UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA Período : 08 /2014 ( ) PARCIAL (x) FINAL RELATÓRIO TÉCNICO CIENTÍFICO IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO: VALIDAÇÃO COMPORTAMENTAL DO MODELO DE MEDO E ESQUIVA NATURAL EM DANIO RERIO Nome do Orientador: Bruno Rodrigues dos Santos Titulação do Orientador: Doutor Faculdade: Faculdade de Educação e Ciências Sociais FAECS Unidade: Universidade Federal do Pará Campus de Abaetetuba/ Baixo Tocantins Título do Plano de Trabalho: Validação Comportamental do Modelo de Medo e Esquiva Natural em Danio rerio Nome do Bolsista: Lana Thais Rodrigues Freitas Tipo de bolsa: (X) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/INTERIOR ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PARD ( ) PARD - renovação ( ) Bolsistas PIBIC do edital CNPq 001/2007 O objetivo deste trabalho é realizar a validação farmacológica do teste de esquiva inibitória e fuga com ambiente aversivo incondicionado em Daniorerio (N = 96). Para tal

2 foi mimetizado o teste de Labirinto em T Elevado utilizado em ratos, o qual consiste em dois braços perpendiculares (formando um T) suspensos a 50 cm do chão, os quais possuem dimensões necessárias para um roedor caminhar. Um dos braços possui uma parede (braço fechado) e o outro não possui parede (braço aberto). O animal é exposto ao teste de fuga. Neste teste ele é colocado no braço aberto e mede-se a latência do tempo de transição entre o braço aberto e o braço fechado em uma única tentativa. Depois ele é exposto ao teste de ansiendade em que ele é colocado no braço fechado e mede-se a latência do tempo de transição desses dois braçoe me três tentatuvas. O Danio rerio apresenta o comportamento natural de evitação de lugares abertos e claros. Portanto foi realizado um teste de fuga, colocando o animal no compartmento claro de um aparato e foi medido o tempo de transição desse lado claro para o lado escuro em uma tentativa. E o teste de ansiedade consistiu na colocada do animal no lado escuro do aquário e a medida da latência de tempo de transição desse lado escuro para o lado clero em cinco tentativas. Além da validação do teste comportamental, uma validação farmacológica também foi realzida. Foram administrados intraperitonialmente dois recaptadores seletivos de serotonina: fluozetina (10 e 20 mg/kg) e sertralina (10 e 20 mg/kg); um antidepressivo tricíclico: imipramina (08 e 16 mg/kg); e um benzodiazepínico: clonazepam (0.05 e 0.1 mg/kg). Justificativa Peixes são modelos, que apresentam padrões neurais, bioquímicos e comportamentais funcionalmente análogos aos mamíferos, incluindo humanos (Gouveia Jr., Maximino, e Brito, 2006). O telencéfalo do peixe é desenvolvido através da porção rostral do tubo neural embrionário, o qual forma-se com dois hemisférios. Além de telencéfalo, o Sistema Nervoso Central (SNC) também possui mesencéfalo e diencéfalo tegmentar, cerebelo e corpo e válvula cerebelar. Pesquisas envolvendo bases olfatórias, visuais e paladar são realizadas devido ao alto grau de especialização destas funções no sistema nervoso (Kotrschal, Van Staaden e Huber, 1998). Quando se trata do mecanismo de ansiedade em peixes, estudos indicam que existem estruturas telencefálicas homólogas entre mamíferos e peixes teleósteos. Existem indícios que o pallium medial e o pallium lateral, estruturas telencefálicas dos teleósteos, podem ser homólogas a amígdala e hipocampo dos mamíferos, respectivamente (Vargas

3 et al., 2006; Gomez et al., 2006; Portavella e Vargas, 2005; Portavella, Torres e Salas, 2004; Portavella et al., 2003; Portavella et al., 2002).O peixe Paulistinha, Zebrafish ou, nome científico, Danio rerio, é um dos peixes mais utilizados devido a apresentação de padrões de comportamento estáveis, de ter sua neuroanatomia bem descrita (Flinn, 2008) e sua ecologia conhecida (Subbiah e Kar, 2013; Bilotta, 2001; Houart, 2001). Desde 1970, este animal vem se desenvolvendo enquanto um grande modelo de processos comportamentais e fisiológicos, se estabelecendo e apresentando grande relevância nos dias atuais (Meunier, 2012). Contudo, para estudiosos do comportamento, o que torna o Danio rerio um excelente modelo animal de ansiedade é a sua consistência de respostas e similariadade dos roedores, os quais preserva a validade do modelo, bem como a validade de constructo e farmacológica (Subbiah e Kar, 2013; Stewart et al., 2012). Modelos em Zebrafish com esquiva inibitória, que é aquela em que o animal inibe um comportamento para evitar um estímulo aversivo (Nahas, 1999; Tomaz, Silva, Batistão e Castreghini, 1987), utilizando aversivo incondicionado ainda não foram explorados. Dados ainda submetidos para publicação desenvolvidos no Laboratório de Neurociências e Comportamento da UFPA indicam a eficácia do ambiente claro como aversivo incondicionado no teste de esquiva passiva, bem como os efeitos ansiogênico da fluoxetina e ansiolíticos do clonazepam, mas testes vinculados ao comportamento de fuga ainda não foram realizados. Não foram encontrados modelos desenvolvidos para o estudo dos mecanismos de medo em Danio rerio. Este trabalho tem como finalidade desenvolver um teste em Zebrafish que mimetize os resultados apresentados pelo Labirinto em T-Elevado, o qual foi importante para o estudo dos mecanismos de defesa, pois reproduziu uma situação experimental em que ambos podem ser separados e estudados. Desta forma, o objetivo deste trabalho é desenvolver um teste de esquiva inibitória, um de fuga e verificar o efeito de drogas serotoninérgicas e GABAérgicas sobre estes dois testes. Objetivo Geral: Verificar o efeito da fluoxetina, sertralina, clonazepam e imipramina no teste de esquiva inibitória e fuga utilizando o ambiente claro como aversivo incondicionado. Objetivos Específicos: - Validar o teste de esquiva inibitória com aversivo incondicionado como modelo de ansiedade;

4 - Validar o teste de fuga com aversivo incondicionado como modelo de medo; - Verificar o efeito de drogas serotoninérgicas nos testes de esquiva inibitória e fuga com ambiente incondicionado; - Verificar o efeito de droga GABAérgica nos testes de esquiva inibitória e fuga com ambiente incondicionado. Materiais e Métodos: Sujeitos Foram utilizados Daniorerio (N= 81), sexo indeterminado, com peso médio de 0,33 g, mantidos em aquários coletivos (N= 60). Todos os animais foram comprados em Pet Shops Locais (Belém-PA) e sofreram aclimatação por 15 dias antes do início dos experimentos com iluminação de 14/10h (inicio 6:00 h), Ph 7,0±1 e temperatura média de 24º±2 ºC. Aparato No Teste de Esquiva Inibitória e Fuga foi utilizado um aquário branco e preto (45x10x15 cm) dividido por uma porta guilhotina, a qual separava o aparato em dois compartimentos, sendo o menor da cor preta (10 cm) e o maior da cor branca (35 cm). Neste experimento também era realizado com uma coluna de água de 7 cm. Tratamento Farmacológico Todas as drogas serão injetadas intraperitonialmente, no volume de 10 µl com o auxilio de uma seringa Hamilton nas proporções: salina (10 µl de solução), fluoxetina (10 e 20 mg/kg), clonazepam (0.05 e 0.1 mg/kg), imipramina (08 e 16 mg/kg) e sertralina (10 e 20 mg/kg). Procedimento Os grupos foram submetidos aos seguintes testes: Teste de Esquiva Inibitória: Para este estudo foram utilizados 81 animais, segundo dose e tipo da droga descritos acima. Os sujeitos de cada grupo (N=08) foram expostos ao aparato. Após 300s de habituação a porta guilhotina era aberta. Foi medido o tempo de permanência no compartimento menor em segundos, que corresponde a latência de tempo entre abertura da guilhotina e a entrada do sujeito no compartimento maior. O teste é composto em 5 tentativas, sendo que cada uma terminava quando

5 o sujeito entrava no compartimento maior ou permanecia 300 s ininterruptos no compartimento menor. Em ambas as opções, o animal era retirado do aquário com uma rede própria e reinserido no compartimento menor já isolado pela guilhotina. Entendeu-se que a entrada ao compartimento maior ocorria quando todo o corpo do animal estava neste compartimento. O teste encerrava-se ao final das 5 tentativas. Teste de Fuga: Este teste foi realizado com cada um dos animais, antes do teste de esquiva inibitória. O mesmo aparato era utilizado. O animal era colocado no compartimento escuro do aquário e media-se o tempo de entrada no compartimento branco. Apenas uma tentativa era realizada. Resultados Teste de Fuga CTRL CLON 0,13 Latência de Fuga (s) CLON 0,27 FLUX 10 FLUX 20 IMIP 08 IMIP 16 SERT 10 SERT 20 A análise estatística aponta para a uma diferença estatística entre a latência de fuga do Grupo Sertralina 20 mg/kg quando comparado com os grupos controle e Clonazepam 0,27 mg/kg [H=21,75, p < 0,01]. Indicando efeito panicolítico baseado no aumento da serotonina na fenda sináptica. As outras drogas não apresentaram efeito, embora todas indicam um aumento no teste de fuga. Indicando que o efeito panicolítico do GABA (clonazepam) e da serotonina (fluoxetina, sertralina e imipramina).

6 Teste de Esquiva Ao contrário da literatura, o controle não apresentou aprendizagem de esquiva ao longo das 5 tentativas [H=8,31, p =0,08] 300,00 Controle vs Clonazepam 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 T1 T2 T3 T4 T5 CTRL CL 0,13 CL 0,27 No teste de esquiva inibitória o grupo Clonazepam 0,13 mg/kg não apresentou aprendizagem [F=1,50, p =0,22], enquanto o grupo Clonazepam 0,27 mg/kg a aprendizagem da esquiva aconteceu [H=13,44, p < 0,01]. Quando comparados com o controle, o Clonazepam 0,13 mg/kg apresenta efeito ansiolítico em T1, T3 e T5 [F=2,50, p =0,01] e o grupo Clonazepam 0,27 mg/kg apresenta efeito ansiolítico em T2 [F=2,40, p =0,02] 300,00 Controle vs Fluoxetina 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 T1 T2 T3 T4 T5 CTRL FL 10 FL 20

7 Já os grupos Fluoxetina 10 mg/kg [H=2,24, p=0,70] e Fluoxetina 20 mg/kg [F=2,67, p<0,01], apenas o segundo apresentou aprendizagem de esquiva. Quando comparados com o controle, apenas o grupo Floxetina 20 mg/kg apresenta diminuição no tempo de latência (efeito ansiolítico) em T1 e T2 [F=2,67, p<0,01]. O grupo Fluoxetina 10 mg/kg não apresentou diferenças com relação ao grupo controle [F=1,30, p=0,25]. 300,00 Controle vs Setralina 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 T1 T2 T3 T4 T5 CTRL ST 10 ST 20 Ao contrário dos grupos Fluoxetina, para a Sertralina o grupo que apresenta aprendizagem é o que foi exposto a 10 mg/kg [H=9,93, p=0,04] e não o 20 mg/kg [H=8,76, p=0,07]. Mas quando comparado ao grupo controle o grupo Sertralina 10 mg/kg não apresenta diferença [F=1,82, p=0,08], enquanto que o grupo Sertralina 20 mg/kg apresenta efeito ansiolítico em T3 e T5 [F=4,10, p<0,01].

8 300,00 Controle vs Imipramina 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 T1 T2 T3 T4 T5 CTRL Im 8 IM 16 Com relação a aprendizagem da esquiva inibitória, o grupo Imipramina 8 mg/kg [H=2,11, p=2,71] não apresentou aprendizagem enquanto o grupo Imipramina 16 mg/kg [H=12,95, p=0,01] apresentou. Quando comparado ao grupo controle o grupo Imipramina 8 mg/kg [F=1,26, p=0,27] não apresenta diferença, enquanto que o grupo Imipramina 16 mg/kg apresenta efeito ansiogênico apenas em T4 [F=2,74, p<0,01]. Discussão Como descrito na literatura, o clonazepam que possui efeito GABAérgico e a fluoxetina e sertralina que possuem efeito serotoninérgico apresentam efeitos ansiolíticos. Já a imipramina que age em dopamina e serotonina apresenta efeito ansiogêncico. O que indica que talvez a dopamina ainda possua um efeito sobre os mecanismos de ansiedade que ainda está pouco descrito. Com relação a fuga, todas as drogas apresentaram efeitos panicolíticos, indicando o papel duplo da setoronina, principalmente de sua diminuição, no mecanismo de pânico. O interessante é que dessa vez o grupo controle não apresentou aprendizagem. Por ser este o primeiro grupo feito, os pesquisadores ainda estavam em fase de treino e isso pode ter prejudicado seu desempenho no teste de ansiedade. Este grupo deverá ser refeito para posterior análise. Conclusão Conclui-se portanto que este pode os testes realizados podem ser modelo de ansiedade e pânico em Danio rerio, mimetizando o teste de Labirinto em T Elevado e

9 ratos. Sofrendo os mesmos efeitos de drogas Gabérgicas e Serotoninérgicas indicadas em seus resultados. Referências: Bilotta, J., Saszik, S. (2001). The zebrafish as a model visual system. Int. J. Devl Neuroscience, 19, Blanchard, R. J., Yudko, E. B., Rodgers, R. J., & Blanchard, D. C. (1993). Defense system psychopharmacology: an ethological approach to the pharmacology of fear and anxiety. Behavioral Brain Research, 58(1-2), Blank, M., Guerim L.D., Cordeiro, R.F., Viann, M.R.M. (2009). A one-trial inhibitory avoidance task to zebrafish: Rapid acquisition of an NMDA-dependent long-term memory. Neurobiology of Learning and Memory, 92(4), Bueno, C. H., Zangrossi Jr, H., & Viana, M. d. B. (2007). GABA/benzodiazepine receptors in the ventromedial hypothalamic nucleus regulate both anxiety and panicrelated defensive responses in the elevated T-maze. Brain Research Bulletin, 74, Echeverry, M. B., Hasenöhrl, R. U., Huston, J. P., & Tomaz, C. (2001). Comparison of neurokinin SP with diazepam in effects on memory and fear parameters in the elevated T-maze free exploration paradigm. Peptides, 22, Flinn, L., Bretaud, S., Lo, C., Ingham, P., Bandmann, O. (2008). Zebrafish as a new animal model for movement disorders. J. Neurochem., 106, Galhardo, L., & Oliveira, R. (2005). Dos peixes e dos homens: o estudo do bem-estar animal aplicado à piscicultura. Paper presented at the Anais do ZOOTEC, Campo Grande. Gebauer, D. L., Pagnussat, N., Piato, Â. L., Schaefer, I. C., Bonan, C. D., & Lara, D. R. (2011). Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. Retirado de doi: /j.pbb Gomes, K. S., Carvalho-Netto, E. F. d., Monte, K. C. D. S., Acco, B., Nogueira, P. J. d. C., & Nunes-de-Souza, R. L. (2009). Contrasting effects of acute and chronic treatment with imipramine and fluoxetine on inhibitory avoidance and escape responses in mice exposed to the elevated T-maze. Brain Research Bulletin, 78, Gómez, Y., Vargas, J.P., Portavella, M., López, J.C (2006). Spatial leraning and goldfish telecephalon NMDS recepetos. Beurobiology of Learning and Memory, 85, Gouveia Jr., A., Maximino, C., & Brito, T. M. (2006). Comportamento de Peixes: vantagens e utilidades na neurociências. Bauru: [s.n.]. Graeff, F. G. (2007). Ansiedade experimental humana. Rev. Psiq. Clín, 34(5),

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