Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

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1 Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Mestrandas: Jucimara e Lígia Ramos Disciplina: Bioinformática Vitória 2016

2 Índice Introdução Montagem de Genomas Montagem de Transcriptomas Identificação/ anotação gênica Identificação/ anotação ncrna

3 Introdução Análise in silico de sequências de nucleotídeos ou de genomas constitui uma das mais importantes aplicações da bioinformática. Objetivo: criar ferramentas para identificar e caracterizar genes, elementos genéticos móveis entre outros, além de buscar aspectos evolutivos comuns. Bactéria Haemophilus influenza: - Primeira bactéria a ser sequenciada (1995) milhão de bases - 1 cromossomo circular Craig Venter e colaboradores Instituto de Pesquisa Genômica, USA.

4 Introdução Com a disseminação de estratégias de sequenciamento cada vez menos onerosas, tem-se investido na geração de algoritmos para analisar as sequencias genômicas. Antes da bactéria Haemophilus influenza já existiam programas para montagem de genomas, mas para análise de volumes de sequências pequenas. Bacteriófago pb Citomegalovíru (CMV) pb

5 Introdução História do Sequenciamento: Bacteriófago- RNA 3.569pb Bactéria H. influenza Caenorhabditis elegans Projeto Genoma Humano Bacteriófago- DNA 5,386 pb Saccharomyces cerevisiae Arabidopsis thaliana

6 Montagem de Genomas Nos primeiros anos da era genômica, o sequenciamento do genoma era baseado na metodologia de Sanger ou método dideóxi. Purificação do DNA genômico (qualidade e quantidade) Fragmentação mecânica aleatória (tamanhos variados) Construção das Bibliotecas de DNA genômico Sequenciamento Reads

7 Montagem de Genomas Reads: sequência obtida de cada clone. Contigs: união de duas ou mais sequências reads formadas pela sobreposição de elementos comuns.

8 Montagem de Genomas Sequenciamento Sanger ou método dideóxi. DNA molde + dntps e ddntps + DNA polimerase + Primer

9 Montagem de Genomas Next-generation sequencing (NGS): - Também tem fragmentação aleatória do genoma mas sem clonagem. - Obtenção de reads mais rápida. - Reads são menores. Illumina - HiSeq 2000: Produz acima de 600Gb por corrida em 13 dias. Aproximadamente $6,000

10 Montagem de Genomas Os primeiros algoritmos se baseavam no alinhamento dos reads e na concatenação de sequências obtidas dos reads com os maiores alinhamentos. A montagem do genoma a partir de reads seguia os passos abaixo:

11 Montagem de Genomas Para as novas metodologias, devido ao tamanho pequeno dos fragmentos, diferentes algoritmos tiveram que ser desenvolvidos. Programas atuais usam grafos de sobreposição ou grafos de Bruijn: - Identificam reads com possibilidade de compartilharem trechos de sobreposição entre si utilizando estratégia de alinhamento; - Baseiam-se na decomposição de reads em k-mers. K-mers: pequenos fragmentos de comprimento fixo obtido de cada read. São usados como um índice e apenas pares de leitura que partilham uma sequência são posteriormente avaliados.

12 Montagem de Genomas Grafos de Bruijn:

13 Montagem de Genomas Grafos de Bruijn Grafo de Bruijin

14 Montagem de Genomas Grafos de Bruijn

15 Montagem de Genomas Grafos de Bruijn AAABBBBA

16 Montagem de Genomas Programas diferentes surgiram para montagem de genomas usando diferentes algoritmos.

17 Montagem de Genomas Genoma Procarioto: - Sequenciamento com obtenção de uma sequência única a qual representa toda a sequência nucleotídica do cromossomo; - Plasmídios n de contigs: dependerá do n de plasmídios também.

18 Montagem de Genomas Genoma Eucarioto: - Grande variação no número de cromossomos.; - É esperado maior n de contigs Complexidade do genoma - Sequências repetitivas dificulta o processo de montagem; - Tamanho pode passar de 3 bilhões pb.

19 Montagem de Genomas Genoma Humano: Sequência única e repetitiva

20 Montagem de Genomas Cada sub-biblioteca será sequenciada para gerar contigs. Conjunto de diferentes contigs oriundos de diferentes subbibliotecas será utilizado para a formação de scaffolds.

21 Montagem de Genomas Alguns programas: - Permitem montar genomas complexos com repetições baseadas em reads maiores. - Realizam montagens em duas ou mais fases distintas, nas quais as sequências repetitivas são processadas separadamente.

22 Montagem de Genomas Qualidade da montagem do genoma: pode ser acompanhada por alguns índices. - A cobertura reflete na quantidade de reads associados a um determinado fragmento de DNA. Ex: cobertura de 10X = cada nucleotídio foi encontrado em pelo menos 10 reads. - N50: medida estatística muito utilizada para avaliar a quantidade de montagem, pois revela o quanto de um genoma é coberto por contigs grandes. N50= n n= significa que 50% dos reads estão montados em um contig de tamanho n ou maior.

23 Montagem de Genomas 50% dos reads estão associados a contigs de bases ou maiores

24 Montagem de Transcriptomas Identificação de transcritos: - Fornece indícios sobre quais genes estão sendo expressos em uma situação fisiológica específicas; - Sequenciamento: aplicação importante na procura de sequências codificantes;

25 Montagem de Transcriptomas Transcriptomas: - Material de uso: cdna (geralmente) obtido por transcrição reversa de mrna. Subclonagem Sequenciamento Sanger NGS Reads Montagem do transcriptoma de novo Ancorar em um genoma para identificar sequências codificantes e de extremidade éxon e íntron

26 Montagem de Transcriptomas Montagem de novo: Reads Alinhamento + Geração de muitos contigs Programas: - Realizam a montagem; Cada um possivelmente representando um mrna maduro - Alinhamento de genomas; - Análise representativa de cada transcrito dentro do conjunto total de RNA analisado. Cálculo da frequência relativa de cada transcrito identificado.

27 Montagem de Transcriptomas Cálculo da frequência relativa: - Realizar análises de expressão diferencial de genes. - Programas: - Cufflink-Cuffdiff - DegSeq - DESeq - EdgeR - Duas estratégias: - Mapeamento a uma sequência genômica previamente conhecida; - Análise de novo, independente da sequência genômica e baseada na montagem dos transcritos diretamente a partir dos reads.

28 Montagem de Transcriptomas Mapeamento a uma sequência genômica previamente conhecida: Reads Mapeados ao genoma: regiões de identidade nucleotídica são ancorados à sequência genômica Identificados por sequenciamento que levam em consideração Número de reads em relação à porção do genoma que contém um gene Resultado: determinada sequência do genoma é representada por um grande número de reads

29 Montagem de Transcriptomas Mapeamento de sequência cujo genoma não foi ainda determinado: RNAseq: - Uso de NGS para sequenciar cdna capturar a informação do transcriptoma; - Não necessita uma lista pré-definida dos gene que se deseja detectar; - A princípio, qualquer transcrito que estiver sendo expresso pode ser detectado; - Detecta também eventos de splicing alternativo.

30 Identificação/anotação gênica Anotação de genomas: - Conjunto de protocolos e fluxos de trabalhos utilizados para delimitar possíveis genes e predizer a sua função com base nas similaridades com sequências conservadoras. - Dois grandes grupos de genes: - Genes cujo produto é reconhecido pelos ribossomos e dará origem a proteína (mrna); - Genes cujo produto terá funções estruturais e funcionais dependente da própria moléculas de RNA (trna e rrna).

31 Identificação/anotação gênica Genoma procarioto: - Sem íntrons; - ORF (open reading frame): toda região delimitada por um códon de início e término potencialmente constitui uma região codificante de uma proteína.

32 Identificação/anotação gênica Genoma eucarioto: - Com íntrons papel regulação; - Íntrons sofrem processamento do RNA splicing.

33 Identificação/anotação gênica Produção de proteínas:

34 Identificação/anotação gênica Splicing alternativo: produção de diferentes proteínas do mesmo gene

35 Identificação/anotação gênica Diferentes estratégias foram desenvolvidos para procuras de genes em genomas. Procariotos: - Quando não consideram elementos clássicos de sequências conservadas e operons Procura de genes: baseda apenas na identificação de ORFs resultados falsos positivos e falsos negativos.

36 Identificação/anotação gênica Procariotos: - Desenvolveram algoritmos característicos para detectar na sequência de DNA duas informações: - Sinais; - Conteúdo. Mecanismo foi expandido para procura de genes em organismos eucariotos. Detectores de SINAIS: procuram por caracteres funcionais específicos de genes. - Sinais transcricionais: sequências conservadas

37 Identificação/anotação gênica - Sinais transcricionais: sequências conservadas utilizadas para o processo de transcrição. Procarioto: Eucarioto:

38 Identificação/anotação gênica - Sinais traducionais: regiões importantes para o recrutamento de ribossomos. Procarioto: 5 - GT e AG- 3' Eucarioto:

39 Identificação/anotação gênica Detectores de CONTEÚDOS: - Classificam a sequência de DNA em codificantes e não-codificantes (íntrons, regiões intergênicas, regiões não traduzidas). - Detectores extrínsecos: baseiam-se nas regiões codificantes por serem mais conservadas do que as não codificantes permite identificação de exons conservados para procurar homologias. - Detectores intrínsecos: tem como foco características inatas ao DNA as quais permitem a predição do potencial de uma sequência codificar ou não uma proteína.

40 Identificação/anotação gênica - Detectores intrínsecos: Exemplos: i) preferência por bases G ou C na terceita posição do códon; ii) uso diferencial de códons sinônimos (# códons codificam mesmo aas); iii) frequência de sequências distintas hexâmeras; iv) periodicidade de ocorrência de bases. Modelo de Markov : para a construção de modelos capazes de reconhecer sequências codificantes.

41 Identificação/anotação gênica Modelo de Markov : - Estados anteriores são irrelevantes para os estados seguintes desde que o estado atual seja conhecido. X (t) : variável aleatória escondida no instante t y (t) : variável aleatória observada no instante t x: estados ocultos y : possíveis observações a : probabilidades de transição de estado b : probabilidades de saídas

42 Identificação/anotação gênica Sistemas para procura de genes foram em genomas eucariotos: - Procura empírica de genes: - Leva em consideração buscas por similaridades com outros bancos de dados (genômico, transcriptômico ou proteômico).

43 Identificação/anotação gênica detectores de sinais conteúdo para delimitar a seqüência gênica. os algoritmos são treinados com sequências conhecidas do genoma em questão. O grau de conservação dos nucleotídeos presentes na sequência de Kozak de Drosophila melanogaster, perfil este que pode ser utilizado na predição de novas sequências codificantes neste organismo Padrão de conservação de nucleotídeos nas regiões 5 (painel superior) e 3 (painel inferior) de íntrons humanos.

44 Identificação/anotação gênica Dentre as limitações da predição ab initio está o fato de que, usualmente, o resultado obtido se refere às regiões codificantes. Para tanto, alguns destes algoritmos são treinados com modelos gênicos já conhecidos, de organismos filogeneticamente próximos e, assim, provavelmente possuem uma estrutura gênica muito parecida com a do organismo que está em análise.

45 Identificação/anotação gênica A forma mais simples de anotação automática se dá pela análise de uma série de diferentes mecanismos de predição e delimitação de sequências gênicas e, então, utilização de um algoritmo de seleção, também denominado de combiner. Função de selecionar a predição que melhor represente os modelos gênicos Os combiners estimam os tipos e as freqüências de erros oriundos de cada programa de predição Escolhendo as combinações de evidências que minimizam tais erros.

46 Identificação/anotação gênica

47 Identificação/anotação gênica A anotação da função de genes Processo comparativo Utilizados bancos de dados de proteínas: NCBI UniProt (trembl + Swiss-Prot) domínios proteicos (PFAM, NCBI CDD, Interpro).

48 Identificação/anotação gênica predição da localização da proteína codificada por este gene. Exemplo: se uma proteína possui muitas regiões hidrofóbicas, compatíveis com sua inserção em membrana, possivelmente esta será uma proteína integral de membrana. Diversas ferramentas estão disponíveis para localização de domínios transmembrana (TMHMM, TMPred, HMMTOp), baseando-se em métodos estatísticos para aferição da presença destes domínios.

49 Identificação/anotação gênica diversidade de métodos estatísticos, geralmente treinados com sequências proteicas conhecidamente pertencentes a algum sub-compartimento celular

50 Identificação/anotação gênica

51 Identificação/anotação ncrna No processo de tradução há pelo menos 3 tipos de RNAs i) o RNA mensageiro ii) o RNA ribossômico iii) o RNA transportador A anotação de genes de RNAs não codificantes - RNAnc (RNAt, RNAr, dentre outros) ainda não apresenta um grande número de programas. grande heterogeneidade pequena conservação dos RNAnc quando comparados a seqüências de proteínas.

52 Identificação/anotação ncrna Mecanismo na busca de RNAt em genomas trnascan-se Este algoritmo se baseia em cálculos estatísticos que avaliam: O potencial local para formação das estruturas 2árias típicas de trnas em forma de trevo A presença de bases invariantes que definem regiões conservadas presentes nos promotores destes genes. ARAGORN Algoritmos heurísticos para a predição da estrutura do trna baseada na homologia com sequências conservadas A potencialidade de formar estruturas 2árias típicas do trna.

53 Identificação/anotação ncrna A predição de RNArs é baseada em conservação de sequências. RNAmmer: construído para delineamento dos genes responsáveis pelos RNArs. Rfam: um grande banco de dados com famílias de RNA a cada ano novas adições de sequências de RNAs são feitas.

54 Identificação/anotação ncrna Identificação de pequenos RNAs não codificam proteínas (apesar de alguns serem originados de regiões codificadoras) possuem tamanho variando entre poucas dezenas de nucleotídeos, suas rotas de biogênese e seus papéis funcionais. O RNAi, algumas vezes denominado de silenciamento gênico, é um mecanismo que induz a diminuição da expressão gênica de um transcrito alvo através da clivagem do transcrito alvo e sua posterior degradação, ou através da repressão da maquinaria de tradução.

55 Identificação/anotação ncrna

56 Identificação/anotação ncrna

57 Identificação/anotação ncrna Desafios identificação da região, ou precursor, que dá origem ao pequeno RNA identificação dos genes alvos regulados por estes micrornas ferramentas para identificação: mirtools, mirdeep, mirexpress, miranalyser e mircat. Análise de reads de sequenciamento de bibliotecas de pequenos RNAs Delimitação das regiões de ancoramento com o genoma. Cálculos para avaliação da estabilidade Predição de alvos de micrornas e sirnas podem ser baseadas em ferramentas como o BLAST, procurando regiões complementares ao pequeno RNA.

58 Identificação/anotação ncrna existem muitas interações entre microrna e transcrito alvo validação experimental desta interação. Especialmente para organismos modelo, existem bancos de dados próprios que disponibilizam, baseados em ferramentas de predição, os possíveis alvos para um determinado mirna. Um importante banco de dados é o microrna.org

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