AVALIAÇÃO LONGITUDINAL DA UTILIZAÇÃO DO METRONIDAZOL ASSOCIADO À AMOXICILINA NO TRATAMENTO DAS PERIIMPLANTITES

Transcrição

1 CENTRO DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO CURSO DE MESTRADO EM ODONTOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA AVALIAÇÃO LONGITUDINAL DA UTILIZAÇÃO DO METRONIDAZOL ASSOCIADO À AMOXICILINA NO TRATAMENTO DAS PERIIMPLANTITES DANIEL SANCHEZ FERRARI 1 Orientador: Prof. Dr. Jamil Awad Shibli 2º Orientador: Profª. Drª. Marta F. Bastos Guarulhos 2008

2 Livros Grátis Milhares de livros grátis para download.

3 DANIELSANCHEZ FERRARI AVALIAÇÃO LONGITUDINAL DA UTILIZAÇÃO DO METRONIDAZOL ASSOCIADO À AMOXICILINA NO TRATAMENTO DAS PERIIMPLANTITES Dissertação apresentada à Universidade Guarulhos, para obtenção do título de Mestre em Odontologia, Área de Concentração em Periodontia. 1 Orientador: Prof. Dr. Jamil Awad Shibli 2 Orientador: Profª. Drª. Marta F. Bastos Guarulhos 2008

4 F375a Ferrari, Daniel Sanchez Avaliação longitudinal da utilização do metronidazol associado à amoxilina no tratamento das periimplantites / Daniel Sanchez Ferrari. Guarulhos, SP, f. ; 31 cm Dissertação (Mestrado em Odontologia, área de concentração em Periodontia) - Centro de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão, Universidade Guarulhos, Orientador: Prof. Dr. Jamil Awad Shibli Co-orientadora: Profª. Drª. Marta F. Bastos Bibliografia: p Implantes osseointegrados. 2. Periimplantite. 3. Microbiologia bucal. 4. Índices clínicos I. Título. II. Universidade Guarulhos. CDD 22 st

5

6 DEDICATÓRIA Dedico aos meus pais, Roberto Boschetti Ferrari e Isabela Maria Garcia Sanchez Ferrari, que proporcionam um lar cheio de amor e união e que muitas vezes abrem mão de seus sonhos para realizarem os meus. Ao meu irmão, Felipe Sanchez Ferrari e a minha avó Maria Garcia Sanchez, pelo amor e os conselhos importantes dados à mim. Aos meus familiares, pelo carinho e pela paciência dedicada.

7 AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Ao meu orientador e amigo, Prof. Dr. Jamil Awad Shibli pela paciência, carinho, amizade e competência demonstrados durante todo o curso, contribuindo amplamente na minha vida profissional e pessoal. A minha co-orientadora, Profa. Dra. Marta Ferreira Bastos pelo incentivo e ensinamentos dados durante o curso. Aos Professores do Programa de Pós-Graduação em Odontologia da UnG, Magda Feres, Luciene Figueiredo, Jamil Awad Shibli, Marcelo de Faveri, Cristiane Amaral, Poliana Duarte, Claudia Ota Tsuzuki, André Reis, Alessandra Cassoni, Marta Ferreira Bastos e José Augusto Rodrigues pelo prazeroso convívio durante todo o curso. Aos amigos Leandro de Melo, Marcelo de Faveri e Thales Vitussi Colombo pelos ensinamentos durante minha formação acadêmica e profissional. Aos amigos do mestrado Maria Josefa Mestnik, Maike Paulino, Maria Beatriz Máximo, Adriana Mendonça, Tatiane Alves, Marcel Bernal, Mônica Simões, Joyce Bezerra, Diego Souza, Carlos Datte, Eduardo Sampaio, Sauro Grassi, Geisla Soares, Juliana Mendes, Kelly Aguiar, Marcelo da Rocha, Marcelo Rafaelli e Vanessa Santos pelos momentos de descontração e por toda ajuda durante esse período inesquecível. Aos amigos de longa data Juan Vitor Maqueda, Renato Zima, Tiago Pita, Rodrigo Maaz, Katrin Albiero e Alexandre Vaz pelas inúmeras histórias adquiridas. Ás alunas de iniciação científica Patrícia Antunes Grande, Karine Gonzaga Walter, Renata do Espírito Santo e Luciana Gouvêa, pela ajuda com os pacientes. Á bióloga Izilvânia Barreto pelos ensinamentos laboratoriais que contribuíram para minha formação.

8 Ás funcionárias Cíntia Lobo, Adriana Dias, Regiane, Priscila Lara, Cristina Zoucas e Roseli pelas incontáveis ajudas prestadas. Ás Professoras Dras Patrícia Ramos Cury ( São Leopoldo Mandic ) e Marjorie Jeffcoat ( Universidade da Pennsilvanya ), pelo grande auxílio prestado com o manuseio dos exames radiográficos A Bolsa de Mestrado da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, processo no. 05/ pelo auxílio financeiro. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, processo no. 05/ pelo auxílio financeiro. Aos voluntários que participaram de forma importantíssima para a realização deste trabalho. A todos, o meu respeito e minha gratidão.

9 RESUMO O objetivo deste estudo duplo-cego foi avaliar a longo prazo, o tratamento não-cirúrgico da periimplantite utilizando sistemicamente, metronidazol e amoxicilina associados à raspagem e debridamento periimplantar. Vinte e dois indivíduos portadores de periimplantites foram divididos em 2 grupos: Grupo Teste - Raspagem e debridamento periimplantar (RDP) associado ao metronidazol (400mg x3/dia, 14 dias) e amoxicilina (500mg x3/dia, 14 dias), e Grupo Controle RDP associado a placebo. Parâmetros clínicos como presença de placa (0/1), sangramento marginal (0/1), profundidade de sondagem (mm), sangramento à sondagem (0/1), supuração (0/1), nível clínico de inserção (mm) e perda óssea vertical (mm) foram avaliados por um examinador previamente calibrado nos tempos 0 e aos 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias pós-terapia. Amostras de biofilme subgengival foram obtidas e avaliadas para 39 espécies bacterianas por meio da técnica Checkerboard DNA- DNA hybridization. As terapias utilizadas reduziram significativamente os níveis dos microrganismos, principalmente do complexo vermelho (Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola), embora somente a terapia mecânica associada aos antibióticos foi capaz de manter esta redução até o final do período experimental. As médias de profundidade de sondagem e o nível clínico de inserção foram reduzidos durante todo o período avaliado para ambos os grupos (p<0,05). A percentagem média dos sítios com sangramento marginal e supuração diferiu após a terapia no grupo teste. Nehuma das terapias reduziu significativamente as médias de perda óssea. O emprego da terapia antibiótica associada à raspagem e debridamento periimplantar não promoveu benefícios clínicos adicionais sobre a terapia mecânica apenas. Palavras-Chave: implantes osseointegrados; periimplantite; microbiologia; índices clínicos; amoxicilina; metronidazol.

10 ABSTRACT The aim of this double-blind placebo study was to evaluate, in a long therm period, the treatment of human peri-implantitis using metronidazole plus amoxicillin systemically. Twenty two subjects with signs of peri-implantitis were split in 2 groups: Test group scaling and peri-implant tissue debridment (SPD) associated to metronidazole (400mg 3xday/ 14 days) and amoxicillin (500mg 3xday/ 14 days), and Control Group - SPD and placebo. Clinical parameters such as plaque index (0/1); marginal bleeding (0/1); bleeding on probing (0/1), supuration (0/1), probing depth (mm), clinical attachment level (mm) and vertical bone loss (mm). were evaluated by a single calibrated clinical at baseline and 60, 90, 120, 150, 180, 270 and 365 days after therapy. Subgingival plaque samples were taken and evaluated for 39 bacterial species using Checkerboard DNA-DNA hybridization. The therapies evaluated decreased significantly the levels of microorganism of red complex (Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola), although just the group that utilize antibiotics was able to keep this reduction to the end of the experimental period. The means of probing depth and clinical attachment loss were reduced during all the experimental period for both groups (p<0.05). The mean of percentage of sites with marginal bleeding and suppuration difer after the therapy in the test group. The both therapies were not able to reduce the vertical bone loss. The association of antibiotics and peri-implant debridment did not improve any additional clinical effect over mechanical therapy only. Key Words: Dental implants; peri-implantitis; microbiology; clinical index; amoxicillin; metronidazole.

11 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ETIOLOGIA DAS DOENÇAS PERIIMPLANTARES TRATAMENTO DAS DOENÇAS PERIIMPLANTARES UTILIZANDO MODELOS EXPERIMENTAIS EM ANIMAIS TRATAMENTO ANTI-INFECCIOSO DAS DOENÇAS PERIIMPLANTARES EM HUMANOS TRATAMENTO REGENERATIVO DAS DOENÇAS PERIIMPLANTARES EM HUMANOS PROPOSIÇÃO MATERIAL E MÉTODOS SELEÇÃO DOS INDIVÍDUOS CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO DOS INDIVÍDUOS ENVOLVIDOS NO ESTUDO DELINEAMENTO EXPERIMENTAL Seleção do sítio periimplantar Seqüências das consultas de avaliação EXAME CLÍNICO E RADIOGRÁFICO AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA Cepas bacterianas e condições de crescimento Isolamento do DNA e preparo das sondas Coleta das amostras de biofilme subgengival Checkerboard DNA-DNA Hybridization Hibridização DNA-DNA Detecção das espécies ANÁLISE ESTATÍSTICA Avaliação clínica e radiográfica Avaliação microbiológica RESULTADOS EFEITOS DAS TERAPIAS SOBRE OS PARÂMETROS CLÍNICOS EFEITOS DAS TERAPIAS SOBRE OS PARÂMETROS CLÍNICOS AO LONGO DO PERÍODO EXPERIMENTAL EFEITOS COLATERAIS DAS TERAPIAS EMPREGADAS EFEITOS DA TERAPIA ANTIBIÓTICA NAS CONTAGENS BACTERIANAS EFEITOS DAS TERAPIAS NAS PROPORÇÕES DOS COMPLEXOS MICROBIANOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES...68 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...69

12 10 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA A periimplantite, assim como a doença periodontal, é caracterizada como sendo uma doença complexa, causada por patógenos periodontais que produzem endotoxinas as quais interferem na produção de citocinas, aumentando o infiltrado inflamatório e a liberação de enzimas proteolíticas responsáveis pela destruição dos tecidos periimplantares (Mombelli et al., 1995; Hurzeler et al., 1997; Mombelli & Lang, 1998; Lee et al., 1999; Leonhardt et al., 1999; Mombelli, 1999; Hass et al., 2000; Mombelli et al., 2001; Klinge et al., 2002; Kivela-Rajamaki et al., 2003; Shibli et al., 2003a; Shibli et al., 2003b; Shibli et al., 2003c; Shibli, 2003d; Shibli et al., 2005). Portanto, as doenças periimplantares devem ser diagnosticadas e tratadas como infecções bacterianas (Mombelli et al., 1987; Mombelli et al., 1995; Mombelli & Lang, 1998; Listgarten & Lai, 1999; Mombelli, 1999; Khoury & Buchmann, 2001; Mombelli et al., 2001; Shibli et al., 2003a; Shibli et al., 2003b; Shibli et al., 2003c; Martins et al., 2004; Romeo et al., 2005; Shibli et al., 2005). Os tratamentos utilizados para o re-estabelecimento da saúde e da arquitetura dos tecidos periimplantares são, na sua grande maioria, semelhantes às terapias utilizadas em Periodontia, como por exemplo, químico (Hämmerle et al., 1995; Ericsson et al., 1996; Hurzeler et al., 1997; Mombelli et al., 2001; Schou et al., 2003d), físico (Hass et al., 2000; Shibli et al., 2003a; Shibli et al., 2003c; Shibli, 2003; Shibli et al., 2004; Schwarz et al., 2005; Shibli et al., 2006), não-cirúrgico (Mombelli et al., 1992; Mombelli et al., 2001; Salvi et al. 2006), cirúrgico associado à regeneração óssea guiada e/ou biomateriais (Persson et al., 1996; Hurzeler et al., 1997; Persson et al., 1999; Khoury & Buchmann, 2001; Persson et al., 2001a; Persson et al., 2001b; Schou et al., 2003a; Schou et al., 2003b; Schou et al., 2003c; Schou et al., 2003d) ou uma combinação destas terapias (Persson et al., 1996; Hurzeler et al., 1997; Persson et al., 1999; Behneke et al., 2000; Hass et al., 2000; Khoury & Buchmann, 2001; Persson et al., 2001a; Persson et al., 2001b; Schou et al., 2003a; Schou et al., 2003b; Schou et al., 2003c; Schou et al., 2003d; Shibli et al., 2003a; Shibli, 2003d; Romeo et al., 2005; Shibli et al., 2006). Estas estratégias terapêuticas têm em comum duas finalidades distintas: a descontaminação da superfície do implante e da região periimplantar, e a restauração das condições de saúde dos tecidos periimplantares (Hämmerle et al., 1995; Mombelli & Lang, 1998; Mombelli, 1999; Hass et al., 2000; Khoury & Buchmann, 2001; Mombelli et al., 2001; Klinge et al., 2002; Roos-Jansaker et al., 2003; Shibli et al., 2004; Shibli et al., 2005;

13 11 Shibli et al., 2006). Entretanto, a utilização de técnicas cirúrgicas muitas vezes requer a remoção da prótese implanto-suportada, influenciando a função e a estética do indivíduo (Hämmerle et al., 1995; Behneke et al., 2000; Shibli, 2003d). Os estudos realizados em animais (Ericsson et al., 1996; Persson et al., 1996; Hurzeler et al., 1997; Persson et al., 1999; Persson et al., 2001a; Persson et al., 2001b; Schou et al., 2003a; Schou et al., 2003b; Schou et al., 2003c; Schou et al., 2003d; Shibli et al., 2003a; Shibli et al., 2006) e os escassos ensaios clínicos em seres humanos (Hämmerle et al., 1995; Behneke et al., 2000; Hass et al., 2000; Khoury & Buchmann, 2001; Mombelli et al., 2001; Romeo et al., 2005; Schwarz et al., 2005) mostram que o principal fator para o aumento do percentual de preenchimento ósseo é a descontaminação de toda a área periimplantar associada à supressão dos patógenos periodontais (Hämmerle et al., 1995; Behneke et al., 2000; Hass et al., 2000; Klinge et al., 2002; Roos-Jansaker et al., 2003). Terapias nãocirúrgicas utilizando a raspagem e debridamento das superfícies periimplantares associadas à administração de antibióticos sistêmicos ou locais têm sido propostas, principalmente em modelos animais (Ericsson et al., 1996; Persson et al., 1996; Persson et al., 1999; Persson et al., 2001a). A associação do metronidazol e amoxicilina sistêmicos tem-se mostrado efetiva no tratamento das doenças periodontais diminuindo a contagem de patógenos periodontais como Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Tanerella forsythia (Pavicic et al., 1992; Pavicic et al., 1994; Berglundh et al., 1998; Feres et al., 2001; Serino et al., 2001; Winkel et al., 2001; Rooney et al., 2002). Pela sua difusão no sistema circulatório, os antibióticos atingem os periodontopatógenos residentes em bolsas periodontais profundas, células epiteliais do sulco, além da mucosa jugal, dorso e assoalho de língua. Esta diminuição na contagem microbiana reduz a liberação de mediadores do hospedeiro que iniciam e estimulam a atividade osteoclástica resultando em perda óssea (Nguyen et al., 1991; Plagnat et al., 2002; Kivela-Rajamaki et al., 2003). Considerando que os microrganismos patogênicos envolvidos nas periimplantites (T. forsythia, P. gingivalis e Treponema denticola) são semelhantes às periodontites, a associação do metronidazol e amoxicilina sistêmicos ao debridamento periimplantar pode levar a resultados terapêuticos satisfatórios.

14 Etiologia das doenças periimplantares Sendo a infecção bacteriana uma das razões primárias da falência dos implantes após a osseointegração, vários estudos observaram diferenças microbianas entre sítios periimplantares sadios e sítios periimplantares doentes. Rams et al. (1984) foram os primeiros a investigarem a microbiota do sulco/bolsa periimplantar. Rams et al. (1984) colhendo amostras de 17 implantes em função há no mínimo 6 meses, em 13 indivíduos, valendo-se de microscópio de contraste de fase, observaram altos níveis de espiroquetas e bastonetes móveis em 3 implantes considerados perdidos. Esses dados foram ratificados por Holt & Newman (1986), que observaram por meio de cultura e contraste de fase uma grande quantidade de espiroquetas e Bacteroides sp. em implantes doentes. Ericsson & Lekholm (1986) observaram em implantes e dentes pilares de prótese, ambos clinicamente livres de inflamação, a presença de bacilos/cocos e bastonetes móveis, perfazendo 50 e 25% do total da contagem, respectivamente. Comparando a microbiota associada a implantes sadios e implantes acometidos pela periimplantite, Mombelli et al. (1987), utilizando microscópio de campo escuro e meios de cultura, encontraram, nos implantes com periimplantite, uma microbiota complexa com grande proporção de anaeróbios Gram-negativos. Bacteroides spp., Fusobacterium spp., espiroquetas e fusiformes, assim como bastonetes móveis foram encontrados regularmente. Nos sítios sadios (controle) os autores observaram uma grande quantidade de cocos e uma pequena quantidade de bastonetes móveis e fusiformes. Espiroquetas não foram encontradas nesses sítios. A microbiota associada a implantes cerâmicos de safira foi avaliada por Sanz et al. (1990). Utilizaram dentes com saúde e doença periodontal como grupos controle e implantes com e sem inflamação clínica do tecido periimplantar como grupos teste. Os sítios doentes tanto em dentes quanto em implantes apresentaram uma grande quantidade de bastonetes anaeróbios Gram-negativos, Bacteroides spp. e bactérias que estavam se estabelecendo na superfície. Nos sítios sadios havia predominância de cocos facultativos Gram-positivos e bastonetes, sugerindo que a microbiota periimplantar tinha composição semelhante à microbiota periodontal nas condições de saúde e doença. Avaliando as condições clínicas e microbiológicas de 36 implantes acometidos pela periimplantite, Becker et al. (1990) mostraram um aumento da

15 13 mobilidade e presença de radiolucidez, notada radiograficamente, ao redor desses implantes. Utilizando sondas de DNA encontraram 37,5% de P.gingivalis, 35,4% de Prevotella intermedia nos sítios periimplantares, mas em concentrações moderadas; A. actinomycetemcomitans foi detectado em 27,8% dos sítios, mas em pequenas quantidades. Em outro estudo, analisando a microbiota de conectores protéticos de implantes sadios, Mombelli & Mericske-Stern (1990), por meio de cultura, observaram que 52,8% dos microrganismos cultivados eram cocos anaeróbios facultativos; 17,4% de bastonetes anaeróbios facultativos e 7,3% de bastonetes anaeróbios Gram-negativos. Fusobacterium spp. e P. intermedia perfaziam 8,8% das amostras enquanto espiroquetas e P. gingivalis não foram encontradas. Examinando a presença de patógenos periodontais em indivíduos portadores de próteses implanto-suportadas ou muco-implanto-suportadas, Ong et al. (1992) e George et al. (1994), encontraram A. actinomycetemcomitans, P. intermedia e P. gingivalis. Ong et al. (1992), examinando indivíduos que faziam uso de digluconato de clorexidina a 0,2% como enxaguatório bucal, encontraram mesmo na situação de saúde clínica do tecido periimplantar, um maior número de sítios periimplantares com anaeróbios. A. actinomycetemcomitans, P. intermedia e a P. gingivalis foram encontradas em 1, 7 e 0 sítios, respectivamente, de um total de 37 sítios analisados. Avaliando 98 implantes de 24 indivíduos, George et al. (1994), mostraram que 62,5% dos indivíduos possuíam um ou mais implantes colonizados por A. actinomycetemcomitans e/ou P. intermedia/p. gingivalis, enquanto, somente 37,5% não possuíam nenhum dos seus implantes colonizados por essas espécies. Os autores sugeriram que esses microrganismos, geralmente, associados à doença periodontal ocorrem com maior freqüência em implantes que exibem inflamação dos tecidos periimplantares. Em um estudo semelhante ao de Löe et al. (1965), Pontoriero et al. (1994), induziram experimentalmente mucosite periimplantar em humanos, num grupo de 20 indivíduos parcialmente desdentados entre 36 e 59 anos, que deixaram de realizar medidas de higiene bucal por um período de 3 semanas para promover acúmulo de placa ao redor dos implantes e dentes adjacentes. A composição da microbiota subgengival e submucosa foi avaliada por meio de microscopia de contraste de fase. Tanto os parâmetros microbiológicos quanto os clínicos (presença de placa, índice gengival, sangramento a sondagem, profundidade à sondagem e

16 14 recessão) foram avaliados antes e após o período experimental, quando os hábitos de higiene foram novamente reinstituídos. Após este período, os parâmetros clínicos observados apresentaram diferenças estatisticamente significante (p<0,05) com relação ao início do experimento, porém, sem diferença estatística entre implantes e dentes. Durante as 3 semanas de acúmulo de placa houve uma alteração da contagem bacteriana (p<0,05), porém, não diferindo entre os grupos. Entretanto, a proporção de espiroquetas e bacilos móveis aumentou nesse período, 1,2 e 2,4% para 6,2 e 17,4%, no grupo de implantes e, de 1,9 e 2,8% para 7,8 e 19,2% no grupo controle, respectivamente. Enquanto que os níveis de cocos diminuíram de 79,3 e 76,3% para 54,3 e 47,3% para implantes e dentes, respectivamente. Papaioannou et al. (1996), correlacionando parâmetros periodontais e a microbiota ao redor de implantes osseointegrados, observaram uma microbiota, composta na sua maior parte, em cocos na situação de saúde periimplantar. Assim, a maioria dos estudos comentados sugere que a formação e maturação da microbiota periimplantar segue os mesmos cursos tanto nas situações de saúde como de doença periodontal. Bollen et al. (1996), observaram o acúmulo do biofilme em conectores com diferentes graus de rugosidade. A análise microbiológica, utilizando cultura e microscópio de contraste de fase, não apresentou diferença estatisticamente significante na contagem de P. intermedia e F. nucleatum independente do grau de rugosidade do conector. Lee et al. (1999) comparando a microbiota do tecido periimplantar ao redor de 101 implantes clinicamente saudáveis, dentes com coroas totais e dentes hígidos de 43 indivíduos, encontraram estreptococos, Veillonella parvula, Micromonas micros e F. nucleatum na grande maioria dos implantes. As espécies periodontopatógenas P. gingivalis, T. forsythia, P. intermedia, P. nigrescens e C. rectus foram detectadas em alguns sítios de todos os grupos. Para os dentes com coroas totais a microbiota foi similar à encontrada nos implantes. Nos dentes hígidos, observaram a presença de estreptococos, Selenomonas noxia e P. intermedia. Esses dados foram corroborados pelos achados de Fardal et al. (1999), em um caso clínico de falência múltipla de implantes em curto espaço de tempo, observaram a predominância de P. gingivalis, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis e Capnocytophaga spp.; o A. actinomycetemcomitans não foi isolado.

17 15 Utilizando o Checkerboard DNA-DNA Hibrydization, Salcetti et al. (1997) avaliaram os níveis de mediadores inflamatórios, fatores de crescimento e a presença de 40 espécies microbianas associadas a implantes doentes e compararam com implantes osseointegrados saudáveis. Avaliaram 21 amostras de biofilme de indivíduos que tinham implantes com periimplantite (grupo 1) e 8 indivíduos com implantes saudáveis (grupo 2). Amostras do fluido crevicular foram colhidas e analisadas segundo a presença de "protagonistas" anabólicos para a reabsorção óssea, prostaglandina E 2 (PGE 2 ), interleucina-1β (IL-1β) e IL-6, fatores anabólicos de neoformação óssea, fator de transformação de crescimento β (TGF-β) e fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF). Embora tendências positivas fossem notadas, não observaram nenhuma diferença significativa em qualquer amostra microbiológica ou para os níveis de mediadores de inflamação nos implantes doentes quando comparados aos implantes saudáveis. Os autores encontraram também em uma freqüência muito alta P. nigrescens, M. micros, F. nucleatum ss vicentii e F. nucleatum ss nucleatum, assim como uma elevação significativa no fluido crevicular de PGE 2, IL-1β e PDGF nos indivíduos com implantes doentes quando comparados aos implantes saudáveis. Além disso, encontraram uma contagem de P. nigrescens e M. micros que foi correlacionada com as concentrações de PGE 2. Buscando a característica da microbiota ao redor de implantes e dentes em indivíduos com periimplantites, Hultin et al. (2002) avaliaram os parâmetros clínicos e microbiológicos de 36 indivíduos, sendo 17 indivíduos com periimplantite e 19 controles. Através da técnica Checkerboard DNA-DNA Hibrydization, foram capazes de detectar altas porcentagens de amostras positivas para P. gingivalis, P. intermedia, P. nigrescens, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum, T. denticola, M. micros, C. rectus, E. corrodens, S. noxia e S. intermedia em dentes e implantes. C. rectus e S. noxia não foram encontrados ao redor de implantes do grupo controle. Os principais patógenos periodontais, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia, T. denticola e A. actinomycetemcomitans, estiveram presentes em todas as categorias de sítios em indivíduos e controles. Entretanto, somente ao redor de implantes com periimplantite a quantidade de bactérias encontrada foi superior a 10 6 para estes 5 patógenos.

18 16 Comparando implantes com doença periimplantar e dentes periodontalmente doentes de diferentes indivíduos, Listgarten & Lai (1999), por meio de culturas bacterianas, encontraram T. forsythia (59%), Fusobacterium spp. (41%), P. micra (39%) e P. gingivalis (27%) nas amostras dos implantes doentes. Nos dentes periodontalmente doentes encontraram T. forsythia (83%), Fusobacterium spp. (80%), espiroquetas (79%), P. micra (51%), P. gingivalis (59%) e E. corrodens (37%) na periodontite de adulto e T. forsythia (85%), Fusobacterium spp. (83%), P. gingivalis (60%), espiroquetas (59%), P. micra (56%) e C. rectus (56%) na periodontite refratária. Sugeriram que haveria diferenças qualitativas entre os implantes com periimplantite e os sítios comprometidos periodontalmente. Shibli et al. (2003), avaliaram a indução de periimplantite por meio de ligaduras durante 60 dias em 4 diferentes tipos de superfícies, Ticp (titânio comercialmente puro), TPS (titânio plasma-spray), HA (hidroxiapatita) e Acid (implante de superfície híbrida), em 36 implantes instalados em 6 cães. Foram realizadas avaliações radiográfica e microbiológica, por meio de cultura bacteriana. Pôde-se constatar que para os patógenos investigados P. gingivalis, P. intermedia, Fusobacterium spp., Campylobacter spp. e S. β-hemoliticos, assim como para contagem total das bactérias viáveis que não houve diferença estatística entre os grupos após os 60 dias de estudo. 1.2 Tratamento das doenças periimplantares utilizando modelos experimentais em animais Com a finalidade de avaliar o efeito do uso de antibióticos sistêmicos para o tratamento das periimplantites, Ericsson et al. (1996) instalaram 30 implantes nas mandíbulas de 5 cães e, após a indução das lesões por ligaduras, separaram os animais em 2 grupos onde ambos receberam doses de amoxicilina e metronidazol durante 21 dias, porém, só no grupo teste foi realizado retalho para debridamento e aplicação de delmopinol. Observaram que a antibioticoterapia por si só não foi capaz de eliminar a lesão periimplantar, havendo então a necessidade de um concomitante debridamento local da superfície contaminada. Observaram também que ocorria falha na re-osseointegração devido a uma estreita cápsula de tecido conjuntivo fibroso que se interpunha entre a superfície do implante e o osso neoformado. Este achado também foi descrito nos estudos de Persson et al. (1996, 1999 e 2001).

19 17 Em 2001, para avaliar os resultados dos diferentes tipos de membranas (absorvível e não absorvível) associadas ou não com materiais de preenchimentos (Bio-Oss ) no tratamento das periimplantites induzidas por ligaduras, Nociti Jr. et al. (2001) instalaram 30 implantes (superfície tratada com ácido) em 5 cães. Todos os grupos receberam metronidazol sistemicamente durante 21 dias, acesso cirúrgico para remoção do tecido de granulação e tratamento da superfície do implante com jato abrasivo por 30 segundos. Em seguida cada implante recebeu a terapia local de acordo com seu grupo (apenas debridamento, PTFE e Bio-Oss, Bio-Gide e Bio- Oss, apenas PTFE ou Bio-Gide e, somente Bio-Oss ). Após 5 meses, não houve diferença (p=0,612) entre as diversas formas de terapia apesar dos valores sugerirem melhores resultados para Bio-Gide e Bio-Oss seguido por apenas Bio- Gide, somente Bio-Oss, PTFE e Bio-Oss, apenas PTFE e debridamento apenas. Porém, houve duas exposições da membrana PTFE associada ao Bio-Oss, uma exposição para Bio-Gide e Bio-Oss e uma, para Bio-Gide. Visando a re-osseointegração após a resolução dos defeitos gerados por ligaduras, Persson et al. (1999) avaliaram 24 implantes em 4 cães que receberam associação de amoxicilina e metronidazol sistemicamente durante 21 dias como adjuntos ao debridamento mecânico com acesso cirúrgico, porém a descontaminação final foi realizada com solução salina ou pedra-pomes abrasiva. Da mesma forma que estudos anteriores, Persson et al. (1996) e Ericsson et al. (1996), houve resolução das periimplantites, mas tanto o tratamento mecânico quanto o químico da superfície contaminada do implante não foram capazes de estabelecer condições que conduzissem a re-osseointegração. Utilizando dois tipos de superfícies, lisa ou tratada com ácido (SLA), Persson et al. (2001) avaliaram a influência dessas superfícies para obtenção da reosseointegração. Foram utilizados 4 cães, nos quais foram instalados 24 implantes sendo, de um lado implante liso e do outro, implante SLA. Regime antibiótico composto por amoxicilina e metronidazol foi administrado por 17 dias e, em ambos os lados foram realizados acesso para debridamento e limpeza com cotonete embebido com solução salina. O preenchimento do defeito ósseo após 6 meses da terapia foi de 72 e 76% para implantes lisos e SLA, respectivamente, enquanto que a re-osseointegração obtida foi de 22 e 84%, respectivamente. Entretanto, a razão pela qual implantes SLA promovem uma maior integração ao tecido ósseo ainda não é conhecida.

20 18 De acordo com os estudos prévios de Ericsson et al. (1996) e Persson et al. (1996, 1999 e 2001), fica evidente que a qualidade da superfície do implante após descontaminação é o fator condicionante para a reosseointegração. Então, em um outro estudo em 2001, Persson et al. testaram a hipótese na qual a qualidade da superfície do titânio estaria diretamente relacionada à osseointegração e reosseointegração. Para isso, foram necessários 2 cães e 16 implantes, sendo 4 implantes controles e 12 implantes testes (implantes de 2 porções, 4 mm coronal e 6 mm apical), ambos de superfície lisa e 10 mm de comprimento. Novamente amoxicilina e metronidazol foram administrados sistemicamente por 21 dias, como também o debridamento cirúrgico dos implantes e limpeza com cotonete embebido em solução salina, porém, a porção coronal dos implantes testes foi substituída por implantes novos. Foi constatado que para os implantes controles havia a formação de tecido conjuntivo entre o osso neoformado e a superfície do implante após a resolução da lesão periimplantar, em contraste ao ocorrido com os implantes testes, onde a porção coronal substituta do implante mostrou-se re-osseointegrada. Entretanto, na junção entre as porções coronária e apical do implante observou-se a presença de um infiltrado inflamatório. Em 2003, Shibli et al. avaliaram o potencial de cicatrização e reosseointegração em defeitos periimplantares induzidos por ligaduras em 6 cães. Um total de 36 implantes, de 4 diferentes tipos de superfície, foram instalados, sendo que apenas 19 implantes permaneceram viáveis para o tratamento, que consistiu de debridamento cirúrgico das lesões, terapia fotodinâmica e regeneração óssea guiada. Observaram que a porcentagem de preenchimento ósseo foi maior para implantes com superfície de hidroxiapatita (HA), plasma-spray de titânio (TPS), implantes tratados com ácido (AE) e titânio comercialmente puro (cpti). Enquanto que a porcentagem de re-osseointegração foi maior para TPS, seguida por cpti, AE e HA, respectivamente. 1.3 Tratamento anti-infeccioso das doenças periimplantares em humanos Mombelli & Lang (1992), trataram nove indivíduos, sendo quatro desdentados totais e cinco parcialmente desdentados, por meio de debridamento mecânico, irrigação de todas as bolsas periimplantares maiores que 3 mm com clorexidina 0,5% e antibioticoterapia sistêmica, com uma dose diária de mg de

21 19 ornidazol, durante dez dias. Esses indivíduos foram selecionados de acordo com o monitoramento microbiológico, onde deveriam apresentar contagens > 10 6 unidades formadoras de colônias por mililitro de bactérias anaeróbias cultiváveis e, proporção de bactérias anaeróbias igual ou superior a 20%. No 10º dia após o tratamento, a microbiota foi drasticamente reduzida e espiroquetas não foram mais detectadas, ocorrendo uma mudança bacteriana onde cocos gram positivos facultativos eram predominantes. Após 3 meses de tratamento a recolonização por vários microrganismos, por exemplo, P. intermedia, atingiu o pico. Em 12 meses P. intermedia e Fusobacterium spp diminuíram novamente. Aquela redução inicial foi devida ao efeito imediato do antibiótico, enquanto que a redução microbiana tardia, aos 12 meses, estaria associada à redução gradual da profundidade de sondagem periimplantar juntamente com um aumento na pressão de oxigênio além da redução dos produtos sangüíneos disponíveis. Isso poderia exercer uma pressão ecológica, longitudinal, para estabilizar uma microbiota subgengival menos virulenta, composta por um menor número de patógenos. Buchman et al (1996,1997), apresentaram um relato de 20 implantes com lesão periimplantar clínica ou radiográficamente em 14 indivíduos. Como tratamento, foram propostos a instrução de higiene oral, ajuste oclusal e debridamento associado a antibiótico sistêmico (amoxicilina / ácido clavulônico 500 mg x 3 por 7 dias ou metronidazol 250 mg x 3 por 7 dias), conforme teste de sensibilidade da microbiota frente a esses antibióticos. Seis implantes foram excluídos do estudo para serem tratados cirúrgicamente, devido a recidiva da doença periimplantar. Após 6 meses, os índices de placa visível foram de 0,4 para 0,3 %; Sangramento marginal de 1,1 para 0,4 %; sangramento à sondagem de 60 para 20%; e profundidade de sondagem de 5,1 para 2,6 mm e foi verificado ainda um recobimento ósseo de 1,6 mm. Khoury/Buchmann 2001, como parte de um tratamento pré cirúrgico, relataram o tratamento de 41 implantes apresentando profundidade de sondagem variando entre 7 e 9,5 mm e perda óssea radiográfica entre 2,5 e 9 mm em 25 indivíduos. O tratamento consistia na irrigação com clorexidina e debridamento do elemento selecionado associado a administração de antibiótico sistêmico (variando conforme teste de sensibilidade da microbiota periimplantar ao antibiótico e profilaxia semanalmente conforme necessidade do individuo). Após 6 meses de avaliação, o

22 20 tratameno apresentou melhora na profundidade de sondagem, porém não foi estatístico. Associado ao debridamento periimplantar, Mombelli et al. (2001) utilizaram dispositivos de liberação lenta de tetraciclina (Actisite ) durante 10 dias, no tratamento de 25 indivíduos desdentados parciais, que apresentaram 30 implantes acometidos pela doença. Um mês após o tratamento, houve uma redução estatisticamente significante (p<0,01) com relação ao índice de sangramento modificado (Mombelli et al. 1987), profundidade à sondagem e sangramento à sondagem. Esses índices se mantiveram estatisticamente reduzidos após 1 ano de terapia. Após a remoção das fibras de tetraciclina notou-se uma marcante redução da contagem total de bactérias, de 3,41 para 0,54 x10 6 UFC, mantendo-se reduzida até 6 meses pós-terapia (1,46 x10 6 UFC), porém, aos 12 meses, os níveis assemelharam-se ao inicial. O mesmo ocorreu para os microrganismos anaeróbios gram-negativos. Campylobacter rectus, A. naeslundii, A. actinomycetemcomitans e E. corrodens que não foram mais detectados imediatamente após a remoção do Actisite, porém, houve recolonização por esses microrganismos durante o período do estudo. Testando a efetividade do sistema Vector, Karring et al. (2005) trataram 11 indivíduos, sendo que cada um possuia 2 implantes acometidos por periimplantite. Enquanto que o debridamento de um implante era realizado por meio de curetas de fibra de carbono, o outro implante era tratado pelo sistema Vector. Uma nova sessão de debridamento foi repetida aos 3 meses. Após 3 e 6 meses de acompanhamento, uma suave melhora foi observada no índice de placa ao redor dos implantes para ambos os tratamentos (p > 0,1). No 6 mês, quatro indivíduos do grupo teste e apenas um do grupo controle não apresentaram mais sangramento à sondagem. O nível ósseo no baseline, avaliado através de radiografias digitalizadas, foi de 6,8 + 1,7 e 7,4 + 2,1 mm para o sistema Vector e debridamento no baseline, respectivamente. E, aos 6 meses foi 7,1 + 1,9 e 7,7 + 2,6 mm, expressando uma diferença de -0,3 + 1 e -0,3 + 0,8 mm, mas não houve diferença estatisticamente significante em ambos os grupos entre os tempos. A profundidade de sondagem que foi de 5,8 + 1,1 e 6,2 + 1,6 mm no início e, aos 6 meses foi de 5,8 + 1,2 e 6,3 + 2,2 mm para os grupos teste e controle (debridamento), respectivamente. Renvert et al (2006), dividiram 32 indivíduos com pelo menos um implante ósseointegrado com perda óssea radiográfica 3 roscas e profundidade de

23 21 sondagem 4mm associado a sangramento a sondagem ou supuração, em dois grupos. Ambos os grupos receberam tratamento mecânico no elemento adjacente ao implante estudado. Após o debridamento o grupo controle recebeu aproximadamente 1 ml de clorexidina gel 1% no sítio mais profundo e o grupo teste recebeu 1 mg de monociclina (Arestin ). Após um ano de avaliação microbiológica através do Checkerboard DNA-DNA hybridization e cultura, não houve diferença estatística entre os grupos e nem entre os tempos estudados. Clinicamente também não houve diferença estatística. Persson et al (2006), avaliaram por um ano, o efeito microbiológico do antibiótico local (Arestin ), no tratamento das periimplantites. Trinta e um implantes em 25 indivíduos, com perda de óssea de 2 mm ao redor do implante e que apresentavam uma profundidade de sondagem 5mm após o tratamento inicial, receberam uma dose de Arestin (1 mg minocycline) em cada sítio dos implantes selecionados. Ao final dos 360 dias não houve diferença estatística com o baseline. Salvi et al em 2007, continuando o trabalho de Persson et al (2006), apresentaram os resultados clínicos e radiográficos. Houve diferença estatística entre o baseline e após o tratamento com Arestin após um ano (p<0,05), para alguns parâmetros clínicos. Profundidade de sondagem média por implante reduziu de 4,5 ± 1,3 mm no baseline, para 3,5 ± 0,7 mm aos 360 dias. A profundidade de sondagem do sítio mais profundo de cada implante, reduziu de 5,9 ± 0,7mm no baseline para 4,2 ± 0,6mm aos 360 dias. O nível clínico de inserção médio por implante, reduziu de 3,3 ± 1,1 mm no baseline para 2,2 ± 1mm ao final do estudo e do sítio mais profundo de cada implante houve uma redução de 4,4 ± 1,1 para 2,3 ± 0,9 mm entre os tempos. O sangramaneto a sondagem também sofreu redução estatística tanto na média por implante, como no sítio mais profundo. A redução foi de 69 ± 38% para 19 ± 30% e de 92 ± 28% para 44 ± 51%, do baseline ao final do estudo respectivamente. O índice de placa só sofreu mudança estatística na média por implante, aumentando de 2 ± 2,3% no baseline para 10 ± 25% ao final do estudo. Os níveis de recessão da mucosa e os parâmetros radiográficos não sofreram mudanças estatísticas.

24 Tratamento regenerativo das doenças periimplantares em humanos No estudo de Leonhardt et al. (2003), 9 indivíduos, com 26 implantes acometidos por periimplantite, foram tratados cirurgicamente e receberam antibiótico com base nos testes de susceptibilidade dos microrganismos para penicilina V, amoxicilina, tetraciclina, metronidazol, ciprofloxacino e sulfa/trimetropim. Após 5 anos, os índices de placa e sangramento marginal diminuíram de 100 % para 11 % e 5 %, respectivamente. Dos 26 implantes, 7 (27 %) foram perdidos, enquanto que 4 implantes continuaram a perder osso (> 1 rosca), 9 permaneceram estáveis e 6 apresentaram ganho ósseo (> 1 rosca) em 5 anos de acompanhamento. Observaram também que a resposta ao tratamento em indivíduos fumantes com periimplantite era menos favorável que em não fumantes e, que essa forma de terapia combinada ao uso de antibióticos, não empiricamente administrados, apresentou um índice de 58 % de resolução para as periimplantites. Com relação às amostras subgengivais, dos 6 indivíduos que se apresentaram positivos para a cultura do A. actinomycetemcomitans no início, mostraram-se negativos para esse microrganismo após os 5 anos. Entretanto, P. intermedia e P. nigrescens foram encontradas em 7 indivíduos no início do estudo e no final desse período foram recuperadas em 8 indivíduos. P. gingivalis, que foi encontrada em apenas 1 indivíduo no início do estudo, não foi mais detectada aos 6 meses e 1 ano após, mas no 5 ano voltou a ser detectada em alguns implantes. Romeo et al (2005), avaliaram clinicamente o tratamento cirúrgico da periimplantite. Trinta e cinco implantes de superfície tratada (TPS), em 17 indivíduos com sinais de sangramento marginal ou supuração e profundidade de sondagem >4 mm foram divididos em dois grupos. Grupo teste (n = 19 implantes) sofreu reposicionamento apical do retalho, associado ao polimento da superfície do implante através de brocas diamantadas em peça de mão a 15,000 rpm e taças de silicone e o grupo controle (n = 16 implantes) que sofreu apenas reposicionamento apical do retalho. Ambos os grupos foram tratados mecânicamente e receberam antibiótico sistêmico (Amoxicilina 50 mg/kg durante 8 dias) previamente ao tratamento cirúrgico. Após as cirúrgias, os indivíduos foram intruídos a bochechar clorexedina 0,2% (10 ml por 1 minuto a cada 8 horas, durante 2 semanas). Dois anos após tratamento, o grupo controle apresentou aguns dados clínicos mais altos que o grupo teste, respectivamente: profundidade de sondagem (5,5 e 3,58 mm);

25 23 nível clínico de inserção (7,04 e 5,89 mm) e o índice de sangramento modificado ( 2,33 e 0,5 mm). Em compesação o indice de recessão gengival foi estatíscamente maior no grupo teste em relação ao grupo controle: 1,64 e 2,3mm respectivamente. Comparando-se o tempo inicial em relação ao final (sendo que o grupo controle foi avaliado por 2 anos devido a persistência da doença periimplantar e o grupo teste por 3 anos), podemos observar diferenças estatísticas. No grupo controle: profundidade de sondagem de 6,52 para 5,5 mm; índice de sangramento modificado de 2,86 e 2,33 mm; índice de recessão aumentou de 0,23 para 1,64 mm; nivel clínico de inserção aumentando de 5,95 para 7,04 mm. No grupo teste, os resultados foram: profundidade de sondagem de 5,78 para 3,21 mm; índice de sangramento modificado de 2,83 para 0,61; índice de recessão da mucosaaumentou de 0,5 para 1,96 mm e nível clínico de inserção de 5,5 para 5,18 mm. Em 2007, Romeo et al, apresentaram os resultados radiográficos desse estudo. Não houve diferença estatística entre o início e o final do estudo para perda óssea marginal em ambos os grupos, porém 4 implantes do grupo controle apresentaram mobilidade diminuindo a taxa de sobrevivência desses implantes para 77,8% após 3 anos enquanto o grupo teste apresentou uma taxa de 100%. Schawarz et al (2006), apresentaram um trabalho com 22 implantes que apresentavam perda óssea radiograficamente e profundidade de sondagem > 6mm. Os indivíduos foram divididos em dois grupos: Grupo teste com 11 implantes tratados cirúrgicamente com nanocristais de hidróxiapatita (Ostim ) e Grupo Controle com enxerto bovino (Bio-Oss ) e membrana de colágeno (Bio-Gide ). Após 6 meses de avaliação, houveram melhoras na profundidade de sondagem, nível clínico de inserção e radiograficamente para os dois grupos, mas não foi estatístico. Não houve diferença entre os grupos. Roos-Jansaker et al 2007, avaliaram o tratamento cirúrgico da periimplantite, utilizando um substituto ósseo com ou sem membrana reabsorvível. Todos os 36 indivíduos, com no mínimo um implante osseointegrado, com uma perda óssea 3 roscas associado a sangramento ou supuração a sondagem, foram divididos em 2 grupos e começaram a usar um dia antes do tratamento cirúrgico amoxicilina ( 375 mg x 3 ) associado ao metronidazol ( 400 mg x 2 ) por 10 dias. O grupo 1 recebeu o substituto ósseo ( Algipore ) e foi recoberto por uma membrana reabsorvível ( Osseoquest ), enquanto o grupo 2 recebeu apenas o substituto ósseo. Após um ano de acompanhamento, houve uma melhora radiográfica e

26 24 clínica, porém não houve diferença estatística entre os grupos e nos tempos estudados. Com base na revisão de literatura, nota-se um pequeno número de estudos duplo-cegos, placebo controlado e randomizados, avaliando longitudinalmente a associação sistêmica de antibióticos para o tratamento de lesões periimplantares em humanos assim como seus efeitos clínicos e microbiológicos.

27 25 2. PROPOSIÇÃO Este estudo longitudinal duplo-cego, placebo controlado e randomizado, teve como objetivo avaliar os efeitos da administração sistêmica do metronidazol e amoxicilina associados à raspagem e debridamento periimplantar não-cirúrgico na composição da microbiota mucosal, nos parâmetros clínicos periimplantares e radiográficos, de indivíduos portadores de periimplantites.

28 26 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Seleção dos indivíduos A população incluída neste estudo foi composta por 22 indivíduos adultos (>35 anos), de ambos os gêneros, portadores de periimplantite. Esta amostra foi proveniente de um levantamento clínico realizado por Melo (2005), que examinou todos os indivíduos que buscaram atendimento odontológico na Clínica de Implantes da Universidade Guarulhos desde Para a avaliação do estado geral de suas respectivas restaurações protéticas, 937 indivíduos portadores de algum tipo de prótese implanto-suportada foram examinados clínica e radiograficamente. Após a exclusão daqueles que não utilizavam as próteses implanto-suportadas regularmente (ex. overdentures), possuíam implantes sem restaurações ou que apresentavam restaurações inadequadas, 754 indivíduos foram incluídos, sendo que apenas 22 sujeitos preenchiam os quesitos de inclusão deste estudo. 3.2 Critérios de inclusão e exclusão dos indivíduos envolvidos no estudo Baseado em estudo prévio (Melo et al. 2005), os critérios de inclusão dos indivíduos avaliados neste estudo foram: apresentar os seguintes sinais clínicos de doença periimplantar: sangramento à sondagem e/ou supuração, profundidade de sondagem maior que 4mm; perda óssea radiográfica maior que 3mm (Figura 1), no mínimo 50% de remanescente ósseo periimplantar (caso contrário, este implante foi considerado perdido); apresentar pelo menos uma prótese implanto-suportada, utilizando implantes de superfície lisa (titânio comercialmente puro), hexágono externo e rosqueáveis, sob função há no mínimo 1 ano, acometido pela periimplantite (caso o indivíduo apresentasse mais que um implante acometido pela periimplantite, apenas um implante foi avaliado); ausência de mobilidade, quebra de parafusos ou soltura dos componentes protéticos junto às próteses implanto-suportadas, na tentativa de minimizar a influência de possíveis traumas oclusais; apresentar boas condições de saúde geral ( não ter problemas cardíacos, imunológicos, diabetes, etc );

29 27 não ter passado por tratamento periodontal ou ter utilizado antibióticos ou antiinflamatórios nos 6 meses que antecederem o estudo; ausência de doença periodontal crônica generalizada moderada/avançada e doença periodontal agressiva localizada e generalizada; não ser fumante; não estar grávida ou lactante; não apresentar histórico de alergias ou hipersensibilidade à amoxicilina ou ao metronidazol; próteses que dificultassem o acesso à sondagem. 1a 1b Figura 1. Aspecto radiográfico de indivíduo portador de peri-implantite apresentando extensa perda óssea radiográfica: a) implante localizado na região de maxila posterior e b) implante localizado na porção posterior da mandíbula. Caso o indivíduo apresentasse, durante o tratamento, presença de supuração, aumento da profundidade de sondagem ou aumento da perda óssea observado nas radiografias de 180 e 365 dias após início do tratamento, este indivíduo seria excluído do estudo e receberia tratamento cirúrgico para a periimplantite. Os indivíduos selecionados foram informados a respeito da pesquisa, objetivos, procedimentos clínicos, coletas das amostras microbiológicas, riscos, conseqüências e tipos de terapias a serem utilizadas. Aqueles que concordaram com o exposto e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Guarulhos (Protocolo CEP-UnG 62/2004), foram incluídos na amostra.

30 Delineamento experimental No tempo inicial (-21 dias) todos os indivíduos (n=22) foram submetidos à anamnese, exame clínico de diagnóstico (triagem), e exame radiográfico. Logo após, receberam profilaxia profissional para remoção do biofilme supragengival e adequação do meio assim como instrução de higiene oral nos dentes e implantes (Lang et al. 1997). Os indivíduos foram aleatoriamente distribuídos, em 2 grupos terapêuticos, por sorteio utilizando uma moeda (cara ou coroa), e submetidos a uma das seguintes formas de tratamento: Grupo teste Raspagem e debridamento periimplantar com curetas de teflon em campo fechado associado à administração sistêmica de metronidazol (400mg, 3x/dia) e amoxicilina (500mg, 3x/dia) durante 14 dias, Grupo controle Raspagem e debridamento periimplantar com curetas de teflon em campo fechado associado à administração de placebo (talco farmacêutico) seguindo o mesmo regime utilizado para a administração de antibióticos no grupo teste. O debridamento periimplantar foi realizado juntamente com a administração dos antibióticos. Os indivíduos foram avaliados no início do estudo (dias -21 e 0), logo após a terapia (14 dias) e aos 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias pós-terapia. No decorrer do estudo foram coletados dados clínicos, radiográficos e microbiológicos assim como descrito na Figura 2. O procedimento de raspagem e debridamento periimplantar foi realizado utilizando curetas de teflon (Straumann, Villeret, Switzerland) para evitar danos à superfície dos implantes. Os indivíduos foram tratados pelo mesmo operador (pesquisador 1- TRCV) e examinados por outro (pesquisador 2 DSF). Os examinadores e os sujeitos da pesquisa não foram informados sobre a terapia empregada (medicamento ou placebo), ministrada pelo pesquisador 3 (JAS). Uma vez que nem os examinadores e nem os indivíduos avaliados no estudo, sabiam da terapia antibiótica que era fornecida e os grupos foram divididos aleatóriamente, o estudo foi definido como duplo-cego, placebo controlado e randomizado.

31 29 Figura 2. Delineamento experimental. A raspagem e debridamento periimplantar (RDP) foi realizado concomitantemente ao início da administração dos antibióticos: RDP + Medicamento+: no dia 0 os indivíduos receberam o medicamento (400mg de metronidazol 3x/dia e 500mg de amoxicilina 3x/dia) ou o placebo associado à raspagem e debridamento periimplantar; Medicamento-: no dia 14 o medicamento ou placebo foi suspenso Seleção do sítio periimplantar O sítio periimplantar de maior profundidade de sondagem com sangramento e ou supuração foi selecionado para as coletas de amostras de biofilme subgengival destinadas às análises microbiológicas. Quando dois ou mais sítios no mesmo implante apresentavam a mesma profundidade de sondagem, sangramento e ou supuração, foi escolhido o mais anterior Seqüências das consultas de avaliação Após a seleção do sítio periimplantar (dia -21) os indivíduos foram avaliados em mais 9 consultas (0, 14, 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias após início da terapia). Os procedimentos que foram realizados em cada consulta estão representados na Figura 2 e ocorreram na seguinte ordem: 1- Exame radiográfico (0, 180 e 365 dias); 2- Identificação e isolamento relativo do sítio a ser coletado (ver

32 Seleção do sítio periimplantar); 3- Coleta de biofilme subgengival, e 4- Exame clínico periimplantar Exame clínico e radiográfico Os parâmetros clínicos avaliados foram: 1. Presença (1) ou ausência (0) de biofilme bacteriano visível, 2. Presença (1) ou ausência (0) de sangramento marginal, 3. Presença (1) ou ausência (0) de sangramento à sondagem, 4. Presença (1) ou ausência (0) de supuração, 5. Profundidade de sondagem (mm) - caracterizada pela distância da margem periimplantar até o fundo da bolsa, 6. Nível clínico de inserção (mm) - caracterizada pela distância de ponto fixo previamente determinado (junção conector/implante ou barra em casos de overdentures) até o fundo da bolsa. O exame periimplantar foi realizado por um examinador (pesquisador 2), previamente treinado e calibrado. As medidas de profundidade de sondagem e nível clínico de inserção foram determinadas utilizando uma sonda periodontal manual do tipo Carolina do Norte (PCPUNC 15 Hu-friedy Mfg Co Inc. Chigago IL, Estados Unidos América). As mensurações foram realizadas em 6 faces do implante: mesiovestibular, médio-vestibular, disto-vestibular, mesio-lingual, médio-lingual e distolingual. A metodologia empregada para a calibração tanto para a mensuração realizada nos dentes remanescentes quanto para os implantes osseointegrados foi preconizada por Araújo et al. (2003) no qual se avaliou o erro padrão da medida (e.p.m) e o erro médio percentual (e.m.p) para os parâmetros clínicos contínuos (profunidade de sondagem, nível clínico de inserção). O e.p.m e e.m.p intraexaminador obtido para os dentes remanescentes foram respectivamente de 0,22mm e 5,2% para a profundidade de sondagem, 0,30mm e 6,33% para nível clínico de inserção. Já os valores de e.p.m e e.m.p intra-examinador obtidos para os implantes foi de 0,09mm e 2,2% para a profundidade de sondagem e 0,08mm e 3,99% para nível clínico de inserção. As variáveis categóricas (índice de placa,

33 31 sangramento marginal, sangramento a sondagem e supuração) considerando somente a presença ou ausência do parâmetro clínico foram obtidas, para dentes e implantes, a média do nível de concordância utilizando o teste Kappa Light no valor de 89%. Os exames radiográficos foram realizados por meio de filmes do tipo Ektaspeed (Kodak, Eastman, CO, Estados Unidos da América) utilizando-se posicionadores para a técnica do paralelismo adapatado para cada paciente com o auxílio de silicona de condensação. As radiografias obtidas foram processadas pelo método tempo-temperatura e logo após digitalizadas por meio de câmera digital (Canon EOS 300D, Tokyo, Japão). As tomadas raiográficas foram realizadas nos período inicial, 180 e 365 dias após início da terapia. A radiografia obtida aos 180 dias serviu como controle para observar a presença de perda óssea vertical apos tratamento (critério de exclusão do indivíduo do estudo). As análises foram realizadas com as tomadas radiográficas obtidas no tempo inicial e 365 dias. Para obtenção da perda óssea vertical, foram realizadas as mensurações da distância entre o conector protético e a crista óssea alveolar periimplantar, utilizando-se o software Image Tool 3.0 ( Estas mensurações foram realizadas por um único examinador (pesquisador 2) previamente treinado. A subtração das imagens radiográficas foi realizada segundo Jeffcoat et al As radiografias foram codificadas e agrupadas segundo seus pares (tempo 0 e 365) para cada grupo (teste e controle) fornecendo apenas as dimensões do implantes (comprimento e largura), de maneira que o operadaor fosse cego aos tratamento. A radiografia do tempo inicial (tempo 0) foi capturada por uma câmera de vídeo, digitalizada com 512x480 pixels de resolução e 8 bits (256 níveis de cinza) para resolução de cor e armazenadas em um computador. A radiografia obtida ao final do experimento (tempo 365 dias) foi alinhada sobre cada superfície proximal do implante, digitalizada e armazenada. As radiografias pareadas (tempo 0 e 365 dias) foram subtraídas apos correção para contraste e discrepâncias geométricas em um único plano. A imagem resultante da subtração das radiografias apresenta áreas de perda e ganho ósseo contra um fundo cinza neutro. Áreas de perda óssea periimplantar foram isoladas utilizando-se técnicas de sobreposição de formas e morfologias, que também removem o noise do fundo

34 32 das radiografias. As imagens foram convertidas em imagens binárias (branco e preto sem sombras ou manchas de cinza) utilizando comandos interativos do software. A dilatação das imagens foi realizada para restaurar as mudanças ósseas ao seu tamanho original Avaliação microbiológica Cepas bacterianas e condições de crescimento A lista das 39 cepas bacterianas utilizadas neste estudo para o preparo das sondas de DNA está apresentada na Tabela 1. Todas as cepas foram adquiridas liofilizadas da ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, Estados Unidos da América) ou do Forsyth Institute (Boston, MA, Estados Unidos da América). O conteúdo liofilizado foi reidratado em caldo para crescimento de Mycoplasma (Difco Laboratories, Detroit, MI, Estados Unidos da América) e cultivado em ágar triptose de soja contendo 5% de sangue de ovelha desfibrinado (BBL, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD, Estados Unidos da América) a 35 o C sob condição de anaerobiose (80% N 2, 10% CO 2, 10%H 2 ). Algumas bactérias foram cultivadas em meios de cultura enriquecidos de forma a suprir suas necessidades nutricionais. T. forsythia, por exemplo, foi cultivada em ágar triptose de soja com 5% de sangue de ovelha desfibrinado e 10 µg/ml de ácido N-acetil murâmico (NAM) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA); enquanto P. gingivalis cresceu em um meio similar, suplementado com 5% de sangue de ovelha desfibrinado, 0,3µg/ml de menadiona (Sigma) e 5µg/ml de hemina (Sigma). T. denticola e T. socranskii foram cultivados em caldo para crescimento de Mycoplasma (Difco) suplementado com 1mg/ml de glicose, 400µg/ml de niaciamida, 150µg/ml espermina tetraidroclorídrica, 20µg/ml de isobutirato de sódio, 1mg/ml de L-cisteína, 5µg/ml de tiamina pirofosfato e 0,5% de soro bovino Isolamento do DNA e preparo das sondas As cepas bacterianas foram anaerobicamente cultivadas na superfície de ágar-sangue contido em placas de Petri, com exceção das 2 espécies de espiroquetas, que foram cultivadas em caldo de cultura, por 3 a 7 dias. As colônias foram raspadas e depositadas em tubos de microcentrífuga de 1,5ml contendo 1ml de solução TE (10 mm Tris-HCl, 0,1mM EDTA, ph 7,6). As células foram lavadas 2 vezes por centrifugação na solução-tampão de TE a rpm por 10 minutos. Em

35 33 seguida, as células das cepas Gram-negativas foram novamente suspensas e lisadas com SDS (dodecilsulfato de sódio, C 12 H 25 NaO 4 S) a 10% e proteinase K em uma concentração de 20mg/ml (Sigma). As cepas Gram-positivas foram lisadas em 150µl de uma mistura enzimática contendo 15mg/ml de lisozima (Sigma) e 5mg/ml de acromopeptidase (Sigma) em solução tampão de TE (ph 8,0). O DNA foi isolado e purificado como descrito por Smith et al. (1989). As sondas multi-genômicas (whole-genomic) foram preparadas para cada uma das 39 espécies pela marcação de 1µg do DNA bacteriano com digoxigenina, por meio do random primer digoxigenin labeling kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, Estados Unidos da América), de acordo com o método descrito por Feinberg & Vogelstein (1983). As espécies bacterianas avaliadas foram selecionadas segundo sua associação com diferentes tipos de doenças ou saúde periodontal/periimplantar (Quirynen et al., 2002; Shibli et al., 2003b,c; Shibli et al. 2008) Coleta das amostras de biofilme subgengival Amostras de biofilme subgengival dos sítios periimplantares previamente selecionados, em cada um dos 22 indivíduos foram obtidas independentemente. Após isolamento da área com rolos de algodão e remoção da placa supragingival, as amostras de biofilme subgengivais foram colhidas por meio de curetas de teflon estéreis (Melo, 2005). As amostras foram imediatamente depositadas em tubos plásticos individuais contendo 150µl de solução TE (ph 7,6), ao qual foram adicionados 100µl de NaOH a 0,5 M para que o DNA bacteriano permanecesse viável por longos períodos de tempo. Estes tubos foram então identificados e armazenados (-20º C) até serem analisados por meio da técnica do Checkerboard DNA-DNA Hybridization para as 39 cepas bacterianas descritas na Tabela 1, no laboratório de microbiologia da Universidade Guarulhos Checkerboard DNA-DNA Hybridization Hibridização DNA-DNA As suspensões contidas nos tubos foram fervidas em banho-maria por 10 minutos e, em seguida, neutralizadas pela adição de 0,8 ml de acetato de amônia a 5 M. Cada suspensão de placa bacteriana contendo o DNA livre foi depositada em uma das canaletas do Minislot (Immunetics, Cambridge, MA, Estados Unidos da

36 34 América - Figura 3) ficando, assim, concentrada em uma membrana de nylon (15 x 15cm) com carga positiva (Boehringer Mannheim). As duas últimas canaletas do Minislot (Immunetics) foram ocupadas por controles contendo uma mistura do DNA das espécies de microrganismos investigadas pelas sondas, nas concentrações correspondentes a 10 5 e 10 6 células, ou seja, 1ng e 10ng de DNA de cada espécie, respectivamente (Socransky et al., 1994; Haffajee et al., 1997a, b). A membrana foi então removida do Minislot (Immunetics) e o DNA nela concentrado foi fixado por meio de aquecimento em forno a 120º C por 20 minutos. A membrana foi pré-hibridizada a 42º C, por 1 hora, em uma solução contendo 50% de formamida, 1% de caseína (Sigma), 5 x standard saline citrate -SSC (1 x SSC = 150mM NaCl, 15mM de citrato de sódio, ph 7,0), 25 mm de fosfato de sódio (ph 6,5) (Na 2 HPO 4, Labsynth) e 0,5 mg/ml de RNA de levedura (Sigma). Em seguida, a membrana foi posicionada no Miniblotter (Immunetics, Figura 4) com as linhas de DNA perpendiculares às canaletas do aparato. Em cada canaleta do Miniblotter (Immunetics, Cambridge, MA, USA) foi adicionada uma sonda de DNA (diluída a aproximadamente 20ng/ml) em 130 µl de uma solução de hibridização composta de 45% de formamida, 5 X SSC, 20 mm de fosfato de sódio (ph 6,5), 0,2 mg/ml de RNA de levedura (Boehringer Mannheim), 10% de sulfato de dextrano e 1% de caseína (Sigma). A hibridização ocorreu por um período mínimo de 20 horas, a 42º C Detecção das espécies Após o período de hibridização, a membrana foi removida do Miniblotter (Immunetics) lavada por 40 minutos, a 65ºC numa solução adstringente composta de 1% de SDS, 1mM de EDTA e 20mM de Na 2 HPO 4, a fim de remover as sondas que não hibridizaram completamente. Em seguida, a membrana foi imersa por 1 hora em uma solução contendo 1% de ácido maleico (C 4 H 4 O 4 ), 3 M de NaCl, 0,2 M de NaOH, 0,3% de Tween 20, 0,5% de caseína, ph 8,0, e, logo após, por 30 minutos, na mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina conjugado à fosfatase alcalina em uma concentração de 1: A membrana foi depois lavada 2 vezes, por 20 minutos, em uma solução de 0,1 M de ácido maleico, 3 M de NaCl, 0,2 M de NaOH, 0,3% de Tween 20, ph 8,0, e 1 vez, por 5 minutos, em uma solução de 0,1 M de Tris HCl, 0,1M de NaCl, 50 mm de MgCl 2, ph 9,5.

37 35 Os próximos passos foram a incubação da membrana por 45 minutos a 37 o C em uma solução detectora à base de fosfatase alcalina, CDP-Star Detection Reagent (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, Inglaterra). A seguir, a membrana foi colocada em um cassete, Chassi Radiográfico 30x40cm (Konex, Ind. Bras., SP), sob um filme radiográfico de marca Kodak X-Omat K, 18x24cm (Kodak Brasileira Com. e Ind. Ltda, São José dos Campos, SP) por 40 minutos. O filme foi posteriormente revelado (Figuras 5 e 6) manualmente pelo método convencional temperatura-tempo, de acordo com orientações do fabricante. As soluções utilizadas foram da marca Kodak, sempre mantidas à temperatura de 20ºC. Colocar amostra em 150µl tampão TE ph 7.6 Adicionar 100 µl NaOH 0.5 M Canaleta aberta Ferver durante 10 minutos Membrana de nylon Adicionar 800 µl Acetato de Amônia 5 M filtro Depositar amostras nas canaletas Fixar DNA na membrana a 120 C por 20 min Figura 3. Representação gráfica do Minislot (Immunetics, Cambridge, MA, USA) e resumo da preparação e deposição das amostras de biofilme bacteriano subgengival (técnica do Checkerboard DNA-DNA Hybridization). A leitura dos filmes radiográficos foi realizada por um único examinador treinado (pesquisador 4, IB), da seguinte forma: cada sinal produzido por uma determinada sonda na amostra de biofilme foi comparado em intensidade ao sinal produzido pela mesma sonda nos dois controles contendo 10 5 e 10 6 bactérias. Desta

38 36 forma, o número 0 foi registrado quando não houve detecção do sinal; 1 equivaleu a um sinal menos intenso que o controle de 10 5 células; 2 equivaleu a aproximadamente 10 5 células; 3, entre 10 5 e 10 6 células; 4 aproximadamente 10 6 células e 5, mais de 10 6 células (Tabela 2). Estes registros foram então utilizados para determinar os níveis das diferentes espécies investigadas nos sítios periimplantares e indivíduos do estudo.

39 37 Tabela 1. Relação das cepas empregadas para a confecção das sondas de DNA, subdivididas em complexos microbianos (Socransky et al., 1998; Socransky & Haffajee, 2002). Espécies Cepas Espécies Cepas Actinomyces Complexo Laranja(cont.) Actinomyces gerencseriae a Fusobacterium nucleatum ss. nucleatum Actinomyces israelii a Fusobacterium nucleatum ss. polymorphum Actinomyces naeslundii II a Fusobacterium nucleatum ss. vincentii a a a Complexo Roxo Fusobacterium periodonticum a Actinomyces odontolyticus a Parvimonas micra a Veillonella parvula a Prevotella intermedia a Complexo Amarelo Prevotella nigrescens a Streptococcus gordonii a Streptococcus constellatus a Streptococcus intermedius a Complexo Vermelho Streptococcus mitis a Tannerella forsythia a Streptococcus oralis a Porphyromonas gingivalis a Streptococcus sanguinis a Treponema denticola B1 b Complexo Verde Outras Espécies Aggregatibacter actinomycetemcomitans a e b a Eubacterium sabureum a a Gemella morbillorum a Capnocytophaga gingivalis a Leptotrichia buccalis a Capnocytophaga ochracea a Neisseria mucosa a Capnocytophaga sputigena a Prevotella melaninogenica a Eikenella corrodens a Propionibacterium acnes I+II 11827/11828 a Complexo Laranja Selenomonas noxia a Campylobacter gracilis a Streptococcus anginosus a Campylobacter rectus a Treponema socranskii S1 b Campylobacter showae Eubacterium nodatum a a a ATCC (American Type Culture Collection) b Forsyth Institute.

40 38 MiniBlotter 45 Sondas de DNA genômicas marcadas com digoxigenina Préhibridização a 42 C 1 hr. Girar membrana 90 Hibridização em solução de formamida a 42 C 20hrs. Membrana de nylon Lavagem de alta estringência em solução SSC 0,4M a 65 C 40min. Anticorpo contra digoxigenina conjugado à fosfatase alcalina (1:10.000) Detecção por quimioluminescência com CDP Star em filme RX Figura 4. Representação gráfica do Miniblotter (Immunetics, Cambridge, MA, USA) e resumo das etapas de hibridização e detecção das espécies bacterianas presentes nas amostras biofilme bacteriano subgengival (técnica do Checkerboard DNA-DNA hybridization). Figura 5. Representação gráfica do padrão de hibridização entre as bactérias presentes nas amostras de placa e as sondas de DNA (técnica do Checkerboard DNA-DNA Hybridization).

41 39 Figura 6. Representação esquemática do padrão de hibridização entre as bactérias presentes nas amostras de placa e as sondas de DNA (técnica do Checkerboard DNA-DNA Hybridization). Nesta tabela estão apresentadas 40 bactérias, e as amostras de biofilme são de todos os dentes de um mesmo indivíduo. Tabela 2. Índice utilizado para a determinação dos níveis dos microrganismos nas amostras de biofilme subgengival. ÍNDICE NÍVEL DO MICRORGANISMO 0 Não detectado 1 Menos de 10 5 células 2 Aproximadamente 10 5 células 3 Entre 10 5 e 10 6 células 4 Aproximadamente 10 6 células 5 Mais de 10 6 células

42 Análise estatística Avaliação clínica e radiográfica Os parâmetros clínicos foram analisados tanto para o sitio de maior profundidade de sondagem (sitio teste) quanto para os 6 sítios por implante, em cada indivíduo. A média das medidas clínicas de profundidade de sondagem e nível clínico de inserção, assim como a média da porcentagem de sítios apresentando placa visível, sangramento marginal, sangramento à sondagem e supuração foram computados para cada indivíduo e, posteriormente, dentro de cada grupo (controle e teste). Os testes Mann-Whitney e Friedman foram utilizados para examinar diferenças inter- e intra-grupos respectivamente durante os vários períodos. Significância estatística foi estabelecida em nível de 5% (p<0,05) Avaliação microbiológica Os dados microbiológicos foram expressos em nível médio de cada espécie (contagem) em cada implante e posteriormente convertidos em proporção de microrganismos. Estes níveis foram computados por indivíduo e depois dentro de cada grupo avaliado. Diferenças nos níveis médios ou nas proporções de microrganismos entre os grupos foram avaliadas por meio do teste de Mann- Whitney. O teste Friedman foi utilizado para avaliar as diferenças entre as proporções microbianas durante os vários períodos de avaliação. A significância estatística foi estabelecida em 5% (p<0,05).

43 41 4. RESULTADOS Dos 22 indivíduos selecionados no início do estudo e aleatoriamente distribuídos entre os 2 grupos terapêuticos (n=11/grupo), apenas 17 indivíduos permaneceram ao final do estudo (período de 365 dias). Sendo assim a análise dos dados clínicos e microbiológicos foram avaliados para 22 indivíduos entre o período inicial e 90 dias, 20 indivíduos entre o período de 120 e 180 dias após início da terapia, sendo que 2 indivíduos do grupo controle forma excluídos devido a presença de supuração e aumento da profundidade de sondagem. No período 270 dias, mais 3 indivíduos foram excluídos da analise dos dados por também apresentarem supuração, sangramento a sondagem e aumento da profundidade de sondagem. A avaliação no período 365 dias foi realizada com 17 indivíduos sendo 8 indivíduos do grupo controle e 9 indivíduos do grupo teste. Os indivíduos excluídos receberam tratamento periimplantar baseado em Regeneração Tecidual Guiada e antibióticoterapia. 4.1 Efeitos das terapias sobre os parâmetros clínicos As médias dos parâmetros clínicos para os dentes remanescentes observadas no exame inicial, assim como os dados relativos às características clínicas dos implantes (restauração protética e tempo em função) avaliados neste estudo estão apresentadas nas Tabelas 3. Os resultados demonstraram que os grupos eram homogêneos em relação aos parâmetros clínicos, uma vez que não foi observada diferença significativa entre os grupos, no início do estudo. As tabelas 4 e 5 comparam o efeito clínico das terapias entre o período incial e 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias pós-terapia. Os parâmetros de IG, PS, NCi, SS foram reduzidos significativamente tanto para o grupo controle quanto para o grupo teste ao final de 365 dias pós-tratamento (p<0,05). Houve redução nos valores de PS e NCI em todos os grupos terapêuticos, embora a terapia associada à antibioticoterapia apresentasse maiores reduções (p<0,05). A PS e NCI do grupo controle no ínicio do estudo eram de 5,58+1,93mm e 5,93+1,39mm e passaram a ser 3,89+1,15mm e 4,43+1,42mm respectivamente aos 365 dias (p<0,05). Já para o grupo teste, as médias de PS e NCI no período inicial eram de 7,06+2,60mm e 7,26+2,60mm e foram reduzidas a 3,99+0,85mm e 4,23+1,00mm respectivamente aos 365 dias. De modo geral, os parâmetros clínicos do grupo controle apresentaram melhoras marcantes nos períodos iniciais, quando todos os índices

44 42 clínicos apresentaram melhoras. Aos 365 dias os parâmetros de PV, SM, PS, NCI, SS e SUP aumentaram em relação ao período de 270 dias, sem, no entanto retornar aos parâmetros clínicos no tempo inicial. Entretanto, no grupo teste, os parâmetros clínicos apresentaram uma redução constante até o período 365 dias.a porcentagem de SUP foi reduzido para ambos os grupos aos 90 dias, entretanto apenas o grupo que recebeu antibioticoterapia manteve todos os sítios periimplantares livres de supuração ao final do período experimental (p<0,05). 4.2 Efeitos das terapias sobre os parâmetros clínicos ao longo do período experimental Durante a análise dos dados observou-se que a profundidade de sondagem e o nível clínico de inserção diferiram estatisticamente durante os períodos experimentais para ambos os grupos (p<0,05) tanto no sítio teste (sítio de maior profundidade de sondagem) quanto nas médias obtidas nos 6 sítios ao redor de todo o implante. Houve redução estatisticamente significante no percentual de sítios com sangramento a sondagem e sangramento marginal para ambos os tratamentos (p<0,05). Já o parâmetro de placa visível apresentou reduções principalmente para o grupo teste, sem, no entanto, ser significativo (p>0,05). As figuras 7 e 8 apresentam as diferenças médias para a PS e NCI entre o ínicio do estudo e para cada período avaliado para ambos os grupos. Entretanto, estas diferenças foram maiores para o grupo teste em todos os tempos, exceto as diferenças médias para o NCI aos 270 e 365 dias nos quais tais médias foram semelhantes (p>0,05). Quando os grupos foram comparados entre si (Figuras 9 a 14), durante todos os períodos de avaliação, apenas os índices de sangramento marginal, sangramento a sondagem e supuração paresentaram diferenças significativas (p<0,05). No período de 60 dias pós-terapia, o grupo teste apresentou reduzidas porcentagens médias de SS e SUP (Figuras 13 e 14). Aos 90 dias pós-terapia, os índices de SM e SUP foram menores para o grupo teste (p<0,05) sendo que apenas os índices de SUP se mantiveram reduzidos durante todo o período, sendo que apenas aos 270 dias este índice não foi significativo (p>0,05).

45 43 Tabela 3: Média+desvio padrão dos parâmetros clínicos dos dentes remanescentes e das características das restaurações implanto-suportadas dos indivíduos avaliados no tempo incial. Grupos Terapêuticos Controle (n=11) Teste (n=11) Gênero (m:f) 3:8 4:7 ns Idade (anos) 59,67+9,87 61,55+6,98 ns Parâmetros Clínicos PS (mm) 2,28+0,76 2,37+0,35 ns NCI (mm) 3,25+1,01 2,98+1,34 ns % sítios PV 39,45+29,45 40,04+28,78 ns SM 9,98+7,89 10,02+6,98 ns SS 15,66+9,12 15,78+7,02 ns Sup 0 0 ns Tipo de Restauração Implanto-Suportada Prótese Fixa Overdentures Média do tempo em função dos implantes (meses) 64,65+12,45 66,12+10,64 ns 9 2 Teste de Mann-Whitney e Teste Exato de Fischer, ns=não significativo (p>0,05); m: masculino; f: feminino; PS: profundidade de sondagem; NCI: nível clínico de inserção; PV: placa visível; SM: sangramento marginal; SS: sangramento a sondagem; SUP: supuração. Os indivíduos portadores de overdentures eram totalmente edentulos. 9 2 p ns ns As médias de perda óssea vertical no ínício do estudo foram de 4,80+3,2mm e 5,12+2,89mm para os grupos controle e teste respectivamente (p>0,05). A figura 15 apresenta a perda óssea da crista periimplantar ápos 365 dias do início da terapia sendo semeante para ambos os grupos (p>0,05). A análise da subtração de imagens também ratifica os achados de perda óssea, apresentando perda de estrutura mineral ao redor dos implantes (Fig. 16). A

46 44 figura 17 apresenta a porcentagem de sítios que apresentaram perda, ganho ou se mantiveram constantes ao longo do perído experimental. Ambos os grupos apresentaram resultados estatiscamente semelhantes (p>0,05), embora os sítios proximais do grupo teste apresentassem maiores porcentagens de sítios com ganho de estrutura mineral.

47 45 Tabela 4: Médias+desvio padrão dos parâmetros clínicos do sítio teste (i) e dos 6 sítios ao redor dos implantes (m) para os indivíduos do grupo controle durante todo o período avaliado. Período (dias) Parâmetros Clínicos PVi (%) 60,00+51,60 50,00+52,70 40,00+51,64 50,00+52,70 40,00+51,60 30,00+48,88* 33,65+50,00 50,50+53,50 PVm (%) 61,66+43,78 51,66+47,43 40,00+51,63 41,66+50,46 43,33+41,72 35,00+39,63 42,59+44,18 61,84+41,69 IGi (%) 50,00+52,70 18,00+38,89 10,00+31,62 0* 0* 10,00+31,60 0* 0* IGm (%) 10,00+31,62 10,00+31,62 12,00+21,42 10,67+33,09 10,00+33,56 10,56+29,81 8,98+26,34 4,75+12,58 PSi (mm) 7,60+1,89 6,40+2,06 6,50+1,95* 5,40+2,11* 4,60+1,71* 4,30+1,82* 4,00+1,80* 3,87+1,64* PSm (mm) 5,58+1,36 5,48+1,05 5,15+1,18 4,33+1,17* 3,76+0,97* 3,46+0,93* 3,74+1,15* 3,89+1,15* NCIi (mm) 7,80+1,93 6,60+2,17 6,70+2,00 5,80+2,14* 5,00+1,82* 4,70+2,16* 4,44+2,06* 4,50+2,00* NCIm (mm) 5,93+1,39 5,81+1,24 5,48+1,31 4,66+1,26* 4,09+1,12* 3,81+1,10* 4,15+1,36* 4,43+1,42* SSi (%) 97,00+34,56 80,00+42,16 90,00+31,62 70,00+48,30 50,00+52,71* 40,00+51,63* 22,50+44,10* 50,00+53,50* SSm (%) 85,00+18,34 88,33+22,29 74,99+30,68 69,99+24,59 56,66+25,09 36,66+25,81* 36,94+35,18* 40,35+30,31* SUPi (%) 30,00+48,30 10,00+31,62 0* 0* 0* 0* 11,00+33,33 0* SUPm (%) 5,00+8,05 6,66+21,08 0* 4,98+7,07 5,08+4,60 0* 4,77+6,95 5,34+7,17 Legendas: PV (índice de Placa Visível); IG (índice gengival); PS (Profundidade de sondagem); NCI (Nível Clínico de Inserção); SS (Sangramento à Sondagem); SUP (Supuração); i (Dado relativo ao sítio teste, ou seja; o de maior profundidade de sondagem); m (Dado relativo a média do implante, ou seja, dos 6 sítios avaliados). Teste de Wilcoxon, *p<0,05.

48 46 Tabela 5: Médias+desvio padrão dos parâmetros clínicos do sítio teste (i) e dos 6 sítios ao redor dos implantes (m) para os indivíduos do grupo teste durante todo o período avaliado. Período (dias) Parâmetros Clínicos PVi (%) 40,00+51,64 30,00+48,30 40,00+51,64 40,00+51,60 50,00+53,50 29,00+48,88* 25,25+46,30 68,09+37,80 PVm (%) 56,66+43,88 33,33+47,14 40,00+51,63 45,00+49,72 50,00+53,45 21,43+31,49* 35,36+45,82 49,40+30,27 IGi (%) 50,00+52,70 20,00+42,16 0* 0* 0* 0* 0* 0* IGm (%) 10,40+41,32 7,56+6,45 1,66+5,27 0* 6,00+4,02 5,56+3,38 5,56+3,38 3,66+12,00 PSi (mm) 9,90+3,60 7,70+3,19 6,90+2,51* 6,10+2,37* 5,62+1,76* 5,28+2,13* 5,50+2,50* 5,14+1,86* PSm (mm) 7,06+2,60 6,20+2,12 5,63+1,84* 4,95+1,64* 4,08+1,13* 3,90+1,21* 4,09+1,20* 3,99+0,85* NCIi (mm) 9,90+3,60 7,70+3,19 7,10+2,80* 6,30+2,71* 5,87+2,16* 5,57+2,57* 6,00+3,02* 5,71+2,62* NCIm (mm) 7,26+2,60 6,40+2,18 5,89+1,95* 5,26+1,74* 4,41+1,29* 4,26+1,38* 4,44+1,27* 4,23+1,00* SSi (%) 90,00+31,62 80,00+42,15 90,00+31,62 70,00+42,24 50,00+52,71 43,00+53,35 50,45+53,50 29,00+48,89* SSm (%) 86,66+32,20 56,66+40,21 74,99+36,21 61,66+42,34 50,00+42,72 40,47+34,50 36,97+27,41* 35,64+26,27* SUPi (%) 50,00+52,70 0* 0* 0* 0* 0* 0* 0* SUPm (%) 8,80+8,05 0* 0* 0* 0* 0* 2,38+6,30 0* Legendas: PV (índice de Placa Visível); IG (índice gengival); PS (Profundidade de sondagem); NCI (Nível Clínico de Inserção); SS (Sangramento à Sondagem); SUP (Supuração); i (Dado relativo ao sítio teste, ou seja; o de maior profundidade de sondagem); m (Dado relativo a média do implante, ou seja, dos 6 sítios avaliados). Teste de Wilcoxon, *p<0,05.

49 47 Figura 7: Alterações nas medias de profundidade de sondagem (PS) dos sítios de maior profundidade de sondagem (PSi) entre o inicio do estudo e 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias após início da terapia, em ambos os grupos. Teste de Mann-Whitney * p<0,05.

50 48 Figura 8: Alterações nas medias de Nível Clínico de Inserção (NCI) dos sítios de maior profundidade de sondagem (NCIi) entre o inicio do estudo e 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias após início da terapia, em ambos os grupos. Teste de Mann-Whitney * p<0,05; ns: p>0,05.

51 Placa Visível (%) Controle Teste Períodos (dias) Figura 9: Comparação entre as medias+desvio padrão do percentual de placa visível entre os grupos controle e teste para cada período de avaliação. Teste de Mann-Whitney, p>0, Sangramento marginal (%) Cotrole Teste 2 0 Período (dias) Figura 10: Comparação entre as medias+desvio padrão do percentual de sangramento marginal entre os grupos controle e teste para cada período de avaliação. Teste de Mann-Whitney, * p<0,05

52 Profundidade de Sondagem (mm) Controle Teste 1 0 Periodo (dias) Figura 11: Comparação entre as medias+desvio padrão das profundidades de sondagem entre os grupos controle e teste para cada período de avaliação. Teste de Mann-Whitney, p>0, Nível Clínico de Inserção (mm) Controle Teste 1 0 Período (dias) Figura 12: Comparação entre as medias+desvio padrão do nível clínico de inserção entre os grupos controle e teste para cada período de avaliação. Teste de Mann- Whitney, p>0,05.

53 Sangramento à Sondagem (%) Controle Teste 10 0 Período (dias) Figura 13: Comparação entre as medias+desvio padrão do percentual de sangramento a sondagem entre os grupos controle e teste para cada período de avaliação. Teste de Mann-Whitney, *p<0, Supuração (%) 6 4 Controle Teste 2 0 Período (dias) Figura 14: Comparação entre as medias+desvio padrão do percentual de supuração entre os grupos controle e teste para cada período de avaliação. Teste de Mann- Whitney, *p<0,05, **p<0,01

54 52 a) b ) b) c) Figura 15: Método de subtração de imagem: a) radiografia inicial; b) radiografia final; c) imagem obtida através da subtração Figura 16 : Alterações na margem da crista óssea periimplantar entre o ínicio do estudo e 365 dias pós-terapia para cada face (mesia e distal) para ambos os grupos. Teste de Mann Whitney ns=p>0,05.

55 53 Figura 17: Alterações nas médias da variação dos níveis de cinza entre o ínicio do estudo e 365 dias pós-terapia para cada face (mesia e distal) para ambos os grupos. Teste de Mann Whitney ns=p>0,05. Figura 18: Porcentagem média dos sítios periimplantares que se mantiveram constantes (0), ganharam (+) ou perderam (-) estrutura mineral entre o ínicio do estudo e 365 dias pós-terapia para cada face (mesia e distal) para ambos os grupos. Teste de Mann Whitney ns=p>0,05.

56 Efeitos colaterais das terapias empregadas Efeitos colateriais decorrentes da utilização sistêmica da antibioticoterapia foram observados nos sujeitos do grupo teste e também em alguns indivíduos do grupo controle. 50% dos sujeitos do grupo controle relataram náuses, dor de estomago e gosto amargo. Apenas um indivíduo do grupo teste também relatou diarréia associado aos sintomas já citados. Apesar disso, não houve suspensão dos medicamentos para nenhum dos indivíduos do estudo. 4.4 Efeitos da terapia antibiótica nas contagens bacterianas Amostras de biofilme subgengival foram coletadas do sítio periimplantar de maior profundidade de sondagem no exame inicial (0), logo após o término da terapia inicial (14 dias) e aos 60, 90, 120, 150, 270 e 365 dias. Um total de 182 amostras foram avaliadas. A média da proporção das 39 espécies subgengivais avaliadas em todos os tempos do estudo, em ambos os grupos estão representadas nas Figuras 18 e 19. As espécies foram agrupadas segundo os complexos microbianos descritos por Socransky et al. (1998) e modificados por Socranky & Haffajee (2002). Os níveis médios de cada espécie foram computados para cada indivíduo e depois dentro do grupo, em cada tempo do estudo. As terapias utilizadas alteraram significativamente as contagens de DNA de vários microrganismos. Logo após o término da terapia inicial, 5 espécies bacterianas (E. nodatum, P. micra, T. forsythia, P. gingivalis e T. denticola) foram significativamente reduzidas no grupo controle e 9 no grupo teste, incluindo as 3 espécies do complexo vermelho (T. forsythia, P. gingivalis e T. denticola) e 6 do complexo laranja (E. nodatum, F. nuc. ss nucleatum, F. nuc. ss polymorphum, F. nuc. ss vicentii, F. periodonticum e P. Micra) (Figuras 18 e 19). S. sanguis sofreu aumento na proporção de DNA logo apos o termino da antibioticoterapia (p<0,05). De modo geral a terapia antibiótica levou a uma redução estatisticamente significativa nas contagens de DNA dos patógenos periodontais após o término da terapia inicial. Esse padrão de redução foi mantido aos 365 dias apos terapia apenas para 2 espécies do complexo vermelho (P. gingivalis e T. denticola). No grupo controle todos os microrganismos do complexo vermelho também apresentaram uma redução significativa logo após a terapia (14 dias). Embora os níveis desses

57 55 patógenos ainda estivessem reduzidos em relação ao início do estudo, a partir dos 90 dias após o início da terapia não foram observadas diferenças significativas para os níveis dos 3 microrganismos, níveis estes que se mantiveram ao final do estudo. Complementarmente, a proporção de DNA destas espécies apresentaram altas medias quando comparadas às demais espécies bacterianas avaliadas. Especialmente no grupo teste, as espécies de Actinomyces (complexo azul) assim como as dos complexos amarelo, verde e roxo aos quais agrupam a maior parte das espécies consideradas benéficas, também apresentaram alterações importantes durante o curso do estudo. Espécies de Actinomyces e espécies do complexo verde aumentaram a proporção de DNA, sem no entato apresentar significância estatística (p>0,05), logo após a terapia antibiótica. A figura 20 ilustra as diferenças entre as médias da proporção de DNA das espécies bacterianas nos 2 grupos terapêuticos. O perfil microbiológico dos dois grupos mostrou semelhança no início do estudo. Um total de 3 espécies bacterianas diferiram significativamente entre os grupos, logo após a terapia (14 dias): F. nucleatum ss nucleatum, F. nuc ss vicentii e P. intermedia. Aos 60, 90, 120, 150 e 180 dias, os níveis de pelo menos uma das espécies do complexo vermelho mostraram-se significativamente mais baixos no grupo teste do que no grupo controle. Porém a partir do tempo 270 dias, essa diferença deixou de ser significativa (p>0,05). 4.5 Efeitos das terapias nas proporções dos complexos microbianos A Figura 21 e a tabela 6 mostram as alterações ocorridas nas proporções dos complexos microbianos e na contagem total de bactérias em relação ao início do estudo (área dos gráficos setoriais) nas amostras de biofilme subgengival dos indivíduos de ambos os grupos terapêuticos, em todas as consultas de avaliações. As 39 espécies microbianas identificadas por meio das sondas de DNA foram agrupadas de acordo com os complexos microbianos (Socransky et al., 1998). As espécies pertencentes a cada complexo foram somadas e a proporção de cada complexo em cada consulta de avaliação foi determinada. Comparando os dois grupos terapêuticos, pode-se observar que a contagem total de bactérias (37x10 7 e 30x10 7 para controle e teste respectivamente) e as proporções dos diferentes complexos microbianos eram semelhantes no início do estudo (p>0.05). O complexo presente em maiores proporções foi o laranja,

58 56 representando 53,3% e 52,2% das espécies avaliadas para os grupos controle e teste, respectivamente. O complexo vermelho foi o segundo maior, composto por 22,1% e 28,6% das espécies para os grupos controle e teste respectivamente. As espécies bacterianas dos complexos azul, amarelo, roxo e verde, consideradas benéficas, perfaziam 27,6% e 18,6% para os grupos controle e teste, respectivamente (p>0,05). Logo após o final da terapia inicial (14 dias) embora a contagem total de bactérias diminuira significativamente para ambos os grupos (p<0,05), o grupo que utilizou antibioticoterapia mostrou uma redução mais acentuada na contagem total de microrganismos subgengivais (2,9x10 7 ) em comparação ao grupo controle (13x10 7 ), que pode ser observada pela maior redução em área dos gráficos setoriais. Aos 60 dias a contagem total de microrganismos aumentou e depois foi praticamente mantida no grupo controle até 365 dias. Já o grupo teste, apresentou nova redução na contagem total de microrganismos aos 90 dias pós-terapia e foi mantida até o final do experimento. As espécies consideradas benéficas apresentaram proporções semelhantes para ambos os grupos ao final do período experimental (53,3% e 50,4% para os grupos controle e teste, respectivamente).

59 Inicial 14 dias 60 dias 90 dias 120 dias 150 dias 180 dias 270 dias 365 dias 57 n=11 n=9 n=8 Figura 19. Gráfico de barras das proporções médias (±dp) de 39 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival no início do estudo (0), ao final da terapia inicial (14), 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias pós-terapia, nos indivíduos do grupo Controle. Teste Friedman: diferenças ao longo do período experimental (p<0,05). Teste Wilcoxon: diferenças entre o início do estudo (Inicial) e cada um dos demais tempos experimentais. *p<0,05 entre o período avaliado (14, 60, 90, 120, 150, 180, 270, 365 dias) e

60 58 Inicial 14 dias 60 dias 90 dias 120 dias 150 dias 180 dias 270 dias 365 dias n=11 n=9 Figura 20. Gráfico de barras das proporções médias (±dp) de 39 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival no início do estudo (0), ao final da terapia inicial (14), 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias pós-terapia, nos indivíduos do grupo Teste. Teste Friedman: diferenças ao longo do período experimental (p<0,05). Teste Wilcoxon: diferenças entre o início do estudo (Inicial) e cada um dos demais tempos experimentais. *p<0,05 entre o período avaliado (14, 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias) e o inicial (0).

61 59 Actinos Roxo Amarelo Verde Controle Teste Laranja Figura 21. Gráfico apresentando as médias das porcentagens de DNA de 39 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival no início do estudo (0), ao final da terapia inicial (14), 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias apos terapia, nos indivíduos dos grupos Controle e Teste. Teste Mann-Whitney: diferenças entre os grupos ao longo de cada período experimental, *p<0,05. Vermelho

62 Figura 21. Média das proporções dos complexos microbianos descritos por Socranky & Haffajee (2002) presentes nas amostras de placa subgengival dos indivíduos da cada grupo terapêutico, em todos os tempos do estudo. O grupo azul é constituído por 3 espécies de Actinomyces. A área dos gráficos foi ajustada para refletir a diferença da contagem total de bactérias entre os tempos 0, 14, 60, 90, 120, 150, 180, 270 e 365 dias pós-terapia. Complexos microbianos: Azul, roxo, verde, amarelo, laranja, vermelho, outros microrganismos 60