Pseudomonas aeruginosa

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1 Pseudomonas aeruginosa Prof. Adjunto Ary Fernandes Junior Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências - UNESP Distrito de Rubião Júnior s/n CEP / Botucatu/ SP /Brasil Tel [email protected]

2 Pseudomonas Gessard (1882) - Bacillus pyocyaneus Migula (1894) - Pseudomonas Dispostas em pares de células que lembram uma única célula Em 1992, esse gênero foi subdividido em vários novos gêneros (ex. Burkholderia e Stenotrophomonas)

3 CLASSIFICAÇÃO Família Pseudomonadaceae Pseudomonas (P. aeruginosa e outras), Stenotrophomonas (S. maltophilia), Burkholderia (B. cepacia, B. pseudomallei), Acinetobacter, Xanthomonas, Frateuria, Zoogloea, etc.

4 CLASSIFICAÇÃO Gênero Pseudomonas 223 espécies e 18 subespécies Pouco exigentes nutricionalmente Utiliza inúmeros compostos orgânicos como fonte de C Grande versatililidade metabólica Ampla distribuição na natureza

5 P. aeruginosa PAO1 6,3 milhões de pares de base; genes (open reading frames - ORFs); 8,4% dos genes são de regulação (Stover et al., 2000)

6 Pseudomonas clinicamente importantes

7 Taxonomia Similaridades RNAr e filogenia Grupo I: - Pseudomonas verdadeiras - Exemplos: P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida - espécies relacionadas Grupo II: - P. cepacia, P. mallei Burkholderia - P. solanacearum, P. picketti Ralstonia

8 Grupo III: - P. testosteroni Comamonas - P. acidovorans Comamonas Delftia - P. facilis Acidovorax - P. palleronii Hydrogenophaga - P. saccharophila Grupo IV: - P. diminuta, P. vesicularis Brevundimonas Grupo V: - P. maltophilia Xanthomonas Stenotrophomonas

9 Pseudomonas Grupo Fluorescente (Pigmento pioverdina = fluoresceína Difusível) P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida) Grupo Não Fluorescente P. stutizeri, P. mendocina)

10 Pseudomonas Bacilos Gram-negativos pertencentes ao grupo de não-fermentadores (Aeróbios) Ubíquos: Solo, matéria orgânica em decomposição, vegetação, água, ambiente hospitalar em reservatórios úmidos Exigências nutricionais míninas: Acetato e amônia como fontes de carbono e de nitrogênio (Biorremediação)

11 Pseudomonas É incomum a colonização persistente, como parte da microbiota normal humana Não resistem ao ressecamento e baixas temperaturas

12 Pseudomonas aeruginosa (± 70% das doenças por Pseudomonas) Bacilos Gram negativos, retos ou ligeiramente encurvados, isolados ou aos pares, curtos ( cocobacilos) (1,5 a 3,0 m de comprimento e 0,5 m de diâmetro)

13 Móveis (monotríqueas) (as vezes 2 ou 3 flagelos) Fimbrias - Importante para patogenicidade Não esporulada

14 Catalase positiva (Aeróbias estritas) (algumas crescem anaerobicamente na presença de Nitratoreceptor de elétrons, sendo o nitrato reduzido a nitrito). O teste é revelado através da adição de 3 gotas do reativo de Griess A com 3 gotas do reativo de Griss B no caldo nitrato Redução do nitrato a nitrito e nitrito a gás (após a adição de zinco em pó) Não fermentam carboidratos (BGNNF)(utilizam poucos carboidratos (glicose, ribose e gluconato),

15 Oxidam glicose pequena quantidade de ácidos, citocromo oxidase positiva (Diferenciar das enterobactérias)? Escherichia coli. (Ann C. Smith, University of Maryland, College Park, MD) Pseudomonas aeruginosa (Ann C. Smith, University of Maryland, College Park, MD) Oxidação do Citocromo C pelo O 2 Para fenilenodiamina é oxidado pela enzima adquirindo cor vermelha Pseudomonas (+), Enterobactérias (-)

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17 Não exigentes nutricionalmente (cepas multiplicam em água destilada e algumas podem utilizar mais de 30 compostos orgânicos como fonte de C e N) Em Ágar Sangue hemólise Produção de pigmentos difusíveis (hidrosolúveis - Piocianina - Azul, e Fluresceina (Pioverdina) (algumas produzem também Piorrubina-vermelho)

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19 PIGMENTO PIOCIANINA

20 Patógeno oportunista Introduzida em áreas desprovidas de defesas normais (mucosa ou pele rompidas por lesões teciduais diretas; cateteres intravenosos ou urinários, neutropenia quando na quimioterapia de tratamento de câncer) Cresce bem entre 37 o C e 42 o C Resistente a corantes, muitos anti-sépticos e drogas antimicrobianas (comum nos hospitais)

21 Quege GE, Bachion MM, Lino Junior RS, Lima ABM, Ferreira PS, Santos QR, Pimenta FC. Comparação da atividade de ácidos graxos essenciais e biomembrana na microbiota de feridas crônicas infectadas. Rev. Eletr. Enf. [Internet]. 2008;10(4):

22 Principais fatores de virulência de P. aeruginosa Fímbrias Cápsula Polissacaridica (Alginato) Endotoxina (LPS) Flagelo Outros produtos -Proteases: Elastases (LasA, LasB) Protease Alcalina -Hemolisinas: Fosfolipase C Ramnolipídio -Exotoxina A -Exoenzima S -Piocianina

23 Fatores de Virulência associados à P. aeruginosa Fator de virulência Fímbrias (Neuraminidase) Cápsulas de polissacarídios (Polimeros de ácido manurônico e gulurônico) = Alginato ou alginolato Efeito biológico Aderência ao epitélio respiratório (Melhora adesão das fímbrias) Aderência ao epitélio traqueal (receptor ácido siálico da MP), anti -fagocitose Endotoxina (LPS) (lipídeo A) Febre, oligúria, leucopenia ou leucocitose, coagulação intravascular disseminada (CID), anormalidades metabólicas, choque Exotoxina A (mais importante (Termo lábil e imunogênica) Impede alongamento da cadeia polipeptídica (Inibe síntese protéica) - danos a tecidos e inibe ação de fagócitos Exoenzima S (Termo estável e imunogênica) Ação semelhante da exotoxina A

24 Fator de virulência Elastase Efeito biológico Lesão do tecido vascular (quebra elastina e colágeno) - lesões hemorrágicas (=éctima gangrenoso), inibição da função dos neutrófilos (interfere na resposta inflamatória e imunológica) Protease alcalina (atividade em ph alcalino) Fosfolipase C Lesão tecidual, anticomplementar, inativação da IgG, inibição da função dos neutrófilos (interfere na resposta inflamatória e imunológica) Hemolisina termo lábil, ação necrosante (degradação de lipídeos e lecitina) (fosfatidil colina da membrana de eritrócitos) Leucocidina Bacteriocinas (Piocinas) Inibe ação de neutrófilos e linfócitos (capaz de matar o fagócito mesmo após a bactéria ter sido fagocitada) Matar bactérias (microbiota normal)

25 Fatores de virulência Fímbrias do tipo IV Receptor: Gangliosídeo G M1 quando desprovido de ácido siálico Sialidase (Neuraminidase)

26 Fatores de virulência Flagelo Tipo a pertence a um grupo heterogêneo PM 45 a 52 Kda Tipo b flagelina peso molecular de 53KDa Lipopolissacarídeo (LPS) Liberação de citocinas Obs. LPS adesão ao tecido pulmonar e às células da córnea Febre, oligúria, leucopenia ou leucocitose, coagulação intravascular disseminada (CID), anormalidades metabólicas, choque

27 Fatores de virulência Alginato Polímero de ácido α-l- gulurônico e β-dmanurônico) Antifagocítico e de Adesão (liga-se ao acido siálico do MP. Produção de alginato (gene alg) - mutação gene muc condições normais inibe a expressão do gen alg Produção de alginato em meio Luria-Bertani (LB) Agar sem NaCl e incubados a 37 C durante 12 h, e, a 25 C durante 24 h para melhorar a pigmentação. A. tipo selvagem (linhagem PAO1). B. linhagem mucóide isolada de paciente com fibrose cística (FRD1 (muca22).

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29 Fatores de virulência Alginato/biofilme Em P. aeruginosa, os flagelos são necessários para aproximar a bactéria da superfície, enquanto o LPS media as primeiras interações, havendo talvez a participação de proteínas da membrana externa. Quando formam monocamadas, fímbrias tipo IV mediam o movimento pulsante, necessário à formação de microcolônias. A produção destas fímbrias é regulada, em parte, por sinais nutricionais (Crc), havendo ainda a ativação de genes envolvidos na síntese de alginato e repressão de genes flagelares. A formação do biofilme maduro envolve a participação de homoserina lactonas sinalizadoras.

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31 Microscopia eletrônica de P. aeruginosa em superfícies de vidro. Fracamente aderentes formando uma monocamada (B e D) e moderada e fortemente aderente (A e C). (A e B; 7 e 14 h após a inoculação, respectivamente) e com o biofilme (C e D; 20 e 40 h, respectivamente, após a inoculação). Deligianni et al. BMC Microbiology :38

32 Fatores de virulência Elastase A (LasA) serina protease Proteases Elastase B (LasB) metaloprotease Zinco Protease Alcalina Elastina Parede vascular e tecido pulmonar Protease Alcalina lesões de pele e tecidos hemorragia e necrose LasA LasB Lesão do tecido vascular (quebra elastina e colágeno) - lesões hemorrágicas (=éctima gangrenoso), inibição da função dos neutrófilos (interfere na resposta inflamatória e imunológica)

33 Fatores de virulência Fosfolipase C (Plc) (hemolisina termo lábil) Ação necrosante (degradação de lipídeos e lecitina) (fosfatidil colina da membrana de eritrócitos) Ramnolipídeo (Rhl) Glicolipídeo (ramnose) Ramnolipídeo Ação sinérgica surfactante pulmonar Fosfolipase C

34 Fatores de virulência Exotoxina A (termo lábil e imunogênica) Inibe síntese protéica Danos a tecidos e inibe ação de fagócitos Exotoxina A EF-2 Fator 2 de elongação Exotoxinas (ExoS (90% das cepas), ExoT, ExoU, ExoY) (termo estável e imunogênica) Tóxicas para fagócitos (macrófagos), danos teciduais)

35 Pigmentos Piocianina Fatores de virulência Catalisa a produção de superóxido e peróxido de hidrogênio -Danos aos tecidos endoteliais -Impede o crescimento de outras bactérias -Elimina a atividade ciliar respiratória -Produz danos oxidativos nos tecidos oxigenados, como o pulmonar Pioverdina Sideróforo que se liga aos íons ferro e pode regular secreção de outros FV (Exotoxina A)

36 Fatores de virulência Leucocidina Inibe ação de neutrófilos e linfócitos (capaz de matar o fagócito mesmo após a bactéria ter sido fagocitada) Paradoxo da P. aeruginosa Muitos fatores virulência Por que patógeno oportunista??? Incapacidade de completar os primeiros passo da infecção Não é capaz de invadi-las Não conseguem manter a colonização persistente concomitantemente com a produção de fatores tóxicos que causariam danos ao indivíduo

37 PACIENTES DE RISCO -Queimaduras -Fibrose cística -Transplante de órgãos -Traqueostomia Patogenicidade -Cateteres permanentes -Neoplasia hematológica, diabetes, uso corticóides, uso de antibióticos, próteses intravascular, cateterização, etc.

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39 Manifestações clínicas causadas por P. aeruginosa Manifestação clínica Endocardite Sepsis Infeções pulmonares (Traqueobronquites, Broncopneumonia necrosante) Infecções de ouvido (otite) Condições predisponentes Viciados em drogas injetáveis, indivíduo com prótese de válvulas cardíacas, cirúrgias cardíacas (acometimento de valvas cardíacas) Cirurgias, cateterização, queimaduras graves, leucemia, diabetes mellitus Pacientes com fibrose cística, pacientes entubados (lesão do epitélio traqueal) Natação é um importante fator de risco Infecções de feridas por queimaduras Infecções das vias urinárias SNC - Meningites Infecções oculares (ceratite e endoftalmite) Normalmente através de sondas vesicais (infecção nosocomial) Via hematogênica, extensão de estruturas contíguas(ouvido, seios paranasais) ou por via direta (punção lombar, traumatismo) Associado a uso de lentes de contato, após cirurgias no olho

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41 Dermatite por Pseudomonas aeruginosa

42 Ceratite por Pseudomonas aeruginosa

43 Infecção por Pseudomonas aeruginosa

44 Ectima gangrenoso Vesículas eritematosas que se tornam hemorrágicas, necróticas e ulceradas

45 Diagnóstico cultura: isolamento e identificação Material Clínico (lesões cutâneas, pús, urina, fezes, sangue, líquido cefaloraquidiano, escarro, etc) Ágar sangue: hemolítica McConkey: lactose negativa Gram: BGN série bioquímica não fermentador - oxidase positiva - movimento positivo - crescimento a 42º C - pigmento

46 Diagnóstico Bacterioscopia Método de Gram

47 Diagnóstico ISOLAMENTO Ágar sangue: hemolítica McConkey: lactose negativa

48 Meio seletivo para P. aeruginosa para análise de água para consumo humano.

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50 Tratamento Resistência à inúmeras drogas Imipenem Aminoglicosídeos (gentamicina) Fluoroquinolonas (ciprofloxacina) Polimixinas (caso de multiresistentes)

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52 Gonçalves et al., 2009 Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 42 (4), 2009

53 Epidemiologia Taxa de portadores na comunidade: 0 a 6% Taxa de portadores no hospital: 50% Fontes de infecção diversificadas: flores, verduras, equipamentos respiratórios, água, medicamentos, endoscópios, anti-sépticos, prótese. Fontes humanas do microrganismo podem ser pacientes, profissionais de saúde ou visitantes. Práticas efetivas de controle de infecção devem ser concentradas na prevenção da contaminação de equipamentos estéreis, como equipamento de ventilação mecânica e máquinas para diálise.