHBV Hm100% =146 J/g [CASARIN, 2010]. (2) 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os arcabouços fibrosos de PCL e PHBV apresentaram coloração esbranquiçada, na Fig. 1 observam-se imagens típicas obtidas por estereomicroscopia dos arcabouços fibrosos de PCL e PHBV evidenciando a diferença em sua morfologia e também na rugosidade entre a superfície em contato com o coletor e a superfície em contato com o ar. Esta diferença na rugosidade deve-se, provavelmente, aos parâmetros concentração da solução, pressão de trabalho e distância entre o aerógrafo e o coletor utilizados na preparação dos arcabouços que permitiram que o polímero entrasse em contato com o coletor ainda fluído possibilitando o seu escoamento. 851
4 Figura 1 - Estereomicroscopia de arcabouços típicos de PHBV com aumento de 20x (A) superfície em contato com ar, (B) superfície em contato com o coletor; arcabouços típicos de PCL com aumento de 20x (C) superfície em contato com ar e (D) superfície em contato com o coletor. Também através da técnica de estereomicroscopia em aumentos de 30x e 40x de diferentes regiões dos arcabouços fibrosos de PHBV e PCL, foi possível observar que as amostras obtidas pela técnica de fiação por sopro em solução possuem uniformidade em sua estrutura. Para os arcabouços fibrosos de PHBV, em ampliações maiores obtidos pela microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi possível verificar que na superfície em contato com o coletor formou-se uma placa polimérica, não sendo possível visualizar as fibras. Também, há maior escoamento das fibras do polímero em comparação ao PCL na superfície em contato com o ar sendo possível observar diferença na estrutura dos arcabouços fibrosos de PCL e PHBV (Fig. 2 e Fig. 3). 852
5 Figura 1 - Imagens típicas de microscopia eletrônica de varredura dos arcabouços de PCL: imagens da esquerda (A) e (C) superfície em contato com ar; imagens da direita (B) e (D) superfície em contato com o coletor. Figura 2 - Imagens típicas de microscopia eletrônica de varredura dos arcabouços de PHBV: imagens da esquerda (A) e (C) superfície em contato com ar; imagens da direita (B) e (D) superfície em contato com o coletor. Diversos estudos reportados na literatura relatam a facilidade do PCL para formar fibras por eletrofiação e fiação por sopro em solução [TAVARES, 2011; RAMOS, 2011]. Já o mesmo não acontece com o PHBV, uma provável explicação para o comportamento verificado para este polímero é a sua maior viscosidade na condição empregada neste estudo, 853
6 o jato formado atinge o anteparo ainda fluido, o que causa espalhamento e formação de uma película do polímero em contato com o coletor. Também, verificou-se na literatura relatos da dificuldade na formação de fibras de PHBV [SIMBARA, 2013; BENINI, 2015]. Com a técnica de picnometria, foi obtido o valor de 0,0588 ± 0,0235 g/cm 3 para a densidade aparente do PCL e para o PHBV 0,0405 ± 0,0307 g/cm 3, observou-se alto valor de desvio padrão que pode estar relacionado a técnica de picnometria utilizada, pois depende da habilidade do operador. Em relação a porosidade aparente foram obtidos os valores de 94,86 ± 2,05 para os arcabouços de PCL e 96,89 ± 2,36 para os de PHBV. As medidas dos diâmetros das fibras dos arcabouços de PCL foram feitas utilizando-se o analisador de imagens ImageJ da National Institutes of Health, EUA. Foram realizadas 200 medições e encontrou-se o diâmetro médio de fibras de 0,315 ± 0,181 µm. Não foi possível realizar a análise para os arcabouços de PHBV devido a placa formada na superfície em contato com o coletor e o espalhamento do polímero observado nas fibras formadas na superfície em contato com o ar. Abaixo são comentados os resultados das análises da degradação hidrolítica in vitro dos arcabouços. Na Fig. 4 é possível observar a perda de massa (%) em função do tempo de contato dos arcabouços com o meio fisiológico simulado. Figura 4 - Variação percentual da massa dos arcabouços para diferentes tempos de imersão em solução tampão fosfato. Apesar dos altos valores de desvio padrão, é possível notar através do Fig. 4 que os arcabouços fibrosos de PCL tem a tendência de ganhar massa durante o tempo de contato com a solução salina, o que pode ter sido causado pela absorção de água. Foi verificado o inverso para as membranas fibrosas de PHBV que apresentaram aumento de massa nos 30 primeiros dias e depois perda de massa durante o tempo em contato com o meio fisiológico simulado. Porém, como os valores de perda e ganho de massa foram muito baixos pode-se afirmar que a massa das membranas fibrosas de PHBV permaneceu constante. Não foi possível notar defeitos (aumento de poros, trincas, diferença na coloração, etc.) nas imagens obtidas pelas técnicas de estereomicroscopia e MEV que caracterizassem a perda de massa dos arcabouços antes e após contato com a solução tampão fosfato para os tempos de 30, 60 e 90 dias. Na Fig. 5 nota-se que há aumento significativo das propriedades mecânicas, em especial do módulo de elasticidade e tensão na ruptura dos arcabouços fibrosos de PCL ao longo do tempo de degradação, comportamento oposto ao esperado. Este fato deve-se, provavelmente, a compactação das fibras que ocorreu após o contato das amostras com o meio fisiológico simulado. As amostras após o teste de degradação apresentaram estrutura mais compacta 854
7 quando comparadas com o tempo zero. As espessuras das amostras foram medidas para a realização do ensaio mecânico e os valores médios e desvios padrões são apresentados na Tabela 1, verifica-se que houve compactação das amostras após o contato com o meio fisiológico simulado. Figura 5 - Propriedades mecânicas em função do tempo de contato com a solução tampão fosfato para os arcabouços fibrosos de PCL sob de tração. Figura 6 - Propriedades mecânicas em função do tempo de contato com a solução tampão fosfato para os arcabouços fibrosos de PHBV sob de tração. 855
8 Tabela 1 Valores de espessura e desvio padrão das amostras antes do ensaio tensão x deformação sob tração. Tempo PCL fibroso PHBV fibroso 0 dias 0,21 ± 0,07 0,18 ± 0,12 30 dias 0,14 ± 0,06 0,14 ± 0,04 60 dias 0,11 ± 0,06 0,19 ± 0,05 90 dias 0,11 ± 0,05 0,22 ± 0,04 Já para os arcabouços de PHBV, o comportamento observado foi de redução nas propriedades mecânicas ao longo do tempo de degradação conforme pode ser observado na Fig. 6. Vale ressaltar que os arcabouços fibrosos de PHBV apresentaram estrutura irregular não sendo observado formação de fibras além de não ter sido verificado compactação da amostra (Tabela 1). Na Tabela 2 é apresentado os dados da entalpia de fusão (ΔHm), temperatura de fusão cristalina (Tm) e grau de cristalinidade (GC) obtidos através da técnica de DSC para os arcabouços fibrosos de PCL para os tempos de 0 e 90 dias de contato com a solução tampão fosfato. Tabela 2 - Valores de Tm, ΔHm e GC para os arcabouços fibrosos de PCL para os tempos de 0 e 90 dias de contato com a solução tampão fosfato. PCL fibroso Tempo Aquecimento Tm ( o C) ΔHm (J/g) GC 0 dias 90 dias 1 o Aq. 60,9 42,2 31,0 2 o Aq. 56,7 26,7 19,6 1 o Aq. 63,0 50,6 37,2 2 o Aq. 57,3 28,9 21,2 Para os arcabouços fibrosos de PCL, verificou-se aumento do grau de cristalinidade com o tempo de degradação. Este aumento, também é um fator que pode ter contribuído para o aumento das propriedades mecânicas ao longo do tempo de degradação, em especial o módulo de elasticidade. Já na Tabela 3 é apresentado os dados obtidos da entalpia de fusão (ΔHm), entalpia de cristalização (ΔHc), temperatura de transição vítrea (Tg), temperatura de fusão cristalina (Tm) e grau de cristalinidade (GC) através da técnica de DSC para os arcabouços fibrosos de PHBV para os tempos de seguimento 0 e 90 dias. Tabela 3 - Valores de Tg, Tc, ΔHc, Tm, ΔHm e GC para os arcabouços fibrosos de PHBV para os tempos de 0 e 90 dias de contato com a solução tampão fosfato. PHBV fibroso Tempo Aquecimento Tg ( o C) Tc ( o C) ΔHc (J/g) Tm ( o C) ΔHm (J/g) GC 0 dias 90 dias 1 o Aq. 60,9 NA NA 161,3 20,4 13,9 2 o Aq. -0,6 63,0 25,0 161,6 23,8 0 1 o Aq. 64,5 NA NA 161,5 24,8 16,9 2 o Aq ,9 27,2 149,5 28,3 0,7 Analisando os dados da Tabela 3, pode-se notar aumento no grau de cristalinidade ao longo do tempo de degradação para as curvas do primeiro e segundo aquecimento 856
9 evidenciando que houve degradação, preferencialmente, da fase amorfa. Observa-se também uma diminuição significativa na Tm do 2 aquecimento do tempo 0 para o tempo de contato de 90 dias com o MFS, isto é um forte indício da quebra das cadeias devido ao aquecimento intensificado pela presença de água. 4. CONCLUSÕES O presente trabalho possibilitou a obtenção de arcabouços fibrosos de PCL com diâmetro médio de fibras de 0,315 ± 0,181 µm, nas condições realizadas neste estudo não foi possível obter fibras para os arcabouços de PHBV. Após o contato com o meio fisiológico simulado e a partir dos dados obtidos nas análises conclui-se que a degradação hidrolítica in vitro resultou em aumento da cristalinidade dos polímeros estudados, indicando que as reações de hidrólise ocorrem inicialmente na fase amorfa e que a diminuição das propriedades térmicas é um indicativo da degradação. Notou-se aumento significativo das propriedades mecânicas, em especial do módulo de elasticidade e tensão na ruptura dos arcabouços fibrosos de PCL ao longo da análise de degradação hidrolítica in vitro, comportamento oposto ao esperado devido, provavelmente, a compactação das fibras. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à PHB do Brasil pela doação do PHBV, à Universidade Federal do ABC e a Central Experimental Multiusuários da UFABC pela disponibilidade dos equipamentos e materiais. REFERÊNCIAS ASTM D (2012), Standard Test Method for Tensile Properties of Thin Plastic Sheeting. ASTM F (2011), Standard Test Method for in vitro Degradation Testing of Hydrolytically Degradable Polymer Resins and Fabricated Forms for Surgical Implants. BENINI, K. C. C. C. (2015) Compósitos de nanocelulose/phbv: manta microfibrílica por eletrofiação. Tese de Doutorado. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Guaratinguetá. LeBlon, C. E.; PAI, R.; FODOR, C. R.; GOLDING, A. S.; COULTER, J. P.; JEDLICKA, S. S. (2013), In vitro comparative biodegradation analysis of salt-leached porous scaffolds. Journal of Applied Polymer Science, v. 128, n. 5, p CASARIN, S. A. Blendas de PHBV e PCL para uso em dispositivos de osteossíntese. (2010), 158p. Tese (Doutorado em Ciência e Engenharia de Materiais) - Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. OLIVEIRA, J. E; MORAES, E. A.; MEDEIROS, E. S.; MATTOSO, L. H. C. (2010), Fiação por Sopro em Solução: Um Novo Método para produção de nanofibras de poli(óxido etileno). v. 4, n. II, p.3, 2010, Simpósio Paulista de Nanotecnologia, v. 4, n. II, p. 3. RAMOS, S. L. F. (2011), Membranas de policaprolactona obtidas por eletrofiação para utilização em Engenharia Tecidual. Universidade Estadual de Campinas, Dissertação de mestrado em Engenharia Mecânica, Campinas. ROCHA, A. M.; QUINTELLA, C. M.; TORRES, E. A (2012), Prospecção De Artigos E Patentes Sobre Polímeros Biocompatíveis Aplicados À Engenharia De Tecidos E Medicina Regenerativa. Cadernos de Prospecção, v. 5, n. 2, p SILVA, T. H.; OLIVEIRA, J. E. DE; MEDEIROS, E. S. (2015), Obtenção de micro e nanofibras de PVC pela técnica de Fiação por Sopro em Solução. Polímeros, v. 25, n. 2, p SIMBARA, M. M. O. (2013), Matrizes tridimensionais de poli(ε-caprolactona) (PCL) e poli(hidroxibutirato-covalerato) (PHBV) para uso em Engenharia Tecidual suportes fibrosos x membranas porosas. Universidade Federal do ABC, Trabalho de Conclusão de Curso, Santo André. TAVARES, V. A. C. D. B. (2011), Matrizes de policaprolactona e quitosano para aplicação em Engenharia de Tecidos. Dissertação de Mestrado, Licenciatura em Ciências de Engenharia Biomédica, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa. 857
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