BLOQUEIO DA MEIOSE COM BUTIROLACTONA I EM OVÓCITOS BOVINOS: EFEITOS SOBRE A MATURAÇÃO NUCLEAR E CITOPLASMÁTICA PAULO ROBERTO ADONA

Transcrição

1 BLOQUEIO DA MEIOSE COM BUTIROLACTONA I EM OVÓCITOS BOVINOS: EFEITOS SOBRE A MATURAÇÃO NUCLEAR E CITOPLASMÁTICA PAULO ROBERTO ADONA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ MARÇO 2006

2 BLOQUEIO DA MEIOSE COM BUTIROLACTONA I EM OVÓCITOS BOVINOS: EFEITOS SOBRE A MATURAÇÃO NUCLEAR E CITOPLASMÁTICA PAULO ROBERTO ADONA Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal. Orientadora: Profª. Drª. Cláudia Lima Verde Leal CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ MARÇO 2006

3 FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 028/2006 Adona, Paulo Roberto Bloqueio da meiose com butirolactona I em ovócitos bovinos : efeitos sobre a maturação nuclear e citoplasmática / Paulo Roberto Adona f. il. Orientador: Cláudia Lima Verde Leal Tese (Doutorado em Produção Animal) Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. Campos dos Goytacazes, RJ, Bibliografia: f Butirolactona I 2. Embrião 3. Maturação 4. Meiose 5. Ovócito bovino I. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. II. Título. CDD

4 BLOQUEIO DA MEIOSE COM BUTIROLACTONA I EM OVÓCITOS BOVINOS: EFEITOS SOBRE A MATURAÇÃO NUCLEAR E CITOPLASMÁTICA PAULO ROBERTO ADONA Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal. Aprovado em 10 de março de Comissão Examinadora: Profª. Drª. Gisele Zoccal Mingoti (Doutorado em Fisiologia) UNESP Profª. Drª. Maria Clara Caldas Bussiere (Doutorado em Fisiologia) UENF Profº Dr. Reginaldo da Silva Fontes (Doutorado em Fisiologia) UENF Profª. Drª. Cláudia Lima Verde Leal (Doutorado Reprodução Animal) USP/FZEA (Orientador)

5 AGRADECIMENTOS Em especial à minha mãe, meu irmão e às minhas irmãs. Gostaria de expressar minha profunda gratidão e carinho, em especial: À Rosângela A. Queiroz; À Cláudia L. V. Leal; À Margot A. N. Dode; À Maineide Z. Velasques. À todos meus amigos pelo carinho e companheirismo. Sem cada um de vocês nada disso seria possível e a vida não teria sentido. Alexandre Barreto; Amanda de A. Rocha; Bethania Lopes; Camila Cortez; Felipe C. Braga; Flávio P. Júnior; Gustavo (Sancho); Isabele P. Emanuelli; Kelen S. Viana; Marcos R. Chiaratti; Moysés S. Miranda; Norma Clea Rodovalho; Paula Ripamonte; Roberto Carneiro; Sílvia G. Matta; Tiago H. C. De Bem; Aline S. M. César; Aparecida Mandella; Bruno Fagundes; Fabiana Bressan; Fernando Biaze; Giovana K. F. Merighe; Hebinho (Baby Sauro) Kátia L. Schwartz; Lígia Garcia Mesquita; Mariene (Bitoca); Nilton P. dos Santos; Patrícia M. Porciúncula; Pedro Ratto; Rosemary Bastos; Sylvia S. Cortezzi; Vanessa G. Ueno; ii

6 Aos Professores: Maria Clara C. Bussiere, Flávio Vieira Meirelles, Reginaldo Fontes, Gisele Zoccal Mingoti. Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho. À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy R. (UENF/CCTA/LMGA); À Universidade de São Paulo (USP/FZEA/ZAB); À FAPESP, pelo financiamento do projeto de pesquisa; À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo. iii

7 BIOGRAFIA PAULO ROBERTO ADONA, filho de Ivo Adona e Maria Boniatti Adona, nasceu em 26 de agosto de 1966, na cidade de Campinas do Sul RS. Em março de 1995, ingressou no curso de Biologia da Universidade Católica Dom Bosco (UCDB), em Campo Grande MS. Submeteu-se à apresentação de monografia para conclusão do curso em dezembro de Foi selecionado em março de 1997 como estagiário do setor de Reprodução Animal da Embrapa CNPGC, sob orientação da Pesquisadora Drª. Margot A. N. Dode. Foi aprovado em agosto de 2000 no curso de Pós-graduação em Produção Animal, a nível de mestrado, da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), Campos dos Goytacazes RJ, submetendo-se à defesa de tese para a conclusão do curso em abril de Foi aprovado em março de 2002 no curso de Pós-graduação em Produção Animal, a nível de doutorado, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Campos dos Goytacazes RJ, submetendo-se à defesa de tese para a conclusão do curso em março de iv

8 CONTEÚDO LISTA DE ABREVIATURAS viii RESUMO x ABSTRACT xii 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Ovogênese e foliculogênese Maturação ovocitária Maturação nuclear Maturação citoplasmática Organização estrutural na maturação Citoesqueleto Organelas Mitocôndrias Grânulos corticais Mudanças moleculares e bioquímicas Cinases dependentes de ciclinas (CDKs) Fator promotor da maturação (MPF) Proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK) Competência ovocitária Bloqueio meiótico OBJETIVOS v

9 4. MATERIAL E MÉTODOS Coleta de ovários e ovócitos Solução estoque do inibidor Bloqueio da meiose com butirolactona I Determinação do estádio da meiose Maturação in vitro Microtúbulos Microfilamentos Grânulos corticais Mitocôndrias Fecundação e cultivo in vitro Delineamento experimental Experimento 1. Avaliação de concentrações decrescentes de BL I em meio suplementado com BSA Experimento 2. Avaliação de concentrações crescentes de BL I em meio sem suplementação de BSA Experimento 3. Efeito do bloqueio da meiose na maturação nuclear Experimento 4. Cinética da maturação nuclear pós-bloqueio da meiose Experimento 5. Efeito do bloqueio da meiose na organização dos microtúbulos e dos microfilamentos Experimento 6. Efeito do bloqueio da meiose na distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias Experimento 7. Efeito da BL I no desenvolvimento embrionário in vitro Análise estatística RESULTADOS Experimento Experimento Experimento Experimento Experimento vi

10 5.7. Experimento Experimento DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE vii

11 LISTA DE ABREVIATURAS μg micrograma; μl microlitro; μm micromolar; AI anáfase I; AMPc monofosfato de adenosina cíclica; ATP trifosfato de adenosina; B199 TCM-199, sais de Earle e 20 mm de bicarbonato de sódio; BL I butirolactona I; BSA albumina sérica bovina; CDK cinase dependente de ciclina; CIV cultivo in vitro; CO 2 dióxido de carbono; CSF fator citostático; DMSO dimetilsulfóxido; DNA ácido desoxirribonucléico; ERK cinase regulada por sinal extracelular (MAPK); FITC isotiocianato de fluoresceína; FIV fecundação in vitro; FSH hormônio folículo estimulante; viii

12 GDP guanosina difosfato; GTP guanosina trifosfato; H199 TCM -199, sais de Earle, 20 mm de bicarbonato de sódio e 25 mm de Hepes; LH hormônio luteinizante; MAPK proteína cinase ativada por mitógenos; MAP2K, MAP3K, MAP4K cinases ativadoras de cinases ativadas por mitógenos MAT metáfase I, anáfase I e telófase I; MBP proteína básica de mielina; MEK cinase regulada por sinal extracelular (MAP2K); MI metáfase I; MII metáfase II; Miss MAPK de interação e estabilização do fuso meiótico; MIV maturação in vitro; ml mililitro; mos oncogene c-mos; MPF fator promotor da maturação; Myt1, Wee1 e CDC25 proteínas cinases envolvidas na atividade do MPF; P90 RSK proteína cinase ribossomo S6; PBS tampão fosfato salina; PIV produção in vitro; PKA proteína cinase A; PKC proteína cinase C; PVA álcool polivinílico; Raf-1 MAP3K; Ras MAP4K; RNAm ácido ribonucléico mensageiro; SFB soro fetal bovino; SOF fluido de oviduto sintético; TALP meio tyrode s com albumina, lactato e piruvato; TCM-199 meio de cultura de tecidos 199; TI telófase I; VG vesícula germinativa. ix

13 RESUMO ADONA, Paulo Roberto, Dr. S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro: março de 2006; Bloqueio da meiose com butirolactona I em ovócitos bovinos: efeitos sobre a maturação nuclear e citoplasmática; Orientador: Profª. Drª. Cláudia Lima Verde Leal. Conselheiro: Profª. Drª. Maria Clara Caldas Bussiere. O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito do uso da butirolactona I (BL I) na pré-maturação sobre a progressão da meiose, estruturas celulares e desenvolvimento de ovócitos bovinos cultivados in vitro. Ovários bovinos foram coletados em frigoríficos e os folículos de 2-6 mm de diâmetro foram aspirados para a obtenção dos ovócitos. Inicialmente, foram avaliadas diferentes concentrações de BL I em meio suplementado ou não com BSA. Houve diferença (P < 0,05) nas taxas de vesícula germinativa (VG) entre os grupos C/24 (0,0%), 25 (65,1%), 50 (84,4%) e 100 μm (97,4%) de BL I suplementados com BSA, mas não houve diferença (P > 0,05) entre os tratados com 10 (94,7%), 15 (97,2%), 20 (98,7%) e 25 μm (98,7%) de BL I em meio sem BSA. As taxas de maturação (MII) não diferiram (P > 0,05) entre o controle (91,1%) e os tratados com 10 (B10 = 91,5%) e 100 μm (B100 = 92,4%) de BL I. Em relação à cinética de MIV pós-bloqueio, observou-se que às 6h de MIV os grupos B10 (71,4%) e B100 (74,3%) apresentaram taxas de VG inferiores (P < 0,05) ao controle (97,3%). Com 12h de MIV a maior parte dos ovócitos estava em estádios intermediários da meiose (MAT) (77,9; 83,1 e 86,4% para controle, B10 e B100, respectivamente, P > 0,05). Com 18h de MIV as taxas de MII não diferiram (P > x

14 0,05) entre controle (72,0%), B10 (73,7%) e B100 (78,9%). Com relação aos microtúbulos não foram observadas alterações no fuso meiótico quanto à organização e formação da placa metafásica nos diferentes grupos de ovócitos (controle, B10 e B100) e horários (0, 6, 12, 18 e 24h) avaliados. Também não foi observada nenhuma alteração no arranjo dos microfilamentos no citoplasma dos ovócitos avaliados nas mesmas condições. Em 100% dos ovócitos não maturados independente do grupo (C/0h, B10 e B100), os grânulos corticais apresentavam-se dispersos pelo citoplasma (P > 0,05) dos ovócitos. Após 24h de MIV, 98% dos ovócitos apresentavam migração dos grânulos corticais para a região periférica do citoplasma em todos os grupos (P > 0,05). As mitocôndrias nos ovócitos não maturados dos grupos tratados encontravam-se em sua maioria na periferia dos ovócitos (81,5 e 86,9%, P > 0,05), mas foi inferior (P < 0,05) ao controle (100%). Após 24h de MIV, as mitocôndrias migraram por todo o ovócito, sendo o grupo C/24 (81,5%) inferior (P < 0,05) aos grupos B10M (95,2) e B100M (98,2%) que não diferiram entre si (P > 0,05). As taxas de clivagem (81-87%) não diferiram (P > 0,05) para os ovócitos submetidos à FIV nos grupos controle, B10 e B100. Com relação à percentagem de blastocisto no D7, os grupos controle (38,3%) e B10 (41,6%) não diferiram entre si (P > 0,05), mas ambos foram superiores (P < 0,05) ao grupo B100 (33,0%). A taxa de blastocisto eclodido foi similar (P > 0,05) entre os grupos controle (19,2%), B10 (17,7%) e B100 (11,0%) no D8. Também não foi observada variação (P > 0,05) no número médio de células dos blastocistos no D8, entre o controle (138), B10 (136) e B100 (150). A pré-maturação com BL I não aumentou os índices de desenvolvimento, porém também não induziu alterações estruturais e não comprometeu (B10) o desenvolvimento embrionário, sugerindo a possibilidade de sua aplicação em biotécnicas de PIV de embriões e de clonagem. Palavras-chave: butirolactona I, embrião, maturação, meiose e ovócito bovino. xi

15 ABSTRACT ADONA, Paulo Roberto, Dr. S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro: março de 2006; Meiosis block using butyrolactone I in bovine oocytes: Effects on nuclear and cytoplasmic maturation; Supervisor: Prof. Dr. Cláudia Lima Verde Leal. Counselor: Prof. Dr. Maria Clara Caldas Bussiere. The present study aimed to assess the effects of butyrolactone I (BL I) in prematuration on meiosis progression, cellular structures and development of bovine oocytes cultured in vitro. Bovine ovaries were collected in abattoirs and 2-6mm follicles were aspirated to obtain oocytes. Initially, different BL I concentrations were evaluated in B199 medium supplemented or not with BSA. Germinal vesicle (GV) rates were different (P < 0.05) among the groups C/24 (0.0%) 25 (65.1%), 50 (84.4%) and 100 μm (97.4%) BL I in medium supplemented with BSA. However, no difference (P>0.05) was observed when oocytes were cultured with 10, 15, 20 and 25 μm BL I (94.7, 97.2, 98.7 and 98.7%, respectively) in medium without BSA. Maturation rates (MII) were similar (P > 0.05) between controls (91.1%) and treated oocytes (91.5 and 92.4% for B10 and B100, respectively). Regarding maturation kinetics, VG rates at 6h IVM in controls (97.3%) were superior (P < 0.05) to treated oocytes (71.4 and 74.3% for B10 and B100, respectively). At 12h most of the oocytes were at intermediate stages of meiosis (77.9, 83.1 and 86.4%, for control, B10 and B100, respectively, P>0.05). After 18 h IVM, MII rates were similar (P > 0.05) among groups (72.0, 73.7 and 78,9% for control, B10 and B100, respectively). Regarding xii

16 microtubules no alterations in meiotic spindle were observed for organization and formation of metaphase plate in different groups (control, B10 and B100) and IVM periods (0, 6, 12, 18 and 24h). No alterations in microfilament arrangement were observed either under the same conditions. All immature oocytes (100%) presented cortical granules (CG) dispersed throughout the cytoplasm, irrespective of oocyte group (C/0h, B10 and B100, P > 0.05). After 24 h IVM, also irrespective of oocyte group, 98% of the oocytes had the CG migrated to the periphery of the cytoplasm (P > 0.05). Immature oocytes in treated groups presented mitochondria mostly in the periphery of the oocytes (81.5 and 86.9%, P > 0,05), although at a lower rate than in control oocytes (100%, P < 0.05). After 24 h IVM, mitochondria migrated throughout the cytoplasm, but in both treated groups the migration rates were superior (95.2 and 98.2% for B10 and B100, P > 0.05) to controls (81.5%, P < 0.05). Cleavage rates were not affected (81-87%, P > 0.05) in oocytes fertilized in vitro. However, blastocyst rates in day 7 were reduced in the B100 group (33.0%, P < 0.05). Controls and B10 had similar rates (38.3 and 41.6%, respectively, P >0.05). Day 8 hatching rates (19.2, 17.7 and 11.0% for control, B10 and B100, P > 0.05) and blastocyst cell numbers (138, 136 and 150 B100 for control, B10 and B100, P > 0.05) were unaffected. Pre-maturation using BL I did not increase blastocyst rates, but also did not affect cell structures and development (B10), suggesting the possibility of its use for in vitro embryo production and cloning. Palavras-chave: butyrolactone I, embryo, maturation, meiosis and oocyte bovine. xiii

17 1. INTRODUÇÃO Os mecanismos pelos quais os ovócitos adquirem a competência para desenvolverem-se até o estádio de blastocisto ainda não estão totalmente compreendidos. Há evidências de que a aquisição da competência está correlacionada com moléculas de RNAs e de proteínas estocadas e processadas durante as fases de crescimento, capacitação (pré-maturação) e maturação do ovócito. Essas moléculas são usadas para sustentar as fases iniciais da embriogênese até que a transcrição do DNA do embrião se torne ativa (DE LA FUENTE e EPPIG, 2001). Apesar dos muitos esforços para melhorar a produção in vitro (PIV) de embriões para fins científicos e/ou comerciais, a sua eficiência ainda é relativamente baixa. Apenas 35-40% dos ovócitos bovinos maturados in vitro (MIV) desenvolvemse até o estádio de blastocisto (MAYES e SIRARD, 2001; SIRARD et al., 2006), e ainda desses, somente 30% chegam a termo após a transferência (WARD et al., 2002; PARK et al., 2005). Essas baixas taxas são determinadas por vários fatores decorrentes das etapas que constituem o sistema de PIV de embriões. As condições de cultura para maturação nuclear e citoplasmática do ovócito certamente têm um papel fundamental, e uma maturação completa é essencial para o desenvolvimento embrionário. Portanto, para a obtenção de um sistema que possibilite a produção de um maior número de embriões é necessária a compreensão dos mecanismos envolvidos na maturação. Observou-se que in vivo, os ovócitos, ao final de seu período de crescimento,

18 2 mas antes do período de maturação propriamente dito, passam por um período chamado de capacitação, o qual parece ser importante para o desenvolvimento pleno de sua competência. Nesse período ocorrem modificações estruturais e moleculares que são importantes para o desenvolvimento embrionário (HYTTEL et al., 1997, DIELEMAN et al., 2002). Os ovócitos utilizados no sistema de PIV de embriões normalmente já concluíram sua fase de crescimento e entraram no período de capacitação ovocitária (HYTTEL et al., 1997). Porém, ao serem removidos do ambiente folicular reiniciam a meiose (KUBELKA et al., 2000) e uma parte dessa população ainda não concluiu a capacitação ovocitária. Uma das alternativas que vários pesquisadores vêm analisando para estudar a competência de desenvolvimento dos ovócitos in vitro é o bloqueio da retomada da meiose antes da maturação. No entanto, pouco se sabe do que ocorre nesse período. De toda forma, o bloqueio da meiose serviria como ferramenta para estudar os possíveis fatores envolvidos na indução da capacitação após a remoção dos ovócitos do ambiente folicular, e que poderiam ter efeitos positivos sobre o desenvolvimento embrionário subseqüente. A obtenção de conhecimento nesse sentido, por sua vez, poderá contribuir para um melhor embasamento no desenvolvimento de procedimentos mais eficientes para a PIV de embriões bovinos.

19 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Ovogênese e foliculogênese A ovogênese refere-se à seqüência de eventos em que as células germinativas primordiais diferenciam-se em ovogônias, ovócitos primários e secundários, findando com a fecundação do ovócito maturo (GONSALVES et al., 2002; VAN DEN HURK e ZHAO, 2005). Já a foliculogênese inicia-se com a formação dos folículos Folículo 1º Folículo primordial primordiais, Folículo 2º Dictióteno progredindo para Prófase I Ovócito 1 F folículos primários, Folículo 3º Folículos O pré-antrais L Início da meiose I I secundários e C U Ovogônia Folículos antrais L terciários, finalizando O Folículo Prófase I G com a ovulação de um ovulatório Ê O N V E O ovócito maturo Término da meiose I Mitose S G E Ê N (GONSALVES et al., E S 2002; VAN DEN Ovulação Meiose II E C. germinativas HURK e ZHAO, 2005) Ovócito 2 Término da meiose II primordiais Fecundação (Figura 1). A Endoderma Zigoto diferenciação das Blastocisto Figura 1. Diagrama simplificado da ovogênese e foliculogênese. células da linhagem Fonte: adaptado de Gonsalves et al., (2002) e Van den Hurk e Zhao (2005). germinativa feminina ocorre totalmente ou quase totalmente na fase embrionária/fetal dependendo da espécie (MOORE e PERSAUD, 2000; GONSALVES et al., 2002) (Tabela 1). Estudos recentes, porém, sugerem que possa

20 4 haver diferenciação dessas células também em adultos, embora a maior parte das evidências ainda indique que folículos primários sejam formados apenas na vida fetal (BUKOVSKY et al., 2005). Ao nascer, os bovinos dispõem de um número determinado de ovócitos primários, cada um dos quais com o material genético duplicado (GONSALVES et al., 2002). O processo de diferenciação dos ovócitos primários (imaturo) para secundários (maturo) é iniciado na maturidade sexual quando, a intervalos médios de 21 dias (bovinos), um ovócito (2n) conclui a primeira meiose Tabela 1. Cronologia da ovogênese e foliculogênese em bovinos e ovinos. Eventos Dias de gestação Bovinos Ovinos Células germinativas primordiais Ovogônias Ovócitos primários Folículo primordial Folículos primários Folículos secundários Folículos terciários Nascimento Fonte: McNatty et al., 2000; Gonsalves et al., 2002; Fair, 2003 iniciada na fase fetal. Agora, o ovócito secundário ou maturado (n) encontra-se apto para a fecundação. Com a fusão do espermatozóide, o ovócito finaliza sua segunda divisão meiótica (extrusão do segundo corpúsculo polar). Desse modo o material genético do ovócito é reduzido à metade por meio de duas divisões meióticas sucessivas. A ploidia retorna à sua conformação original (2n) com a interação (singamia) do material genético do espermatozóide com o do ovócito, formando assim o zigoto, que originará o embrião (MOORE e PERSAUD, 2000; GONSALVES et al., 2002; HAFEZ, 2002) Maturação ovocitária Durante todo o período do desenvolvimento, desde a formação e crescimento dos ovócitos e dos folículos, até após o período da dominância folicular, os ovócitos bovinos permanecem em estádio de prófase da primeira meiose. In vivo, o reinício da meiose ocorre com o surgimento do pico pré-ovulatório de LH (hormônio luteinizante) e se dá somente nos ovócitos inteiramente crescidos e meioticamente competentes dos folículos pré-ovulatórios (FAIR, 2003; RODRIGUEZ e FARIN, 2004). A competência dos ovócitos tem uma estreita relação com as multicamadas de células do cumulus que os cercam, mantendo uma importante via de

21 5 comunicação através das junções comunicantes (gap), antes e durante o pico préovulatório de LH (RODRIGUEZ e FARIN, 2004; GILCHRIST et al., 2004). Logo após o pico de LH, começa a ocorrer o desaparecimento dessas vias de comunicação entre o ovócito e as células do cumulus (HYTTEL et al., 1997). A progressão do ciclo celular do ovócito até o estádio de metáfase da segunda meiose (metáfase II), tanto in vivo quanto in vitro, é marcada por uma série de transformações bioquímicas e estruturais no núcleo e no citoplasma do ovócito, eventos esses que caracterizam a maturação ovocitária (MACHATKOVA et al., 2004; DE SOUSA et al., 2004). Na transição da prófase I à metáfase II, estabelecese uma complexa cascata de fosforilações e desfosforilações de uma série de proteínas envolvidas no reinício e na regulação da meiose (DEKEL, 2005; DUMONT et al., 2005). Entre as proteínas que mais se destacam no período da maturação estão as proteínas do complexo MPF (fator promotor da maturação) e da família MAPK (proteína cinase ativada por mitógenos). Para efeito de estudo, a maturação será dividida em maturação nuclear e citoplasmática, apesar desses eventos ocorrerem concomitantemente Maturação nuclear A diferenciação do ovócito imaturo em maturo envolve uma série de alterações que são estimuladas principalmente por hormônios gonadotróficos (MERTON et al., 2003). Sob a influência dos hormônios, o ovócito recomeça seu ciclo celular progredindo da fase de diplóteno da prófase da primeira meiose (prófase I), passando pelos estádios de metáfase I, anáfase I, telófase I (término da primeira divisão meiótica) e progredindo até o estádio de metáfase da segunda divisão meiótica (MEINECKE et al., 2001). No intervalo que compreende os estádios de prófase I a metáfase II, os cromossomos condensam e o envelope nuclear é desfeito marcando o início da maturação nuclear (MEINECKE et al., 2001; JONES, 2004). Dando seqüência, os cromossomos homólogos são divididos em dois grupos, com a metade do número original de cromossomos. Ao término da primeira divisão meiótica o citoplasma é dividido assimetricamente (CAN et al., 2003), gerando duas células de tamanhos diferentes: uma pequena chamada de corpúsculo polar e outra

22 6 grande, o ovócito secundário. Ao término da maturação nuclear o ovócito permanece nesse estádio do ciclo celular (metáfase II) até a fecundação (MAYES e SIRARD, 2001) ou ativação partenogenética (YI e PARK, 2005). Os fatores da ativação (natural ou artificial) dos ovócitos maturos vão promover o término da segunda divisão meiótica, que se caracteriza pela progressão da metáfase II até a telófase II com a liberação do segundo corpúsculo polar. Após a ativação, o futuro embrião prossegue seu ciclo celular por divisão mitótica. In vitro, a maturação nuclear de ovócitos bovinos de folículos > 2 mm de diâmetro em condições apropriadas requer de 18 a 24 horas de cultivo (KHATIR et al., 1998; DODE e ADONA, 2001; ADONA e LEAL, 2004) Maturação citoplasmática A competência de desenvolvimento do ovócito em embrião em estádio adiantado de desenvolvimento é basicamente dependente das modificações bioquímicas, moleculares e estruturais do citoplasma. Essas alterações na maturação do ovócito são processos altamente complexos que envolvem vários eventos simultâneos como síntese de proteínas (KHATIR et al., 1997; SIRARD et al., 1998), modificações moleculares (KUBELKA et al., 2000) e migração e reorganização de organelas no citoplasma (STOJKOVIC et al., 2001). Se compararmos as taxas de Tabela 2. Comparação entre maturação nuclear e citoplasmática. maturação (Tabela 2), Nuclear 1 Citoplasmática 2 observaremos que a maturação 81,0% 33,5% 81,4% 22,2% citoplasmática (taxa de 90,9% 34,8% blastocistos) in vitro está aquém 1 Taxa de ovócitos em estádio de metáfase II; 2 Taxa de embriões em estádio de blastocisto, após sete dias de cultivo in vitro. Fonte: Hashimoto et al., 2002; Oyamada et al., 2004; Adona e Leal, 2004 da maturação nuclear (taxa de metáfase II) (HASHIMOTO et al., 2002; OYAMADA et al., 2004; ADONA e LEAL 2004). Por outro lado, in vivo, as taxas de blastocistos são de aproximadamente 80% (RIZOS et al., 2002).

23 Organização estrutural na maturação Citoesqueleto Microtúbulos, um dos componentes do citoesqueleto, são filamentos altamente dinâmicos e sua dinâmica se dá pela adição (polimerização) ou remoção (despolimerização) constante de novas unidades de tubulina α e β. Na transição do ciclo celular durante a maturação de ovócitos de mamíferos ocorre uma intensa reorganização dos microtúbulos (KIM et al., 2000). Durante a maturação meiótica, duas populações de centrossomos regulam coordenadamente o conjunto de microtúbulos nos eventos nucleares e citoplasmáticos, tais como formação do eixo meiótico orientado assimetricamente, segregação dos cromossomos durante a meiose, a extrusão do primeiro corpúsculo polar e a formação da segunda placa metafásica (ALBERTS et al., 1997; KIM et al., 2000; CAN et al., 2003; SUN et al., 2004). Os erros de segregação dos cromossomos durante uma ou outra divisão meiótica podem resultar em embrião aneuplóide após a fecundação, o que por sua vez pode ter grave conseqüência para o desenvolvimento (BRUNET et al., 2003; SUN et al., 2004). Especificamente nos mamíferos, a perda ou ganho de um cromossomo autossômico resulta em distúrbios fisiológicos e de desenvolvimento (ABRUZZO e HASSOLD, 1995). Para o sucesso da fecundação, o fuso meiótico no ovócito deve permanecer estável e corretamente organizado durante o bloqueio do ovócito em metáfase II (TERRET et al., 2003). Há evidências de que as proteínas da família MAPK (proteína cinase ativada por mitógenos) e a PKC (proteína cinase C) são responsáveis pela estabilidade dos microtúbulos mantendo o fuso meiótico estável em ovócitos de ratos (HORNE et al., 2003; TONG et al., 2003). Os substratos da MAPK (Figura 2), tais como a p90 rsk (proteína cinase ribossomo S6) e a MISS (MAPK de interação e estabilização do fuso) Miss Estabilidade do fuso MII mos MAPKK MAPK? P90 RSK CSF bloqueio Figura 2. Proteínas envolvidas na estabilidade do fuso meiótico e na atividade do CSF em camundongos. Fonte: Lefebvre et al., (2002).

24 8 parecem participar dessa estabilidade via proteínas mos/.../mapk (LEFEBVRE et al., 2002; TERRET et al., 2003). A rede de microtúbulos é usada por proteínas motoras (famílias das cinesinas e dineínas) para gerar movimentos periódicos das organelas no interior da célula. As proteínas motoras dependentes de microtúbulos desempenham uma função importante no posicionamento das organelas (ALBERTS et al., 1997). Os microfilamentos são os maiores componentes do citoesqueleto em ovócitos de mamíferos e fornecem a estrutura para divisão celular (KIM et al., 2000). Ficam situados principalmente no córtex celular (camada situada logo abaixo da membrana plasmática rica em actina e uma variedade de proteínas) de ovócitos em estádio VG (vesícula germinativa) e no eixo meiótico da célula depois do rompimento da VG (desestruturação da membrana nuclear) (ALBERTS et al., 1997; KIM et al., 2000). Estão envolvidos na incorporação do espermatozóide, na extrusão do corpúsculo polar e na migração dos grânulos corticais para o córtex celular durante a maturação ovocitária em diferentes espécies de mamíferos (CONNORS et al., 1998; KIM et al., 2000; SUN et al., 2001a) Organelas Mitocôndrias As mitocôndrias são a central bioenergética da célula com função claramente essencial que define a competência funcional dos ovócitos. São organelas especializadas que ocupam uma porção substancial do volume citoplasmático das células de origem materna. São responsáveis pela produção da maior parte da energia celular em forma de ATP (trifosfato de adenosina), por fosforilação oxidativa através do metabolismo dos carboidratos e dos ácidos graxos contidos no citoplasma provenientes do meio interno e externo (WILDING et al., 2001; CUMMINS, 2004). Nos ovócitos em geral, há uma grande concentração de mitocôndrias para suportar uma taxa mais elevada de síntese de moléculas dos processos fisiológicos envolvidos no desenvolvimento. A eficiência da matriz mitocondrial na conversão do piruvato em ATP é requerida para o processo de maturação e divisão celular (WILDING et al., 2001). A inabilidade das mitocôndrias

25 9 de aumentarem e/ou acumularem ATP tem sido ligada ao desenvolvimento anormal ou ao bloqueio do desenvolvimento embrionário (STEUERWALD et al., 2000). Durante a mitose, as mitocôndrias são distribuídas aleatoriamente entre as células filhas e no decorrer da ovogênese há um aumento substancial no número de mitocôndrias (6000 para mitocôndrias no ovócito em humanos) com uma variação expressiva entre ovócitos do mesmo estádio de desenvolvimento (REYNIER et al., 2001; CUMMINS, 2004). Porém, se os blastômeros embrionários não receberem uma população suficiente de mitocôndrias para produção de ATP podem tornare-se disfuncionais e fragmentados (CUMMINS, 2004). Há uma correlação similar entre o potencial para o desenvolvimento, índice de ATP e função mitocondrial tanto nos ovócitos quanto nos embriões bovinos (STOJKOVIC et al., 2001). Durante a maturação ovocitária as mitocôndrias modificam sua disposição dentro do citoplasma celular. Elas são localizadas próximas às gotas de lipídios que por sua vez aumentam de tamanho com a progressão da maturação (HYTTEL et al., 1997). Em ovócitos de mamíferos em estádio de VG, as mitocôndrias são encontradas em maior quantidade na periferia do citoplasma, e com pequenos grupos dispersos mais ao centro do ovócito (HYTTEL et al., 1997; SUN et al., 2001b). Já nos ovócitos em estádio metáfase II, as mitocôndrias estão mais centralizadas no citoplasma (HYTTEL et al., 1997; SUN et al., 2001b) Grânulos Corticais Os grânulos corticais (GC) são organelas produzidas a partir do complexo de Golgi e estão presentes apenas nos gametas femininos de todos os mamíferos, na maioria dos vertebrados e em muitos invertebrados (WESSEL et al., 2001; MAYES, 2002). São possuidores de uma população de moléculas que incluem proteases, glicosidases, enzimas e proteínas estruturais que contribuem para a barreira física e bioquímica que bloqueia a polispermia (WESSEL et al., 2001). Os GC são vesículas secretoras não renováveis e com advento da fecundação o seu conteúdo não é mais sintetizado. Os RNAs que codificam as diversas moléculas do conteúdo dos GC são degradados seletivamente no período

26 10 da maturação do ovócito e só voltam a ser transcritos e codificados nos novos ovócitos do ciclo reprodutivo (WESSEL et al., 2001). A principal função do conteúdo presente nos GC é de construir (equinodermos Ex.: ouriço-do-mar) ou de modificar (mamíferos Ex.: bovinos) a matriz extracelular (zona pelúcida) existente nos ovócitos para oferecer uma barreira bioquímica e mecânica que impede a entrada de mais de um espermatozóide no ovócito (WESSEL et al., 2001). Os GC são formados nos ovócitos em crescimento, mas sua redistribuição ocorre no período da maturação (DUCIBELLA et al., 1994; HYTTEL et al., 1997). Primeiramente, os GC podem ser identificados em pequenos grupos pelo citoplasma dos ovócitos em estádio de VG. Sua migração para a periferia do ovócito vai ocorrendo com o avanço da maturação. Em estádio de metáfase II, os GC estão distribuídos no córtex próximo à membrana plasmática (CONNORS et al., 1998; WESSEL et al., 2001; VELILLA et al., 2004) Mudanças moleculares e bioquímicas Durante o crescimento, a capacitação e a maturação do ovócito, diversas moléculas são sintetizadas e armazenadas. Essas moléculas vão dar suporte à maturação e ao desenvolvimento após a fecundação, até que o genoma do embrião se torne transcricionalmente ativo e as mensagens derivadas do embrião comecem a regular a embriogênese (CHA e CHIAN, 1998; MERMILLOD et al., 2000; MEIRELLES et al., 2004). A maioria dos RNAm (ácido ribonucléico mensageiro) no ovócito é sintetizada e acumulada durante o período de crescimento do ovócito (DE SOUSA et al., 1998). Esse metabolismo no ovócito é caracterizado pela transcrição e pela tradução ativa durante o período pré-ovulatório. Entretanto, a transcrição gênica bovina cessa antes da ovulação, assim, o ovócito, o zigoto e o embrião com menos de 16 blastômeros são dependentes do pool dos RNAs e das proteínas acumuladas durante o período de crescimento e de maturação do ovócito (GANDOLFI e GANDOLFI, 2001; MEMILI e FIRST 2000; LONERGAN et al., 2003). Ovócitos de muitas espécies dependem da síntese e da ativação de uma variedade de proteínas para que possam ingressar e prosseguir no processo de maturação ovocitária. Entre as proteínas mais importantes que regulam o

27 11 mecanismo da maturação ovocitária estão as proteínas do complexo MPF e as proteínas da família MAPK (SHENG et al., 2002; TIAN et al., 2002; JONES, 2004) Cinases dependentes de ciclinas (CDKs) As CDKs são uma família de serina/treonina cinases envolvidas na regulação do ciclo celular (CDK1, 2, 3, 4, 6 e 7), na transcrição (CDK7, 8 e 9) ou na função neuronal (CDK5) (SCHANG, 2004; MAPELLI et al., 2005). A atividade da CDK é dependente da interação com uma ciclina, cujos níveis são regulados seqüencialmente para assegurar que as fases do ciclo celular prossigam na ordem correta (ARRIS et al., 2000). Por exemplo, as ciclinas D interagem com as CDKs 4 e 6 durante a fase G1, a ciclina E com a CDK2 no final da fase G1, a ciclina A com a CDK2 na fase S/G2 e a ciclina B com a CDK1 na fase G2/M (Figuras 3 e 4) (KNOCKAERT et al., 2002; ARRIS et al., 2000). A falha no controle das CDKs e a conseqüente perda da função do ponto de verificação do ciclo celular têm sido relacionadas diretamente à patologia Ciclina B molecular do câncer (ARRIS et CDK1 Transição de prófase I para metáfase II Ringo Regulação da topoisomerase II al.,2000). F a s e Fase G2 CDK 2 Ciclina A Mitose F CDK 1 Ciclina B a s e M ovócito Meiose CDK2 CDK3 Ciclina E? CDK4 CDK5 CDK6 CDK7 Ciclina E Ciclina A Ciclina D P35, P25 P39, P29 Ciclina D Ciclina H Transição das fases G1/S e S/G2 Duplicação do centrossomo. Transição das fases G1/S Fase G1 Apoptose Migração dos neurônios Envolvida em outros eventos celular Fase G1, morte de células neurais. Ativação da CDK1 e CDK2 S CDK 2 Ciclina E Fase G1 CDK 4/6 Ciclina D Figura 3. Diagrama simplificado da atividade das CDKs/ciclinas na regulação do ciclo celular. Fonte: Knockaert et al., (2002) e Arris et al., (2000) CDK8 CDK9 Ciclina C Ciclina K Ciclina T Regulação da DK7/ciclina H Sinal de tradução e transcrição Processamento de RNA ou transcrição CDK11 Ciclina L Apoptose Figura 4. CDKs envolvidas na regulação do ciclo celular, na transcrição e na função neuronal. Fonte: Knockaert et al., (2002)

28 Fator promotor da maturação (MPF) O MPF é um heterodímero composto por uma cinase catalítica (p34 cdc2 ou CDK1) e uma subunidade de ciclina B regulatória (ABRIEU et al., 2001; JONES, 2004). Há ao menos três tipos de ciclinas B (B1, B2 e B3), e nos mamíferos parece que a ciclina B1 é a principal responsável pela atividade do complexo MPF. Embora a ligação da CDK1 com a ciclina B1 seja necessária, não é o suficiente para desencadear a atividade do complexo MPF (CASTRO et al., 2001; JONES, 2004), que é dependente dos mecanismos subseqüentes: fosforilação da CDK1 nos resíduos de tirosina 15 (Y15), Síntese M CDK1 Ciclina B treonina 14 (T14), treonina 161 E AMPc I O (T161) e a posterior S Wee1 PKC E MPF Myt1 desfosforilação dos resíduos B L Y15 e T14 (KIKUCHI et al., O Q Ativação 2000; VAILLANT et al., 2001; U Ovócito em VG E CDC25 A JOSEFSBERG e DEKEL, D A Condensação dos cromossomos 2002). Em termos gerais a Rompimento da VG MPF Ativo M Mos -RMAm poliadenilação CDK1 é fosforilada em Y15 e E I Mos síntese, MEK MAPK ativação. O T14 pelas proteínas cinases S E MPF Ativo Formação do fuso Myt1 e Wee1, que causam uma A T fosforilação inibitória da CDK1. I Extrusão do 1ª corpúsculo polar V MPF Ativo A Nesse estádio o complexo MPF D A CSF estável está formado (pré-mpf), mas Metáfase II bloqueada ainda está inativo (Figura 5). A n Fecundação ou ativação artif. CSF instável ativação do MPF depende da CDK1 desfosforilação em Y15 e T14 Figura 5. Diagrama simplificado do mecanismo de ativação do MPF. Fonte: Dekel (2005). pela proteína fosfatase CDC25 (MPF ativo) (KIKUCHI et al., 2000; JONES, 2004). O aumento da atividade da proteína CDC25 e a baixa atividade das proteínas cinases Myt1 e Wee1 são necessários para a ativação completa do complexo MPF (JONES, 2004). A variação da atividade do MPF pode ser detectada nos ovócitos bovinos durante a maturação. Sua atividade é baixa em VG passando a ser observada no início do rompimento da VG. Alcança um pico no estádio de metáfase I e declina sua

29 13 atividade durante a transição entre os estádios de metáfase I e metáfase II (KUBELKA et al., 2000), reativando para entrada do ovócito em metáfase II. Sua inativação nos ovócitos em estádio de metáfase II é induzida pela fecundação ou pela ativação paternogenética (NEBREDA e FERBY, 2000; KUBELKA et al., 2000; KIKUCHI et al., 2000; ABRIEU et al., 2001; LEDAN et al., 2001). A inativação abrupta do MPF é considerada como um disparador necessário para o escape da meiose bloqueada em metáfase II (TAIEB et al., 1997). O processo de desorganização do heterodimero do complexo MPF independe da sua ativação catalítica, que é causada geralmente pela proteólise da ciclina B. Em ovócitos fecundados de camundongos e de suínos, a degradação da ciclina B foi claramente relacionada com a inativação do complexo MPF (WINSTON, 1997; KIKUCHI et al., 1999). O MPF é um dos principais reguladores das alterações morfológicas durante a maturação ovocitária, regulando a condensação dos cromossomos, o rompimento do envelope nuclear, a reorganização dos microtúbulos e outras organelas citoplasmáticas com a participação de outras proteínas (KIM et al., 2000; KANO et al., 2000; KRISCHEK e MEINECKE, 2002; KUBELKA et al., 2002; LEFEBVRE et al., 2002) Proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK) Um segundo grupo importante de proteínas que estão envolvidas na progressão da meiose pertencem à família das serina/treonina cinases, as proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPK) (KUBELKA et al., 2000). Essas proteínas são ativadas dentro de vias específicas de transdução de sinais (Figura 6), por sinais extracelulares (NEBREDA e FERBY, 2000). Por esta razão, a MAPK também é chamada de ERK (cinase regulada por sinal extracelular suas variantes, ERK1/2 p44/p42 kda) (KRISCHEK e MEINECKE, 2002). A via intracelular de transdução de sinal consiste na proteína mos (do oncogene c-mos) que ativa a MEK (MAPKK) que fosforila a ERK (MAPK) (CHA e CHIAN, 1998; KRISCHEK e MEINECKE, 2002; SUN et al., 2002).

30 14 A ampla faixa de atuação das MAPKs é mediada pela fosforilação de diversos substratos, incluindo fosfolipases, fatores de transcrição e proteínas do citoesqueleto. As MAPKs também catalisam fosforilação e a ativação de diversas proteínas cinases, denominadas de proteínas cinases ativadas pelas MAPKs, que representam um adicional enzimático de vários espectros em diferentes células (ROUX e BLENIS, 2004). As MAPKs são amplamente ativadas por fatores de crescimento e por soro, com uma ativação menor pelo estresse, efeito osmótico e pela desorganização dos microtúbulos. MAP4K Ras Uma variedade de estímulos GDP GTP GDP GTP diferentes pode ativá-las, mas no MAP3K mos Raf-1 AMPc geral a ERK1 e ERK2 são ativadas MAPKK MEK PKA preferencialmente em resposta aos MAPK ERK fatores de crescimento, enquanto CSF as cinases JNK (c-jun amino Figura 6. Diagrama simplificado das vias de ativação das MAPKs. Fonte: Cha e Chian 1998; Nebreda e Ferby, 2000; Kubelka et al., 2000; terminal cinase) e p38 cinase são Krischek e Meinecke, 2002; Sun et al., mais responsivas aos estímulos de estresse e efeitos osmóticos (CHEN et al., 2001; ROUX e BLENIS, 2004). A via MAPK é ativada universalmente durante a maturação meiótica em ovócitos de vertebrados. Entretanto, o tempo requerido para sua ativação é díspar nas diferentes espécies (NEBREDA e FERBY, 2000). A ativação da MAPK em ovócitos bovinos ocorre após 8 horas de cultivo in vitro e apresenta um aumento gradual até horas e se mantém estável até o final da maturação (KUBELKA et al., 2000). As duas principais isoformas (ERK1/2) da MAPK são ativadas com a proximidade do rompimento da VG em ovócito bovinos (KUBELKA et al., 2000). Isso sugere que a MAPK não é requerida para o reinício da meiose, mas é essencial em eventos pós-rompimento da VG (KANO et al., 2000; LEFEBVRE et al., 2002). Porém, a injeção de MAPK ativa em ovócitos de suíno ou de bovino induz o rompimento da VG, indicando que essa proteína promove o reinício da meiose em condições especiais (FISSORE et al., 1996; INOUE et al., 1998).

31 Competência ovocitária A competência para a progressão da maturação meiótica em ovócitos de mamíferos é adquirida durante o crescimento folicular (PAVLOK et al., 2000; MIYANO, 2003). Nesse contexto, para que o ovócito tenha competência para a maturação tanto nuclear como citoplasmática esse deve completar sua fase de crescimento. Em bovinos foi demonstrado que folículos de diâmetro acima de 3 mm de diâmetro contêm ovócitos ( μm de diâmetro) com potencial de desenvolvimento mais elevado que os de folículos menores (GANDOLFI e GANDOLFI, 2001). Ovócitos obtidos de folículos maiores de 3 mm de diâmetro resultam em blastocistos com maior número de células nucleadas, comparados com os ovócitos obtidos de folículos menores que 3 mm (AVELINO et al., 1998). Ainda não está totalmente compreendido como os ovócitos adquirem a competência meiótica durante sua fase de crescimento e se tornam competentes para reiniciar e terminar a meiose. Há evidências de que a aquisição da competência meiótica nos ovócitos está correlacionada com as moléculas de RNAs e de proteínas estocadas durante a fase de crescimento e maturação do ovócito e com o aumento da funcionalidade das mitocôndrias (DE LA FUENTE e EPPIG, 2001; STOJKOVIC et al., 2001; TOMEK et al., 2002; CHIAN et al., 2003). Essas moléculas são usadas para sustentar as fases iniciais do desenvolvimento embrionário antes que a transcrição do DNA do embrião se torne ativa (DE LA FUENTE e EPPIG, 2001). Os padrões de síntese protéica aumentam antes do rompimento da vesícula germinativa em ovócitos durante o cultivo de maturação, sugerindo que essa síntese de proteínas possa ser importante para o subseqüente desenvolvimento embrionário (TOMEK et al., 2002; CHIAN et al., 2003). Isso faz do ovócito uma célula muito especial, completamente diferente das células somáticas, onde os RNAs e as proteínas se submetem geralmente a uma rápida rotação de estoque. Para permitir o estoque e o uso oportuno de tais moléculas armazenadas, vários mecanismos necessitam ser eficaz nesse controle no ovócito (GANDOLFI e GANDOLFI, 2001; TOMEK et al., 2002). Em bovinos, os RNAs e as proteínas do ovócito conduzem o desenvolvimento embrionário inicial após a fecundação até o 4º ciclo celular quando o controle genômico (estádio de 8 a 16 células) do embrião torna-se evidente. Muitos dos

32 16 produtos derivados dos transcritos maternos são necessários para preparar o maquinário biológico do embrião (SIRARD, 2001; DIELEMAN et al., 2002; KAÑKA, 2003). A competência meiótica em ovócitos de Xenopus sp está correlacionada com as mudanças no acúmulo e na ativação de moléculas do ciclo celular (JESSUS e OZON, 2004). Esses mesmos Folículos 0,5-0,7mm 1,0-1,5 mm 4,0-6,0 mm Ovócitos 104 μm 109 μm 122μm mecanismos foram observados em ovócitos em crescimento de suínos histona H1 que começam a acumular moléculas CDK1. Já a ciclina B foi MBP observada em ovócitos de folículos Cultivo (h) h antrais pequenos quando cultivados em meio de maturação (Figura 8), Figura 8. Mudanças nas atividades da CDK1 e da MAPK durante a maturação de ovócitos de suínos em vários estádios do crescimento folicular. As atividades da CDK1 e da MAPK foram detectadas pela mas a CDK1 foi negativamente fosforilação de histona H1 e da proteína básica de mielina (MBP), respectivamente. Adaptado a partir de Miyano, fosforilada e assim inativada, talvez pela proteína Myt1 (KANAYAMA et al., 2002; MIYANO, 2003). Nos folículos de 1,0-1,5 mm de diâmetro, os ovócitos iniciam a meiose, mas param em metáfase I. Eles são capazes de ativar o MPF, mas não estabelecem a cascata de proteínas da via MAPK (KANAYAMA et al., 2002; MIYANO, 2003). Os ovócitos em crescimento desenvolvem primeiramente a habilidade de ativar CDK1 e posteriormente de ativar a via MAPK. Somente os ovócitos com o crescimento completo possuem competência para ativar efetivamente as duas vias do ciclo celular. Na produção de embriões in vitro, a maioria dos ovócitos bovinos são provenientes de folículos de 2 a 6 mm de diâmetro (ADONA e LEAL, 2004; DALVIT et al., 2005). A remoção dos ovócitos dos folículos antes de eles finalizarem a foliculogênese é, provavelmente, um dos fatores envolvidos na baixa produção de embriões in vitro. Assim sendo, a interrupção da foliculogênese seria um fator responsável pela redução da competência ovocitária. Para contornar a foliculogênese interrompida a que os ovócitos são submetidos, uma alternativa seria mantê-los por um determinado período com a mesma configuração nuclear daquela encontrada nos folículos. Para tal, os ovócitos seriam submetidos ao bloqueio meiótico, evitando a retomada da meiose logo após a sua remoção dos folículos, para que tenham o tempo necessário para sofrerem as mudanças necessárias antes de serem submetidos à maturação in vitro.

33 Bloqueio meiótico A maturação espontânea em ovócitos de bovinos ocorre in vitro após sua retirada do ambiente folicular, o que se deve, provavelmente, à remoção do sinal inibidor proveniente do folículo. Estudos sugerem que o fator inibidor que controla a retomada da meiose seja produzido pelas células da teca e/ou granulosa (células foliculares) (FOOTE e THIBAULT, 1969; SIRARD et al., 1998). KOTSUJI et al. (1994) demonstraram que o fator inibidor da meiose em ovócitos bovinos seria sintetizado pelas células da granulosa, mas que as células da teca contribuiriam na amplificação desse sinal. O mecanismo que envolve o reinício da meiose também está associado a redução nas concentrações de AMPc (monofosfato de adenosina cíclica) (CONTI et al., 1998). O AMPc é uma molécula sinalizadora intracelular que exerce um importante controle na meiose em mamíferos, anfíbios e em alguns invertebrados (BILODEAU- GOESEELS, 2003). A redução do AMPc no interior do ovócito parece estar envolvida com a ruptura da vesícula germinativa, ao menos in vitro. Assim, os níveis elevados da AMPc dentro do ovócito mantêm o bloqueio meiótico, visto que a redução do AMPc é um sinal necessário para a maturação ovocitária (CONTI et al., 1998; EYERS et al., 2005). A regulação nas atividades enzimáticas de uma série de proteínas cinases e fosfatases controla a meiose em ovócitos de mamíferos. Dessa forma, a meiose pode ser bloqueada por inibidores que mantenham altas concentrações de AMPc no interior do ovócito (BILODEAU-GOESEELS, 2003), por inibidores não específicos da síntese protéica (MEINECKE et al., 2001), de proteínas cinases (ANDERIESZ et al., 2000; DODE e ADONA, 2001) e por inibidores específicos da fosforilação de proteínas CDKs (ADONA e LEAL, 2004). In vitro, o reinício da meiose ocorre porque o ovócito é liberado da influência dos inibidores provenientes do folículo (KOTSUJI et al., 1994). No entanto, a maturação in vitro resulta em uma redução na produção de embriões, sugerindo que nem todos os ovócitos conseguem maturar adequadamente (maturação citoplasmática). Portanto, diferentes protocolos estão sendo usados in vitro para permitir que todos (ou a maioria) os ovócitos coletados terminem a maturação nuclear sem afetar a qualidade dos mesmos, a fim de maximizar a produção de

34 18 embriões (ADONA e LEAL, 2004; SCHOEVERS et al., 2005). O uso de inibidores fisiológicos ou farmacológicos pode ser uma alternativa in vitro para um cultivo de pré-maturação antes de submeter os ovócitos à maturação, fecundação e ao desenvolvimento embrionário. A ativação das cinases dependentes de ciclinas (CDKs - MPF) é um ponto chave no reinício da meiose em ovócitos. Na tentativa de sincronizar o desenvolvimento nuclear nos ovócitos in vitro, alguns estudos demonstraram a inibição da ativação do MPF pelo aumento de níveis intracelulares de AMPc com dbcamp ou hipoxantina (SUN et al., 1999; MA et al., 2003), pela inibição não específica da síntese protéica com cicloheximida (MEINECKE et al., 2001) ou pela inibição não específica de proteínas cinases com 6-dimetilaminopurina (ANDERIESZ et al., 2000; DODE e ADONA, 2001). Embora a inibição da ativação do MPF seja bem sucedida com o uso dessas drogas, os efeitos não específicos desses inibidores são prejudiciais para o desenvolvimento subseqüente do ovócito. As CDKs desempenham um papel central na regulação do ciclo da divisão celular, o que lhes faz um alvo promissor para o desenvolvimento de agentes terapêuticos do câncer. Um grande esforço foi feito nos últimos anos na busca de inibidores específicos de CDKs de baixo peso molecular (BRAÑA et al., 2004). A butirolactona I é um inibidor natural isolado do fungo Aspergillus terreus, que exibe atividade antiproliferativa, inibindo seletivamente em mamíferos as cinases CDK2 e CDK1, que executam um importante papel na progressão do ciclo celular nas fases G1/S e G2/M, respectivamente (SCHIMMEL et al., 1998; SCHANG, 2004). Entretanto, tem pouco efeito nas proteínas cinases ativadas por mitógenos, proteína cinase C, cinases dependentes de AMPc, caseína cinase I e II e no receptor tirosina cinase do fator de crescimento epidermal (SCHIMMEL et al., 1998; SAX et al., 2002; BRAÑA et al., 2004). A butirolactona I comporta-se como um inibidor competitivo pelo local de ligação do ATP na CDK1 (SAX et al., 2002; BRAÑA et al., 2004). É possível manter os ovócitos bovinos em estádio de vesícula germinativa in vitro por um determinado período de tempo com o uso de inibidores específicos ou não de CDKs (butirolactona I, roscovitina, cicloheximida e 6-dimetilaminopurina). Essas informações são importantes, pois tornam possível fazer um cultivo de prématuração para, posteriormente, induzir a maturação final. Assim, permite ao ovócito um tempo maior para sofrer as mudanças necessárias à aquisição da competência meiótica, visto que estes são submetidos a uma foliculogênese interrompida, sendo

35 19 removidos precocemente dos folículos e ocorrendo a retomada espontânea da meiose. Entretanto, convém ressaltar que nesse tipo de estudo é importante verificar não só a efetividade das substâncias em inibir o reinício da meiose, mas também sua eficiência na reversibilidade e ausência de efeitos negativos sobre o desenvolvimento embrionário.

36 20 3. OBJETIVOS O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito da butirolactona I no cultivo de pré-maturação sobre a meiose, estruturas celulares e desenvolvimento dos ovócitos bovinos cultivados in vitro. Mais especificamente foram avaliados: 1) as condições de redução da concentração de BL I para indução de bloqueio meiótico e sua reversão (maturação in vitro); 2) a cinética de maturação pós-bloqueio; 3) a organização do citoesqueleto (microtúbulos e microfilamentos) após o bloqueio meiótico e sua reversão; 4) a distribuição de organelas (grânulos corticais e mitocôndrias) após o bloqueio meiótico e sua reversão; 5) o efeito do bloqueio meiótico sobre o desenvolvimento embrionário.

37 21 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Coleta de ovários e ovócitos Ovários de fêmeas bovinas foram coletados em frigoríficos logo após o abate e transportados em solução fisiológica estéril (NaCl 0,9% Sigma, S9625) acrescida de antibióticos (100 UI/mL de penicilina Sigma, P7794 e 100 ug/ml de estreptomicina Sigma, S9137) a uma temperatura de 30º C. No laboratório, os ovários foram lavados em NaCl 0,9% e os folículos com diâmetro de 2 6 mm foram aspirados com auxílio de uma agulha de 18 G (1,20 X 40 mm) conectada a uma seringa descartável de 10 ml. O líquido folicular contendo os ovócitos foi depositado em tubos cônicos de 50 ml (Cellstar, ) e mantido em repouso para decantação por 5 minutos. A porção superior do líquido foi retirada e na porção restante foram adicionados 3-5 ml de meio H199 (TCM199 com 25 mm de Hepes Gibco, ) acrescido de 100 UI/mL de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina; suplementado com 1% de soro fetal bovino Gibco, ). Posteriormente, o material do tubo foi transferido para uma placa de Petri (60 x 15 mm Falcon, ), onde foi feita a busca dos ovócitos sob estereomicroscópio para avaliação e classificação dos mesmos. Somente ovócitos classificados como graus I e II (DE LOOS et al., 1991), contendo três ou mais camadas de células do cumulus oophorus e citoplasma uniforme, foram utilizados para os experimentos.

38 Solução estoque do inibidor O inibidor de cinases dependentes de ciclinas (CDKs) butirolactona I (Biomol, ) foi preparado em solução estoque de 50 mm em dimetilsulfóxido (DMSO Sigma, D5879) e rediluído para 5 mm com B199 [TCM199 com sais de Earle e com 20 mm de bicarbonato de sódio (Gibco ) suplementado com 10 μg/ml de gentamicina (Sigma, G1272)], aliquotado em tubos para microcentrífuga e conservado no freezer a -20º C Bloqueio da meiose com butirolactona I Para o bloqueio da meiose os ovócitos bovinos foram cultivados in vitro com butirolactona I (BL I) diluída em meio B199 (suplementado com 0,2 mm de piruvato Sigma, P5280) na concentração apropriada do experimento (descrita posteriormente). O cultivo foi feito em gotas de 100 µl de meio de bloqueio (±20 ovócitos por gota), sob óleo mineral (Sigma, M8410) a 38,5º C em atmosfera de 5% de CO 2 em ar Determinação do estádio da meiose Para determinação do estádio da meiose, os ovócitos foram desnudados (remoção das células do cumulus oophorus) em tubo de 5 ml com 0,3 ml de PBS acrescida de 1% de SFB (soro fetal bovino) e agitados no vortex por 4 minutos (Figura 9). Os ovócitos desnudos foram fixados entre lâmina e lamínula por 24 horas em etanol (Synth, A BJ) e ácido acético (Synth, A BJ) 3:1. Após a fixação, foram corados com lacmóide 0,004% (Aldrich, ) e observados em microscópio de contraste de fase para determinação dos estádios da meiose. Os ovócitos foram classificados de acordo com a configuração nuclear em vesícula germinativa (VG), metáfase I (M I), anáfase I (A I), telófase I (T I) e metáfase II (M II)

39 23 (Figura 10). A taxa de bloqueio foi avaliada como a percentagem de ovócitos em VG e a de reversão como a percentagem de ovócitos em M II. 1) Procedimento para desnudar os ovócitos 2) Preparação das lâminas para fixação dos ovócitos P B S Em um tubo de 5 ml adicionar 0,3 ml de PBS e os ovócitos. Agitar no vortex (velocidade 6-7) por 4 minutos; lavar a parede do tubo com 2 ml de meio; transferir o conteúdo para uma placa de Petri para seleção dos ovócitos. Lâmina: Fazer uma gota de ±4μL com ± 25 ovócitos. Lamínula: Colocar pequenas gotas de cola (silicone) nas bordas. 3) Pressionar a lamínula sobre a lâmina suavemente até fazer uma pressão nos ovócitos pouca pressão os ovócitos ficam soltos entre a lâmina/lamínula; o inverso os ovócitos rompem. 4) Colocar a lâmina no fixador 3:1 (álcool etílico e ácido acético). 5) Deixar fixando por no mínimo 24 h. 6) coloração com lacmóide ou orceina acética a) Colocar a lâmina em um ângulo de 45, adicionar o corante na parte superior da lâmina; b) Corar por ±5 minutos; c) se for necessário remover o excesso de corante com o próprio fixador; d) Não deixar secar a lâmina vedar com esmalte. (corante: 40 ml ácido acético, 60 ml água + 0,004% do corante aquecer para dissolver melhor e filtrar) Figura 9. Procedimentos para fixação e coloração de ovócitos. A B C D 400X 400X 200X 200X Figura 10. Classificação da meiose de ovócitos bovinos. A) vesícula germinativa; B) metáfase I; C) anáfase I/telófase I; D) metáfase II. Seta vermelha: placa metafásica e seta azul: 1 corpúsculo polar Maturação in vitro Após o período de bloqueio, os ovócitos foram lavados três vezes em meio livre de inibidor e transferidos para o meio de maturação [B199 suplementado com 10% de SFB (soro fetal bovino), 5,0 µg/ml de LH (hormônio luteinizante, Bioniche Lutropin-v), 0,5 µg/ml de FSH (hormônio folículo estimulante, Bioniche Folltropinv), 0,2 mm de piruvato e 10 μg/ml de gentamicina]. Como controle, um grupo de ovócitos foi submetido à maturação sem sofrer cultivo prévio de bloqueio. O cultivo

40 24 de maturação in vitro (MIV) foi feito em gotas de 100 µl de meio de maturação (±20 ovócitos por gota), sob óleo mineral a 38,5 º C e atmosfera de 5% de CO 2 em ar Microtúbulos Para avaliação dos microtúbulos os ovócitos foram desnudados e fixados em 3,7% de paraformaldeído (Sigma, P6148) acrescido de 0,6% Triton X-100 (USB, ) em PBS (livre de cálcio e magnésio) com 0,1% de PVA (álcool polivinílico - Sigma, P8136) por 30 minutos; lavados três vezes em PBS com 0,1% de PVA (PP); bloqueados com 3% de soro de cabra (Invitrogen, ) em PP por 45 minutos; corados com anticorpo anti-alfa tubulina conjugada com FITC (Sigma, F23168) (1:100) em PP por uma hora; lavados por três vezes em PP; corados com 10 μg/ml de iodeto de propídio (Sigma, P4170) em PP por 15 minutos; lavados três vezes em PP e montados entre lâmina e lamínula com glicerol (USB, ) para a avaliação sob microscópio de epifluorescência Microfilamentos Para avaliação dos microfilamentos os ovócitos foram desnudados e fixados em 3,7% de paraformaldeído mais 0,6% Triton X-100 em PP por 30 minutos; lavados três vezes em PP; colorados com 1 μg/ml de faloidina conjugada com FITC (P5282) mais 10 μg/ml de iodeto de propídio em PP por 30 minutos; lavados três vezes em PP e montados entre lâmina e lamínula com glicerol para a avaliação sob microscópio de epifluorescência.

41 Grânulos corticais Para avaliação dos grânulos corticais os ovócitos foram desnudados e a zona pelúcida foi removida com 0,5% protease (Sigma, P8811) em PBS (livre de cálcio e magnésio) por ±6 minutos a 38,5 C; fixados em 3,7% de paraformaldeído em PP por 30 minutos; incubados em solução de bloqueio [SB: PBS suplementado com 0,1% de BSA, 0,751% de glicina (Sigma, G8790) e 0,2% de azida sódica (Research Organics, 0939S)] por duas horas; permeabilizados com 0,1% Triton X-100 em SB por 5 minutos; lavados três vezes em SB; corados com 1 μg/ml de lectina Lens culinaris (Sigma, L9262) e 10 μg/ml de iodeto de propídio em SB por 15 minutos; lavados três vezes em SB e montados entre lâmina e lamínula com glicerol para a avaliação sob microscópio de epifluorescência Mitocôndrias Para avaliação das mitocôndrias os ovócitos foram desnudados; corados com 0,5 µm de Mitotracker red (Molecular probes) e 10 µg/ml Hoechst (Sigma, B2261) em PP por 20 minutos; lavados três vezes em PP e montados entre lâmina e lamínula para a avaliação sob microscópio de epifluorescência Fecundação e cultivo in vitro Para a fecundação in vitro (FIV) foi utilizado sêmen congelado de um mesmo touro e da mesma partida, o qual foi preparado segundo a técnica de gradiente Percoll (Amersham Biosciences, ). Em um tubo cônico de 15 ml (Tedia Brazil, ), foi adicionado 1 ml de Percoll 90% e, em seguida, 1 ml de Percoll 45% (Apêndice). O gradiente foi mantido na estufa de CO 2 por uma hora antes de sua utilização. O sêmen foi descongelado a uma temperatura de 37 C por 30 segundos e, em seguida, adicionado na porção superior do gradiente de Percoll e

42 26 centrifugado por minutos a 650 g. Após a retirada do sobrenadante foram adicionados 4 ml de meio TALP-sp (Apêndice), e uma nova centrifugação de 2 minutos a 200 g foi realizada para remover o excedente do Percoll. Os espermatozóides foram adicionados na gota de fecundação a uma concentração final de 2 x 10 6 espermatozóides/ml. A fecundação foi feita em TALP FIV (Apêndice) suplementado com 2 µm penicilamina (Sigma, P4875), 1 µm hipotaurina (Sigma, H1384), 250 µm epinefrina (Sigma, E1635) e 20 µg/ml heparina (181 UI/mg, USB, ). Os espermatozóides e os ovócitos foram coincubados em gotas de 100 µl de meio sob óleo mineral em placa de Petri (35 x 10 mm. Corning, ) por um período de 18 horas. Após as 18 horas de FIV, os ovócitos foram parcialmente desnudados com auxílio de um micro-pipetador de 50 µl. Após o desnudamento parcial, os ovócitos foram transferidos para o meio de cultivo in vitro SOF (fluido de oviduto sintético - Apêndice) em gotas de 100 µl e com 48 horas de cultivo in vitro (D2), foi avaliada a taxa de clivagem. Os ovócitos clivados permaneceram no meio de cultivo in vitro e os demais foram removidos e descartados. No quinto dia (D5) de cultivo in vitro foi feita a troca (feeding) parcial (40%) do meio de cultivo e a partir do sétimo (D7) e do oitavo dia (D8) foi feita a avaliação das taxas de formação de blastocisto (D7), de eclosão (D8) e a contagem do número de células dos embriões eclodidos (D8). O cultivo in vitro dos embriões foi feito em estufa de CO 2 a 38,5ºC em atmosfera de 5% de CO 2 em ar. Para a contagem do número de células dos embriões em estádio de blastocisto eclodido, eles foram corados com 10 µg/ml de Hoechst em PP por 15 minutos; lavados três vezes em PP e montados entre lâmina e lamínula para a avaliação sob microscópio de epifluorescência.

43 Delineamento experimental Experimento 1: Avaliação de concentrações decrescentes de BL I em meio suplementado com BSA. Nesse experimento foram avaliadas concentrações decrescentes de BL I (100, 50 e 25 μm) em meio de cultivo (B-199) suplementado com albumina sérica bovina (BSA, Sigma, A9647) (Figura 11), para avaliar a capacidade da BL I em promover o bloqueio meiótico em diferentes concentrações. Os ovócitos foram cultivados na presença ou ausência (controle) de BL I por um período de 24 h. Após o período de cultivo in vitro, os ovócitos foram desnudados, fixados, corados e avaliados sob microscópio de contraste de fase para determinação das taxas de bloqueio da meiose (VG). Um grupo de ovócitos foi fixado logo após a aspiração (controle zero hora). 24 h de cultivo com BSA 100 μm de BL I 50 μm de BL I 25 μm de BL I Controle C/24 desnudados fixados corados Controle C/0 Avaliado logo após a aspiração Figura 11. Esquema representativo do delineamento do experimento 1. avaliados Experimento 2: Avaliação de concentrações crescentes de BL I em meio sem suplementação de BSA Nessa avaliação, não foi usada suplementação protéica (BSA) no meio de bloqueio (Figura 12). O bloqueio da meiose foi feito em meio B199 com diferentes concentrações de BL I (10, 15, 20 e 25 μm) com o intuito de investigar a capacidade do inibidor em bloquear a meiose em concentrações ainda mais baixas, porque segundo KUBELKA et al., (2000) o inibidor (BL I) poderia interagir com o BSA, reduzindo sua disponibilidade no meio. Com base nesse estudo os ovócitos bovinos

44 28 foram cultivados na presença ou ausência (controle) do inibidor sem suplementação de BSA por um período de 24 horas. Após o cultivo, os ovócitos foram desnudados, fixados, corados e avaliados sob microscópio de contraste de fase para determinação das taxas de bloqueio da meiose (percentagem de VG). 24 h de cultivo sem adição de BSA 10 μm de BL I 15 μm de BL I 20 μm de BL I Avaliados 25 μm de BL I Controle C/24 Figura 12. Esquema representativo do delineamento do experimento Experimento 3: Efeito do bloqueio da meiose na maturação nuclear Para a avaliação da maturação pós-bloqueio da meiose, ovócitos bovinos foram cultivados na presença (10 μm em meio sem BSA e 100μM em meio com BSA) de BL I por 24 h, conforme definido nos experimentos 1 e 2. Como controle, um grupo submetido apenas à maturação in vitro. Após o período de bloqueio, ambos os grupos foram maturados in vitro por mais 24 h (Figura 13). A seguir, foram desnudados, fixados, corados e avaliados sob microscópio de contraste de fase para determinação das taxas de maturação (percentagem de metáfase II). 100 μm de BL I 24 h de MIV 24 h de bloqueio 10 μm de BL I 24 h de MIV Avaliados Controle 24 h de MIV Figura 13. Esquema representativo do delineamento do experimento 3.

45 Experimento 4: Cinética da maturação nuclear pós-bloqueio da meiose Nesse experimento, os ovócitos foram bloqueados por um período de 12 horas na presença (100 μm de BL I) ou na ausência (10 μm de BL I) de BSA e avaliados ao longo da MIV, nos horários de 6, 12 e 18 horas de maturação (Figura 14). Os períodos de bloqueio da meiose e da maturação (reversão) foram baseados no estudo feito por ADONA e LEAL (2006). Após cada período de maturação (6, 12 e 18 horas), os ovócitos foram desnudados, fixados, corados e avaliados sob microscópio de contraste de fase para determinação do estádio de maturação nuclear. Um grupo de ovócitos submetido somente à MIV também foi avaliado nos mesmos períodos dos tratados com BL I. Cinética da maturação pós-bloqueio da meiose 100 μm debli 12 horas de bloqueio MIV Horários das avaliações 6 h de MIV 10 μm de BL I 12 h de MIV Avaliações Controle 18 h de MIV Figura 14. Esquema representativo do delineamento do experimento Experimento 5: Efeito do bloqueio da meiose na organização dos microtúbulos e dos microfilamentos Nesse experimento foram avaliados os efeitos do bloqueio meiótico em condições de baixa e alta concentração de BL I (definidos nos experimentos 1 e 2) na organização dos microtúbulos e dos microfilamentos. Os ovócitos foram bloqueados por 24 horas e posteriormente cultivados em meio de maturação. Ovócitos foram coletados às 0, 6, 12, 18 e 24 horas de pós-bloqueio para a avaliação da organização dos microtúbulos, microfilamentos. A progressão meiótica foi avaliada concomitantemente (Figura 15). O controle foi avaliado nos mesmos

46 30 horários ao longo da MIV sem ter sofrido inibição prévia. Um grupo de ovócitos foi avaliado logo após a aspiração (controle 0h) e um outro no final das 24 horas de bloqueio (antes do início da MIV controle 24h). 100 μm debli 24 horas de bloqueio 10 μm de BL I Avaliação dos microtúbulos e dos microfilamentos Horários das avaliações 0 h de MIV MIV 6 h de MIV 12 h de MIV 18 h de MIV Avaliações Controle 24 h de MIV Figura 15. Esquema representativo do delineamento do experimento Experimentos 6: Efeito do bloqueio da meiose na distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias. Nesse experimento foi avaliado o efeito da BL I na distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias nos ovócitos tratados com duas concentrações de BL I, uma na ausência (10 μm) e outra na presença (100 μm) de BSA. Os ovócitos foram bloqueados por 24 horas e após esse período de bloqueio foram divididos em dois grupos, uns para avaliação imediata (24 horas de bloqueio) e os demais cultivados em meio de maturação e coletados somente depois de 24 horas de MIV (Figura 16), para a avaliação do efeito na distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias nos ovócitos tratados com o inibidor do ciclo celular. No grupo controle, a avaliação foi feita em dois momentos, um logo após a aspiração (zero hora) e uma outra no final da maturação (24 horas de MIV).

47 μm de BL I Avaliação dos grânulos corticais e das mitocôndrias 24 horas de bloqueio Bloqueados Maturados 10 μm de BL I Avaliados Avaliados Controle Imaturos Maturados Figura 16. Esquema representativo do delineamento do experimento Experimento 7: Efeito da BL I no desenvolvimento embrionário in vitro Nesse experimento foi avaliado o efeito de BL I sobre os ovócitos que foram expostos (tratados) ou não (controle) a duas concentrações do inibidor, uma na ausência (10 μm de BL I) e outra na presença de BSA (100 μm de BL I). Após o período de bloqueio (24 horas) e de maturação in vitro (MIV, 21 horas), os ovócitos foram submetidos à fecundação in vitro (FIV, 18 horas) seguida pelo cultivo in vitro (CIV, 8 dia) (Figura 17). Com 48 horas de CIV (D2), foram avaliados quanto às taxas de clivagem. As taxas de desenvolvimento dos embriões em estádio de blastocistos foram determinadas no dia 7 (D7) da CIV. No dia 8 (D8) da CIV foram determinadas as taxas de eclosão e o número total de células dos blastocistos eclodidos. Controle/MIV FIV CIV 10 μm de BLI MIV FIV CIV 100 μm de BLI MIV FIV CIV 24 horas 21 horas 18 horas D2 D7 D8 Clivagem Blastocistos Figura 17. Esquema representativo do delineamento do experimento 7. Eclosão Nº de células

48 Análise estatística Os dados foram avaliados utilizando metodologia de quadrados mínimos, por meio do procedimento PROC GLM do programa Statistical Analysis System, versão (SAS, 1995). As variáveis foram transformadas, de acordo a função arco seno (raiz - percentagens), de acordo com as recomendações de Banzatto e Kronca (1989). Os dados dos números de células dos blastocistos não foram transformados, sendo analisados em escala original. Para os resultados significativos nas análises de variância foi utilizado o teste t de Student como procedimento de comparações múltiplas entre os grupos. O nível de significância foi de 5% para evidenciar diferenças entre os tratamentos.

49 33 5. RESULTADOS 5.1. Experimento 1 Nesse experimento foram avaliadas diferentes concentrações de butirolactona I (BL I) em meio de cultivo B199 suplementado com albumina sérica bovina (BSA), visando determinar a concentração mais adequada em estudos de bloqueio meiótico em ovócitos bovinos. A maioria dos ovócitos tratados nas concentrações de 100 (B100), 50 (B50) e 25 µm (B25) de BL I permaneceram bloqueados na meiose em estádio de vesícula germinativa (VG), nas proporções de 97,4; 84,4 e 65,1%; respectivamente. No grupo controle após 24 h de cultivo (C/24) não foram observados ovócitos em estádio de VG (0%). Dos ovócitos avaliados logo após a aspiração folicular (controle zero hora C/0), 100% dos mesmos encontravam-se em estádio VG (Tabela 3). Os grupos C/24 (0%), B100 (97,4%), B50 (84,4%) e B25 (65,1%) diferiram entre si (P < 0,05) para o percentual de ovócitos em VG, com as taxas de bloqueio meiótico diminuindo com a redução da concentração do inibidor. O grupo B100 (97,4%) e o C/0 (100%) por outro lado, foram similares entre si (P > 0,05). Foram observados ovócitos nas fases intermediárias da meiose (MAT, metáfase I, anáfase I e telófase I), somente no grupo C/24, no demais tratamentos os ovócitos estavam em VG ou MII (metáfase II). A taxa de ovócitos em MAT do grupo C/24 (10,4%) diferiu (P < 0,05) dos demais tratamentos (0%). Com relação aos percentuais de ovócitos que atingiram o estádio de MII, ou seja, que concluíram a maturação in vitro (MIV), houve diferença (P < 0,05) nas taxas de MII entre os ovócitos dos grupos C/24 (89,6%), B100 (2,6%), B50 (15,6%) e

50 34 B25 (34,9%) após 24 horas de cultivo, com a redução da taxa de MII com o aumento da concentração de BL I. Não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos C/0 (0%) e B100 (2,6%) para o percentual de ovócitos em estádio de MII. Tabela 3. Estádios da meiose de ovócitos bovinos submetidos ao bloqueio meiótico com concentrações decrescentes de BL I (100, 50 e 25 µm) em meio de cultivo B199 suplementado com BSA. Estádios da meiose Tratamentos* Ovócitos VG 1 MAT 2 MII 3 Nº (%) Nº (%) Nº (%) C/ (100) a 0 (0,0) b 0 (0,0) d C/ (0,0) d 8 (10,4 ± 1,4) a 69 (89,6 ± 1,4) a B (97,4 ± 3,9) a 0 (0,0) b 2 (2,6 ± 3,9) d B (84,4 ± 1,8) b 0 (0,0) b 12 (15,6 ± 1,8) c B (65,1 ± 4,0) c 0 (0,0) b 29 (34,9 ± 4,0) b 1 Vesícula germinativa (VG); 2 metáfase I, anáfase I e telófase I (MAT); 3 metáfase II (MII); *controle 0 hora (C/0), ovócitos avaliados logo após a aspiração folicular; controle 24 horas (C/24), ovócitos cultivados por 24 horas em meio B199 suplementado com BSA; tratados (B25, B50 e B100), ovócitos cultivados por 24 horas com 25, 50 e 100 μm de BL I em meio B199 suplementado com BSA. Resultado de três réplicas. a-d Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média Experimento 2 No experimento anterior não foi possível reduzir a concentração de BL I sem perder a eficiência do bloqueio. Então, procurou-se reduzir a concentração de BL I em meio de cultivo sem suplementação de BSA, verificando se o bloqueio nessa condição de cultivo seria eficiente na manutenção da meiose bloqueada. Após 24 horas de bloqueio (sem adição de BSA) a maioria dos ovócitos tratados nas concentrações de 10 (B10), 15 (B15), 20 (B20) e 25 µm (B25) de BL I permaneceram em estádio de VG. Houve diferença (P < 0,05) do grupo C/24 (13,7%) em relação aos tratados com B10 (94,9%), B15 (97,2%), B20 (98,7%) e B25 (98,7%) para o percentual de ovócitos em estádio de VG (Tabela 4), os quais não diferiram entre si (P > 0,05). Após 24 horas de cultivo foram observados ovócitos nos estádios de MAT, somente no grupo C/24 (11,0%, P 0 < 0,05).

51 35 Os percentuais de ovócitos que atingiram o estádio de MII após 24 horas de cultivo diferiram (P < 0,05) entre o grupo C/24 (75,3%) e os grupos B10 (5,1%), B15 (2,8%), B20 (1,3%) e B25 (1,3%), que não diferiram entre si (P > 0,05). Pode-se observar que na ausência de BSA, concentrações mais baixas de BL I (entre 10 e 25 µm) são igualmente eficientes no bloqueio da meiose de ovócitos bovinos cultivados in vitro. Tabela 4. Estádios da meiose de ovócitos bovinos submetidos ao bloqueio meiótico com diferentes concentrações de BL I (10, 15, 20 e 25 µm) em meio de cultivo B199 sem suplementação de BSA. Estádios da meiose Tratamentos* Ovócitos VG 1 MAT 2 MII 3 Nº (%) Nº (%) Nº (%) C/ (13,7 ± 2,4) b 8 (11,0 ± 3,5) a 55 (75,3 ± 1,1) a B (94,9 ± 2,6) a 0 (0,0) b 4 (5,1 ± 2,6) b B (97,2 ± 2,3) a 0 (0,0) b 2 (2,8 ± 2,3) b B (98,7 ± 2,2) a 0 (0,0) b 1 (1,3 ± 2,2) b B (98,7 ± 2,4) a 0 (0,0) b 1 (1,3 ± 2,4) b 1 Vesícula germinativa (VG); 2 metáfase I, anáfase I e telófase I (MAT); 3 metáfase II (MII); *controle 24 h (C/24), ovócitos cultivados por 24 h em meio B199 sem suplementação de BSA; tratados (B10, B15, B20 e B25), ovócitos cultivados por 24 h com 10, 15, 20 e 25 μm de BL I em meio B199 sem suplementação de BSA. Resultado de três réplicas. a-b Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média Experimento 3 Como foi possível bloquear a meiose dos ovócitos bovinos com eficiência, em meio de bloqueio na presença e na ausência de BSA, fez-se necessário averiguar se a reversibilidade da meiose nos ovócitos (maturação) seria afetada pelo bloqueio meiótico nas duas condições de cultivo. Os ovócitos foram bloqueados por 24 h nas concentrações de 10 µm (B10) e 100 µm BL I (B100) em meio de cultivo suplementado (B100) ou não (B10) com BSA e maturados em meio de MIV por igual período. Um pequeno percentual dos ovócitos permaneceu nos estádios de VG (3,3; 0,0 e 1,1%) e de MAT (5,6; 8,5 e 6,5%) após 24 h de MIV (P > 0,05) nos grupos C/24, B10 e B100, respectivamente. O percentual de maturação nuclear (taxa de metáfase II) foi de 91,0; 91,4 e 92,3%

52 36 para os grupos C/24, B10 e B100, respectivamente. As taxas de VG, MAT e MII não diferiram (P > 0,05) entre os tratamentos após 24 h de MIV (Tabela 5). O uso de BL I em baixa concentração (10 µm) na ausência de BSA não reduz a taxa de MIV (MII) pós-bloqueio da meiose, indicando ser tão eficaz quanto a concentração usual de 100 µm em meio suplementado com BSA, ao menos no que se refere a esse parâmetro. Tabela 5. Estádios da meiose de ovócitos bovinos submetidos ao bloqueio meiótico nas concentrações de 10 e 100 µm de BL I em meio de cultivo B199 suplementado ou não com BSA. Estádios da meiose Tratamentos* Ovócitos VG 1 MAT 2 MII 3 Nº (%) Nº (%) Nº (%) C/ (3,3 ± 0,4) 5 (5,6 ± 2,3) 82 (91,1 ± 2,6) B (0,0) 8 (8,5 ± 2,1) 86 (91,5 ± 2,1) B (1,1 ± 1,9) 6 (6,5 ± 3,1) 85 (92,4 ± 1,8) 1 Vesícula germinativa (VG); 2 metáfase I, anáfase I e telófase I (MAT); 3 metáfase II (MII); *controle 24 horas (C/24), ovócitos cultivados por 24 horas em meio de maturação in vitro; tratados (B10 e B100), ovócitos cultivados por 24 h com 10 e 100 μm de BL I em meio B199 suplementado (B100) ou não (B10) com BSA seguidos de MIV por 24 h. Resultado de três réplicas. Não houve diferença entre tratamentos (P > 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média Experimento 4 Uma vez determinados nos experimentos anteriores que o bloqueio meiótico com BL I na presença e na ausência de BSA e a reversibilidade dos mesmos foi eficiente, fez-se necessário fazer um acompanhamento mais detalhado da maturação nuclear para averiguar um possível efeito do bloqueio sobre a progressão meiótica (cinética) durante a maturação in vitro. Os ovócitos foram bloqueados por 12 h com B10 e B100 e transferidos para o meio de MIV e avaliados em diferentes horários (6, 12 e 18 h) de MIV. O grupo controle foi avaliado nos mesmos horários sem ser submetido ao bloqueio com BL I. As taxas de VG observadas com 6 h de MIV pós-bloqueio (Tabela 6) nos grupos controle (97,3%) e tratados com B10 (71,4%) e B100 (74,3%) apresentaram diferença (P < 0,05) entre o controle e os tratados. O percentual de MAT às 6 h de MIV também apresentou diferença (P < 0,05) somente entre o controle (2,7%) e os

53 37 tratados com B10 (28,6%) e B100 (25,7%). Essa observação sugere uma aceleração nas primeiras 6 h de maturação, independente da concentração de BL I. Com 12 h de MIV as taxas de VG do grupo controle (11,7%) e do B10 (7,0%) não diferiram (P > 0,05), mas ambos diferiram (P < 0,05) do grupo B100 (3,7%). Nesse mesmo horário (12 h), a maioria dos ovócitos encontravam-se em estádios de MAT. Não houve diferença (P > 0,05) quanto às taxas de MAT entre o grupo controle (77,9%) e o grupo B10 (83,1%), mas houve diferença (P < 0,05) com o B100 (86,4%). Já os grupos B10 (83,1%) e B100 (86,4%) não diferiram (P > 0,05) entre si. Nesse horário uma pequena parcela dos ovócitos (±10%) já estava em MII em todos os grupos (P > 0,05). Com 18 h de maturação, os percentuais de ovócitos em estádios de VG (2,7; 2,6 e 1,1%) e MAT (25,3; 23,7 e 20,0%) não apresentaram diferença (P > 0,05) entre os grupos controle, B10 e B100, respectivamente. As taxas de ovócitos em estádio de MII também não diferiram (P > 0,05) entre os grupos controle (72,0%), B10 (73,7%) e B100 (78,9%). Após 18 h de maturação, o efeito da aceleração da meiose induzida pela BL I não foi mais observado, sugerindo que tal aceleração em ovócitos bovinos tratados com BL I só ocorre aparentemente no início da meiose (retomada). Tabela 6. Estádios da meiose após 6, 12 e 18 horas de maturação em ovócitos submetidos a 12 horas de bloqueio da meiose com 10 e 100 µm de BL. Estádios da meiose Tratamentos* MIV 4 Ovócitos VG 1 MAT 2 MII 3 Nº (%) Nº (%) Nº (%) Controle (97,3 ± 3,3) a 2 (2,7 ± 3,3) b 0 (0,0) B10 6 h (71,4 ± 3,7) b 20 (28,6 ± 3,7) a 0 (0,0) B (74,3 ± 7,6) b 19 (25,7 ± 7,6) a 0 (0,0) Controle 77 9 (11,7 ± 1,5) a 60 (77,9 ± 5,1) b 8 (10,4 ± 3,7) B10 12 h 71 5 (7,0 ± 3,1) a 59 (83,1 ± 8,4) ab 7 (9,9 ± 5,5) B (3,7 ± 4,4) b 70 (86,4 ± 3,9) a 8 (9,9 ± 3,8) Controle 75 2 (2,7 ± 2,8) 19 (25,3 ± 5,0) 54 (72,0 ± 5,5) B10 18 h 76 2 (2,6 ± 2,8) 18 (23,7 ± 4,4) 56 (73,7 ± 4,8) B (1,1 ± 2,1) 19 (20,0 ± 1,9) 75 (78,9 ± 1,1) 1 Vesícula germinativa (VG); 2 metáfase I, anáfase I e telófase I (MAT); 3 metáfase II (MII); 4 tempo (h) em que os ovócitos foram maturados (MIV); *controle, ovócitos maturados; tratados, ovócitos bloqueados com 10 e 100 μm de BL I em meio suplementado (B100) ou não (B10) com BSA e maturados. Resultado de 4 réplicas. a-b Letras diferentes na mesma coluna e no mesmo horário de MIV indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média.

54 Experimento 5 Nesse experimento foram avaliadas a configuração da maturação nuclear, organização dos microtúbulos e a disposição dos microfilamentos nos ovócitos submetidos ao bloqueio meiótico com B10 e B100. Os ovócitos foram bloqueados por 24 horas, transferidos para o meio de maturação (MIV) e avaliados em diferentes horários de MIV (0, 6, 12, 18 e 24 horas). O grupo controle foi avaliado nos mesmos horários sem ser submetido a uma pré-maturação com BL I. Os resultados da configuração da maturação nuclear não serão descritos aqui por que seguiram o mesmo padrão observado na cinética da maturação nuclear pósbloqueio. As observações feitas sugerem uma aceleração no início da retomada da meiose nos ovócitos tratados com BL I, mas no decorrer da MIV essa aceleração não foi mais evidenciada, confirmando os resultados do experimento 4. A marcação positiva dos microtúbulos foi observada por todo o citoplasma dos ovócitos em todos os grupos e horários. Uma marcação mais intensa dos microtúbulos foi observada em MAT e MII junto aos cromossomos (fuso meiótico) nos ovócitos que haviam iniciado o rompimento da VG (Figura 18). Esse mesmo padrão foi observado em todos os tratamentos (controle, B10 e B100) e horários (6, 12, 18 e 24 h). Não foram observadas alterações no fuso meiótico quanto à organização e formação da placa metafásica nos diferentes grupos de ovócitos e horários dos tratamentos. Dos 653 ovócitos avaliados nesse experimento apenas um ovócito tratado com B100 após 24 horas de maturação pós-bloqueio apresentou alteração na placa metafásica, o que é importante para demonstrar a segurança e a efetividade da droga. Com relação aos microfilamentos, observou-se uma marcação por todo o citoplasma dos ovócitos em todos os grupos e horários (Figura 19). Uma marcação mais intensa dos microfilamentos foi observada na região onde o corpúsculo polar foi liberado e no córtex celular, nos horários de 18 e 24 horas maturação, para todos os grupos (controle, B10 e B100). Não foi observada nenhuma diferença ou alteração no arranjo dos microfilamentos no citoplasma dos ovócitos avaliados nos diferentes grupos e horários de maturação, indicando a segurança na utilização dessa droga.

55 39 A B C 400X 400X 400X D E F G 400X H 200X 400X 400X 200X Figura 18. Dinâmica dos microtúbulos em ovócitos bovinos: Corado em vermelho a cromatina e em verde os microtúbulos. Ovócitos em estádio de VG (A), MI (B), AI (C e D), TI (E), MII (F), fuso meiótico alterado (G) e imagem mostrando somente a marcação dos microtúbulos (H). A C 100X 400X B D 400X 100X Figura 19. Disposição dos microfilamentos em ovócitos bovinos: Corado em vermelho a cromatina e em verde os microfilamentos. Imagem geral do ovócito com marcação dos microfilamentos (A), ovócitos em estádio de VG (B), TI (C) e MII (D).

56 Experimento 6 A configuração da maturação nuclear, migração dos grânulos corticais e mitocôndrias foram avaliadas nos ovócitos submetidos ao bloqueio da meiose com BL I e nos ovócitos maturados pós-bloqueio da meiose. Os ovócitos do grupo controle (não bloqueados) foram avaliados logo após a aspiração folicular e após a MIV. As taxas de ovócitos em estádio de VG para os grupos C/0, B10 e B100 foram de ~98,4%. Os percentuais de ovócitos em estádio de VG não diferiram (P > 0,05) entre os grupos de ovócitos avaliados. Após 24 h de MIV ~96,6% (P > 0,05) ovócitos encontravam-se no estádio de MII para os grupos C/24, B10 e B100. Em 100% dos ovócitos imaturos (não maturados) independente dos grupos (C/0, B10 e B100, P > 0,05), os clusters de grânulos corticais apresentavam-se dispersos pelo citoplasma dos ovócitos (distribuição geral). Mas, após 24 horas de maturação, também independente dos grupos, 98% (P > 0,05) dos ovócitos apresentavam migração dos grânulos corticais para a região periférica do citoplasma (distribuição periférica) (Tabela 7, Figura 20). As mitocôndrias encontravam-se em sua maioria na região periférica do citoplasma nos ovócitos imaturos. No entanto, nos grupos tratados a proporção (81,5 e 86,9%, P > 0,05) de ovócitos com mitocôndrias localizadas na região mais periférica do citoplasma foi inferior (P < 0,05) ao controle (100%). Após 24 horas de maturação, as mitocôndrias migraram por todo o citoplasma do ovócito. No grupo C/24 (81,5%) a migração das mitocôndrias foi inferior (P < 0,05) aos grupos B10M (95,2) e B100M (98,2%) que não diferiram (P > 0,05) entre si (Tabela 8, Figura 21). De acordo com os resultados, sugere-se que embora o ciclo celular meiótico estivesse bloqueado com BL I, o que também bloqueou a migração dos grânulos corticais, a migração das mitocôndrias não foi totalmente bloqueada. No entanto, o bloqueio não interfere na migração posterior dos grânulos corticais e das mitocôndrias quando os ovócitos são submetidos à maturação in vitro.

57 41 Tabela 7. Distribuição dos grânulos corticais dos ovócitos imaturos e maturados in vitro tratados ou não com 10 e 100 µm de BL I. Tratamentos* MIV** Ovócitos Geral 1 Distribuição dos grânulos corticais Nº (%) Periférica 2 Nº (%) Ovócitos imaturos C/ (100) 0 (0,0) B10 0 h (100) 0 (0,0) B (100) 0 (0,0) Ovócitos maturados C/ (1,7 ± 4,5) 58 (98,3 ± 4,5) B10M 24 h 57 1 (1,8 ± 3,8) 56 (98,2 ± 3,8) B100M 57 1 (1,8 ± 3,5) 56 (98,2 ± 3,5) 1 Geral, distribuição dos clusters de grânulos corticais por todo o citoplasma do ovócito; 2 periférica, distribuição dos grânulos corticais mais na região do córtex citoplasmático do ovócito; *controle (C/0), ovócitos avaliados logo após aspiração folicular; tratados (B10 e B100), ovócitos submetidos ao bloqueio da meiose por 24 h com 10 e 100 μm de BL I em meio suplementado (B100) ou não (B10) com BSA; controle (C/24), ovócitos submetidos à maturação in vitro; tratados (B10M e B100M), ovócitos bloqueados por 24 h com 10 e 100 μm de BL I e em seguida submetidos a maturação in vitro; **maturação in vitro (MIV). Resultados de quatro réplicas. Letras diferentes na mesma coluna dos ovócitos imaturos ou dos maturados indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média. A B 400X 200X Figura 20. Distribuição dos grânulos corticais em ovócitos bovinos imaturos e maturados in vitro. Distribuição geral dos clusters de grânulos corticais em ovócito em estádio VG (A) e distribuição periférica dos grânulos corticais em ovócito em estádio MII (B).

58 42 Tabela 8. Distribuição das mitocôndrias dos ovócitos imaturos e maturados in vitro tratados ou não com 10 e 100 µm de BL I. Distribuição das mitocôndrias Tratamentos* MIV** Ovócitos Periférica 1 Geral 2 Nº (%) Nº (%) Ovócitos imaturos C/ (100) b 0 (0,0) b B10 0 h (81,5 ± 11,1) a 12 (18,5 ± 11,1) a B (86,9 ± 12,7) a 8 (13,1 ± 12,7) a Ovócitos maturados C/ (16,9 ± 5,7) a 49 (83,1 ± 5,7) b B10M 24 h 62 3 (4,8 ± 5,3) b 59 (95,2 ± 5,3) a B100M 57 1 (1,8 ± 3,3) b 56 (98,2 ± 3,3) a 1 Periférica, distribuição das mitocôndrias na região mais periférica do citoplasma do ovócito; 1 Geral, distribuição das mitocôndrias por todo o citoplasma do ovócito; *controle (C/0), ovócitos avaliados logo após aspiração folicular; tratados (B10 e B100), ovócitos submetido ao bloqueio da meiose por 24 h com 10 e 100 μm de BL I em meio suplementado (B100) ou não (B10) com BSA; controle (C/24), ovócitos submetidos à maturação in vitro; tratados (B10M e B100M), ovócitos bloqueados por 24 h com 10 e 100 μm de BL I e em seguida submetidos à maturação in vitro; **maturação in vitro (MIV). Resultados de quatro réplicas. Letras diferentes na mesma coluna dos ovócitos imaturos ou dos maturados indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média. A B C 100X 200X 200X Figura 21. Distribuição das mitocôndrias em ovócitos bovinos imaturos e maturados in vitro (MIV). Corados em azul a cromatina (setas) e em vermelho as mitocôndrias. Distribuição periférica das mitocôndrias nos ovócitos em estádio VG (A e B) e distribuição geral das mitocôndrias no ovócito em estádio MII (C).

59 Experimento 7 Para a avaliação do desenvolvimento embrionário, os ovócitos foram submetidos à inibição com BL I, maturados, fecundados e cultivados in vitro. Os resultados estão apresentados na Tabela 9. As taxas de clivagem observadas foram de 85,8; 86,7 e 80,7% para os ovócitos submetidos à fecundação in vitro nos grupos controle, B10 e B100, respectivamente, não havendo diferença (P > 0,05) entre os tratamentos. Entretanto, o desenvolvimento embrionário variou entre os grupos. Com relação à percentagem de ovócitos que atingiram o estádio de blastocisto aos sete dias (D7) de cultivo, os grupos controle (38,3%) e B10 (41,6%) não diferiram entre si (P > 0,05), mas ambos diferiram (P < 0,05) do grupo B100 (33,0%). A percentagem de ovócitos que chegaram até o estádio de blastocisto eclodido (Figura 22) foi similar (P > 0,05) entre os grupos controle (19,2%), B10 (17,7%) e B100 (11,0%) aos oito dias (D8) de cultivo. Também não foi observada variação significativa (P > 0,05) no número médio de células dos blastocistos eclodidos aos oito dias (D8) de cultivo, entre os grupos controle (138), B10 (136) e B100 (150). A concentração de BL I mais elevada reduziu a produção de blastocistos aos 7 dias de CIV, embora a proporção de blastocistos eclodidos e o número de células totais não tenham sido afetada pelos tratamentos ou pela concentração de BL I. Tabela 11. Desenvolvimento embrionário de ovócitos bovinos fecundados in vitro após o bloqueio meiótico com 10 e 100 µm de BL I. Tratamet* Ovócitos Nº Clivados Nº (%) Desenvolvimento embrionário Blastocistos D7 1 Nº (%) Eclodido D8 2 Nº (%) Nº de células (média ± dp) 3 Controle (85,8±6,1) 46 (38,3±3,2) a 23 (19,2±3,7) 138 ± 30 B (86,7±4,7) 47 (41,6±2,2) a 20 (17,7±1,9) 136 ± 21 B (80,7±2,0) 36 (33,0±3,5) b 12 (11,0±1,4) 150 ± 22 1 Percentual de blastocistos em relação ao número de ovócitos aos 7 dias (D7) de cultivo in vitro; 2 percentual embriões eclodidos em relação ao número de ovócitos aos 8 dias (D8) de cultivo; 3 média do número de células dos blastocistos e seu respetivo desvio padrão aos 8 dias (D8) de cultivo; *Controle, ovócitos maturados in vitro sem serem submetidos ao bloqueio da meiose; tratados (B10 e B100), ovócitos bloqueados por 24 horas com 10 e 100 μm de BL I em meio suplementado (B100) ou não (B10) com BSA e em seguida submetidos a maturação in vitro. Resultados de quatro réplicas. a-b Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da médias.

60 44 Figura 22. Blastocisto eclodido em D8 corado com Hoechst para visualização dos núcleos para contagem de células. 100X