EFEITO DA INIBIÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE SENSÍVEL À AMINOGUANIDINA NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS

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1 1 EFEITO DA INIBIÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE SENSÍVEL À AMINOGUANIDINA NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS SÍLVIA GONSALVES DE CARVALHO MATTA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ JULHO-2006

2 2 EFEITO DA INIBIÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE SENSÍVEL À AMINOGUANIDINA NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS SÍLVIA GONSALVES DE CARVALHO MATTA Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutora em Produção Animal. Orientadora: Prof a. D ra. Maria Clara Caldas Bussiere CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ julho 2006

3 3 EFEITO DA INIBIÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE SENSÍVEL À AMINOGUANIDINA NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS SÍLVIA GONSALVES DE CARVALHO MATTA Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutora em Produção Animal. Aprovada em 27 de julho de 2006 Comissão Examinadora Prof. Luiz Altamiro Garcia Nogueira (Reprodução Animal) - UFF Prof. Reginaldo da Silva Fontes (Reprodução Animal) - UENF Prof a. Celia Raquel Quirino (Melhoramento Genético Animal) UENF Prof a. Maria Clara Caldas Bussiere (Doutora, Fisiologia Animal) UENF (Orientadora)

4 4 Alguma coisa por acontecer. Silêncio. Frio. Noite estrelada. Belém dorme tranqüila, sem saber Da hora que a sua noite traz, guardada... Alguma coisa. É o que parece ser? Silêncio. Quietude. Madrugada. A noite leve faz perecer Nenhuma coisa guardada. Alguma coisa. E nada há de conter. Como se milimetricamente calculada. Que certamente há de ver quem é de ver E há de escutar quem traz a alma alinhada. Quem ousa, em sã consciência, desdizer? Que palavra não cala, encabulada? Que sacerdote? Que Império? Que poder? Que humanidade necessitada? Alguma coisa. Porque Deus querer É o mesmo que uma ordem executada. Alguma coisa. Dá pra perceber. Silêncio. Frio. Noite abençoada. Luís Alberto Mussa Tavares ii

5 5 A Deus, que foi o início de tudo; Ao meu pai e à minha mãe que, me deram a vida e oportunidade de estudar, mostrando-me o melhor caminho, a educação... Ao meu esposo e aos meus filhos, pelo amor, carinho, compreensão e força para continuar... Dedico iii

6 6 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro e ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), pelo oferecimento deste curso. À UENF, pela concessão da bolsa de estudo. À minha orientadora, pela sua valiosa orientação, competência, incentivo e exemplo de dedicação profissional. Um agradecimento mais do que especial pelos ensinamentos e credibilidade. Aos professores Reginaldo da Silva Fontes e Ângelo Burla Dias, pela atenção e apoio na realização do trabalho. À professora Celia Raquel Quirino, pela orientação nas análises estatísticas, boa vontade e pelos encontros nos feriados e finais de semana. Os meus sinceros agradecimentos à minha amiga Kelen Salaroli Viana, pelo seu companheirismo, dedicação, fidelidade, sugestões e ajuda durante todo o meu trabalho. À minha amiga Carla Sobrinho Paz de Carvalho, pela sua competência e experiência profissional e importante participação nas pesquisas. A todos os membros da Coordenação de Pós-Graduação Animal, em especial a Jovana e a Etiene, pela disponibilidade nas informações. iv

7 7 Aos funcionários da biblioteca do CCTA, pelos empréstimos concedidos durantes todos esses anos. À minha amiga Márcia Rezende Faes, pelo carinho e amizade. Aos bolsistas de apoio do laboratório de Melhoramento Genético Animal, do setor de Reprodução Animal, pela preparação de material necessário para a realização deste trabalho. Aos amigos João, Steeven, Vitor, Luís, Leonardo, Janaína, Bianca, Reubes, Vanessa, Helga, Georgina, Patrícia, Camila e Fernanda, pelo carinho e convívio no laboratório. A Deus, por ter dado força de vontade para continuar, apesar das dificuldades encontradas, e pela oportunidade de chegar até aqui. v

8 8 BIOGRAFIA Sílvia Gonsalves de Carvalho Matta, filha de Mário Leite de Carvalho Júnior e Maria Madalena de Souza Gonsalves, nasceu em 17 de fevereiro de 1973, na cidade de Campos dos Goytacazes RJ. Concluiu o segundo grau no curso Científico da Escola Estadual Liceu de Humanidades de Campos, em, Em janeiro de 1999, concluiu o curso de nível superior em Medicina Veterinária, na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, sendo que no período entre 01 de agosto de 1997 a 31 de janeiro de 1999, foi bolsista de Iniciação Científica no setor de Reprodução Animal. Em agosto de 2001, concluiu o curso de Mestrado em Fisiologia Animal, na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Foi admitida em agosto de 2001 no Curso de Pós-Graduação em Produção Animal, Doutorado, Reprodução Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, em Campos dos Goytacazes RJ, submetendo-se à defesa de tese para conclusão do curso em julho de vi

9 9 CONTEÚDO LISTA DE TABELAS...ix LISTA DE FIGURAS...xi LISTA DE ABREVIATURAS...xii RESUMO...xiv ABSTRACT...xvi 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA REVISÃO DE LITERATURA Maturação oocitária Maturação nuclear Maturação citoplasmática Maturação molecular Fatores que afetam a maturação oocitária Adenosina monofosfato cíclica (AMPc)...10 vii

10 Proteínas envolvidas no controle do ciclo celular Células do cumulus GDF Hormônios esteróides: P 4 e E Óxido nítrico (NO) Óxido nítrico no sistema ovariano Papel do óxido nítrico na maturação oocitária REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS TRABALHO Efeito da inibição da enzima óxido nítrico sintase sensível à aminoguanidina na maturação in vitro de oócitos bovinos. RESUMO...49 ABSTRACT...50 INTRODUÇÃO...51 MATERIAL E MÉTODOS...53 RESULTADOS...59 DISCUSSÃO...68 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...74 CONCLUSÔES GERAIS...79 viii

11 11 LISTA DE TABELAS Tabela 01. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na expansão das células do cumulus de oócitos bovinos maturados in vitro por 24 h...60 Tabela 02. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na viabilidade das células do cumulus de oócitos bovinos maturados in vitro por 24 h...62 Tabela 03. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na progressão da meiose de oócitos bovinos maturados in vitro por 24 h...63 Tabela 04. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na integridade da membrana plasmática de oócitos bovinos maturados in vitro por 24 h...64 Tabela 05. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na concentração de NO - 2 e NO ix

12 12 Tabela 06. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na concentração de hormônios esteróides: 17β-estradiol (E 2 ) e progesterona (P 4 )...66 Tabela 07. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na migração dos grânulos corticais de oócitos bovinos...67 Tabela 08. Efeito da adição de aminoguanidina no meio de maturação de oócitos bovinos in vitro na concentração na taxa de clivagem e formação de blastocistos (média ± DP)...68 x

13 13 LISTA DE FIGURAS Figura 01. Eventos celulares que ocorrem durante a maturação nuclear em oócitos de mamíferos...7 Figura 02. Atividades do MPF e MAPK durante a maturação nuclear...13 Figura 01. Efeito da adição de diferentes concentrações de AG no meio de maturação na expansão das células do cumulus de oócitos bovinos...61 xi

14 14 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS AC Adenil ciclase AG Aminoguanidina AMPc adenosina monofosfato cíclica AMPC - PDE Fosfodiesterase AMPc AI Anáfase I COC Complexo cumulus oócito CSF Fator citostático Cx43 Conexina 43 D-NMMA N G -monometil-d-arginina E 2 17β-Estradiol enos Óxido nítrico sintase endotelial FIV Fertilização in vitro FSH Hormônio folículo estimulante GDF-9 Fator de crescimento e diferenciação do tipo 9 GMPc guanosina monofosfato cíclica IBMX 3-isobutil-1-metil xantina inos Óxido nítrico sintase induzível L - NAME N w -nitro-l-arginina metil éster xii

15 15 LH Hormônio luteinizante L-NMMA N G -monometil-l-arginina MAPK MAP cinase MAPKK MAP cinase cinase MAPKKK MAP cinase cinase cinase MBP Proteína básica de mielina MI Metáfase I MII Metáfase II MIV Maturação in vitro MPF Fator promotor da maturação MTOC Centro de organização de microtúbulos nnos - Óxido nítrico sintase neuronal NO Óxido nítrico NO - 2 Nitrito NO - 3 Nitrato NOS Óxido nítrico sintase P 4 - Progesterona PIV Produção in vitro PKA Proteína cinase Pkc Proteína cinase c SFB Soro fetal bovino SNP Nitroprussiato de sódio. TCM Meio de cultura de tecidos TI Telófase I VG Vesícula germinativa VGBD Rompimento da vesícula germinativa xiii

16 16 RESUMO MATTA, Sílvia Gonsalves de Carvalho, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; julho de 2006; Efeito da inibição da enzima óxido nítrico sintase sensível à aminoguanidina na maturação in vitro de oócitos bovinos; Professor Orientador: Prof a Maria Clara Caldas Bussiere. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da inibição da enzima óxido nítrico sintase (NOS) sensível à aminoguanidina (AG) na maturação nuclear e citoplasmática in vitro de oócitos bovinos. Os COCs foram cultivados com diferentes concentrações de AG (0, 1, 10 e 100 mm) e 10-5 M de nitroprussiato de sódio (SNP, doador de NO) adicionado a 100 mm de AG, durante 24 h. No experimento 1, foi avaliado o grau da expansão das células do cumulus, o estádio de maturação nuclear, a integridade da membrana plasmática das células do cumulus e do oócito. As concentrações de NO - 2,/NO - 3, P 4 e E 2 foram determinadas no meio de maturação pelo método de Griess e por quiluminescência, respectivamente. A adição de diferentes concentrações de AG no meio de maturação promoveu um efeito dose-resposta na expansão das células do cumulus de COCs bovinos (P<0,05). A adição de 1 e 10 mm de AG no meio de MIV não afetou a integridade da membrana plasmática dos oócitos nem a maturação nuclear (P>0,05), contudo, diminuiu a integridade da membrana das células do cumulus. A concentração de 100 mm inibiu a transição da metáfase I xiv

17 17 (MI) para a metáfase II (MII), promoveu lesão da membrana plasmática dos oócitos (P<0,05) e aumentou a concentração de NO - 2,/NO - 3 quando comparada com o controle (P<0,05) e com 1 e 10 mm de AG (P>0,05). A adição de 10-5 M de SNP a 100 mm de AG não reverteu os efeitos causados por 100 mm de AG, mas aumentou a concentração de NO - 2 /NO - 3. Nenhuma concentração adicionada ao meio de maturação alterou a concentração de E 2. A adição de 100 mm de AG diminuiu a concentração de P 4 (P<0,05), quando comparada ao controle e demais concentrações. Este efeito foi revertido pela adição de SNP. No experimento 2, foi avaliado o efeito da adição de diferentes concentrações de AG na maturação citoplasmática in vitro pela avaliação da taxa de migração dos grânulos corticais, clivagem e produção de blastocistos. Houve um efeito dose-resposta na migração dos grânulos corticais, onde 1 mm (83,9 ± 6,2%) não diferiu do controle (83,6 ± 8,2%; P>0,05), 10 mm inibiu parcialmente (3,8 ± 6,4%) e 100 mm inibiu totalmente a migração dos grânulos corticais (P<0,05). A adição de SNP (10-5 M) não reverteu o efeito inibitório da migração dos grânulos corticais dos oócitos tratados com 100 mm. Somente as concentrações de AG que não inibiram a MIV foram utilizadas para avaliar a taxa de clivagem e produção de blastocistos. A adição de 10 mm de AG no meio de maturação diminuiu (73,0 ± 8,1%; P<0,05) a taxa de clivagem e produção de blastocistos, quando comparada com grupo controle (89,1 ± 3,4%; 37,6 ± 7,3%, respectivamente), mas não diferiu, (P>0,05), do grupo tratado com 1 mm de AG (80,9 ± 8,4%; 41,5 ± 10,5%, respectivamente). Os resultados do presente experimento demonstram que o NO derivado da NOS sensível à AG modula a maturação nuclear e citoplasmática in vitro de oócitos bovinos. Palavras-chave: óxido nítrico, aminoguanidina, maturação nuclear, grânulos corticais, desenvolvimento embrionário inicial. xv

18 18 ABSTRACT MATTA, Sílvia Gonsalves de Carvalho, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; julho de 2006; Effects of inhibition of nitric oxide synthase sensitive to aminoguanidine on in vitro maturation of bovine oocytes; Graduate supervisor: Prof. Maria Clara Caldas Bussiere. The aim of the present study was to investigate the effects of inhibition of the enzyme nitric oxide synthase (NOS) sensitive to aminoguanidine (AG) on nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes in vitro. COCs were cultured with different concentrations of AG AG (0, 1, 10 and 100 mm) and to 10-5 M sodium nitroprusside (SNP, NO donor) associated with 100mM AG for 24h. In experiment 1, the degree of cumulus cells expansion, nuclear maturation status and plasma membrane integrity of oocytes and granulosa cells were assessed. NO - 2,/NO - 3, P 4 and E 2 were determined in culture medium by Griess method and chemiluminescence, respectively. Addition of different concentrations of AG to maturation medium promoted a dose-response effect on cumulus expansion (P<0.05). Addition of 1 and 10mM AG to IVM medium did not affect plasma membrane integrity of oocytes or nuclear maturation rates (P>0.05), however, plasma membrane integrity was reduced in cumulus cells. One hundred millimolar inhibited metaphase I (MI) to metaphase II (MII) transition, promoted plasma xvi

19 19 membrane damage in oocytes (P<0.05) and increased NO - 2,/NO - 3 concentration when compared to controls (P<0.05). Association of 10-5 M SNP to 100mM AG did not reverse the effects of AG, but increased NO - 2 /NO - 3 concentration. None of the AG concentrations tested in maturation medium affected E 2 concentration. Addition of 100mM AG reduced P 4 concentration (P<0.05) when compared to controls and the other concentrations used. This effect was reversed by SNP. In experiment 2, the effect of different AG concentrations on cytoplasmic maturation in vitro was assessed based on cortical granules migration, cleavage and blastocyst development rates. There was a doseeffect on cortical granules migration rate, in which 1mM AG (83.9 ± 6.2%) did not differ from control oocytes (83.6 ± 8.2%; P>0.05), but 10mM partially inhibited (3.8 ± 6.4%) and 100mM totally inhibited migration (P<0.05). SNP (10-5 M) did not revert this inhibitory effect on cortical granules migration in oocytes treated with 100mM AG. Only those concentrations that did not inhibit IVM were used to assess cleavage and blastocyst rates. Addition of 10mM AG to IVM medium reduced (73.0 ± 8.1%; P<0.05) cleavage and blastocyst rates when compared with controls (89.1 ± 3.4%; 37.6 ± 7.3%, respectively), but did not differ, (P>0,05), from the group treated with 1mM AG (80.9 ± 8.4%; 41.5 ± 10.5%, respectively). The results from the present study demonstrate that NO derived from NOS sensitive to AG modulates nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes in vitro. Keyword: nitric oxide, aminoguanidine, nuclear maturation, cortical granules, early embryo development. xvii

20 1 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA Durante os últimos trinta anos, os estudos clássicos como superovulação, recuperação e transferência de embriões e avançadas tecnologias embrionárias, como produção in vitro e clonagem por transferência nuclear de células somáticas, têm gerado informações sobre estrutura, função e qualidade durante o desenvolvimento do oócito, na fertilização e no desenvolvimento embrionário (SCHENK et al., 2006). Estas informações têm gerado novas incertezas, não somente nessas tecnologias, mas também sobre fatores que contribuem para a fertilidade em bovinos (GREVE e CALLESEN, 2005; GALLI e LAZZARI, 2005). Os perfis endócrino folicular e periférico têm uma profunda influência no subseqüente desenvolvimento da competência do embrião e está estabelecido, também, que a manipulação de oócitos ou embriões pode, adversamente, afetar o desenvolvimento embrionário e fetal (GREVE e CALLESEN, 2005; GALLI e LAZZARI, 2005). A habilidade para a retomada da meiose, clivagem após a fertilização e desenvolvimento até blastocistos, taxa de prenhez e geração de descendentes saudáveis são eventos que ocorrem separadamente, mas estão associados a três tipos de maturação observados no oócito: nuclear, citoplasmática e molecular. Estas habilidades variam dependentemente com o tipo de oócitos que são removidos dos folículos. A influência da qualidade do oócito no potencial de desenvolvimento do embrião tem sido mostrada mais claramente em bovinos do que em quaisquer outras

21 2 espécies, pois sabe-se que existem múltiplos fatores que estão envolvidos e uma grande quantidade de dados têm sido publicados nesta área (SIRARD et al., 2006). Estudos recentes mostram que em comparações feitas entre a maturação in vivo e in vitro, o potencial de desenvolvimento de oócitos maturados in vitro é, geralmente, menor do que de oócitos maturados in vivo. Esses achados são, também, uma conseqüência óbvia da coleta de uma população heterogênea de oócitos com diferentes potenciais de desenvolvimento. Os mesmos autores apontam que a qualidade do desenvolvimento embrionário seguido da maturação in vitro fertilização in vitro (MIV FIV) é muito influenciada pelas condições dos meios de cultivo dos zigotos até blastocisto (RISOS et al., 2002). A maturação do oócito requer um ajuste adicional às gonadotrofinas realizado pelos fatores intra-ovarianos esteróides e não-esteróides que atuam como reguladores parácrinos e autócrinos da sinalização hormonal (TERRANOVA e RICE, 1997). Uma célula animal possui um sistema complexo de proteínas que lhe permite responder aos sinais enviados por outras células. Este sistema inclui receptores protéicos de superfície celular e intracelulares, proteinoquinases, fosfatases, proteínas ligadoras de GTP e muitas outras, pequenos peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos, esteróides, retinóides, derivados de ácidos graxos e o óxido nítrico (NO), que vem se destacando como uma molécula envolvida na sinalização intra e intercelular, controlando muitos processos da fisiologia ovariana (DIXIT e PARVIZI, 2001). Três isoformas de NOS têm sido identificadas: duas isoformas constitutivas, incluindo a endotelial (enos) e neuronal (nnos) e a isoforma induzível (inos). As isoformas constitutivas são cálcio-calmodulina dependentes e produzem pequenas quantidades de NO. Em contraste, a inos é expressa em muitos tipos celulares (DIXIT e PARVIZI, 2001). Das três isoformas, os ovários de mamíferos expressam a enos e a inos, mas não a nnos (TAO et al., 2005). Os mecanismos exatos da influência do sistema NO/NOS (NO/óxido nítrico sintase) na maturação de oócitos de fêmeas de camundongos, ratos e bovinos não são totalmente conhecidos. Os estudos sustentam o conceito de que o NO tanto pode inibir (JABLONKA-SHARIFF et al., 1999a) quanto estimular (VIANA et al., 2006) a maturação nuclear, dependendo de sua concentração. Segundo MATTA et al. (2001), num trabalho realizado em oócitos de bovinos, demonstraram que apesar do inibidor da

22 3 síntese de NO utilizado no experimento (L-NAME) nas concentrações utilizadas na maturação in vitro não inibir a meiose, o NO está envolvido na regulação de proteínas, possivelmente relacionadas com a inibição da maturação e, conseqüentemente, com o desenvolvimento embrionário inicial. Estudos realizados também com doadores de NO, como por exemplo, o SNP (nitroprussiato de sódio) sugerem que adequadas concentrações de NO no meio de cultivo são necessárias para a ocorrência da maturação normal do oócito, da fertilização e, conseqüentemente, do desenvolvimento embrionário inicial (VIANA et al., 2003, 2006), demonstrando, pela primeira vez na literatura, que a maturação in vitro de oócitos bovinos é influenciada pela concentração de NO no meio de cultivo. Neste estudo, propomos determinar o papel da enzima óxido nítrico sintase sensível à aminoguanidina (AG), utilizando-se diferentes concentrações do inibidor da síntese de NO pela inos durante a maturação in vitro, com o objetivo de entendermos melhor o papel do NO na maturação nuclear e citoplsmática in vitro de oócitos bovinos.

23 4 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Maturação oocitária A maturação oocitária compreende a maturação nuclear (LONERGAN et al., 1997; CHA e CHIAN, 1998; MAYES e SIRARD, 2001), a maturação citoplasmática (KHATIR et al., 1997) e a maturação molecular (SIRARD et al., 2006), as quais envolvem mudanças morfológicas (KIM et al., 1996; KIM et al., 2000) e mudanças moleculares ou bioquímicas (WU et al., 1996; KHATIR et al., 1998; LEDAN et al., 2001; SIRARD et al., 2006). Tanto a maturação nuclear e citoplasmática quanto a molecular são consideradas importantes para o desenvolvimento normal do embrião (PLACHOT E CROZET, 1992; YANG et al., 1998; GALLI e LAZZARI, 2005; SIRARD et al., 2006) e não há dúvida de que muitos fatores biológicos agem juntos para preparar oócitos imaturos para o desenvolvimento de embriões competentes após a fertilização (YANG et al., 1998) e que alguns defeitos na maturação do oócito podem ser causados por uma maturação nuclear, citoplasmática ou molecular inadequada (PLACHOT e CROZET, 1992; YANG et al., 1998; SIRARD et al., 2006).

24 Maturação nuclear Em oócitos mamíferos, a meiose é interrompida durante o período fetal na prófase I, permanecendo assim até serem estimulados a retomarem a primeira divisão meiótica, que ocorre antes da ovulação, após o oócito/folículo ter sofrido um extenso crescimento. A primeira etapa da retomada da meiose é o rompimento da vesícula germinativa (VGBD), que não é um processo regulado por microfilamentos (SUN e SHATTEN, 2006), quando os cromossomos condensam-se numa forma compacta. O centrossoma, então, se divide em dois centríolos, ao redor dos quais aparecem ásteres que se movem separadamente e um feixe é formado entre eles. Os cromossomos, em pares diplóides, estão dispostos livres no citoplasma e tornam-se arranjados numa placa de feixe equatorial, estacionando na metáfase I (MI). Esse movimento polarizado dos cromossomos depende dos processos mediados por microfilamentos (Figura 01: Linha 1) (SUN e SHATTEN, 2006). O oócito primário sofre duas divisões meióticas. Na primeira divisão, duas células são formadas, mas uma delas contém quase todo o citoplasma; e a outra, muito menor, forma o primeiro corpúsculo polar (Figura 01: Linha 2). Além dos cromossomos, o primeiro corpúsculo polar contém uma variedade de organelas, incluindo mitocôndrias, ribossomas e grânulos corticais (VEECK, 1991; JONES, 2004). Estas divisões consistem em uma seqüência de eventos celulares que são controlados pelo citoesqueleto do oócito e são altamente regulados com o tempo. Os microtúbulos formam um fuso e segregam cromossomos homólogos durante a primeira divisão meiótica graças aos microfilamentos de actina (BRUNET e MARO, 2005). Interações diretas entre os cromossomos e os microfilamentos de actina controlam a posição do fuso mitótico (ZENG, 2004). Os cromossomos agem para organizar tanto os microtúbulos quanto os microfilamentos de actina, atuando como fator essencial para a divisão meiótica assimétrica para a formação do gameta funcional (BRUNET e MARO, 2005). Assim, a maturação meótica em oócitos mamíferos é um complexo processo que envolve um extenso rearranjo de microtúbulos e microfilamentos de actina (ROTH e HANSEN, 2005), bem como outras proteínas associadas ao citoesqueleto (SUN e SCHATTEN, 2006).

25 6 Durante a mitose, a formação do fuso é controlada pelo rearranjo dos cromossomos, os principais sítios de polimerização dos microtúbulos (OU e RATTNER, 2004). No início da mitose, ocorre a divisão do centrossoma em dois e a migração dos mesmos para lados opostos do núcleo. Como conseqüência, assim como, a VGBD, ocorre o prolongamento dos microtúbulos e o desprendimento dos centrossomas, que interagem com os cromossomos e tornam-se rapidamente organizados dentro de um fuso bipolar. Os centrossomas dos oócitos e os microtúbulos são polimerizados num discreto sítio no citoplasma chamado de centros de organização de microtúbulos (MTOCs). Em oócitos de camundongos, onde os MTOCs estão dispersos no citoplasma, os cromossomos prendem-se para conduzir a montagem do fuso. No início da MI, logo após a VGBD, os MTOCs são, preferencialmente, ativados e/ou recrutados juntamente com os cromossomos e os microtúbulos são, preferencialmente, estabilizados nesta área. O crescimento dos microtúbulos é, então, organizado de uma maneira bipolar ao redor dos cromossomos (BRUNET e MARO, 2005). Assim, a progressão da telófase I (TI) da primeira divisão meiótica para a extrusão do primeiro corpúsculo polar permite que um grupo de cromossomos seja expelido no espaço perivitelínico, enquanto o outro grupo permanece no citoplasma do oócito. O oócito passa a ser chamado de oócito secundário e os cromossomos vitelínicos revertem-se para a formação do segundo eixo meiótico. A segunda divisão meiótica começa e progride para a metáfase II (MII), mas não é completada até que a penetração do espermatozóide ocorra. O objetivo da meiose é a redução para o número haplóide de cromossomos e a recombinação genética. Somente os oócitos que tenham alcançado este estádio de maturação e que tenham sido bloqueados na MII são capazes de ser fertilizados e se desenvolver normalmente (Figura 01: Linha 3) (STRÖMSTEDT e BYSKOV, 1999).

26 7 Figura 01: Eventos celulares que ocorrem durante a maturação nuclear em oócitos de mamíferos. Linha 1: Durante a VGBD, os microtúbulos em verde, polimerizam-se ao redor dos cromossomos e organizam-se progressivamente até formar um fuso bipolar; Linha 2: A formação do fuso induz a reorganização dos cromossomos na região cortical do oócito (áreas vermelha e rosa) e a liberação do primeiro corpúsculo polar; Linha 3: Durante a MII, o fuso metafásico é ancorado na membrana plasmática do oócito e após a fertilização ocorre a liberação do segundo corpúsculo polar (BRUNET e MARO, 2005) Maturação citoplasmática O processo de maturação citoplasmática ainda não está tão bem definido (FAIR, 2003), mas se sabe que a capacidade de desenvolvimento adquirida pelo oócito é dependente das mudanças citoplasmáticas, que ocorrem simultaneamente às mudanças nucleares durante a maturação. A maturação citoplasmática, em mamíferos, é um processo altamente complexo que envolve, entre outros eventos, mudanças na

27 8 síntese de proteínas (KHATIR, et al., 1997: SIRARD et al., 1998) e na migração e reorganização de organelas (HYTTEL et al., 1997; STOJKOVIC et al., 2001). A maturação citoplasmática é caracterizada pelo acúmulo de lipídios do oócito, pela redução no aparato de Golgi, pelo aparecimento de numerosos ribossomos especialmente adjacentes aos cromossomos, alinhamento dos grânulos corticais (CRAN e ESPER, 1990) e rearranjo de microfilamentos, que são as principais mudanças citoplasmáticas que ocorrem durante a maturação do oócito (KIM et al., 1996; KITO e BAVISTER, 1997; SUN et al., 2001b). Os microtúbulos e os microfilamentos, são estruturas altamente dinâmicas que podem aumentar ou diminuir em comprimento pela adição ou perda de subunidades de tubulina. Proteínas motoras se movem numa direção ou outra ao longo dos microtúbulos, carregando organelas específicas para locais pré-determinados dentro da célula (ALBERTS et al., 1997). Eles são, também, os maiores componentes do citoesqueleto de oócito de mamíferos e são responsáveis pela divisão celular (KIM et al., 1996; KIM et al., 2000; SUN e SHATTEN, 2006), manutenção do fuso meiótico, posicionamento dos cromossomos na periferia e pela extrusão do corpúsculo polar durante a maturação e fecundação (KIM et al., 2000). Na maioria das espécies, após a fertilização, o conteúdo dos grânulos corticais é liberado por exocitose para o córtex do oócito (CRAN e ESPER, 1990; DENG et al., 2005) e, em seguida, algumas proteínas dos grânulos bloqueiam a poliespermia na zona pelúcida e no oolema (DUCIBELLA, 1996; SUN e SHATTEN, 2006). Nos mamíferos e nos marsupiais, algumas proteínas dos grânulos corticais permanecem no espaço perivitelínico e formam, após a fertilização, uma matriz chamada de envelope de grânulos corticais, que é ancorada na membrana plasmática dos oócitos maturados (TALBOT e DiCARLANTONIO, 1984; DANDEKAR e TALBOT, 1992), e que é retida até a implantacão do blastocisto (TALBOT e DiCARLANTONIO, 1984; DANDEKAR e TALBOT, 1992; DANDEKAR et al., 1995). Em oócitos de ouriço-do-mar, a migração dos grânulos corticais requer uma associação com microfilamentos e não com microtúbulos. Logo após a VGBD, os grânulos corticais prendem-se aos microfilamentos e são translocados para a superfícies da célula. A ativação do MPF estimula a associação entre a vesícula e os

28 9 microfilamentos e isso é a chave regulatória para a migração coordenada dos grânulos corticais para o córtex (WESSEL et al., 2002). No entanto, de acordo com SUN et al. (2001a), a localização dos grânulos corticais no oolema e sua ancoragem no córtex foi independente dos microfilamentos ou dos microtúbulos; eles se mantiveram no córtex após o tratamento com inibidores da maturação do oócito para permanecerem na MII. Mas os dados envolvendo exocitose dos grânulos corticais com microfilamentos de actina e microtúbulos precisam ser melhor elucidados (SUN e SCHATTEN, 2006). Com estas modificações, o oócito secundário apresenta mudanças biológicas celulares necessárias para o sucesso da fertilização e do desenvolvimento embrionário inicial (HYTTEL et al., 1997). A avaliação da maturação citoplasmática é importante para um bom entendimento dos fatores envolvidos na maturação oocitária in vitro, visando a uma maior eficiência no desenvolvimento embrionário inicial (ALBERIO et al., 2000; SIRARD et al., 2006) Maturação molecular A maturação molecular é uma das definições mais recentes do processo de maturação do oócito (SIRARD et al., 2006). O controle da conformação da cromatina durante o crescimento e a maturação oocitária faz parte de um caminho fisiológico complexo. Múltiplas sinalizações convergem para induzir modificações póstransducionais em resíduos de aminoácidos específicos de várias proteínas histonas (CHEUNG et al., 2000). A maioria das hipóteses sustenta o conceito de que RNAs mensageiros específicos e a possibilidade de algumas proteínas serem produzidas e estocadas no oócito nos últimos dias antes da ovulação proporcionam ao oócito a capacidade de desenvolvimento, sendo essenciais para promover a cascata molecular durante a ativação do gameta embrionário e o desenvolvimento até o estádio de blastocisto (SIRARD et al., 2006).

29 Fatores que afetam a maturação oocitária Adenosina monofosfato cíclica (AMPc) A adenosina monofosfato cíclica exerce um importante papel no controle da maturação nuclear de oócitos bovinos (GUIXUE et al., 2001). Tem sido sugerido que uma parte do AMPc requerido pode ser sintetizado pelas células do cumulus e transferido para o oócito via junções comunicantes (DEKEL et al., 1988; TORNELL et al., 1991; BILODEAU et al., 1993). Também é possível que a estimulação das células do cumulus induza a síntese de AMPc em níveis basais que sejam suficientes para a manutenção do bloqueio meiótico (BORNSLAEGER e SCHULTZ, 1985; EPPIG, 1993). Em bovinos, a adenilato ciclase (AC) foi localizada nas células do cumulus, principalmente nas células em contato com o oócito (KUYT et al., 1988). Sugere-se, também, que o próprio oócito produz seu próprio AMPc a partir de um receptor para proteína G na membrana plasmática dele mesmo, que estimula a Gs, uma proteína ligada à proteína G, a ativar a AC (MEHLMANN et al., 2002; 2004). O receptor acoplado à Gs (GPR3) foi identificado como um regulador essencial do bloqueio meiótico em oócitos de camundongos (MEHLMANN et al., 2004). Esse receptor exibe um alto grau de atividade constitutiva quando expresso em várias linhas celulares, resultando em um aumento na produção de AMPc (UHLENBROCK et al., 2002), indicando que ele está ligado à Gs. A atividade constitutiva do GRP3 no oócito é suficiente para produzir a quantidade de AMPc requerida para o bloqueio meiótico. Tem sido mostrado que existem ainda substâncias que têm o papel de inibir a maturação de oócitos, tais como, purinas (DOWNS et al., 1985), esteróides (EPPIG et al., 1983) e guanosina monofosfato cíclica (GMPc) (HUBBARD e TERRANOVA, 1982; DOWS e EPPIG, 1984; TORNELL et al., 1990; TORNELL et al., 1991; DOWNS, 1993). Concentrações elevada de GMPc pode inibir a maturação espontânea em oócitos de ratas (TORNELL et al., 1990) e também inibir a atividade da fosfodiesterase- AMPc (AMPc-PDE) no oócito, elevando as concentrações de AMPc (BORNSLAEGER et al., 1984). Segundo TORNELL et al. (1990), as concentrações de GMPc diminuem em paralelo à maturação de oócitos em ratas, mas os mecanismos que controlam esta produção ainda não são claros. No entanto, num estudo feito por HUBBARD e PRICE

30 11 (1988) e EPPIG et al. (2004), sugere-se que o GMPc diminua a concentração de AMPc pela ativação da fosfodiesterase AMPc do oócito de hamster, permitindo que o processo de maturação oocitária continue. A proteína cinase A (PKA), uma enzima que pertence ao grupo das MAP cinases (MAPK) de membrana, é dependente de AMPc (MOCHLY-ROSEN, 1995), ou seja, intercede na ação do AMPc nas células pela fosforilação de proteínas alvo (STRÖMSTEDT e BYSKOV, 1999), fazendo parte da cascata de transdução de sinal, incluindo a AC e AMPc-PDE. A AC converte o ATP para o AMPc e esta atividade é controlada pela proteínas-g de membrana. Uma vez produzido, o AMPc se liga às subunidades regulatórias da PKA. Porém, para balancear os níveis intracelulares de AMPc, a AMPc-PDE transforma AMPc em 5, - AMPc, que, por sua vez, é ineficiente para a atividade da PKA (MOCHLY-ROSEN, 1995). Segundo DOWNS e HUNZICKER- DUNN (1995), a ativação da isoenzima tipo I (uma isoenzima da PKA) do oócito mantém o bloqueio meiótico. Em oócitos de hamsters, a atividade da PKA também parece ser necessária para manter o bloqueio meiótico e a inibição da PKA induz a retomada meiótica (HELLEKANT e BAVISTER, 1996a). Assim, estes eventos estão relacionados com o papel da PKA e tem sido proposto que, em oócitos de bovinos, a subunidade regulatória da PKA poderia modular o processo de transcrição nas células do cumulus e a subunidade catalítica poderia manter o bloqueio meiótico, fosforilando proteínas importantes deste mecanismo de regulação (HELLEKANT e BAVISTER, 1996b) Proteínas envolvidas no controle do ciclo celular O ciclo celular em células animais consiste em um ciclo de replicação do DNA cromossômico na fase S que procede ao estádio completo de diplóteno da primeira prófase e é detida na diacinese. Este estádio corresponde à fase G 2 do ciclo celular e é caracterizado por cromossomos difusos cercados por uma membrana nuclear intacta chamada vesícula germinativa (VG). O reinício da meiose, onde ocorre um crescimento total dos oócitos após a puberdade, representa a transição da fase G 2 para a fase M e envolve a condensação da cromatina, a VGBD, formação do fuso mitótico e segregação do cromossomo replicado em núcleos filhos na fase M (DEKEL, 1995; 1999).

31 12 A regulação da divisão do ciclo celular tem sido o assunto de muitos estudos durante os últimos anos (MURRAY e HUNT, 1993; DOREE e HUNT, 2002). Entre os reguladores do ciclo celular, as cinases dependentes de ciclinas exercem um papel central no início e na ordenação dos eventos do ciclo celular, ou seja, regulam a progressão das fases G 1, S, G 2 e M (GOULD, 1995; GRANA e REDDY, 1995; MORGAN, 1995; PINES, 1995; KNOCKAERT et al., 2002). Inúmeros estudos vêm mostrando que os eventos ocorridos no processo de maturação nuclear são acompanhados por mudanças específicas na fosforilação de proteínas controladas por enzimas que são modificadas pela transdução de sinais (WANG e LIU, 2004). Uma enzima importante é o fator promotor da maturação (MPF), a qual pertence ao grupo de proteínas cinases dependentes de ciclinas (MASUI e MARKERT, 1971). O MPF é uma proteína cinase que consiste de duas subunidades, uma cinase p34 cdc2 catalítica e uma ciclina B regulatória (ALBERTS et al., 1997; MOTLIK et al., 1999; DOREE e HUNT, 2002). A atividade do complexo ocorre na entrada da fase-m, ou seja, quando há o rompimento da VG marcando o final da prófase I, mas requer a desfosforilação da p34 cdc2 cinase com remoção dos fósforos da treonina 14 e tirosina 15 (JOSEFSBERG et al., 2001; VAILLANT et al., 2001). Um rápido declínio na atividade do MPF ocorre durante o período de transição entre a MI e MII. O MPF é reativado rapidamente para entrar na MII e mantido em altas concentrações durante a MII (Figura 02) (BRUNET e MARO, 2005). A desfosforilação da forma p34 cdc2 (forma ativa) presente em oócitos retidos na fase G 2 desaparece logo após o início da meiose com nenhuma mudança até a MII (POLANSKI e KUBIAK, 1999). O processo da condensação dos cromossomos durante a fase M, em muitas espécies, é acompanhado por fosforilações da histona H1 e da histona H3, que são substratos do MPF (KUBELKA et al., 2000). A atividade cinase da histona H1, que está alta durante a MI e MII, diminuiu com a extrusão do corpúsculo polar. Estes resultados sugerem que, na maturação de oócitos de mamíferos, a desfosforilação da p34 cdc2 dispara esta ativação na primeira metáfase (POLANSKI e KUBIAK, 1999).

32 13 VGBD Pro-metáfase e metáfase I Metáfase II Fertilização Figura 02: Atividades do MPF e MAPK durante a maturação nuclear. A atividade do MPF está representada em linha vermelha e a atividade da MAPK em linha verde (BRUNET e MARO, 2005). Alguns estudos mostram que a atividade do MPF é encontrada na divisão mitótica das células, pois parece controlar a transição da G2 para a fase M, tanto na meiose quanto na mitose (POLANSKI e KUBIAK, 1999; BRUNET e MARO, 2005). O início da ativação do MPF ocorre em cerca de 7 h (progressão VG MI) após o inicio da maturação in vitro e alcança um pico ao término da primeira fase M (MI, 12 h). Posteriormente, ocorre um declínio em sua atividade durante a transição entre a MI e MII. Esse fator é reativado para entrar na MII e mantido em níveis altos durante o segundo bloqueio em MII (24 h) (POLANSKI e KUBIAK, 1999, KUBELKA et al., 2000; LEDAN et al., 2001). Segundo VERDE et al. (1990) e KIM et al. (2000), o MPF regula diretamente algumas mudanças morfológicas que ocorrem durante a fase M. Por exemplo, o MPF pode converter o estado de intérfase dos microtúbulos para uma configuração de metáfase in vitro. Porém, a relação entre a condensação dos cromossomos durante a fase M e a ativação do MPF ainda apresenta algumas controvérsias (KUBELKA et al., 2000; BRUNET e MARO, 2005). Recentemente, tem sido sugerido que o fator-chave que controla a meiose é a síntese de ciclina B (SIRARD et al., 1998; BRUNET e MARO, 2005). Sugere-se, também, que os níveis de p34 cdc2 não mudam na maturação de oócitos bovinos, em

33 14 contraste, a ciclina B está ausente em oócitos bovinos no momento de sua liberação do folículo, mas ela é sintetizada durante a maturação do mesmo, ou seja, após a VGBD, a síntese de ciclina B aumenta progressivamente, alcançando a concentração máxima no final da primeira fase M, associando-se imediatamente com a p34 cdc2 para formar um complexo ativo (LEDAN et al., 2001). A degradação da ciclina B é requerida durante a extrusão do primeiro corpúsculo polar (TERRET et al., 2003). Assim, a atividade do MPF é regulada pelo mecanismo de transição dependente que determina a concentração da síntese de ciclina (BRUNET e MARO, 2005). A injeção da proteína ciclina B1 humana em oócitos bovinos tratados com ciclohexamida dá início à retomada meiótica (LEVESQUE e SIRARD, 1996). Em camundongos, a síntese de ciclina B1 controla a duração da primeira fase M meiótica (POLANSKI et al., 1999). Em porcas, há uma quantidade extremamente pequena de pré-mpf na VG do oócito (NAITO et al., 1995). A ativação do MPF não é dependente da amplificação autocatalítica, mas requer atividade de síntese da proteína (FULKA et al., 1988). Segundo SUN et al. (2001a), há evidências de que a síntese de ciclina B1 determina a habilidade do oócito de porcas retomar a meiose. Um segundo grupo importante de enzimas envolvidas na retomada da meiose são as proteínas da família das cinases ativadas por mitógenos, ou seja, as MAPK de membrana. Estas enzimas são ativadas por transdução de sinais específicos provenientes de sinais extracelulares. A ativação do MPF e da MAPK está temporalmente relacionada com a progressão da meiose (MASUI e MARKERT, 1971; SUN et al., 1999; JONES, 2004). As MAPK são os principais componentes celulares que controlam a embriogênese, diferenciação celular, proliferação celular e morte celular (PEARSON et al., 2001). Essas proteínas pertencem a uma família de serina/treonina cinases que são reguladas por uma cascata de fosforilação, ativadas pela MAPKK (MAP cinasescinases, ativadora da MAPK) que fosforila os resíduos de tirosina e serina da MAPK (KUBELKA et al., 2000; LU et al., 2001; PEARSON et al., 2001). A atividade da MAPK pode ser associada à ativação do MPF. Paralelamente com o MPF, a ativação da MAPK ocorre em torno das 8 h e apresenta um aumento gradual, alcançando valores máximos entre h e mantendo-se assim até completar as 24 h de maturação in vitro em oócitos bovinos (KUBELKA et al., 2000; JONES, 2004).

34 15 A parada do oócito na MII é causada, provavelmente, por dois fatores: o MPF e o fator citostático (CSF) (LIU et al., 1998). O CSF é uma proteína citoplasmática que também está envolvida na regulação dos processos de maturação (CHA e CHIAN, 1998; LIU e YANG, 1999; KUBELKA et al., 2000). A oncoproteína C-mos cinase e a MAP cinase são componentes do CSF, que, provavelmente, fazem parte da retroalimentação positiva entre o MPF, C-mos e a cascata de MAPK, que são importantes para a maturação do oócito e parada do mesmo em MII (GOTOH et al., 1995; FISHER et al., 2000; VIVEIROS et al., 2001; VAILLANT et al., 2001). A C-mos é uma MAPKKK (MAP cinases-cinases-cinases) que ativa a MAPKK, que, por sua vez, ativa MAPK, que implica na parada do oócito em MII (GOTOH et al., 1995; KUBELKA et al., 2000; VAILLANT et al., 2001). Já o CSF é o responsável por manter um nível elevado de MPF, e, portanto, a retenção em MII. A MAPK contribui para estabilizar a atividade ciclina B/cdk2 cinase (MOTLIK et al., 1999), mantendo o MPF em níveis elevados (JOSEFSBERG e et al., 2002) Células do cumulus As células da granulosa do cumulus desempenham um importante papel na manutenção e controle da função ovariana. Elas contribuem para a formação do folículo ovariano e fornecem um micro-ambiente e cito-arquitetura próprios para o desenvolvimento do oócito. Segundo SUN et al. (2001a), as células do cumulus e gonadotrofinas não são requeridas para a retomada da meiose, mas são necessárias tanto para a maturação nuclear quanto para a citoplasmática. Os efeitos das gonadotrofinas parecem ser mediados pelas células do cumulus no complexo cumulusoócito (COC) e quando o cumulus foi removido e os oócitos foram cultivados em meio suplementado com gonadotrofinas, somente em 32% havia ocorrido o rompimento da VG e 4,2% concluíram a maturação nuclear. Correspondentemente, as mudanças da maturação citoplasmática, como concentração de ciclina B1, fosforilação da MAPK e migração dos grânulos corticais foram também bloqueados. Durante o desenvolvimento folicular, as células da granulosa podem se comunicar umas com as outras e com o oócito via junções comunicantes (GILULA et al., 1978). Esses canais permitem a passagem de moléculas de baixo peso molecular

35 16 incluindo nutrientes (piruvato), precursores metabólicos (aminoácidos e nucleotídeos) (WASSARMAM, 1988) e moléculas envolvidas com a sinalização celular, como o AMPc, que pode regular a manutenção do bloqueio da meiose do oócito (LAWRENCE et al., 1978; TORNELL et al., 1991). Em ratos, a retomada da meiose tem sido correlacionada com a diminuição das junções comunicantes das células do cumulus (SUN et al., 2001a). Em bovinos, a mesma correlação tem sido observada, mas as junções comunicantes se mantêm funcionais até a MII (SUTOVSKY et al., 1993). Esta rede de junções comunicantes une as células murais com as antrais e do cumulus com o oócito, formando um sincício funcional e estrutural. Segundo os estudos, esta comunicação exerce um importante papel durante a maturação do oócito pelo sustento da maturação citoplasmática necessária para o subseqüente desenvolvimento posterior à fertilização in vitro (NAGAI et al., 1993; ALI e SIRARD, 2002 a,b). Tem sido mostrado que a remoção das células do cumulus antes da maturação in vitro é prejudicial para a maturação do oócito em vaca (CHIAN e NIWA, 1994). A importância das células do cumulus durante a maturação in vitro é, provavelmente, atribuída à função das junções comunicantes e suas específicas capacidades metabólicas (TANGHE et al., 2002). Assim, a comunicação via junções comunicantes é o pilar para as interações celulares que controlam as funções foliculares, principalmente aquelas reguladas por sinais endócrinos, parácrinos e/ou autócrinos (EPPIG, 1991). A resposta ao LH da rede de comunicação juncional vem sendo analisada. Estes estudos mostram que a proteína da junção comunicante, a conexina 43 (Cx43), sofre fosforilação/desfosforilação 10 min após a exposição ao LH, mudando a conformação da proteína e, assim, diminuindo a ligação entre o oócito e as células do cumulus. Posteriormente, o efeito se traduz em diminuição da expressão do RNAm da Cx43 (KNOBIL e NEILL, 1998). A expansão das últimas camadas de células durante a segunda metade da maturação in vitro limita a comunicação entre as células do cumulus e o oócito (MATTIOLI e BARBONI, 2000). Sabe-se, também, que esta queda da regulação da comunicação das junções comunicantes é um pré-requisito para a expansão do cumulus e que não há comunicação entre as células quando a expansão no cumulus já ocorreu (BUCCIONE et al., 1990). ALI et al. (2005), em um trabalho realizado em oócitos bovinos maturados in vitro, mostrou que a expansão inicial das células do

36 17 cumulus, causando um rompimento das junções comunicantes, teve uma grande influência no subseqüente desenvolvimento do oócito GDF-9 (fator de crescimento e diferenciação do tipo 9) Após o surgimento do pico de LH, as conexões intracelulares entre o oócito e as células do cumulus são rompidas, mas essas células já possuem capacidade de alcançar o processo de expansão de suas camadas ao redor do oócito, influenciando diretamente na ovulação e na subseqüente fertilização. As características da expansão das células do cumulus incluem a secreção do ácido hialurônico pelas próprias células e a expressão de outras proteínas requeridas para a formação e retenção da matriz (FULOP et al., 2003). Estudos recentes têm mostrado que alguns fatores de crescimento e diferenciação, como o GDF-9, estão associados com o desenvolvimento folicular no ovário de mamíferos (JAYAWARDANA et al., 2006), promovendo a expansão in vitro das células do cumulus (VANDERRHYDEN et al., 2003) e que alguns distúrbios na comunicação entre o oócito e as células somáticas, tanto no período pré-ovulatório quanto no pós-ovulatório, pode resultar numa baixa fertilidade (PANGAS et al., 2005). Uma vez sintetizado no oócito, o GDF-9 chega nas células da granulosa e se liga a receptores específicos, como o BMPRII, receptores de ativina (AcTRIIA ou AcTRIIB), e receptores do tipo I (ALK-3, ALK-5 e ALK-6) na membrana dessas células (AOKI et al., 2001). Em bovinos, alguns receptores como o ALK-3, ALK-6 e BMPRII têm sido identificados (BODENSTEINER et al., 1999; GLISTER et al., 2004;). Isso sugere que o GDF-9 pode precisamente controlar o processo de expansão das células do cumulus, influenciando na fase de maturação final de oócitos mamíferos (HAYASHI et al., 1999; AALTONEN et al., 1999; McKENZIE et al., 2004; PANGAS e MATZUK, 2005; JAYAWARDANA et al., 2006). A expressão da GDF-9 tem sido encontrada em oócitos de roedores (HAYASHI et al., 1999), em ovários suínos (SHIMIZU et al., 2004a), ovinos, bovinos (BODENSTEINER et al., 1999) e humanos (AALTONEN et al., 1999). Segundo SHIMIZU et al. (2004a), a injeção direta do gene GDF-9 em ovário de suínos promoveu o desenvolvimento folicular e, de acordo com VITT et al. (2000a), o tratamento GDF-9

37 18 melhorou o crescimento de folículos pré-antrais e primários, tanto in vivo quanto in vitro e GLISTER et al. (2004) observaram que o GDF-9 promoveu a proliferação das células da granulosa, pois se ligou a receptores específicos da membrana das células da granulosa de oócitos bovinos Hormônios esteróides: progesterona (P 4 ) e 17β-estradiol (E 2 ) O papel dos esteróides na retomada da meiose em mamíferos tem sido examinado com dois objetivos: ver se alguns dos esteróides servem como inibidores da meiose oocitária e se eles mediam a ação das gonadotrofinas na estimulação da meiose (TSAFRIRI et al., 2005). Durante o desenvolvimento folicular, o retorno da meiose é iniciado por uma onda pré-ovulatória de LH e só ocorre em oócitos que já tenham completado o seu crescimento e adquirido competência meiótica. Durante o período entre a onda de LH e a ovulação, o oócito passa por uma série de transformações no núcleo e no citoplasma. A onda de LH estimula uma mudança na síntese de esteróides feita pelas células da granulosa, sendo que a síntese do E 2 tem uma queda significativa, enquanto a concentração de P 4 começa a se elevar e se torna mais marcante momentos antes da ovulação. A inibição da síntese de LH ou o bloqueio dos seus receptores provocam falhas na maturação e na ovulação, sendo que os receptores para LH estão presentes somente nas células somáticas do folículo. Desse modo, os sinais que disparam a maturação chegam ao oócito por meio das células da granulosa (VAN DEN HURK e ZHAO, 2005). Em bovinos, o pico de LH inibe a produção de androstenediona pelas células da teca e induz a luteinização das células da granulosa murais. Este processo é refletido pela concentração de esteróides no fluido folicular, que mostra que alta concentração de E 2 ao redor de 1µg/ml antes e até 6 h após a concentração máximo de LH (pico pré-ovulatório) ocorre após um declínio na concentração de E 2. Este fenômeno é seguido pelo aumento gradual da progesterona cerca de 20 h após o pico de LH. Apesar do declínio da concentração de E 2 ocorrer concomitantemente com a GVBD, não há evidência de que o E 2 esteja envolvido na retomada da meiose (DIELEMAN et al., 1983).

38 19 Os receptores esteróides realmente se localizavam na membrana do oócito, fazendo parte do processo de maturação nuclear e citoplasmática, mediando a sinalização de outros sistemas, incluindo, por exemplo, o efeito da indução pelo P 4 na ativação da MAPK e da enos no tecido cardíaco e em células endoteliais, respectivamente (SHAUL, 2002). Em xenopus, foi observada a ação dos receptores de P 4 na maturação oocitária, demonstrando que eles têm participação neste processo (TIAN et al., 2000; BAGOWSKI et al., 2001). A presença de esteróides no fluido folicular antes e também durante a maturação sugere que esses hormônios (P 4 e E 2 ) sejam importantes para a maturação nuclear e citoplasmática. Embora tenham sido feitos vários trabalhos nessa linha, os resultados são inconsistentes e a função desses hormônios na maturação ainda gera controvérsias (LI et al., 2004). Segundo EPPIG e KOIDE (1978), a adição de E 2 no meio de maturação reduziu a taxa de maturação de oócitos com as células do cumulus e desnudos em oócitos de camundongos. Para avaliar o efeito dos esteróides na maturação dos oócitos, estudos recentes foram conduzidos usando-se oócitos de camundongas tratadas com gonadotrofinas e com um inibidor da fosfodiesterase (IBMX). Foi observado que tanto a testosterona quanto o E 2 foram capazes de potencializar um sinal inibitório e promover a VGBD, assim como a ativação da CDK1 e MAPK de uma maneira dose-dependente (HAMMES, 2004). Segundo ALI et al. 2004, a adição de E 2 ao meio de maturação provocou aumento na produção de blastocistos em bovinos. Também em bovinos, KIM et al. (1995) mostraram que a adição de E 2 no meio de maturação não alterou os índices de maturação e a formação de blastocistos, enquanto que BEKER et al. (2002) concluíram que a suplementação com E 2 no meio de maturação livre de SFB afetou negativamente a retomada da meiose, com diminuição na proporção de oócitos em MII e pelo aumento na ocorrência de aberrações nucleares, como também no subseqüente desenvolvimento embrionário, diminuindo a taxa de balstocistos. JAYAWARDANA et al. (2006) observaram que o E 2, juntamente com o FSH, está envolvido na expressão do GDF-9, que é um dos principais fatores secretados pelo oócito que está envolvido no processo de expansão das células do cumulus durante a maturação.

39 20 Vários trabalhos têm demonstrado que a P 4 tem sido um importante mediador da maturação de oócitos de Xenopus (WANG e LIU, 2004; HAMMES, 2004), de suínos (LI et al., 2004), ratas (DAVE et al., 1997) e de bovinos (FATEHI et al., 2002). Segundo WANG e LIU (2004), a P 4 está envolvida na retomada da meiose, diminuindo as concentrações de AMPc. No entanto, ainda há algumas controvérsias em relação aos níveis de AMPc durante a maturação do oócito induzida pela P 4. DUCKWORTH et al. (2002) demonstraram que a P 4 diminui a atividade da PKA, ativando o MPF, e por fim, a MAPK. O uso de P 4 nos meios de maturação não é uma prática comum, e, além disso, também tem sido mostrado que a sua adição nos meios de maturação é desnecessária (DODE e GRAVES, 2002; LI et al., 2004). Se esses hormônios esteróides são importantes para a maturação, provavelmente as células do cumulus os sintetizam em quantidades suficientes (DODE e GRAVES, 2002). MINGOTI et al. (2002) demonstraram que as células de COCs bovinos possuem a capacidade de secretar E 2 e P 4 no meio de cultura definido durante a maturação in vitro. WANG et al. (2006) demonstraram que a inibição da secreção de esteróides pela adição de aminoglutatimida (AGT, um inibidor da cadeia de clivagem do colesterol) no meio de maturação preveniu a maturação e expansão das células do cumulus em oócitos bovinos, e que seu efeito inibitório não foi revertido pela adição de E 2 e P 4 nesse meio. Essas evidências mostram que os hormônios esteróides secretados pelo COC durante o cultivo têm efeito significativo na maturação oocitária in vitro, contudo mais estudos são necessários para se avaliar o seu papel em bovinos Óxido nítrico O óxido nítrico (NO) é um radical livre (YAMAUCHI et al., 1997) sintetizado via oxidação da L-arginina em NO e L-citrulina (MONCADA et al., 1991; NATHAN, 1992), catalisada por três diferentes isoformas de NOS (NO sintase), dependendo do tecido de origem, assim como nas propriedades funcionais: 1) NOS neuronal (nnos), 2) NOS endotelial (enos), que são constitutivas (cnos) e são capazes de liberar NO em pequenas quantidades por períodos curtos em resposta ao estímulo no receptor (PALMER et al., 1998) e 3) NOS induzível (inos), que é expressada, principalmente,

40 21 em resposta a citocinas inflamatórias e lipopolissacarídeos (MORRIS e BILLIAR, 1994; VAN VOORHIS et al., 1995; ZACKRISSON et al., 1996; JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997; NAKAMURA et al., 1999) e responsável pela produção de NO em alta concentração por um período prolongado. Tanto a nnos quanto a enos são cálcio/calmodulina dependentes durante sua ativação (SNYDER, 1995). O aumento do cálcio intracelular desencadeia uma cascata de eventos ativando a cnos e a síntese de NO. O cálcio intracelular se liga à calmodulina para formar um complexo cálicio-calmodulina e regula a ligação da calmodulina ao alelo dominante, permitindo a transferência de elétrons do NADPH via grupamento flavina, cujo sítio ativo contém domínio heme redutase, facilitando a conversão do O 2 e L-arginina em NO e L-citrulina (SIDDHANTA et al., 1996). O NO gerado por essas isoformas participa de várias respostas fisiológicas, por exemplo, neurotransmissão e manutenção do tônus vascular (DAWSON e DAWSON, 1996). Já a inos é cálcio independente e contém calmodulina para cada subunidade da enzima e sua ativação não requer um aumento intracelular de cálcio e resulta na permanente ativação da enzima (CHO et al., 1992). O NO liberado por esta enzima está envolvido na vasodilatação patológica e danificação dos tecidos (KILBOURN et al., 1990). Além do cálcio, vários outros fatores podem regular a atividade da NOS. Mecanismos pré e pós-transducionais e transcripcionais têm sido mostrados por regular a expressão de todas as isoformas da NOS (KELLY et al., 1996). Apesar da inos ser citosólica, a cnos possui um sítio para miristilação, possibilitando sua ligação na membrana da célula (BUSCONI e MICHEL, 1993). A fosforilação da cnos pela proteína cinase C e A está associada com o desligamento da enzima e perda da atividade (MICHEL et al., 1993). Segundo GELLER et al. (1993), existem sitios de fosforilação na inos, mas nenhuma significância funcional tem sido demonstrada. Estudos mostram que a atividade da NOS é dependente de uma variedade de substratos e co-fatores como NADPH, flavina mononucleotídeo (FMN), flavina adenina dinucleotídeo (FAD) e tetrahidrobiopterina (THB) e a disponibilidade desses co-fatores determina o padrão de síntese de NO pelas células. A ativação máxima de NOS requer NADPH, FAD, FMN, THB e thiol reduzido. Isto implica que a atividade dos caminhos metabólicos que geram ou competem com esses co-fatores, sob condições fisiológicas e patológicas, poderia exercer um importante papel na determinação da taxa de NO

41 22 celular. A síntese de NADPH tem sido demonstrada por ser co-induzida com a inos. Além disso, a atividade da geração da NADPH pelo caminho das pentoses e da taxa limitante da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, em particular, tem sido correlacionada com a produção de NO (MORRIS e BILLAR, 1994). A glicose, então, estimula a síntese de NADPH via caminho das pentoses fosfatos, que, por sua vez, favorecem a conversão da L-arginina em L-citrulina (BLACHIER et al., 1991). Diversos efeitos na citotoxidade celular podem ser causados pelo NO, mas seu efeito é mais complexo em relação à apoptose. A morte celular mediada pela apoptose é controlada por sinais celulares específicos. O NO pode tanto proteger quanto mediar esse tipo de morte celular, dependendo do tipo da célula e de sua concentração. A proteção pode ocorrer em diferentes condições. Por exemplo, o NO protege os hepatócitos in vivo da apoptose induzida pelo TNFα (BOHLINGER et al., 1995) e também os folículos ovarianos da degeneração causada pela atresia em ratas (CHUN et al., 1995). Por outro lado, o NO participa na apoptose de neurônios corticais, macrófagos (TERENZI et al., 1995) e células pancreáticas, entre outros (MESSMER et al., 1994). A morte celular mediada pelo NO em macrófagos é inibida por antagonistas dos fatores ativadores das proteínas cinase A e C, sugerindo que a transdução de sinais por meio destas proteínas está envolvida no mecanismo de ação do NO, que leva à apoptose (MESSMER et al., 1995). Contudo, este mecanismo nunca foi estudado no sistema reprodutor de bovinos. Um dos primeiros alvos para a ação citotóxica do NO é a mitocôndria (MONCADA et al., 1991). A inibição da mitocôndria mediada pelo NO parece ter um componente reversível e irreversível. O NO pode interagir diretamente com a citocromo c oxidase para inibir reversivelmente a respiração celular (LISDERO et al., 1996; SHIVA et al., 2001) e esta interação ocorre quando o NO se encontra em altas concentrações. Entretanto, como ocorre em condições inflamatórias, o complexo I (NADH-ubiquinona oxidoredutase) e o complexo II (succinato-ubiquinona oxidoredutase) são, irreversivelmente, inibidos pelo NO (BROWN, 1995). O NO pode atuar por meio da sua ligação com radicais livres levando à inativação do O - 2, prevenindo, assim, a toxidade celular. No entanto, em condições - apropriadas, a reação do NO com O 2 pode resultar na formação do peroxinitrito (ONOO-), um potente oxidante (BECKMAN e CROW, 1993). Esses achados

42 23 demonstram que a ação do NO na célula depende da sua concentração, seu estado reduzido, e da abundância de metais, proteínas e tiols de baixo peso molecular, como a glutationa. A solubilidade máxima do NO na água é semelhante à do oxigênio puro. Ele é considerado uma molécula polar que se difunde livremente através das membranas. Na presença de tecidos biológicos, a meia-vida do NO é de 3 a 5 segundos (MONCADA et al., 1991; IGNARRO, et al., 1993; BLASHKIV et al., 2001). Numerosas interações químicas nas células ou tecidos podem ocorrer mesmo com esta meia-vida tão curta, incluindo reações com O 2, ânion superóxido e outros radicais derivados de O 2 e - - oxihemoproteínas (IGNARRO et al., 1993). A mensuração de NO 2 e de NO 3 em soluções aquosas é utilizada para prover uma estimativa indireta do NO endógeno (ARCHEOR, 1993) Óxido nítrico no sistema ovariano O óxido nítrico é gerado por várias células ovarianas e no interior dos vasos sangüíneos ovariana; macrófagos residentes neste local também têm sido indicados como uma possível fonte de NO em ratas (DAVE et al., 1997). O sistema NOS/NO ovariano exerce papel na regulação da esteroidogênese (OLSON et al, 1996; JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1998; MITHELL et al., 2004), na morte apoptótica das células (CHUN et al, 1995; YAMAGATA et al., 2002), na ovulação (DIXIT e PARVIZI, 2001; YAMAGATA et al., 2002; LUKAS et al., 2002), na maturação meiótica in vivo (JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1998; JABLONKA-SHARIFF et al, 1999a) e in vitro (SENGOKU et al., 2001; MATTA et al., 2001; NAKAMURA et al., 2002; GOUD et al., 2005; HUO et al., 2005; VIANA et al., 2003) e no desenvolvimento embrionário inicial (SENGOKU et al., 2001; BLASHKIV et al., 2001; LUKAS et al., 2002; YANG et al., 2005). Das três isoenzimas de NOS, os ovários de ratas expressam a enos e a inos, mas não a nnos (VAN VOORHIS et al., 1995; ZACKRISSON et al., 1996; JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997; NAKAMURA et al., 1999). A expressão da enos aumenta depois do surgimento de LH ou da injeção de hcg (VAN VOORHIS et al., 1995; JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997; NAKAMURA et al., 1999). Foi

43 24 observada a presença da enos na região periférica de oócitos de ratas por meio de estudos imunocitoquímicos de folículos imaturos estimulados por gonadotrofinas (JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997). Em camundongos, foi observado que, na ausência da enos, a maturação meiótica foi prejudicada (JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1998). Usando a análise por transcrição reversa, ou seja, a reação em cadeia de polimerase (RT-PCR) e Western blotting, foi demonstrado por HATTORI et al. (2000, 2001) que oócitos de porca apresentavam alto conteúdo de proteína enos. Sob condições basais, a enos constantemente produz pequenas quantidades de NO, mas um aumento na síntese pode ocorrer se estimulado pela elevação do Ca 2+ ou, talvez, ativado por fosforilação devido à sinalização parácrina. Embora as mudanças da expressão da inos durante os processo citados acima sejam controversas (VAN VOORHIS et al., 1995; ZACKRISSON et al., 1996; JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997; MATSUMI et al., 1998a; NAKAMURA et al., 1999) e o papel do NO derivado da inos não esteja tão bem estabelecido, estudos indicam que a expressão, tanto da inos quanto da enos, é regulada por gonadotrofinas (JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997). A produção de NO nas células ovarianas de ratas é ativamente estimulada pela interleucina-1, assim como por várias citocinas inflamatórias. Tem sido demonstrado que a inos pode ser induzida pelo fator de necrose tumoral (TNFα), estimulando, assim, o GMPc (MATSUMI et al., 1998a). Segundo ANTEBY et al. (1996), num estudo realizado em fluido folicular de humanos, a geração de NO (medido pelas concentrações basais de nitrito e nitrato) aumentou tanto com os níveis de estradiol quanto com o tamanho do folículo. Estas observações sugerem que há uma possível relação entre E 2 com a concentração de NO, assim como em suínos (GRASSELI et al., 1998), como em bovinos (BASINI et al., 1998). Vários fármacos que inibem a síntese de NO vêm sendo utilizados em estudos sobre a fisiologia ovariana, como, por exemplo, a aminoguanidina (AG), que inibe seletivamente a produção de NO pela inibição da enzima inos (CORBETT et al., 1992; NAKAMURA et al., 2002; TAO et al., 2004; 2005; HUO et al., 2005). Este inibidor da síntese de NO é estruturalmente similar à L-arginina por apresentar dois grupos nitrogênio guanidina equivalentes quimicamente e competitivamente inibem a síntese de NO (CORBETT et al., 1992).

44 Papel do óxido nítrico na maturação oocitária No processo de maturação oocitária, várias pesquisas indicam que o NO inibe (camundongos, JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1998; ratas, JABLONKA-SHARIFF et al., 1999a; NAKAMURA et al., 2002) ou estimula (camundongos, SENGOKU et al., 2001; BLASHKIV et al., 2001; BU et al., 2004; HUO et al., 2005; suínos, TAO et al., 2004; 2005; bovinos, MATTA et al., 2001; 2002; VIANA et al., 2005) a maturação nuclear, dependendo de sua concentração. Um mecanismo pelo qual o NO pode participar na maturação oocitária envolve a regulação da síntese de nucleotídeos cíclicos. O NO é conhecido como regulador da guanilato ciclase (MILLER et al., 2003) e estimula a produção de GMPc em células alvo (NATHAN, 1992). Nucleotídeos cíclicos sintetizados pelas células do cumulus têm sido reconhecidos como importantes moduladores da maturação de oócitos (TORNELL et al., 1991). O óxido nítrico se liga e ativa a guanilato ciclase e aumenta a concentração de GMPc nas células alvo. O GMPc foi localizado nas células da granulosa de ovários de ratas e está envolvido na retomada da meiose (TORNELL et al., 1991). Sua influência na sinalização celular é através da ativação ou inibição de fosfodiesterases (PDE). Existem 11 famílias conhecidas da PDE, e a atividade da PDE classe 3, expressa no oócito, é inibida pelo GMPc (CONTI et al., 1995). Alguns estudos mostram que o GMPc aumenta os níveis de AMPc pela inativação da fosfodiesterase AMPc do tipo 3 (AMPc- PDE3), resultando no aumento da concentração de AMPc, impedindo a retomada da meiose (KURTZ et al., 1998). MATTA et al. (2001), pela primeira vez na literatura, demonstraram que o inibidor da síntese de NO (L-NAME), nas concentrações utilizadas na maturação in vitro de oócitos bovinos, não inibiu a meiose. Observaram, também, que a maturação citoplasmática é mais sensível do que a nuclear a concentrações reduzidas de NO no meio de maturação e que o NO está envolvido na regulação da concentração de proteínas, possivelmente relacionadas com a inibição da maturação citoplasmática e, conseqüentemente, com o desenvolvimento embrionário inicial. Além disso, MATTA et al. (2002) comprovaram que a utilização de concentrações mais elevadas de L-NAME resultou numa menor taxa de oócitos em MII após 24h de cultivo e que os oócitos que

45 26 não alcançaram a MII apresentaram-se degenerados com alterações no rearranjo dos cromossomos, sugerindo que concentrações adequadas de NO são essenciais para que a maturação nuclear de oócitos bovinos in vitro ocorra. YAMAGATA et al. (2002) sugeriram que a diminuição da produção de NO derivado da inos pode exercer um papel importante na maturação nuclear do oócito de ratas. Ainda neste estudo, foi verificado que o inibidor da inos diminuiu a produção de GMPc em folículos pré-ovulatórios e que a adição de um doador de NO bloqueou esta supressão, sugerindo que o NO derivado da inos produz alta concentração de GMPc nestes folículos, capaz de inibir o processo de maturação meiótica em oócitos de ratas. O GMPc mantém a parada meiótica de oócitos de folículos pré-ovulatórios por meio de 2 vias: uma envolvendo a sustentação dos níveis de AMPc pela inibição da AMPc-PDE no oócito e outra envolvendo a ativação da proteína cinase dependente de GMPc (TORNELL et al., 1991). A MAPK exerce um papel importante na maturação inicial de oócitos mamíferos (FISSORE et al., 1996; YAMASHITA et al., 2000) e o interessante é que o NO inibe a atividade da MAPK via geração de GMPc via tirosina cinase (INGRAM et al., 2000). Segundo DHAUNSI et al. (1997), o NO inibe diretamente a MAPK via ativação da tirosina cinase, mas esses mecanismos ainda não são totamente conhecidos. Estudos realizados por HUO et al. (2005), em camundongos, utilizando AG nas concentrações de 1, 10 e 50 mm revelaram a localização subcelular da inos nos diferentes estádios da maturação meiótica e na fertilização, usando microscopia confocal e micro-injeção de anticorpo específico da AG e por meio da inibição específica da inos e concluíram que há uma localização específica da inos no oócito maturado. Em oócitos em estádio de VG, a imunoreatividade da inos foi principalmente localizada na VG. Logo após da VGBD, inos acumulou-se ao redor dos cromossomos condensados. Na MI e MII, já com a organização da placa equatorial dos cromossomos, a inos estava concentrada ao redor dos cromossomos alinhados. O acúmulo da inos na região do fuso não pôde ser detectado nas fase A e na fase T, estava concentrada entre os cromossomos separados. O processo de VGBD e da liberação do primeiro corpúsculo polar foi, significantemente, inibido pela AG de uma maneira dosedependente, ou seja, quando utilizaram a concentração de 50 mm de AG observaram que houve uma completa inibição da VGBD, além de terem visto que essa

46 27 concentração também inibiu, completamente, a fosforilação da MAPK, sugerindo que o NO derivado da inos exerce um papel crucial na maturação meiótica de oócitos de camundongos. Outros trabalhos também mostraram que a AG inibiu o processo de retomada da meiose (NAKAMURA et al., 2002; TAO et al., 2004; 2005) e que inibidores da NOS também influenciam a maturação do oócito em ratas (JABLONKA-SHARIFF et al., 1999a; NAKAMURA et al., 2002) e em coelhas (YAMAUCHI et al., 1997). Segundo NAKAMURA et al. (2002), num experimento feito com oócitos de ratas, foi observado que, quando eles utilizaram as concentrações de 10 e 100 mm de AG, houve um significante aumento na porcentagem de oócitos com estádio de VG, inibindo a retomada da meiose e que esse efeito foi revertido quando adicionaram NO no meio de cultura (500 µm de SNAP, s-nitroso-l-acetil penicilamina, um doador de NO), sugerindo que o NO derivado da inos seja um inibidor da maturação meiótica de oócitos de ratas. Foi também observado que a AG diminuiu a produção de GMPc em folículos préovulatórios e que a adição de SNAP bloqueou esta supressão. Em suínos, foi observado que 10 mm de AG inibiu o rompimento da VG (TAO et al., 2004; 2005).

47 28 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AALTONEN, J., LAITINEN, M. P., VUOJOLAINEN, K., JAATINEN, R., HORELLI- KUITUNEN, N., SEPPÄ, L., LOUHIO, H., TUURI, T., SJÖBERG, J., BÜTZOW, R., HOVATTA, O., DALE, L., RITVOS, O. (1999) Human Growth Differentiation Factor 9 (GDF-9) and Its Novel Homolog GDF-9B Are Expressed in Oocytes during Early Folliculogenesis. J. Clin. Endocr. Metab. 84, ALBERIO, R.; KUBELKA, M.; ZAKHARTCHENKO, V.; HAJDÚCH, M.; WOLF, E.; MOTLIK, J. (2000) Activation of bovine oocytes by specific inhibition of cyclin dependent kinases. Mol. Reprod. Dev. 55, ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J. D. (1997) Biologia Molecular da Célula. Tradução de Amauri Braga Simonetti. Artes Medicas, 3ª ed. Porto Alegre, 1294p. ALI, A. T. E. F., PARADIS, F., VIGNEAULT, C., SIRARD, M. A. (2005) The potential role of gap junction communication between cumulus cells and bovine oocytes uring in vitro maturation. Mol. Reprod. Dev. 71, ALI, A., SIRARD, M.A., (2002a) Effect of the absence or presence of various protein supplements on further development of bovine oocytes during in vitro maturation. Biol. Reprod. 66,

48 29 ALI, A., SIRARD, M.A., (2002b) The effects of 17beta-estradiol and protein supplement on the response to purified and recombinant follicle stimulating hormone in bovine oocytes. Zygote 10, ANTEBY, E. Y., HURWITZ, A., KORACH, O., REVEL, A., SIMON, A., FINCIYEHESKEL, Z., MAYER, M., LAUFER, N. (1996) Human follicular nitric oxide pathway: Relationship to follicular size, oestradiol concentrations and ovarian blood flow. Hum. Reprod. 11, AOKI, H., FUJII, M., IMAMURA, T., TAKEHARA, K., KATO, M., MIYAZONO, K. (2001) Synergistic effects of different bone morphogenetic protein type I receptors on alkaline phosphatase induction. J Cel. Sci. 114, ARCHEOR, S (1993) Measurement of NO in biological models. FASEB J., 7: BAGOWSKI, C.P.; MYERS, J.W.; FERRELL, Jr. J.E. (2001) The classical progesterone receptor associates with p42 MAPK and is involved in phosphatidylinositol 3-kinase signaling in Xenopus oocytes. J. Biol. Chem. 276, BASINI, G., BARATTA, M., PONDERATO, N., BUSSOLATI, S. & TAMANINI, C. (1998) Is nitric oxide an autocrine modulator of bovine cumulus cell function? Reprod. Fertil. Dev. 10, BECKMAN, J.S., CROW, J.P. (1993). Pathological implications of nitric oxide, superoxide and peroxynitrite formation. Biochem. Soc Trans. 21, BEKER, A.R. C. L., COLENBRANDER, B.; BEVERS, M.M. (2002) Effect of 17betaestradiol on the in vitro maturation of bovine oocyte. Theriogenology, 58, BILODEAU, S., FORTIER, M. A., SIRARD, M. A. (1993) Effect of adenylate cyclase stimulation on meiotic resumption and cyclic AMP content of zona-free and cumulusenclosed bovine oocytes in vitro. J. Reprod. Fertil, 97, BLACHIER, F., RABET-TOUIL, H. M., DARCY-VRILLON, B., POSHO, I., DUCE, P. H. (1991) Stimulation by D-glucose of the direct conversion of arginine to citrulline in enterocytes isolated from pig jejunum. Bioch. Bioph. Res Comm. 177,

49 30 BLASHKIV, V.T., KORNIICHUK, N. A., VOZNESENSKAYA, Yu.T., PORNICHENKO, G. A. (2001) Role of nitric oxide in ovulation, meiotic maturation of oocytes, and implantation in mice. Bol. Exp. Biol. Med. 132, BODENSTEINER, K. J., CLAY, C. M., MOELLER, C. L., SAWER, H. R. (1999) Molecular cloning of the ovine Growth/Differentiation factor-9 gene and expression of growth/differentiation factor-9 in ovine and bovine ovaries. Biol. Reprod. 60, BOHLINGER, I., LEIST, M., BARSIG, J., UHLIG, S., TIEGS, G., WENDEL, A. (1995) Tolerance against tumor necrosis factor alpha (TNF)-induced hepatotoxicity in mice: the role of nitric oxide. Toxicol. Let , BORNSLAEGER, E., SCHUITZ, R. (1985) Regulation of mouse oocyte maturation: effect of elevating cumulusi cell camp on oocyte camp levels. Biol. Reprod. 33, BROWN, G.C. (1995) Nitric oxide regulates mitochondrial respiration and cell finctions by inhibiting cytochrome oxidase. FEBS Let. 369, BRUNET, S., MARO, B. (2005) Cytoskeleton and cell cycle control during meiotic maturation of the mouse oocyte: integrating time and space. Reproduction 130, BU, S., XIE, H., TAO, Y., WANG, J. XIA, G. (2004) Nitric oxide influences the maturation of cumulus cell-enclosed mouse oocytes cultured in spontaneous maturation medium and hypoxanthine-supplemented medium through different signaling pathways. Mol. Cel. Endocr. 223, BU, S.M., XIA, G.L., TAO, Y., LEI, L. & ZHOU. B. (2003) Dual effects of nitric oxide on meiotic maturation of mouse cumulus cell-enclosed oocytes in vitro. Mol. Cel. Endocl. 207, BUCCIONE, B., VANDERHYDEN, B. C., CARON, P. J., EPPIG, J. J. (1990) FSHinduced expansion of the mouse cumulus oophorus in vitro is dependent upon a specific factor(s) secreted by the oocyte. Dev. Biol. 1381, BUSCON, I. L., MICHEL, T. (1993) Endothelial nitric oxide synthase. N-terminal myristoylation determines subcellular localization. J Biol Chem. 268,

50 31 CHA, K-Y.; CHIAN, R-C. (1998) Maturation in vitro of immature human oocytes for clinical use. Hum. Reprod. 4, CHEUNG, W. M., HUI, W. S., CHU, P.W., CHIU, S. W., IP, N. Y. (2000) Ganoderma extract activates MAP kinases and induces the neuronal differentiation of rat pheochromocytoma PC12 cells. FEBS Let. 486, CHIAN, R. C., NIWA, K. (1994) Effect of cumulus cells present during different period of culture on maturation in vitro of bovine oocytes. Theriogenology, 41, 176. CHO, H. J., KIE, Q., CALAYCAY, J. (1992) Calmodulin is a subunit of nitric oxide synthase from macrophages. J. Exp. Med. 176, CHUN, S. Y. EISENHAUER, K. M., KUBO, M., HSUEH, A.J.W. (1995) Interleukin-1β supresses apoptosis in rat ovarian follicles by increasing nitric oxide production. Endocrinology 136, CONTI, M., NEMOZ, G., SETTE, C., VICINI, E. (1995) Recent progress in understanding the hormonal regulation of phosphodiesterases. Endocr. Rev. 16, CORBETT, J. A., TILTON, R. G., CHANG, K., HASAN, K. S., IDO, Y., WANG, J. L., SWEETLAND, M. A., LANCASTER, J. R. Jr., WILLIAMSON, J. R., McDANIEL, M. L. (1992) Aminoguanidine, a novel inhibitor of nitric oxide formation, prevents diabetic vascular dysfunction. Diabetes 41, CRAN, D. G., ESPER, C. R. (1990) Cortical granules and the cortical reaction in mammals. J. Reprod. Fertil. 42, DANDEKAR, P., MATE, K. E., TALBOT, P. (1995) Perivitelline space of marsupial oocyte: extracellular matrix of the unfertilized oocyte and formation of a cortical granule envelop folloing the cortical reaction. Mol. Reprod. Dev. 41, DANDEKAR, P., TALBOT, P. (1992) Perivitelline space of mammalian oocytes: extracellular matrix of unfertilized oocytes and formation of a cortical granule envelope following fertilization. Mol. Reprod. Dev. 41, DAVE, S., FARRANCE, D. P., WHITEHEAD, S. A. (1997) Evidence that nitric oxide inhibits steroidogenesis in cultured rat granulosa cells. Clin Sci. 92,

51 32 DAWSON, V. L., DAWSON, T. M. (1996) Nitric oxide actions in neurochemistry. Neuroch. Int. 29, DEKEL, N. (1995) Molecular control of meiosis.trend. Endocr. Metab., 6: DEKEL, N. (1999) Meiotic cell cycle, oocyte. Encyclotedia of Reproduction. cattle. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 24, DEKEL, N., GALIANI, D., SHERIZLY, I. (1988) Dissociation between the inhibitory and the stimulatory action of camp on maturation of rat oocytes. Mol. Cel. Endocr. 56, DENG, M.; WILLIAMS, C.J.; SCHULTZ, R.M. (2005) Role of MAP kinase and myosin light chain kinase in chromosome-induced development of mouse egg polarity. Dev. Biol. 278, DHAUNSI, G. S., MATTHEWS, C., KAUR, K., HASSID, A. (1997) NO increases protein tyrosine phosphatase activity in smooth muscle cells: relationship to antimitogenesis. Am. J. Physiol. 272, HI342-HI349. DIELEMAN, S. J., BEVERS, U. M., POORTMA, J., VAN TOL, H. T. M. (1983) Steroid and pituitary hormone concentrations in the fluid of preovulatory bovine follicles relative to the peak of LH in the peripheral blood. J. Reprod. Fertil. 69: DIXIT, D. V., PARVIZI, N. (2001) Nitric oxide and the control of reproduction. Anim. Reprod. Sci., 65, DODE, M. A. N. ; Graves, C.N. (2002) Involvement of steroid hormones on in vitro maturation of pig oocytes. Theriogenology 57, DODE, M. A. N., GRAVES, C. N. (2003) Role of estradiol-17β on nuclear and cytoplasmic maturation of pig oocytes. Anim. Reprod. Sci. 78, DOREE, M., HUNT, T. (2002) From Cdc2 to Cdk1: when did the cell cycle kinase join its cyclin partner? J. Cel. Sci. 115, DOWNS, S. M. (1993) Factors affecting the resumption of meiotic maturation in mammalian oocytes. Theriogenology 39,

52 33 DOWNS, S. M., COLEMAN, D. L., WARD-BAILEY, P.F., EPPIG, J. J. (1985) Hypoxanthine is the principal inhibitor of murine oocyte maturation in a low molecular weight fraction of porcine follicular fluid. Proc. Natl. Acad. Sci. 82, DOWNS, S. M., EPPIG, J. J. (1984) Cyclic adenosine-monophosphate and ovarian follicular-fluid act synergistically to inhibit mouse oocyte maturation. Endocrinology 114, DOWNS, S. M., HUNZICKER-DUNN, M. (1995) Differencial regulation of oocyte maturation and cumulus expanion in the mouse oocyte-cumulus cell complex by siteselective analogs of cyclic adenosine monophosphate. Dev. Biol. 172, DUCIBELLA, T. (1996) The cortical reation and development of activation competence in mammalian oocyte. Hum. Reprod. 2, DUCKWORTH, B. C., WEAVERS, J. S., RUDERMAN, J. V. (2002) G2 arrest in Xenopus oocytes depends on phosphorylation of cdc25 by protein kinase A. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, EPPIG, J. J. (1991) Intercommunication between mammalian oocyte and companion somatic cells. Biol. Essays, 13, EPPIG, J. J. (1993) Regulation of mammalian oocyte maturation. The Ovary. New York. Raven Press EPPIG, J. J., FRETER, R., WARD-BAILEY, P.F., SCHULTZ, R. M. (1983) Inhibition of oocyte maturation in the mouse: participation of camp, steroid hormones, and a putative maturation-inhibitory factor. Dev. Biol. 100, EPPIG, J. J., KOIDE, S.L. (1978) Effects of prostaglandine and oestradiol-17beta on the spontanea meiotic mataration of mouse oocytes. J. Reprod. Fertil. 53, EPPIG, J.J.; VIVIEROS, M.M.; MARIN-BIVENS, C.; DE LA FUENTE, R. (2004) Regulation of mamalian oocyte maturation. In The Ovary, Eds PCK Leung & EY Adashi. Amsterdam: Elsevier Academic Press pp FAIR T. (2003). Follicular oocyte growth and acquisition of developmental competence. Anim. Reprod. Sci. 78,

53 34 FATEHI, A. N., ZEINSTRA, E. C., KOOIJ, R. V., COLENBRANDER, B., BEVERS, M. M. (2002) Effect of cumulus cell removal of in vitro matured bovine oocytes prior to in vitro fertilization on subsequent cleavage rate. Theriogenology 57, FISHER, D. L., MANDART, E., DORÉE, M. (2000) Hsp 90 is required for c-mos activation and biphasic MAP kinase activation in Xenopus oocytes. EMB. J. 19, FISSORE, R. A., HE, C. L., VANDE WOUDE, G. F. (1996) Potential role of mitogenactivated protein kinase during meiosis resumption in bovine oocytes. Biol. Reprod. 55, FULKA, J., Jr., FLECHON, J., E., MOTLIK, J., (1988) Does autocatalytic amplification of maturation-promoting factor (MPF) exist in mammalian oocyte? Gam. Res. 21, GALLI, C., LAZZARI, G. (2005) Embryo technologies in dairy cattle. The 26th European Holstein and Red Holstein Conference. Session 3, GELLER, D. A., LOWENSTEIN, C. J., SHAPIRO, R. A. (1993) Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from human hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 90, GILULA, N. B., EPSTEIN, M. L., BEERS, W. H. (1978) Cell-to-cell communication and ovulation. A study of the cumulus-oocyte complex. J. Cel. Biol. 78, GLISTER, C., KEMP, C. F., KNIGHT, P. G. (2004) Bone morphogenetic protein (BMP) ligands and receptors in bovine ovarian follicle cells: actions of BMP-4, -6 and -7 on granulosa cells and differential modulation of smad-1 phosphorylation by follistatin. Reproduction 127, GOTOH, Y.; MASUYAMA, M.; DELL, K.; SHIRAKABE, K.; NISHIDA, E. (1995) Initiation of xenopus oocyte maturation by activation of the mitogen-activated protein kinase cascade. J. Biol. Chem. 270, GOUD, A. P., GOUD, P. T., DIAMOND, M. P., ABU-SOUD, H. M. (2005) Nitric oxide delays oocyte aging. Biochemistry 44, GOULD, K. L. (1995) Protein kinases. IRL Press: Oxford

54 35 GRANA, X., REDDY, E. P. (1995) Cell cycle control in mammalian cells: role of cyclins, cyclin dependent kinases (CDKs), growth supressor genes and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). Oncogene 11, GRASSELLI, F., PONDERATO, N., SALERI, R., TAMANINI, C. (1998) Nitri oxide production in swine granulosa cells. Domestic Animal Reproduction, Conf. European Soc., Keszthely, Hungary, 2, 67. GUIXUE, Z., LUCIANO, A. M., COENEN, K., GANDOLFI, F., SIRARD, M. A. (2001) The influence of camp before or during bovine oocyte maturation on embryonic developmental competence. Theriogenology 55, HAMMES, S.R. (2004) Steroids and oocyte maturation a new look at an old story. Mol. Endocr. 18, HATTORI, M. A., NISHIDA, N., TAKESUE, K., KATO, Y., FUJIHARA, N. (2000) FSH suppression of nitric oxide synthesis in porcine oocytes. J. Mol. Endocri., 24, HATTORI, M. A., TAKESUE, K., KATO, Y., FUJIHARA, N. (2001) Expression of endothelial nitric oxide synthase gene in the porcine oocyte and its possible function. Mol. Cel. Biochem. 219, HELLEKANT, T.A.R., BAVISTER, B. D. (1996a) Precocious oocyte maturation is induced by an inhibitor of camp-dependent protein kinase in the intact golden hamster. Mol. Reprod. Dev. 44, HUBBARD, C. J., PRICE, J. (1988) The effects of follicle-stimulating hormone and cyclic guanosine 3, 5 -monophosphate and cyclic adenosine 3 5 -monophosphatephosphodiesterase and resumption of meiosis in hamster cumulus-oocyte complexes. Biol. Reprod. 39, HUBBARD, C. J., TERRANOVA, P. F. (1982) Inhibition action of cyclic guanosine 5, - phosphoric acid (GMP) on oocyte maturation: dependence on an intact cumulus. Biol. Reprod. 26, HUO, J. L., LIANG, C. G., YU, L. Z., ZONG, Z. S., YANG, Z. M, FANT, H. Y, CHEN, D. Y., SUN, Q. Y. (2005) Inducible nitric oxide synthase-derived nitric oxide regulates

55 36 germinal vesicle breakdown and first polar body emission in the mouse oocyte. Reproduction 129, HYTTEL, P.; FAIR, T.; CALLESEN, H.; GREVE, T. (1997) Oocyte growth capacitation and final maturation in cattle. Theriogenology 47, IGNARRO, L. J., FUKUTO, J. M., GRISCAVAGE, J. M., et al. (1993) Oxidation of nitricoxide in aqueous-solution to nitrite but not nitrate-comparison with enzymatically formed nitri-oxide from L-arginine. P. Natl. Acad. Sci. 90, INGRAM, A. J., JAMES, L., CAI, L., THAI, K., LY, H., SCHOLEY, J. W. (2000) NO inhibits stretch-induced MAPK activity by cytoskeletal disruption. J. Biol. Biochem. 275, JABLONKA-SHARIFF, A., BASURAY, R., OLSON, L. M. (1999a) Inhibitors of nitric oxide synthase influence oocyte maturation in rats. J. Soc.. Gyn. Inv. 6, JABLONKA-SHARIFF, A., OLSON, L. M. (1998) The role of nitric oxide in oocyte meiotic maturation and ovulation: meiotic abnormalities of endothelial nitric oxide synthase knock-out mouse oocytes. Endocrinology 139, JABLONKA-SHARIFF, A., OLSON, L.M., (1997) Hormonal regulation of nitric oxide synthases and their cell-specific expression during follicular development in the rat ovary. Endocrinology 138, JAYAWARDANA, B., SHIMIZU, T., NISHIMOTO, H., KANEKO, E., TETSUKA, M., MIYAMOTO, A. (2006) Hormonal regulation of expression of growth differentiation factor-9 receptor type I and II genes in the bovine ovarian follicle. Reproduction 131, JONES, K.T. (2004) Turning it on and off: M-phase promoting factor during meiotic maturation and fertilization. Mol. Hum. Reprod. 10, 1-5. JOSEFSBERG, L. B-Y., KAUFMAN, O., GALIANI, D., KOVO, M., DEKEL, N. (2001) Inactivation of M-phase promoting factor at exit from first embryonic mitosis in the rat is independent of cyclin B1 degradation. Biol. Reprod. 64, KELLY, R. A., BALLIGAND, J. L, SMITH, T. N. (1996) Nitric oxide and cardiac function. Circ. Res. 79,

56 37 KHATIR, H.; CAROLAN, C.; LONERGAN, P.; MERMILLOD, P. (1997) Characterization of calf follicular fluid and its ability to support cytoplasmic maturation of cow and calf oocytes. J. Reprod. Fertil. 111: KHATIR, H.; LONERGAN, P.; MERMILLOD, P. (1998) Kinetics of nuclear maturation and profiles of oocytes from prepubertal and adult cattle during in vitro maturation. Theriogenology 50, KILBOURN, R. G., GROSS, S. S., JUBRAN, A., ADAMS, J., GRIFFTH, O. W., LEVI, R., LODATO, R. F. (1990) N G - methyl-l-arginine inhibits tumor necrosis factor-induced hypotension: implications for the involvement of nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, KIM, N-H.; CHO, S. K.; CHOI, S. H.; KIM, E. Y.; PARK, S. PILL.; LIM, J. H. (2000) The distribution and requirements of microtubules an microfilaments in bovine oocytes in vitro maturation. Zygote 8, KIM, N-H.; FUNAHASHI, H.; PRATHER, R. S.; SCHATTEN, G.; DAY, B. N. (1996) Microtubule and microfilament dynamics in porcine oocytes during meiotic maturation. Mol. Reprod. Dev. 43, KITO, S., BAVISTER, B. D. (1997) Gonadotropins, serum, and amino acids alter nuclear maturation, cumulus expansion, and oocyte morphology in hamster cumulus-oocyte complexes in vitro. Biol. Reprod. 56: KNOBIL, E., NEILL, J.D. (1998) Encyclopedia of Reproduction. San Diego, Academic Press. KNOCKAERT, M., GREENGARD, P., MEIJER, L. (2002) Pharmacological inhibitors of cyclin-dependent kinases. Trend. Pharmacol. Sci. 23, KUBELKA, M.; MOTLIK, J.; SCHULTZ, R. M.; PAVLOK, A. (2000) Butyrolactone I reversibly inhibits meiotic maturation of bovine oocytes, without influencing chromosome condensation activity. Biol. Reprod. 62, KURTZ, A.; GOTZ, K.H.; HAMANN, M.; WAGNER, C. (1998) Stimulation of rnin secretion by nitric oxide is mediated by phosphodiesterase 3. Proc. Nat. Acad. Sci. 95,

57 38 KUYT, J. R.M., KRUIP, T. A. M., De JONG-BRINK, M. (1988) Cytochemical localization of adenylate cyclase in bovine cumulus-oocyte complexes. Exp. Cel. Res. 174, LAWRENCE, T. S., BEERS, W. H., GILULA, N. B. (1978) Transmission of hormonal stimulation by cell-to-cell communication. Nature 272, LEDAN, E.; POLANSKI, Z.; TERRET, M-E.; MARO, B. (2001) Meiotic Maturation of the Mouse Oocyte Requires an Equilibrium between Cyclin B Synthesis and Degradation. Dev. Biol. 232, LEVESQUE, J. T., SIRARD, M. A. (1996) Ressumption of meiosis is initiated by the acumulation of ciclin B in bovine oocyte. Biol. Reprod. 55, LI, Q., NIWA, K., HUNTER, M. G. (2004) Effects of 17β-Estradiol on in vitro maturation of pig oocytes in protein-free medium. J. Reprod. Dev. 50, LISDERO, C.; RIOBO, N.; SCHOPFER, F.; BOVERIS, A. (1996) Nitric oxide inhibits electron transfer and increases superoxide radical production in rat heart mitochondrial and submitochondrial particles. Arch. Biochem. Biophs. 328, LIU, L., YANG, X. (1999) Interplay of Maturation-Promoting Factor and Mitogen- Activated Protein Kinase Inactivation during Metaphase-to-Interphase Transition of Activated Bovine Oocytes. Biol. Reprod. 61, 1 7. LIU, L.; JU, J. C.; YANG, X. (1998) Differential inactivation of maturation-promoting factor and mitogen-activated protein kinase following parthenogenetic activation of bovine oocytes. Biol. Reprod. 59, LONERGAM, P., KHATIR, H., CAROLAN, C., MERMILLOD, P (1997) Bovine blastocyste production in vitro after inhibition of oocyte meiotic resumption for 24 h. J. Reprod. Fertil. 109, LU, Q., SMITH, G. D., CHEN, D-Y., YANG, Z., HAN, Z-M., SCHATTEN, H., SUN, Q-Y. (2001) Phosphorylation of mitogen activated protein kinase is regulated by protein kinase C, cyclic 3,5 -adenosine monophosphate, and protein phosphatase modulators during meioses resumption in rat oocytes. Biol. Reprod. 64,

58 39 LUKAS, A., HEFLER, M. D., ANTHONYR. G. (2002) Iducible and endothelial nitric oxide synthase: genetic background affects ovulation in mice. Reprod. Biol. 77, MASUI, Y., MARKERT, C. L. (1971) Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocyte. J. Exp. Zool.117, MATSUMI, H., YANO, T., KOJI, T., OGURA, T., TSUTSUMI, O., TAKETANI, Y., ESUMI, H. (1998a) Expression and localization of inducible nitric oxide synthase in the rat ovary: a possible involvement of nitric oxide in the follicular development. Biochem. Bioph. Res. Com. 243, MATTA, S. G. C., BUSSIERE, M. C. C., VIANA, K. S., QUIRINO, C. R. (2002) Efeito de diferentes concentrações do inibidor da síntese de óxido nítrico na maturação nuclear in vitro de oócitos bovinos. Ver. Bras. Reprod. Animal 26, MATTA, S.G.C.; BUSSIERE, M. C. C.; FAES, M. R.; ADONA, P. R.; CARVALHO, C. S. P.; DOMINGUES, S. F. S.; DOMINGUES, S. J. S.; VIANA, K. S.; ANTUNES- RODRIGUES, J. (2001) Efeito de diferentes concentrações do inibidor da síntese de óxido nítrico na maturação in vitro de oócitos bovinos. In: Congresso de Integração em Biologia da Reprodução, FMRP, São Paulo. MATTIOLI, M., BARBONI, B. (2000) Signal transduction mechanism for LH in cumulusoocyte complex. Mol. Cel. Endocr. 161, MAYES, M. A. e SIRARD, M. A. (2001) The influence of cumulus-oocyte complex morphology and meiotic inhibitors on the kinetics of nuclear maturation in cattle. Theriogenology 55, McKENZIE, L. J., PANGAS, S. A., CARSON, S. A., KOVANCI, E., CISNEROS, P., BUSTER, J. E., AMATO, P., MATZUK, M. M.. (2004) Human cumulus granulosa cell gene expression: a predictor of fertilization and embryo selection in women undergoing IVF. Hum. Reprod. 19, MEHLMANN, L.M.; JONES, T.L.; JAFFE, L.A. (2002) Meiotic arrest in the mouse follicle maintained by a Gs protein in the oocyte. Science 297,

59 40 MEHLMANN, L.M.; SAEKI, Y.; TANAKA, S.; BRENNAN, T.J.; EVSIKOV, A.V.; PENDOLA, F.L.; KNOWLES, B.B.; EPPIG, J.J. (2004) The Gs-linked receptor GPR3 maintains meiotic arrest in mammalian oocytes. Science 306, MESSMER, U.K.; ANKARCRONA, M.; NICOTERA, P.; BRUNE, B. (1994) p53 Expression in nitric oxide-induced apoptosis. FEBS Let. 355, MESSMER, U.K.; LAPETINA, E.G.; BRUNE, B. (1995) Nitric oxide-induced apoptosis in RAW macrophages is antagonized by protein kinase C- and protein kinase A- activating compounds. Mol. Pharm. 47, MICHEL, T., LI, G. K., BUSCONI, L. (1993) Phosphorylation and subcellular translocation of endothelial nitric oxide synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. 90, MICTHELL, L. M., KENNEDY, C. R., HARTSHORNE, G. M. (2004) Expression of nitric oxide synthase and effect of substrate manipulation of the nitric oxide pathway in mouse ovarian follicles. Hum. Reprod.19, MILLER, L. N., NAKANE, M., HSIEH, G. C., CHANG, R., KOLASA, T., MORELAND, R. B., BRIONI, J-D. (2003) A : A novel activator of soluble guanylyl cyclase. Life Sci. 72, MINGOTI, G.Z.; GARCIA, J.M.; ROSA-E-SILVA, A.A. (2002) Steroidogenesis in cumulus cells of bovine cumulus-oocyte-complexes matured in vitro with BSA and different concentrations of steroids. Anim. Reprod. Sci. 69, MOCHLY-ROSEN, D. (1995) Localization of protein kinase by anchoring proteins: A theme is signal transduction. Science 268, MONCADA, S., PALMER, R. M. J., HIGGS, E. A. (1991) Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharm. Rev. 43, MORGAN, D. O. (1995) Principles of CDK regulation. Nature 374, MORRIS, S. M., and BILLAR, T. R. (1994) New insights into the regulation of inducible nitric oxide synthesis Am. J. Physiol. 266, E829-E839. MOTLIK, J.; ALBERIO, R.; KUBELKA, M. (1999) Ativação dos oócitos mamíferos como um passo essencial para novas biotecnologias. Arq. Fac. Vet. 27, , (supl.).

60 41 MURRAY, A., HUNT, T. (1993) The cell cycle an introduction. W. H. Freeman and Company: New York. NAGAI, T., DING, J., MOOR, R. M. (1993) Effect of follicle cells and steroigenosis on maturation and fertilization in vitro of pig oocytes. Exp. Zool. 266, NAITO, K., HAWKINS, C.YAMASHITA, M., NAGAHAMA, Y., AOKI, F., KOHMOTO, K., TOYODA, M., MOOR, R. M. (1995) Association of p34cdc2 and ciclin B1 during meiotic maturation in porcine oocytes. Dev. Biol. 168, NAKAMURA, Y., KASHIDA, S., NAKATA, M. TAKIGUCHI, S. YAMAGATA, Y., TAKAYAMA, H., SUGINO, N., KATO, H. (1999) Changes in nitric oxide synthase activity in the ovary of gonadotropin treated rats: the role of nitric oxide during ovulation. Endocrinology 46, NAKAMURA, Y., YAMAGATA, SUGINO, N., TAKAYAMA, H., KATO, H. (2002) Nitric oxide inhibits oocyte meiotic maturation. Biol. Reprod. 67, NATHAN C. (1992) Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J. 6, OLSON, L. M., JONES-BURTON, C. M., JABLONKA-SHARIFF, A. (1996) Nitric oxide decreases estradiol synthesis in rat luteal cells in vitro: possible role for nitric oxide in functional luteal regression. Endocrinology 137, OU, Y., RATTNER, J. B. (2004) The centrosome in higher organisms: structure, composition, and duplication. Int. Rev. Cytol. 238, PALMER, R. M. J., ASHTON, D. S., MONCADA, S. (1998) Vascular endotelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature 333, PANGAS, S. A., MATZUK, M. M. (2005) The art and artifact of GDF9 activity: cumulus expansion and the cumulus expansion-enabling factor. Biol. Reprod. 73, PEARSON, G., ROBINSON, F., GIBSON, T. B., XU, B-E., KARANDIKAR, M., BERMAN, K., COBB, M. H. (2001) Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions. Endocr. Rev. 22, PINES, J. (1995) Cyclins and cyclin-dependent kinases: a biochemical review. Biochem. J. 308,

61 42 PLACHOT, M., CROZET, N. (1992) Fertilization abnormalities in human in vitro fertilization. Hum. Reprod. 1, POLANSKI, Z., KUBIAK, J. Z. (1999) Meiosis. Encycl. Reprod. 3, RISOS, D., WARD, F., DUFFY, P., BOLAND, M. P., LONERGAN, P. (2002) Consequences of bovine oocyte maturation, fertilization or early embryo development in vitro versus in vivo: implications for blastocyst yield and blastocyst quality. Mol. Reprod. Dev. 61, ROTH, Z.; HANSEN, P.J. (2005) Disruption of nuclear maturation and rearrangement of citoskeletal events in bovine oocytes exposed to heat shock during maturation. Reproduction 129, SCHENK, J. L., SUH B, T. K., SEIDEL JR., G. E. (2006) Embryo production from superovulated cattle following insemination of sexed sperm. Theriogenology 65, SENGOKU, K., TAKUMA, N., HORIKAWA, M., TSUCHIYA, K.; KOMORI, H.; SHARIFA, D.; TAMATE, K.; ISHIKAWA, M. (2001) Requirement of nitric oxide for murine oocyte maturation, embryo development, and trophoblast outgrowth in vitro. Mol. Reprod. Dev. 58, SHAUL, P.W. (2002) Regulation of endothelial nitric oxide synthase: location, location, location. Annu. Rev. Physiol. 64, SHIMADA, M., TERADA, T. (2002) FSH and LH induce progesterone production and progesterone receptor synthesis in cumulus cells: a requirement for meiotic resumption in porcine oocytes. Mol. Hum. Reprod. 8, SHIMIZU, T., MIYAHAYASHI, Y., YOKOO, M., HOSHINO, Y, SASADA, H., SATO, E. (2004a) Molecular cloning of porcine growth differentiation factor 9 (GDF-9) cdna and its role in early folliculogenesis: direct ovarian injection of GDF-9 gene fragments promotes early folliculogenesis. Reproduction 128, SHIVA, S.; BROOKES, P.S.; PATEL, R.P.; ANDERSON, P.G.; DARLEY-USMAR, V.M. (2001) Nitric oxide partitioning into mitochondrial membranes and the control of respiration at cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. 98,

62 43 SIDDHANTA, U., WU, C., ABU-SOUD, H.M. (1996) Heme iron reduction and catalysis by a nitric oxide synthase heterodimer containing one reductase and two oxygenase domains. J. Biol. Chem. 271, SIRARD, M. A.; RICHARD, F.; MAYES, M. (1998) Controlling meiotic resumption in bovine oocytes: a review. Theriogenology 49, SIRARD, M.A.; RICHARD, F.; BLONDIN, P.; ROBERT, C. (2006) Contribution of the oocyte to embryo quality. Theriogenology 65, SNYDER, S. H. (1995) Nitric oxide: NO endothelial NO. Nature 377, STOJKOVIC, M.; MACHADO, S. A.; SOTOJKOVIC, P.; ZAKHARTCHENKO, V.; HUTZLER, P.; GONÇALVES, P. B.; WOLF, E. (2001) Mitochondrial distribution and adenosine triphosphate content of bovine oocytes before and after in vitro maturation: correlation with morphological criteria and developmental capacity after in vitro fertilization and culture. Biol. Reprod. 64, STRÖMSTEDT, M., BYSKOV, G. A. (1999) Oocyte, Mammalian. Encycl. Reprod. 3, SUN, Q.Y.; RUBINSTEIN, S.; BREITBART, H. (1999) MAP kinase activity is downregulated by phorbol ester during mouse oocyte maturation and egg fertilization. Mol. Reprod. Dev. 52, 1-9. SUN, Q.Y.; SCHATTEN, H. (2006) Regulation of dynamic events by microfilaments during oocyte maturation and fertilization. Reproduction 131, SUN, Q.Y.; WU, G.M.; LAI, L.; PARK, K.W.; CABOT, R.; CHEONG, H.T.; DAY, B.N.; PRATHER, R.S.; SCHATTEN, H. (2001a) Translocation of active mitochondria during pig oocyte maturation, fertilization and early embryo development in vitro. Reproduction 122, SUN, Y. Q., LAI, L., BONK, A., PRATHER, S. R., SCHATTEN, H. (2001b) Cytoplasmic changes in relation to nuclear maturation and early embryo developmental potential of porcine oocytes: effects of gonadotropins, cumulus cells, follicular size, and protein synthesis inhibition. Mol. Reprod. Dev. 59,

63 44 SUTOVSKY, P., FLÉCHON, J., FLÉCHO, B., MOTLIK, J., PEYNOT, N., CHESNÉ, P., HEYMAN, Y. (1993) Dymamic changes of gap junctions and cytoskeleton during in vitro culture of cattel oocite cumulus complexes. Biol. Reprod. 49, TALBOT, P., DiCARLANTONIO, G. (1984) The oocyte-cumulus complex: ultrastructure of the extracellular components in hamsters and mice. Gamete 10, TANGHE, S.; VAN SOOM, A.; NAUWYNCK, H.; CORYN, M.; DE KRUIF, A. (2002) Minireview: functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation, and fertilization. Mol. Reprod. Dev. 61, TAO, Y., FU, Z., ZANG, M., XIA, G., YANG, JIE, XIE, H. (2004) Immunohistochemical localization of inducible and endothelial nitric oxide synthase in porcine ovaries and effects of NO on antrum formation and oocyte meiotic maturation. Mol. Cel. Endocr. 222, TAO, Y., XIE, H., HONG, H., CHEN, X., XIA, J. J. G. (2005) Effects of nitric oxide synthase inhibitors on porcine oocyte meiotic maturation. Zygote 13, 1 9. TERENZI, F.; DIAZ-GUERRA, M.J.; CASADO, M.; HORTELANO, S.; LEONI, S.; BOSCA, L. (1995) Bacterial lipopeptides induce nitric oxide synthase and promote apoptosis through nitric oxide-independent path-ways in rat macrophages. J. Biol. Chem. 270, TERRANOVA, P. F., RICE, V. M. (1997) Cytokine involvement in ovarian processes (Review). Am. J. Immunol. 37, TERRET, M. E., WASSMANN, K., WAIZENEGGER, I., MARO, B., PETERS, J. M., VERLHAC, M.H. (2003) The meiosis I-to-meiosis II transition in mouse oocytes requires separase activity. Curr. Biol. 13, TIAN, J.; KIM, S.; HEILIG, E.; RUDERMAN, J.V. (2000) Identification of XPR-1, a progesterone receptor required for Xenopus oocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, TORNELL, J., BILLIG, H., HILLENSJO, T. (1990) Resumption of rat oocyte meiosis is paralleled by a decrease in guanosine 3,,5, -cyclic monophosphate (cgmp) and is inhibited by microinjection of cgmp. Acta Physiol. Scand. 139,

64 45 TORNELL, J., BILLIG, H., HILLENSJO, T. (1991) Regulation of oocyte maturation by changes in ovarian levels of cyclic nucleotides. Hum. Reprod. 6, TSAFRIRI, A., CAO, X., ASHKENAZI, H., MOTOLA, S., POPLIKER, M., POMERANTZ,S. H. (2005) Resumption of oocyte meiosis in mammals: on models, meiosis activating sterois, steroids and EGF-like factors. Mol. Cel. Endocr. 234, UHLENBROCK, K., GASSENHUBER, H.; KOSTENIS, E. (2002) Sphingosine 1- phosphate is a ligand of the human gpr3, gpr6 and gpr12 family of constitutively active G protein-coupled receptors. Cell. Sign. 14: VAILLANT, M. F.; HACCARD, O.; OZON, R.; JESSUS, C. (2001) Interplay between Cdc2 Kinase and the c-mos/mapk Pathway between Metaphase I and Metaphase II in Xenopus Oocytes. Dev. Biol. 231, VAN DEN HURK, R., ZHAO, J. (2005) Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology 63, VAN VOORHIS, B. J., MOORE, K., STRIJBOS, P. J. L. M., NELSON, S., BAYLIS, S. A., GRZYBICKI, D., WEINER, C. P. (1995) Expression and localization of induzible and endothelial nitric oxide synthase in the rat ovary. J. Clin. Inv. 96, VANDERHYDEN, B. C., MACDONALD, E. A., NAGYOVA, E., DHAWAN, A. (2003) Evaluation of members of the TGFbeta superfamily as candidates for the oocyte factors that control mouse cumulus expansion and steroidogenesis. Reprod. Suppl. 61, VEECK, L. L. (1991) Atlas of the Human Oocyte and Early Conceptus. v. 2. WILLIANS and WILKINS, BALTIMORE, MARYLAND, p. 97. VIANA, K. S., CALDAS-BUSSIERE, M. C., MATTA, S.G.C., FAES, M. R., CARVALHO, C. S. P., QUIRINO, C. R. (2006) Effect of sodium nitroprusside, a nitric oxide donor, on the in vitro maturation of bovine oocytes. An. Reprodc. Sci. In press. VIANA, K. S., CALDAS-BUSSIERE, M. C., MATTA, S.G.C., QUIRINO, C. R. (2003) Papel do doador de óxido nítrico na maturação in vitro de oócitos bovinos. CIBR, Ribeirão Preto.

65 46 VITT, U. A., MCGEE, E. A., HAYASHI, M, HSUEH, A. J. (2000a) In vivo treatment with GDF-9 stimulates primordial and primary follicle progression and theca cell marker CYP17 in ovaries of immature rats. Endocrinology 141, VIVEIROS, M. M.; HIRAO, Y.; EPPIG, J. J. (2001) Evidence that protein kinase C (PKC) Participates in the meiosis I to meiosis II transition in mouse oocytes. Dev. Biol. 235, WANG, H.F.; ISOBE, N.; KUMAMOTO, K.; YAMASHIRO, H.; YAMASHITA, Y.; TERADA, T. (2006) Studies os the role os steroid hormone in regulation of oocyte maturation in cattle. Reprod. Biol. Endocr. 4:4. WANG, J., LIU, X. J. (2004) Progesterone inhibits protein kinase A (PKA) in Xenopus oocytes: demonstration of endogenous PKA activities using an expressed substrate. J. Cel. Sci. 117, WASSARMAN, P. M. (1988) Mammalian ovum. In: KNOBIL, E.; NEIL, J. eds. The physiol. Reprod. New York: Raven Press, WESSEL, G. M., CONNER, S. D., BERG, L. (2002) Cortical granule translocation is microfilament mediated and linked to meiotic maturation in the sea urchin oocyte. Development 129, WU, B.; IGNOTZ, G. G.; CURRIC, B. W.; YANG, X. (1996) Temporal distinctions in the synthesis and accumulation of proteins by oocytes and cumulos cells during maturation in vitro of bovine oocytes. Mol. Reprod. Dev. 45, YAMAGATA, Y., NAKAMURA, Y., SUGINO, N., HARADA, A., TAKAYAMA, H., KASHIDA, S., KATO, H. (2002) Alterations in nitrate/nitrite and nitric oxide synthase in preovulatory follicles in gonadotropin-primed immature rat. Endocrin. J. 49, YAMASHITA, M., MITA, K., YOSHIDA, N., KONDO, T. (2000) Molecular mechanisms of the inhitiation of oocyte maturation: general and species-specific aspects. In: MEIJER, L., JEZEQUEL, A., DUCOMMUN, B. (eds.), Progress in cell cycle research. New York. Plenum Publishers 4,

66 47 YAMAUCHI J, MIYAZAKI, T, IWASKI S, KISHI I, KUROSHIMA M, TEI C, YOSHIMA Y. (1997) Effects of nitric oxide on ovulation and ovarian steroidogenesis and prostaglandin production in the rabbit. Endocrinology 138, YANG, J. Z., AJONUMA, L. C., ROWLANDS, D. K., TSANG, L. L., HO, L. S., LAM, S. Y., CHEN, W. Y., ZHOU, C. X., CHUNG, Y. W., CHO, C. Y., TSE, J. Y. H., JANES, A. E., CHAN, H. C. (2005) The role of inducible nitric oxide synthase in gamete interaction and fertilization: A comparative study on knockout mice of three NOS isoforms. Cel. Biol. Intern. 29, YANG, X., KUBOTA, C., SUZUKI, H., TANEJA, M., BOLS, P. E., PRESICCE, G. A. (1998) Control of oocyte maturation in cows biological factors. Theriogenology 49, ZACKRISSON, U., MIKUNI, M., WALIN, A., DELBRO, D., HEDIN, L., BRÄNNSTRÖM, M. (1996) Cell-specific localization of nitric oxide synthases (NOS) in the rat ovary during follicular development, ovulation and luteal formation. Hum. Reprod. 11, ZHENG, Y., (2004) G protein control of microtubule assembly. Annual Reviews of Cel. Develop. Biol. 20,

67 48 4. TRABALHO O trabalho a seguir foi elaborado para futura publicação, segundo as normas da revista: Animal Reproduction Science. Título: Efeito da inibição da enzima óxido nítrico sintase sensível à aminoguanidina na maturação in vitro de oócitos bovinos.

68 49 EFEITO DA INIBIÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE SENSÍVEL À AMINOGUANIDINA NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS RESUMO O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da inibição da enzima óxido nítrico sintase (NOS) sensível à aminoguanidina (AG) na maturação nuclear e citoplasmática in vitro de oócitos bovinos. Os COCs foram cultivados com diferentes concentrações de AG (0, 1, 10 e 100 mm) e 10-5 M de nitroprussiato de sódio (SNP, doador de NO) adicionado a 100 mm de AG, durante 24 h. No experimento 1, foi avaliado o grau da expansão das células do cumulus, o estádio de maturação nuclear, a integridade da membrana plasmática das células do cumulus e do oócito. As concentrações de NO - 2,/NO - 3, P 4 e E 2 foram determinadas no meio de maturação pelo método de Griess e por quiluminescência, respectivamente. A adição de diferentes concentrações de AG no meio de maturação promoveu um efeito dose-resposta na expansão das células do cumulus de COCs bovinos (P<0,05). A adição de 1 e 10 mm de AG no meio de MIV não afetou a integridade da membrana plasmática dos oócitos nem a maturação nuclear (P>0,05), contudo, diminuiu a integridade da membrana das células do cumulus. A concentração de 100 mm inibiu a transição da metáfase I (MI) para a metáfase II (MII), promoveu lesão da membrana plasmática dos oócitos (P<0,05) e aumentou a concentração de NO - 2,/NO - 3 quando comparada com o controle (P<0,05) e com 1 e 10 mm de AG (P>0,05). A adição de 10-5 M de SNP a 100 mm de AG não reverteu os efeitos causados por 100 mm de AG, mas aumentou a concentração de NO - 2 /NO - 3. Nenhuma concentração adicionada ao meio de maturação alterou a concentração de E 2. A adição de 100 mm de AG diminuiu a concentração de P 4 (P<0,05), quando comparada ao controle e demais concentrações. Este efeito foi revertido pela adição de SNP. No experimento 2, foi avaliado o efeito da adição de diferentes concentrações de AG na maturação citoplasmática in vitro pela avaliação da taxa de migração dos grânulos corticais, clivagem e produção de blastocistos. Houve um efeito dose-resposta na migração dos grânulos corticais, onde 1 mm (83,9 ± 6,2%) não diferiu do controle (83,6 ± 8,2%; P>0,05), 10 mm inibiu parcialmente (3,8 ± 6,4%) e 100 mm inibiu totalmente a migração dos grânulos corticais (P<0,05). A adição de SNP (10-5 M) não reverteu o efeito inibitório da migração dos grânulos corticais dos oócitos

69 50 tratados com 100 mm. Somente as concentrações de AG que não inibiram a MIV foram utilizadas para avaliar a taxa de clivagem e produção de blastocistos. A adição de 10 mm de AG no meio de maturação diminuiu (73,0 ± 8,1%; P<0,05) a taxa de clivagem e produção de blastocistos, quando comparada com grupo controle (89,1 ± 3,4%; 37,6 ± 7,3%, respectivamente), mas não diferiu, (P>0,05), do grupo tratado com 1 mm de AG (80,9 ± 8,4%; 41,5 ± 10,5%, respectivamente). Os resultados do presente experimento demonstram que o NO derivado da NOS sensível à AG modula a maturação nuclear e citoplasmática in vitro de oócitos bovinos. Palavras-chave: óxido nítrico, aminoguanidina, maturação nuclear, grânulos corticais, desenvolvimento embrionário inicial. ABSTRACT The aim of the present study was to investigate the effects of inhibition of the enzyme nitric oxide synthase (NOS) sensitive to aminoguanidine (AG) on nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes in vitro. COCs were cultured with different concentrations of AG AG (0, 1, 10 and 100 mm) and to 10-5 M sodium nitroprusside (SNP, NO donor) associated with 100mM AG for 24h. In experiment 1, the degree of cumulus cells expansion, nuclear maturation status and plasma membrane integrity of oocytes and granulosa cells were assessed. NO - 2,/NO - 3, P 4 and E 2 were determined in culture medium by Griess method and chemiluminescence, respectively. Addition of different concentrations of AG to maturation medium promoted a dose-response effect on cumulus expansion (P<0.05). Addition of 1 and 10mM AG to IVM medium did not affect plasma membrane integrity of oocytes or nuclear maturation rates (P>0.05), however, plasma membrane integrity was reduced in cumulus cells. One hundred millimolar inhibited metaphase I (MI) to metaphase II (MII) transition, promoted plasma membrane damage in oocytes (P<0.05) and increased NO - 2,/NO - 3 concentration when compared to controls (P<0.05). Association of 10-5 M SNP to 100mM AG did not reverse the effects of AG, but increased NO - 2 /NO - 3 concentration. None of the AG concentrations tested in maturation medium affected E 2 concentration. Addition of 100mM AG reduced P 4 concentration (P<0.05) when compared to controls and the other concentrations

70 51 used. This effect was reversed by SNP. In experiment 2, the effect of different AG concentrations on cytoplasmic maturation in vitro was assessed based on cortical granules migration, cleavage and blastocyst development rates. There was a doseeffect on cortical granules migration rate, in which 1mM AG (83.9 ± 6.2%) did not differ from control oocytes (83.6 ± 8.2%; P>0.05), but 10mM partially inhibited (3.8 ± 6.4%) and 100mM totally inhibited migration (P<0.05). SNP (10-5 M) did not revert this inhibitory effect on cortical granules migration in oocytes treated with 100mM AG. Only those concentrations that did not inhibit IVM were used to assess cleavage and blastocyst rates. Addition of 10mM AG to IVM medium reduced (73.0 ± 8.1%; P<0.05) cleavage and blastocyst rates when compared with controls (89.1 ± 3.4%; 37.6 ± 7.3%, respectively), but did not differ, (P>0,05), from the group treated with 1mM AG (80.9 ± 8.4%; 41.5 ± 10.5%, respectively). The results from the present study demonstrate that NO derived from NOS sensitive to AG modulates nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes in vitro. Keyword: nitric oxide, aminoguanidine, nuclear maturation, cortical granules, early embryo development. INTRODUÇÃO O controle dos processos envolvidos na maturação do oócito é crítico para as técnicas de reprodução assistida (ART) (FISSORE et al., 2002). As mudanças celulares que ocorrem no oócito durante a maturação e os mecanismos relacionados não são totalmente conhecidos. O envolvimento do NO na maturação in vitro de oócitos bovinos tem sido demonstrado (MATTA et al., 2001; 2002; VIANA et al., 2005; NATORI et al., 2005; SCHWARDZ et al., 2006). O NO é sintetizado pela conversão da L-arginina em L- citrulina e NO, catalizada pela família de isoenzimas conhecida como óxido nítrico sintase (NOS) (MITCHELL et al., 2004; HUO et al., 2005). Duas isoformas constitutivas foram identificadas: endotelial (enos) e neuronal (nnos) e induzível (inos) (TOTZKE et al., 2001). Estudos recentes também mostram que o NO pode ser produzido pela NOS mitocondrial (mtnos) (BUSTAMANTE et al., 2004).

71 52 No processo de maturação oocitária, o NO inibe (camundongos, JABLONKA- SHARIFF e OLSON, 1998; ratas, JABLONKA-SHARIFF et al, 1999a; NAKAMURA et al., 2002) ou estimula (camundongos, SENGOKU et al., 2001; BU et al., 2004; HUO et al., 2005; suínos, TAO et al., 2004; 2005; bovinos, VIANA et al., 2005) a maturação nuclear, dependendo de sua concentração. Tem sido demonstrado que a inos pode ser detectada em folículos de suínos (HATTORI et al., 2001), células da granulosa (TAKESUE et al., 2003), células do cumulus e oócitos de camundongos (MITCHELL et al., 2004). HUO et al. (2005) demonstraram a localização subcelular da inos nos diferentes estádios da maturação nuclear e na fertilização, usando micro-injeção de anticorpo específico da inos. O NO sintetizado pela inos sensível à AG modula o processo da maturação nuclear do oócito, incluindo a inibição da VGBD e a liberação do primeiro corpúsculo polar de oócitos de camundongos (BLASHKIV et al., 2001; HUO et al. (2005), ratas (VOZNESENS KA e BLASHKIV, 2003; BU et al., 2003) e porcas (TAO et al., 2004; 2005). Vários fármacos que inibem a síntese de NO vêm sendo utilizados em estudos sobre a fisiologia ovariana, como por exemplo, a aminoguanidina (AG), que inibe seletivamente a produção de NO pela inibição da atividade da inos (NAKAMURA et al., 2002; TAO et al., 2004; 2005; HUO et al., 2005). Este inibidor da síntese de NO é, estruturalmente, similar à L-arginina, por apresentar dois grupos nitrogênio guanidina equivalentes quimicamente, inibindo, por competição, a síntese de NO (CORBETT, 1992). Em bovinos, não há nenhum trabalho mostrando qual (ais) isoformas de NOS é (são) inibida (s) com o uso da AG. A presença de esteróides no fluido folicular antes e também durante a maturação sugere que esses hormônios (P 4 e E 2 ) sejam importantes para a maturação nuclear e citoplasmática (HAMES, 2004). Em bovinos, ALI et al. (2004) relataram que a adição de E 2 ao meio de maturação provocou aumento na produção de blastocistos. JAYAWARDANA et al. (2006) observaram, em bovinos, que o E 2, juntamente com o FSH, está envolvido na expressão do GDF-9, que é um dos principais fatores secretados pelo oócito que está envolvido no processo de expansão das células do cumulus durante a maturação. FATEHI et al. (2002) relataram que a falta de P 4 durante a maturação in vitro provoca diminuição nas taxas de fertilização e clivagem em

72 53 bovinos. Essas evidências mostram que os hormônios esteróides secretados pelo COC durante o cultivo têm efeito significativo na maturação oocitária in vitro. Tem sido demonstrado que o NO diminui a produção de P 4 e E 2 em células da granulosa em bovinos, sendo este um dos possíveis mecanismos de ação do NO durante a MIV de oócitos bovinos (FAES et al., 2005). Neste estudo, nós objetivamos investigar a ação da inibição da enzima NOS sensível à AG na maturação nuclear e citoplasmática in vitro de oócitos bovinos e a sua relação com a esteroidogênese das células do cumulus. MATERIAL E MÉTODOS Coleta dos ovários e obtenção dos oócitos Ovários de vacas cíclicas foram obtidos diariamente em matadouros. Após a coleta, foram imediatamente colocados em frascos térmicos, contendo solução salina estéril mantida entre 35 e 37 o C. Os ovários foram levados ao laboratório, onde foram puncionados com a utilização de uma bomba a vácuo (100 mm/hg). O período entre a coleta e início da maturação dos ovários foi de cerca de 2 h. Os complexos cumulus oócito (COCs) foram aspirados com uma agulha de calibre 40 x 1,2 mm (19 G) e liberados em meio de lavagem (TCM 199 com HEPES) acrescido de 100 UI/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina, suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) numa temperatura de 30º C, contendo 3-isobutil-1-metil xantina (IBMX) a 0,5 mm, para evitar a retomada da meiose durante o período de manipulação dos mesmos. O IBMX inibe a síntese da enzima, que degrada o AMPc (fosfodiesterase AMPc, AMPc-PDE) (EPPIG & DOWNS, 1984). Os COCs foram selecionados e apenas os de categorias 1 e 2 (aparência clara, apresentando cumulus compacto e ooplasma homogêneo) (DE LOOS et al., 1989) foram utilizados no experimento. Após a seleção, os COCs foram lavados (4x) com o mesmo meio sem IBMX e, em seguida, foram colocados nas gotas de maturação in vitro.

73 54 Maturação in vitro Os COCs selecionados foram transferidos para gotas de 150 µl de meio de maturação em placas de cultura (3,5 cm), sob óleo mineral e incubados a 38,5 o C em atmosfera com 5 % de CO 2 em ar durante 24 h. O meio de maturação in vitro foi o meio de cultura de tecidos (TCM) 199 suplementado com 10 % de SFB, 0,5 µg/ml de FSH, 5 µg/ml de LH e antibióticos (100 UI/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina). Após 24 h de maturação, os oócitos foram removidos e o meio coletado (130 µl) e estocado a -20 o C até o dia das dosagens de NO - 2 /NO - 3, P 4 e E 2 Avaliação da expansão do cumulus A expansão do cumulus foi avaliada 24 h após o início da maturação in vitro, utilizando-se um método de classificação subjetiva (VANDERHYDEN, 2003): 0- nenhuma resposta observada; 1- reposta mínima; 2- expansão das camadas externas; 3- expansão de todas as camadas, exceto da corona radiata e 4- expansão de todas as camadas (TAO et al., 2004a). Avaliação da morfologia nuclear Após o período de maturação, os COCs foram desnudados mecanicamente numa solução contendo PBS e SFB a 10% para remoção das células do cumulus, sendo colocados em microtubos com 0,5 ml de solução fisiológica (NaCl 0,9%) acrescida de 5% de SFB, e foram delicadamente agitados no vortex por 5 min. Em seguida, os oócitos foram fixados entre lâmina e lamínula por 24 a 48 h em etanol/ácido acético (3:1), corados com orceína acética 2%, lavados com etanol e observados em microscópio de contraste de fase da marca NIKON (400 x) para determinação dos estádios de maturação nuclear: vesícula germinativa (VG), pré-metáfase I (pré-mi,), metáfase I (MI), anáfasei (AI), telófase I (TI) e metáfase II (MII) (BRUNET e MARO, 2005).

74 55 Avaliação da integridade da membrana plasmática No final do período de maturação, os COCs foram desnudados mecanicamente. O oócito e as células do cumulus foram expostos separadamente a um mix de corantes fluorescentes, laranja de acridina e brometo de etídio na concentração de 1:1 e PBS suplementado com 10% de SFB e incubados numa temperatura ambiente durante 5 min. Em seguida, foi feita a montagem entre lâmina e lamínula contendo glicerol, TRIS fosfato suplementado com n-propil (0,5%). Após esse procedimento, os oócitos foram submetidos à microscopia de fluorescência para avaliação da integridade da membrana plasmática e da condensação da cromatina. Assim, a integridade da membrana plasmática do oócito e das células do cumulus, foi classificada da seguinte forma: viáveis (cromatina verde), pois houve a penetração da laranja de acridinas nas células e não-viáveis (cromatina laranja), com penetração do brometo de etídio. Foram contadas de 200 a 250 células do cumulus de cada COC. Coloração de grânulos corticais Para a coloração dos grânulos corticais, o método utilizado foi o de BEKER et al. (2000). Após o período de 24 h de maturação, os oócitos foram desnudados mecanicamente numa solução de PBS e SFB a 10%, lavados 3 vezes em meio TCM 199 a 39ºC, onde foi feita a remoção completa das células do cumulus. Em seguida, foi feita a remoção da zona pelúcida com protease de Streptomices griseus, tipo XIV diluída numa concentração de 0,1% em PBS. Após, os oócitos foram lavados por mais 3 vezes, de 5 min cada, em meio contendo TCM 199 para retirar o resto da zona pelúcida, lavados em solução bloqueio (SB), que consistiu em PBS suplementado com 0,1% de BSA, fração V e 0,75% de glicina. Em seguida, foram fixados em solução de paraformaldeído dissolvido em PBS a 3% numa temperatura ambiente por 30 min, lavados em SB (3 vezes de 5 min cada) e permeabilizados em 0,1% de Triton X-100 diluído em PBS por extritamente 5 min a 39ºC, lavados novamente em SB (3 vezes de 5 min cada), incubados com 100 µg/mlde amedoim aglutinina conjugada a FITC (FITC- PNA) a 37ºC, durante 30 min. Após a coloração, os oócitos foram lavados por mais 2 vezes (de 5 min cada) em SB e 1 vez em água destilada. A montagem das lâminas foi

75 56 feita utilizando-se um meio contendo glicerol a 90% e TRIS suplementado com 0,5% de n-propil a 10% e levadas para o microscópio de fluorescência (400x, Eclipse TE300/TE200, Nikon) para visualização dos grânulos corticais. Dosagem de nitrito e nitrato O reagente de Griess é composto de uma mistura de sulfanilamida 2% e N-(1- naphthyl) ethylene-diamine 0,2% em água Milii Q. A primeira reação na amostra ocorreu com o nitrito para formar o sal diazonium que reagiu com o segundo reagente para formar a cor púrpura com um pico de absorbância a 540 nm. Para reduzir o nitrato a nitrito, as amostras (40 µl) foram incubadas com uma mistura contendo 1000 µl da enzima nitrato redutase (100 µl da enzima 10 UI diluída em água Milli Q µl de água Milli Q) oriunda de bactéria, 1000 µl do cofator NADPH (5mg/mL) diluído em água Milli Q, 1000 µl de tampão fosfato de potássio (0,5 M). Em seguida, as amostras foram incubadas a 37 o C por h. O método foi desempenhado em placa de 96 poços. Posteriormente, 80 µl do reagente de Griess foram adicionados às amostras. Todas as soluções foram protegidas da luz. Uma curva padrão de nitrito de sódio diluída em DMEM/Ham`s-F12 contendo valores conhecidos de nitrito foi realizada, onde o valor mínimo de nitrito foi de 0,5 µm e o máximo de 100µM. Com os valores da absorbância foi montado um gráfico de dispersão. A relação entre a absorbância e a concentração de nitrato/nitrito foi linear (R2=0,98; P<0,05). Dosagem de17β-estradiol e progesterona No final de 24 h, o meio de cultura foi coletado e armazenado a -20 o C para dosagem de E 2 e P 4 pelo sistema automatizado de quimioluminescência ACS:180. O teste é um imunoensaio competitivo que usa uma tecnologia de quimioluminescente direta. O anticorpo anti-p 4 e anti-e 2 monoclonal é marcado com éster de acridina. A curva de P 4 variou de ng/ml e a de E 2, de pg/ml. As amostras para dosagem de P4 foram diluídas em meio de cultivo (1/40) e para a dosagem de E 2, não foi realizada nenhuma diluição.

76 57 Fecundação e cultivo in vitro Foi utilizado sêmen congelado de um mesmo touro e de uma mesma partida, o qual foi preparado segundo a técnica de gradiente Percoll (Pharmacia) para a fecundação in vitro. Os espermatozóides vivos foram separados por gradiente de Percoll 45-90% (Percoll diluído em Talp SP). O gradiente foi mantido na estufa de CO 2 até o momento de sua utilização. O sêmen foi descongelado a uma temperatura de C durante 1 minuto e, em seguida, adicionado na porção superior do gradiente de Percoll e centrifugado por 8 min a 600 x g. Após a retirada do sobrenadante, uma nova centrifugação de 2 min a 150 x g com 5 ml de meio TALP-SP foi realizada para remover o excedente do Percoll. A concentração espermática final foi ajustada para 2,0 x 10 6 /ml acrescido com meio de fertilização. Após a maturação, 30 min antes do início da FIV, os oócitos foram lavados (4x) em meio de fertilização e incubados juntamente com os espermatozóides a uma temperatura de 38,5 o C em atmosfera de 5% de CO 2 durante 18 h. Depois desse período de cultivo, os supostos zigotos foram lavados 4 vezes em meio de cultivo (TCM 199 sem Hepes suplementado com SFB a 10% acrescido de antibióticos: penicilina e estreptomicina) para remoção das células do cumulus e espermatozóides e, em seguida, transferidos para gotas de 100µl de meio de cultivo em placas de cultura sob óleo mineral, onde foram mantidos por 8 dias a 38,5 o C, em atmosfera de 5% de CO 2 em ar, sendo avaliada a taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário inicial. O meio de fecundação in vitro utilizado foi o Talp-fecundação (Talp-fec) suplementado com 6 mg/ml de BSA livre de ácidos graxos, 100 UI/ml de penicilina e 100 µg/ml de estreptomicina, 2 mm de penicilamina, 1 mm de hipotaurina e 25 mm de epinefrina. O Talp-SP consistiu numa mistura de BSA, piruvato e nistatina. Todos os meios foram preparados no dia dos experimentos. Todos os reagentes utilizados foram da marca Sigma (USA), exceto o etanol, da marca Merck (Damstadt, Alemanha).

77 58 Delineamento experimental Experimento 1: Efeito de diferentes concentrações da AG na maturação nuclear Experimento 1a: Foram adicionadas diferentes concentrações (0, 1, 10 e 100 mm) de AG ao meio de maturação para avaliação da ação da AG na maturação in vitro de oócitos bovinos. Somente no tratamento de 100 mm foram adicionados 10-5 M de SNP (nitroprussiato de sódio) para observar se o efeito inibitório da atividade da inos sensível à AG poderia ser revertido, pois VIANA et al. (2005) observaram, em bovinos, que esta concentração melhorou, significativamente, a taxa de blastocistos produzidos in vitro. Após o período de maturação (24 h), foi feita a avaliação do grau de expansão das células do cumulus. Em seguida, os oócitos foram desnudos, fixados e corados para a observação do estádio de maturação nuclear. Experimento 1b: As mesmas concentrações da AG foram utilizadas para avaliar o seu efeito na integridade da membrana plasmática do oócito e das células do cumulus. O meio de maturação de todos os tratamentos foi coletado e armazenado a - 20 o C até o dia da dosagem de NO - 2 /NO - 3, P 4 e E 2. Experimento 2: Efeito de diferentes concentrações da AG na maturação citoplasmática Após a maturação, foi avaliada a localização dos grânulos corticais nos oócitos tratados com as diferentes concentrações de AG. Experimentos subseqüentes foram realizados somente com os oócitos tratados com concentrações do inibidor que não interferiram no processo de maturação nuclear. Estes oócitos foram fertilizados e foi observada a taxa de clivagem 48 horas após e de desenvolvimento embrionário até blastocisto 7 e 8 dias depois. Foram utilizados 30 a 40 oócitos em cada gota para cada concentração testada e este procedimento foi repetido 6 a 8 vezes, mantendo-se sempre a mesma relação (30 oócito/150 µl de meio de MIV).

78 59 Análise estatística Para verificar o efeito da adição de diferentes concentrações de AG, inibidor da síntese de NO, na maturação nuclear e citoplasmática, foi realizada uma análise de variância (ANOVA) a 5% de probabilidade, com exceção para as características da expansão das células do cumulus onde o tratamento de 10 mm de AG apresentou 100% de COCs com expansão do cumulus, com classificação 2, aplicando-se o teste Quiquadrado a 5% de probabilidade. Os resultados obtidos da expansão do cumulus com classificação 3 foram transformados devido ao fato de apresentarem coeficiente de variação alto. RESULTADOS Experimento 1: Efeito de diferentes concentrações da AG na maturação nuclear Células do cumulus Expansão A adição de diferentes concentrações de AG no meio de maturação promoveu um efeito dose-resposta na expansão das células do cumulus de COCs bovinos (Tabela 01, Figura 01). Não houve diferença significativa no grau de expansão das células do cumulus de COCs tratados com 1 mm (92,1 ± 6,3%, classificação 4) quando comparados com o controle (92,0 ± 7,9%, classificação 4, P>0,05). Contudo, quando se adicionaram 10 mm de AG, verificou-se que 100% dos oócitos cultivados apresentavam-se com expansão somente das camadas mais externas das células do cumulus (100%, classificação 2), havendo diferença quando comparado com os resultados obtidos no controle e nas demais concentrações utilizadas (P<0,05). Este efeito da inibição da expansão das células do cumulus foi aumentado quando se adicionaram 100 mm de AG, onde 92,8 ± 2,8% dos COCs não apresentaram nenhuma expansão das células do cumulus (classificação 0) e 7,2 ± 2,8% dos COCs

79 60 apresentaram uma expansão mínima (classificação 1), havendo diferença significativa entre o controle e demais concentrações utilizadas (P<0.05). O mesmo efeito foi observado foi adicionado 100 mm de AG com 10-5 M de SNP, pois a adição de SNP não reverteu o efeito inibitório de 100 mm de AG na expansão das células do cumulus. Tabela 01: Efeito da adição de diferentes concentrações da AG na expansão das células do cumulus de oócitos bovinos maturados in vitro por 24 h. Tratamento/AG (mm) n Expansão das células do cumulus (classificação em %) Controle 240 0,0 ± 0,0 b 0,0 ± 0,0 b 0,0 ± 0,0 a 8,0 ± 7,9 b 92,0 ± 7,9 b ,0 ± 0,0 b 0,0 ± 0,0 b 0,0 ± 0,0 a 7,9 ± 6,2 b 92,1 ± 6,3 b ,0 ± 0,0 b 0,0 ± 0,0 b 100± 0,0 b 0,0 ± 0,0 a 0,0 ± 0,0 a ,8 ± 2,8 a 7,2 ± 2,8 a 0,0 ± 0,0 a 0,0 ± 0,0 a 0,0 ± 0,0 a AG + SNP ,5 ± 2,7 a 6,5 ± 2,7 a 0,0 ± 0,0 a 0,0 ± 0,0 a 0,0 ± 0,0 a (100 mm+10-5 M) ab Valores com diferentes letras na mesma coluna diferem significativamente (P < 0.05). A média ± S.E.M foi calculada de seis experimentos com gotas de 40 oócitos.

80 61 A B C D Figura 01: Efeito dose-resposta da adição de diferentes concentrações de AG no meio de maturação na expansão das células do cumulus de oócitos bovinos. Figura 1, painel A: Controle; painel B, C e D: mostram COCs tratados com diferentes concentrações de AG (1, 10 e 100 mm, respectivamente) durante 24 horas de maturação. Escala de barra de aproximadamente de 250 µm. Viabilidade A adição de 1 mm de AG não alterou a viabilidade das células do cumulus, pois 96,0 ± 2,8% das mesmas encontraram-se sem lesão de membrana quando comparado com os resultados obtidos do controle (94,6 ± 3,1%, P>0,05). Houve um efeito doseresposta, ou seja, as células do cumulus de COCs tratados com 10 mm de AG apresentaram 26,8 ± 4,8% de células intactas, diferenciando (P<0,05) do controle e das demais concentrações adicionadas no meio de maturação. A adição de 100 mm de AG diminuiu a porcentagem de células do cumulus intactas (2,6 ± 1,1%) quando comparada com o controle e as demais concentrações (Tabela 02).