AVALIAÇÃO DO PAPEL DOS RECEPTORES 5-HT 1A DO HIPOCAMPO VENTRAL DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS -UFSCar CENTRO DE EDUCAÇÃO E CIÊNCIAS HUMANAS -CECH DEPARTAMENTO DE PSICOLOGIA - DPsi LABORATÓRIO DE PSICOLOGIA DA APRENDIZAGEM - LPA AVALIAÇÃO DO PAPEL DOS RECEPTORES 5-HT 1A DO HIPOCAMPO VENTRAL DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO Por Gabriel Fachini (216020) Profª. Orientadora: Azair Liane Matos do Canto de Souza Monografia apresentada como requisito obrigatório para adquirir o Bacharelado em Psicologia São Carlos Dezembro, 2004

2 Agradecimentos Este trabalho, realizado por um longo período, não foi somente um simples trabalho de conclusão de curso, mas também o maior contato com uma das diversas áreas da Psicologia. Desta forma, gostaria de oferecer todo meu agradecimento aos meus pais, aos meus amigos que sempre estiveram presentes, a minha professora orientadora Azair, aos técnicos do LPA e a todas àqueles que me apoiaram e acreditaram que um bom trabalho seria realizado.

3 SUMÁRIO Abreviações Resumo Abstract Introdução Histórico da Ansiedade Ansiedade segundo CID-10 e DSM-IV Fundamentos Neurofisiológicos da Ansiedade Sistema Límbico e Ansiedade As Drogas: Agonistas e Antagonistas Modelo Animal de Ansiedade Objetivo Material e Método Sujeitos Cirurgia Equipamento Procedimento Drogas Análise Comportamental Histologia Estatística Resultados Discussão Conclusão Anexo Bibliografia

4 ABREVIATURAS LCE Labirinto em Cruz Elevado HV Hipocampo Ventral MCP Matéria Cinzenta Periaquedutal 5-HT Serotonina 5-HT 1A Receptores específicos 1A de Serotonina S Estímulo SNC Sistema Nervoso Central n número de sujeitos por grupo EPM Erro padrão da média BA Braço aberto T.Ent. Total de entrada nos braços do labirinto Ent. Ab. Entrada nos braços abertos Ent. Fec. Entrada nos braços fechados T.Ab. (s) Tempo gasto nos braços abertos em segundos T. Fec (s) - Tempo gasto nos braços fechados em segundos T. Cent (s) - Tempo gasto no centro do labirinto em segundos % Ent. Ab. Porcentagem de entrada nos braços abertos % Ent. Fec. Porcentagem de entrada nos braços fechados % T.Ab. (s) Porcentagem de tempo gasto nos braços abertos em segundos % T. Fec (s) - Porcentagem de tempo gasto nos braços fechados em segundos % T. Cent (s) - Porcentagem de tempo gasto no centro do labirinto em segundos Veic. Grupo veículo

5 RESUMO Nas pesquisas sobre ansiedade os modelos animais são freqüentemente empregados como ferramentas para a seleção de potenciais agentes terapêuticos bem como para simulações sobre a neurobiologia das emoções. Neste sentido, um dos modelos animais mais utilizado nas últimas décadas é o labirinto em cruz elevado que já foi validado tanto em ratos como em camundongos. O teste é baseado na aversão natural de roedores a espaços abertos e é bidirecionalmente sensível a manipulações projetadas para avaliar ansiedade. As pesquisas envolvendo os efeitos da administração central de ligantes de receptores 5-HT 1A na modulação da ansiedade no labirinto em cruz elevado têm enfocado o uso do agonista (±) 8-OH-DPAT. A exposição ao LCE (situação aversiva) pode resultar em ativação das vias serotonérgicas com projeções para estruturas pertencentes ao sistema de defesa, tais como, amígdala, septo, hipotálamo, matéria cinzenta periaquedutal (MCP) e hipocampo. Diante dos relatos da literatura este projeto tem por objetivo identificar os mecanismos centrais que medeiam a resposta de ansiedade, observada em animais ingênuos ao labirinto. A abordagem adotada acarretou em injeções intracerebrais do agonista de receptores 5-HT 1A.

6 ABSTRACT Objective: We have recently demonstrated that microinjections of WAY (a selective 5-HT1A receptor antagonist) into ventral hippocampus (VH) produce anxiolytic effects in the elevated plus-maze (EPM) in mice (Brain Res., v.927, p.87-96, 2002). This study investigated the effects of intra-vh injections of 8-OH-DPAT, a 5-HT1A receptor agonist, on anxiety in the EPM in mice. Materials and Methods: 4-5 days after cannula implantation in the VH, mice (n=8-10/group) received intra-vh injection of vehicle (0.1 µl) or 8-OH-DPAT (5.6 or 10 nmol/0.1 µl) and were exposed in the EPM for 5 min. The following behaviors were analyzed: number of closed arm entries (CE), a measure of locomotor activity, and percentage of open arm entries (%OE) and percentage of open arm time (%OT) (indices of anxiety). Data were analyzed using one-way ANOVA followed by Duncan test when appropriate. Results showed that both doses of 8-OH-DPAT decreased %OE (vehicle: 46.8±5.7; 8-OH-DPAT 5.6 nmol: 24.1±5.8; 10 nmol: 33.9±4.5) and %OT (vehicle: 31.50±6.3; 8-OH-DPAT 5.6 nmol: 12.2±3.0; 10 nmol: 12.8±3.0) but did not alter number of CE (vehicle: 7.5±1.0; 8-OH-DPAT 5.6 nmol: 7.1±1.3; 10 nmol: 8.8±0.9). Conclusion: The present study demonstrated that intra-vh infusion of 8-OH-DPAT produces a selective anxiogenic effect in mice. These results corroborate a previous study that demonstrated that the blockade of 5-HT1A receptors in the VH attenuates anxiety in the EPM (Brain Res., v.927, p.87-96, 2002).

7 A ansiedade é uma emoção. Porém, sua fonte quase nunca é definida, sendo alguma fonte de perigo incerto ou desconhecido. Dificilmente o estado de ansiedade pode ser descrito, mas geralmente é dito como sensação de estrangulamento ou constrição. É um quadro desagradável e constitui uma motivação negativa, desejando sempre se livrar desse estado. Cognitivamente, a ansiedade manifesta-se por pensamentos de que algo ruim irá acontecer, influenciando na capacidade de concentração, estados de vigilância. Além de toda uma mudança no quadro psicológico, a ansiedade e também o medo produzem mudanças fisiológicas, ativando o sistema simpático, elevando o ritmo cardíaco e respiratório, há também tremores, sudorese e em alguns casos aumento da motilidade intestinal. Esses dois quadros, medo e ansiedade, possuem valor adaptativo, visto que leva o indivíduo a proteger sua integridade. Quando a ansiedade ultrapassa os níveis normais, o desempenho não melhora ou é prejudicado. Nestes casos, a ansiedade constitui quadros patológicos, sendo considerados quadros psiquiátricos, necessitando de tratamento psicológico e farmacológico (para revisão, veja Graeff e Guimarães, 2001). Histórico da Ansiedade Percorrendo os vastos campos da produção científica, partindo de filósofos até os fisiologistas mais modernos, o conceito de ansiedade é extremamente amplo e carregado daquilo que na cultura de uma época é relevante como ansiedade e, muitas vezes incongruentes entre si elas possuem como substrato comum essas tendências históricoculturais.

8 Para tal argumento, uma consulta rápida a textos básicos sobre a ansiedade revela tal diversidade entre as definições existentes. Freud (1920) escreveu: Como nós sabemos, o desenvolvimento da ansiedade é a reação do ego ao perigo e o sinal preparatório para a fuga; não é um grande salto imaginar que também na ansiedade neurótica o ego está tentando uma fuga das exigências da sua libido e está tratando esse perigo interno como se ele fosse externo. Logo em 1926, no apêndice sobre a angústia, Freud Descreve que na situação de perigo ocorre o sinal de angústia. Isso significa: eu espero que se verifique uma situação de impotência; ou então: a situação presente me recorda um evento traumático vivido anteriormente... a ansiedade é, pois, de um lado, a expectativa do trauma e, de outro, a repetição atenuado dele. Segundo Pessotti (1978), ao examinar a evolução do conceito de ansiedade (ou angústia), segundo Freud, nota-se que o sentimento de importância evolui gradativamente na elaboração teórica, passando de elemento modulador da sensação de medo na versão de 1920, a uma condição que assegura a aversividade da percepção de ativação fisiológica, e elemento de conexão entre a sensação penosa presente e o trauma anterior, a condição essencial para a existência do trauma, e daí a significar a própria essência da ansiedade. Ao continuar a análise da obra de Freud, no apêndice de 1926 ele propõe que a ansiedade é fundamentalmente a sensação penosa frente à ameaça de incapacidade ou, ou seja, a percepção da própria impotência ante a proximidade de uma situação análoga a alguma outra em que tal percepção ocorreu, no passado. Uma outra definição, agora apresentada por behavioristas, explanando que o principal resultado... foi o condicionamento de um estado de ansiedade ao som, cujo indicador primário era a redução na força do comportamento de pressão à barra motivada pela fome (Estes e Skinner, 1941).

9 Esta definição é reformulada e passa a ser mais precisa, onde o paradigma experimental para estabelecer a ansiedade é S 1 S 2, onde S 1 é um estímulo inicialmente neutro e S 2 é um estímulo aversivo (noxious) que não pode ser terminado ou evitado pelo organismo e indica a passagem de um certo tempo. Nota-se que o paradigma da ansiedade leva à aquisição, pelo estímulo inicialmente neutro, de propriedades aversivas secundárias, por causa de seu emparelhamento com S 2 (Schoenfeld, 1950). Segundo Estes e Skinner (1941), a ansiedade tem pelo menos duas características que a definem: primeiramente é um estado emocional, semelhante o estímulo perturbador é antecipado no futuro. A contradição aparente, presente nos termos acima, em relação aos termos subjetivos são definidos como: o estímulo perturbador é o estímulo presente (S 1 ) e que foi associado a algum outro no passado (S 2 ). O estado emocional é entendido, de um lado, como reação de certos comportamentos, medida em freqüência destes por unidade de tempo. Ainda de acordo com os mesmo autores, exclui-se, assim, qualquer experiência subjetiva de medo e qualquer experiência subjetiva de medo e qualquer processo de percepção de alterações fisiológicas. O que resulta então é uma ansiedade média, sinônimo de alterações médias de um comportamento instrumental, como efeito de um certo arranjo experimental. É complicado aceitar tal definição de ansiedade, pois o método impõe a definição. Partindo do cerne da psicologia e invadindo o campo filosófico, é possível encontrar já na obra de filósofos estóicos o tratamento relativamente sistemático da ansiedade humana (sem o uso do termo ansiedade, obviamente), seja no campo da explicação da natureza humana, seja como uma questão eminentemente ética, envolvendo os problemas da responsabilidade moral e da culpa.

10 A afirmação do próprio ser, como ato de coragem entre o destino e a morte, é uma linha mestra da filosofia de Sêneca (apud Mondolfo, 1967), para quem querer viver é saber morrer, já que o medo da morte é indissociável do medo da vida. Sêneca antecipa, de certo modo, um conceito freudiano, ao apontar uma libido moriendi daqueles que sentem a vida de como supérflua e sem significado. A incapacidade de afirmar a vida não implica, segundo Sêneca, a capacidade de afirmar a morte. O suicídio estoicista é recomendado não aos que a vida vencer, mas aos que a dominaram e são, por isso, capazes de viver e de morrer. O medo da morte (ou a consciência da própria finitude, que ocupará a seu tempo Pascal e Kierkegaard), elemento básico da ansiedade, só se vence pelo controle exercido pela razão humana. Deste modo, tanto a ansiedade existencial (medo da morte e do destino) como a ansiedade episódica (apreensão ou culpa) podem ser superadas, segundo a filosofia estoicista, pela afirmação da própria natureza racional, ora entendida como resignação a ser parte de um logos transcendente, ora como aceitação das limitações do próprio domínio sobre si mesmo e sobre as coisas. Em qualquer caso, a coragem estóica é um ato ético de resignação a uma realidade cósmica que dá significação e essência ao humano, mas não pertence a cada homem. O Conceito de Angústia, de Soren Kierkegaard (1844), é o primeiro texto a tratar especificamente, já mesmo no título, o problema da ansiedade. Embora a preocupação última do autor nessa obra seja religiosa ou teológica, seus escritos cuja significação contemporânea é crescente no campo da psicologia da ansiedade. Para Kierkegaard a ansiedade patológica deriva do poupar-se dos riscos inerentes à ansiedade normal; para Nietzsche, o patológico e o imoral praticamente se identificam e

11 correspondem às distorções da vontade de potência, seja por supressão racional dos impulsos, seja por realização irracional, a crítica desses últimos. Ansiedade segundo CID-10 e DSM-IV A ansiedade, de acordo com a CID-10 (1993), é um grupo de transtornos nos quais uma ansiedade é desencadeada exclusiva ou essencialmente por situações nitidamente determinadas que não apresentam atualmente nenhum perigo real. Estas situações são, por esse motivo, evitadas ou suportadas com temor. As preocupações do sujeito podem estar centradas sobre sintomas individuais tais como palpitações ou uma impressão de desmaio, e freqüentemente se associam com medo de morrer, perda do autocontrole ou de ficar louco. A simples evocação de uma situação fóbica desencadeia em geral ansiedade antecipatória. A ansiedade fóbica freqüentemente se associa a uma depressão. Para determinar se convém fazer dois diagnósticos (ansiedade fóbica e episódio depressivo) ou um só (ansiedade fóbica ou episódio depressivo), é preciso levar em conta a ordem de ocorrência dos transtornos e as medidas terapêuticas que são consideradas no momento do exame. Segundo o DSM IV (1994), a ansiedade pode configurar vários quadros e subdivisões menores, mas não menos complexas. Uma vez que Ataques de Pânico e Agorafobia ocorrem no contexto de diversos outros transtornos, os conjuntos de critérios para Ataque de Pânico e para Agorafobia são listados separadamente no início desta seção. Um Ataque de Pânico é representado por um período distinto no qual há o início súbito de intensa apreensão, temor ou terror, freqüentemente associados com sentimentos de catástrofe iminente. Durante esses ataques, estão presentes sintomas tais como falta de ar,

12 palpitações, dor ou desconforto torácico, sensação de sufocamento e medo de "ficar louco" ou de perder o controle. A Agorafobia é a ansiedade ou esquiva a locais ou situações das quais poderia ser difícil (ou embaraçoso) escapar ou nas quais o auxílio poderia não estar disponível, no caso de ter um Ataque de Pânico ou sintomas tipo pânico. O Transtorno de Pânico Sem Agorafobia é caracterizado por Ataques de Pânico inesperados e recorrentes acerca dos quais o indivíduo se sente persistentemente preocupado. O Transtorno de Pânico com Agorafobia caracteriza-se por Ataques de Pânico recorrentes e inesperados e Agorafobia. A Agorafobia Sem História de Transtorno de Pânico caracteriza-se pela presença de Agorafobia e sintomas tipo pânico sem uma história de Ataques de Pânico inesperados. A Fobia Específica caracteriza-se por ansiedade clinicamente significativa provocada pela exposição a um objeto ou situação específicos e temidos, freqüentemente levando ao comportamento de esquiva. A Fobia Social caracteriza-se por ansiedade clinicamente significativa provocada pela exposição a certos tipos de situações sociais ou de desempenho, freqüentemente levando ao comportamento de esquiva. O Transtorno Obsessivo-Compulsivo caracteriza-se por obsessões (que causam acentuada ansiedade ou sofrimento) e/ou compulsões (que servem para neutralizar a ansiedade). O Transtorno de Estresse Pós-Traumático caracteriza-se pela revivência de um evento extremamente traumático, acompanhada por sintomas de excitação aumentada e esquiva de estímulos associados com o trauma. O Transtorno de Estresse Agudo caracteriza-se por sintomas similares àqueles do Transtorno de Estresse Pós-Traumático, ocorrendo logo após um evento extremamente traumático. O Transtorno de Ansiedade Generalizada caracteriza-se por pelo menos 6 meses de ansiedade e preocupação excessivas

13 e persistentes. O Transtorno de Ansiedade Devido a Uma Condição Médica Geral caracteriza-se por sintomas proeminentes de ansiedade considerados como sendo a conseqüência fisiológica direta de uma condição médica geral. O Transtorno de Ansiedade Induzido por Substância caracteriza-se por sintomas proeminentes de ansiedade, considerados como sendo a conseqüência fisiológica direta de uma droga de abuso, um medicamento ou exposição a uma toxina. O Transtorno de Ansiedade Sem Outra Especificação é incluído para a codificação de transtornos com ansiedade proeminente ou esquiva fóbica que não satisfazem os critérios para qualquer um dos Transtornos de Ansiedade específicos definidos nesta seção (ou sintomas de ansiedade acerca dos quais existem informações inadequadas ou contraditórias). Uma vez que o Transtorno de Ansiedade de Separação (caracterizado por ansiedade relacionada à separação de figuras parentais) geralmente se desenvolve na infância, ele é incluído na seção "Transtornos Geralmente Diagnosticados pela Primeira Vez na Infância ou Adolescência". A esquiva fóbica limitada ao contato genital sexual com um parceiro sexual é classificada como Transtorno de Aversão Sexual e está incluída na seção "Transtornos Sexuais e da Identidade de Gênero". Fundamentos Neurofisiológicos da Ansiedade O entrave e não congruência entre as teorias psicológicas acabam por ocultar uma área tão importante quanto as duas correntes: as bases neurofisiológicas presentes em todo e qualquer comportamento, inclusive ao âmbito da ansiedade. Investigando a constituição do Sistema Nervoso Central (SNC) humano, encontramos as mais diversas estruturas. Ele pode ser dividido em um neuroeixo simétrico,

14 constituído por medula espinhal, rombo encéfalo (incluindo o bulbo, a ponte e o cerebelo), mesencéfalo e diencéfalo (tálamo, subtálamo e hipotálamo) e uma divisão pareada, os hemisférios cerebrais ou telencéfalo. O telencéfalo é composto pelos hemisférios cerebrais e os gânglios da base. Na região mais externa dos hemisférios cerebrais encontra-se o córtex cerebral. Tal estrutura apresenta quatro divisões, configurando os lobos occipital, parietal, temporal e frontal. Particularmente, os lobos temporais processam informações auditivas e visuais, além disso, contém áreas essenciais para a aprendizagem, a memória e o comportamento emocional, como o córtex entorrinal, e regiões subcorticais como o hipocampo e amígdala. O diencéfalo inclui o tálamo e hipotálamo, sendo este último uma estrutura envolvida na regulação vegetativa. No mesencéfalo localizam-se importantes estruturas, como a matéria cinzenta periaquedutal, entre outras, relacionadas ao controle motor e emocional. Na ponte encontram-se núcleos motores e sensoriais da face, também está envolvido com a regulação do estado de vigília. Uma importante estrutura são os núcleos da rafe possuidores de neurônios serotoninérgicos. O cerebelo, acima do bulbo, é responsável pela regulação da postura, equilíbrio e coordenação motora. O bulbo, por sua vez controla funções neurovegetativas e outras funções como a deglutição (para revisão, veja Graeff e Guimarães, 2001).

15 Sistema Límbico e a Ansiedade A ansiedade é uma emoção, portanto, as estruturas cerebrais relacionadas estão presentes no sistema Límbico. Desde sua cunhagem, por Paul Broca em 1878 e novas concepções propostas por James Papez (Figura 1), posteriores inclusões de outras áreas do sistema nervoso, tal sistema passou a ser encarado como central de controle das vísceras e as emoções, possuídas de estruturas nucleares ricas em neuropeptídeos e suas estruturas adjacentes contém monoaminas: noradrenalina, dopamina e serotonina. Figura 1. Circuito de Papez. (Fonte: Brandão, 1995) O conhecimento atual das estruturas envolvidas na regulação da ansiedade baseia-se tanto em casos clínicos quanto experimentais, conseguidos através de seres humanos e animais testados em laboratório. O valor adaptativo de condutas como fuga, esquiva faz com que indivíduos com expressão emocional mais notáveis tenham sido favorecidas pela seleção natural.

16 Em 1878, Paul Broca descreveu uma região do cérebro de todos os mamíferos que é muito distinto de outras áreas corticais que ele denominou de lobo límbico (Figura 2): formava um anel em torno do corpo caloso e incluía o giro do cíngulo, o giro parahipocampal e o hipocampo. É um lobo é filogeneticamente muito antigo e está presente em todos os vertebrados. Até que fosse associado como parte dos circuitos emocionais, este lobo esteve primariamente associado com o sentido da olfação. Diferentemente do neocortex (isocortex), o lobo límbico é filogeneticamente mais antigo (alocortex e justalocórtex) e predomina nos mamíferos mais primitivos (macrosmatas). Em relação ao medo e à ansiedade, evolutivamente pode-se concluir que tais emoções associam-se a diferentes estratégias de defesa, sendo iniciadas em resposta a perigos iminentes e presentes no seu ambiente. Figura 2. Lobo Límbico de Paul Broca. (Fonte: Brandão, 1995) O sistema límbico recebe conexões aferentes de praticamente todo o SN. As informações sensoriais provem de áreas sensoriais associativas corticais, indiretamente, pelo giro para-hipocampal que as repassa para o hipocampo (e entra no circuito básico de

17 Papez). A exceção é o estímulo olfatório que chega diretamente do giro-parahipocampal e deste para a amigdala. Já as informações viscerais (gerais e viscerais especiais) chegam diretamente do núcleo do trato solitário e, indiretamente, via hipotálamo. O sistema límbico é modulado pelas projeções do tronco encefálico através de vias serotonérgicas e dopaminérgicas (Figura 3). Figura 3. Circuito de Papez enriquecido com outras estruturas. (Fonte: Brandão, 1995) Um outro sistema neural implicado na ansiedade é o sistema de inibição comportamental, descrito por Jeffrey A. Gray (Gray, 1982). Quando há lesões do septo

18 e/ou hipocampo em ratos alterações comportamentais são encontradas e semelhantes às causadas pela administração de ansiolíticos do tipo barbitúrico ou benzodiazepínicos. Os resultados levaram a sugerir que o sistema septo-hipocampal constitui o componente principal do sistema de inibição comportamental e este, quando ativado, gera estados de ansiedade. O funcionamento de tais estruturas seria facilitado pelas aferências noradrenérgicas e serotonérgicas advindas do mesencéfalo e drogas ansiolíticas reduziriam a ação facilitadora dessas monoaminas. As Drogas: Agonistas e Antagonistas Para a investigação desses prováveis estados, há utilização de várias classes de drogas e com propriedades características. Aquelas que possuem capacidade de se ligar aos receptores e também promover alteração conformacional, gerando em efeito farmacológico, são chamadas de agonistas. Na classe dos agonistas, encontramos os plenos e os parciais. Os primeiros ligam-se aos receptores e produzem o efeito esperado. Já no segundo caso, mesmo em altas concentrações não se atinge o máximo efeito. Também há o conceito de agonista inverso, provocam alterações conformacionais eficazes quando estão ligadas aos receptores específicos, porém, possui o efeito na interação drogareceptor oposto ao determinado pelos agonistas dos mesmos receptores e seus efeitos podem ser revertidos por antagonistas competitivos do receptor. Outro tipo amplamente utilizado são as drogas antagonistas. O antagonista competitivo é a droga que interage reversivelmente com o receptor para formar o complexo, mas o complexo antagonista-receptor não produz uma resposta. A interação antagonistareceptor é caracterizada por uma constante de dissociação, mas a atividade intrínseca do

19 antagonista é zero. Quando se constrói curvas de concentração de agonista X ocupação de receptores por agonista (ou resposta produzida), na presença de concentrações diferentes de antagonista competitivo, obtêm-se curvas com mesma forma, com mesma resposta máxima, com porções lineares paralelas, mas com deslocamento à direita ou à esquerda. Ou seja, curvas log da concentração x resposta são deslocadas para à direita na presença do antagonista competitivo, mas a resposta máxima permanece a mesma e a porção linear permanece paralela a aquela do agonista sozinho. O efeito do antagonista pode ser sobreposto pelo aumento na concentração do agonista. Quando um antagonista forma uma ligação forte com o receptor, a taxa de dissociação do complexo antagonista-receptor é tão lenta que é virtualmente zero. Nesse caso, o antagonista é denominado de irreversível e o antagonismo não é sobreposto pelo aumento na concentração do agonista. O grau de antagonismo aumenta com o aumento na concentração de antagonista. A população de receptores disponível para a interação com agonista é reduzida, portanto, a resposta máxima também é reduzida. A ocupação dos receptores pelo antagonista irreversível pode ser reduzida pela presença simultânea de elevadas concentrações do agonista ou de um antagonista competitivo (para revisão, veja Graeff e Guimarães, 2001, Rang and Dale, 1991). Modelo Animal de Ansiedade Nas pesquisas sobre ansiedade os modelos animais são freqüentemente empregados como ferramentas para a seleção de potenciais agentes terapêuticos bem como para simulações sobre a neurobiologia das emoções (Treit, 1985; Lister, 1990; Green e Hodges,

20 1991; Handley, 1991; Treit, 1991; File, 1992; Rodgers e Cole, 1994a; Griebel, 1995; Rodgers, 1997; Rodgers et al. 1997a). Neste sentido, várias pesquisas pré-clínicas sobre ansiedade têm utilizado modelos animais e a maioria deles empregando métodos comportamentais (Griebel, 1995). Contudo, o tipo de comportamento estudado varia consideravelmente, sendo a distinção mais comum entre os testes aquela baseada nas respostas condicionadas (aprendidas) e as respostas envolvendo o estudo do comportamento incondicionado (não aprendido): exemplos disso são os procedimentos de conflito clássico de Geller-Seifter e do labirinto em cruz elevado, respectivamente. Para que os testes com animais sejam considerados como modelos válidos para a ansiedade, devem responder alguns critérios, tais como: a) a maioria dos modelos comportamentais possui um grau razoável de validade de semelhança (face validity), isto é, as respostas exibidas (sejam aprendidas ou inatas) parecem análogas as reações humanas, sob circunstâncias comparáveis. Embora a analogia seja importante, um modelo animal deve satisfazer também ao critério de homologia (validade teórica), cujo requisito é o de que os mesmos processos psicobiológicos responsáveis pela etiologia e fisiopatologia dos sintomas clínicos estejam ocorrendo. Esses testes também compartilham outra propriedade comum que é a sensibilidade a ansiolíticos estabelecidos e, em especial, a benzodiazepinas. Na verdade, mais que qualquer outro, este critério (validade preditiva) tem sido o fator tradicional dos testes descritos como modelos animais de ansiedade. Assim, analisando os resultados obtidos em diferentes modelos, parece razoável sugerir que alguns testes podem ser mais apropriados que outros para detectar agentes eficazes em particulares transtornos de ansiedade. Além disso, resultados inconsistentes obtidos com supostos mesmos modelos podem simplesmente significar que o estado emocional associado seja dependente dos parâmetros do estímulo.

21 Dessa forma, os transtornos de ansiedade podem ser encarados como desordens de defesa (Deakin e Graeff, 1991; Marks e Nesse, 1994), e é muito significante notar que os mamíferos apresentam reações defensivas a uma ampla variedade de estímulos ameaçadores (Blanchard et al., 1990). Contudo, embora sejam similares nas formas e funções entre diferentes espécies de mamíferos, têm sido demonstrado que tais defesas variam de modo marcante de acordo com fatores específicos do estímulo ameaçador. Assim, além das defesas clássicas de congelamento, fuga, ataque defensivo e falsa-morte, as pesquisas nas últimas décadas têm revelado outros componentes do repertório defensivo dos animais de laboratório. Essas reações, as quais dependem da natureza específica da ameaça e das oportunidades comportamentais disponíveis, incluem a ocultação defensiva (Pinel e Treit, 1978) vocalização ultra-sônica (Gardner, 1985; Miczek et al., 1995; Blanchard et al., 1991; Brudzynski et al., 1992), tigmotatismo (Treit e Fundytus, 1989) e avaliação de risco (Blanchard e Blanchard, 1989; Rodgers et al., 1992a). Como demonstrado por Blanchard e Colaboradores (1993), a diversidade e especificidade do contexto dos comportamentos defensivos contrastam de modo preciso com o mais tradicional conceito psicológico da resposta de medo ou ansiedade. Em vista disso, um dos modelos animais mais utilizado nas últimas décadas é o labirinto em cruz elevado, que desde a sua introdução por Handley e Mithani em 1984, tornou-se um dos modelos animais mais usados para detectar atividade ansiolítica de drogas (Hogg, 1996). O teste é baseado na aversão natural de roedores a espaços abertos (Treit et al., 1993), foi validado em ratos (Pellow et al., 1985) e em camundongos (Stephens et al., 1986; Lister, 1987) e é bidirecionalmente sensível a manipulações projetadas para avaliar ansiedade (Rodgers e Cole, 1994a). Os índices principais de ansiedade no labirinto em cruz elevado compreendem medidas espaço-temporais de esquiva dos braços abertos, enquanto

22 a atividade locomotora é avaliada seja pelo número total de entradas nos braços ou pelo número de entradas nos braços fechados (Lister, 1987; File, 1992). Resultados de vários laboratórios têm demonstrado uma sensibilidade aumentada em certos comportamentos e posturas e, em especial, daqueles relacionados ao padrão defensivo de avaliação de risco (Rodgers et al., 1992a; Adamec et al., 1993; Cruz et al., 1994; Shepherd et al., 1994; Griebel et al., 1996, 1997). Estas medidas etológicas não são apenas freqüentemente mais sensíveis às ações das drogas, mas também podem detectar compostos tais como os agonistas parciais de receptores 5-HT1A que falham em influenciar a esquiva aos braços abertos ou o fazem em doses que debilitam o organismo (para revisão, ver Rodgers, 1997; Rodgers et al., 1997a). Até o momento, várias pesquisas têm envolvido predominantemente os ligantes de receptores benzodiazepínicos e 5-HT 1A como prováveis sítios de ação das drogas ansiolíticas em animais ingênuos ao labirinto em cruz elevado. Os efeitos de ligantes seletivos sobre o comportamento têm sido demonstrado em ratos após infusões de midazolam no núcleo dorsal da rafe (Gonzalez e File, 1997), matéria cinzenta periaquedutal dorsal (Motta e Brandão 1993; Russo et al., 1993), amígdala basolateral (Green e Vale, 1992; Zangrossi e Graeff, 1994; Pesold e Treit, 1995) e septo (Pesold e Treit, 1994, 1996). Uma vez que esses efeitos são bloqueados pelo antagonista benzodiazepínico, flumazenil, tem sido sugerido o envolvimento específico dos receptores das benzodiazepinas. As pesquisas envolvendo os efeitos da administração central de ligantes de receptores 5-HT 1A na modulação da ansiedade no labirinto em cruz elevado têm enfocado o uso do agonista (±)8-OH-DPAT. Este agonista seletivo dos receptores 5-HT 1A, produz efeitos ansiolíticos quando aplicado no núcleo mediano da rafe (File et al., 1996; File e

23 Gonzalez, 1996) e no hipocampo dorsal (Menard e Treit, 1998), mas não nos núcleos dorsal da rafe, na amígdala e basolateral da amígdala ou septo (Zangrossi e Graeff, 1994; File et al., 1996; File e Gonzalez, 1996; Gonzalez et al., 1996; Menard e Treit, 1998; Nunes-de- Souza et al., 2000). Embora esses resultados tenham sugerido diferenças nos sítios da ação ansiolítica dos benzodiazepínicos e dos ligantes dos receptores 5-HT 1A no labirinto em cruz elevado, algum cuidado deve ser tomado de maneira que afirmações injustificadas têm sido feitas com relação às ações farmacológicas do (±)8-OH-DPAT, uma vez que poucos estudos demonstraram que os efeitos deste agente pode ser bloqueado por antagonistas seletivos de receptores 5-HT 1A. Referentes as estruturas límbicas, o hipocampo não esta relacionado somente à memória, mas também é um dos principais centros de informação e regulação de informações e na regulação dos comportamentos (Bannerman et al., 2004). Seguindo suas subdivisões, dorsal e ventral, Moser et al. (1993) demonstrou que a retirada do hipocampo dorsal provoca graves perdas de memória no teste do labirinto aquático de Morris, enquanto que a retirada da porção ventral não causou efeitos. Dessa forma, o hipocampo ventral diferencia-se do dorsal por suas conexões anatômicas (descritas logo a seguir) e suas grandes ligações a amigdala e ao hipotálamo sugerem que a região ventral esteja relacionada ao medo e a ansiedade (Pitkanen et al., 2000). Está bem estabelecido na literatura que a formação hipocampal recebe inervação serotonérgica dos núcleos dorsal e mediano da rafe (Azmitia e Segal, 1978; Vertes, 1991) e contem altas concentrações de receptores 5-HT 1A (Hoyer et al., 1986; Laporte et al., 1994; Pazos et al., 1987). Além disso, resultados recentes do nosso laboratório demonstraram que infusões de WAY (antagonista seletivo dos receptores 5-HT 1A ) dentro do

24 hipocampo ventral (Nunes-de-Souza et al., 1999, 2002) de camundongos ingênuos, atenuaram os principais índices de ansiedade (% entradas nos braços abertos e % tempo gasto nos braços abertos) sem afetar de modo significativo a freqüência de entradas nos braços fechados, uma medida usada para avaliar a atividade locomotora dos animais expostos ao LCE (Cruz et al., 1994; File, 1992; Rodgers and Johnson, 1995). Além de alterar as medidas convencionais de ansiedade, o antagonista 5-HT 1A também provocou diminuições significativas (Nunes-de-Souza et al., 1999, 2002) na exibição do comportamento de esticar o corpo, uma medida etológica que tem sido usada para medir a avaliação de risco em ratos (Cruz et al., 1994, Griebel et al., 1996) e camundongos (Rodgers e Cole, 1994a). A busca por uma interpretação plausível para estes efeitos ansiolíticos nos levou a teoria do papel dual da serotonina proposto por Deakin e Graeff (1991). A serotonina pode facilitar ou refrear o comportamento defensivo, dependendo dos subtipos de receptores serotonérgicos e dos sítios em que atua no sistema nervoso central (SNC). Neste sentido, os núcleos da rafe projetam seus axônios para uma variedade de estruturas no SNC. Todavia, isto não implica que todas elas façam parte do sistema de defesa, ou seja, não implica que a 5-HT esteja exercendo alguma ação pró ou antiaversiva em todos os sítios pós-sinápticos. Entretanto, por se tratar de uma situação aversiva, parece razoável sugerir que a exposição ao LCE resulte na ativação das vias serotonérgicas com projeções para estruturas pertencentes ao sistema de defesa, tais como, amígdala, septo, hipotálamo, matéria cinzenta periaquedutal (MCP) e hipocampo. A proximidade do estímulo aversivo é um dos fatores determinantes para a liberação da serotonina em seus diferentes sítios. Por exemplo, o aumento dos disparos dos neurônios serotonérgicos da rafe com projeções para amígdala (prosencéfalo), desencadeado por estímulos aversivos condicionados, resulta em facilitação

25 do comportamento defensivo via ativação de receptores 5-HT 2A/2C e 5-HT 3 (efeito ansiogênico). Porém, o aumento da liberação de serotonina na matéria cinzenta periaquedutal mesencefálica provocado por estímulos aversivos incondicionados resulta em efeito oposto, isto é, atenua a exibição de respostas fisiológicas e comportamentais relacionadas ao medo, em ratos, provavelmente via receptores 5-HT 2A/2C e 5-HT 1A (efeito ansiolítico ou antipânico) (Deakin e Graeff, 1991; Graeff et al., 1996, 1997). Em resumo, baseado na teoria de Deakin e Graeff (1991), a serotonina apresenta um papel dual no sistema de defesa, podendo atuar como ansiolítica ou ansiogênica, dependendo das características do estímulo aversivo (se proximal ou distal, condicionado ou incondicionado). Neste sentido, recentes resultados obtidos em nosso laboratório indicaram que a microinjeção de 8-OH-DPAT na amígdala provoca efeitos ansiogênicos (Nunes-de- Souza et al., 2000), sugerindo que, em camundongos, a ativação dos receptores 5-HT 1A da amígdala leva ao aumento da ansiedade. Embora muito ainda necessite ser investigado sobre a neurobiologia do sistema de defesa dos animais, as evidências encontradas até o momento apontam que, pelo menos em algumas de suas estruturas prosencefálicas, a serotonina exerce um papel ansiogênico nos receptores 5-HT 1A e talvez uma dessas estruturas seja o hipocampo ventral.

26 OBJETIVO Considerando-se as evidências acima este estudo verificou os efeitos da administração de 8-OH-DPAT, agonista dos receptores 5-HT 1A, no hipocampo ventral de camundongos expostos ao labirinto em cruz elevado.

27 MATERIAL E MÉTODO Sujeitos Camundongos da cepa Suíço-albino, machos, pesando gramas (n=8-10), proveniente do biotério central da Universidade Federal de São Carlos foram utilizados para o presente estudo. Os animais (Foto 1) foram agrupados em gaiolas coletivas (41 x 34 x 16 cm, 10 por gaiola), mantidos em condições controladas de temperatura ( C), umidade (55 + 5%), luz (ciclo claro/escuro de 12/12 horas, luzes acesas as 07h00 e apagadas as 19h00) e livre acesso ao alimento e água, exceto durante as breves sessões de teste. Foto 1. Camundongos.

28 Cirurgia Os animais receberam implantação bilateral craniana de cânulas-guia (25-gauge) de 7 mm de comprimento, após anestesia com pentobarbital sódico (60 mg/kg, intraperitonealmente). As cânulas foram fixadas no crânio do animal com cimento acrílico. As coordenadas estereotáxicas para implantação das cânulas-guia foram (coordenadas: A= - 2,8; L= +3,1; V= - 4,0) definidas pelo atlas de Franklin e Paxinos (1997). As pontas das cânulas-guia foram posicionadas ± 1,0 mm dorsal à estrutura alvo. Os mandris, os quais foram removidos durante o procedimento de injeção, foram inseridos dentro das cânulasguia para evitar problemas com obstrução e para reduzir contaminação. As agulhas de injeção (33-gauge) foram inseridas dentro de cada cânula-guia para a injeção das soluções dentro do hipocampo ventral, sendo que o comprimento da mesma, ultrapassará em 1,0 mm a ponta de cada cânula-guia. As agulhas de injeção foram conectadas, por meio de tubos de polietileno (PE-10), a microsseringas Hamilton de 10 microlitros (Hamilton 80300, Hamilton Company, 701 N 10 µl SYR, Foto 2). Por meio de uma bomba de infusão (Modelo B12000, Insight Equipamento Científicos, Foto 3), programou-se a injeção de 0,1 µl (0,1 µl em cada hemisfério do hipocampo ventral) de solução durante um período de 60 segundos. Foto 2. Microseringa Hamilton.

29 Foto 3. Bomba de Infusão. O procedimento de microinjeção consistiu na remoção dos mandris, inserção das agulhas de injeção, injeção da solução por 60 segundos, permanência das agulhas de injeção por 90 segundos após o término das injeções e inserção dos mandris enquanto o animal era contido gentilmente pelo experimentador, manualmente. O movimento de uma pequena bolha de ar no tubo de polietileno antes, durante e depois das injeções confirmou o fluxo da solução. Equipamento O labirinto em cruz elevado (LCE) feito de acrílico transparente consiste de dois braços abertos (30 X 5 X 0,25 cm) unidos ortogonalmente a dois braços fechados (30 X 5 X 15 cm), elevados a 38,5 cm do solo por um suporte de madeira (Foto 4).

30 Foto 4. Labirinto em cruz elevado Procedimento Os animais receberam microinjeções no Hipocampo Ventral de salina ou veículo (controle), 8-OH-DPAT (5,6 e 10,0 nmoles/0,1 µl) e também o p_mppi (4,32 nmoles/0,1 µl). Os testes foram conduzidos durante a fase clara do ciclo de luz (08h30-16h00). Após a microinjeção das drogas, conforme procedimento descrito acima, os camundongos foram individualmente colocados sobre a plataforma central com a cabeça voltada para um dos braços abertos e, desta forma, ficaram em posição propícia para explorar o labirinto por um período de 5 minutos. Após este período, o aparelho foi limpo com algodão umedecido com álcool 20% (v/v) e seco com papel toalha.

31 Todo o teste no labirinto foi filmado e gravado e os resultados coletados analisados posteriormente. Para evitar viés na análise das fitas e também dos efeitos produzidos no comportamento dos camundongos, as drogas receberam nomes fictícios: B, C, D e E. Drogas Para os experimentos, utilizou-se o 8-OH-DPAT (8 hidróxido 2-di-n-propilamino), RBI, PM: 328,3 gramas (5,6 e 10,0 nmoles/0,1 µl), dissolvido em veículo (salina com 2 % de Tween 80%). Análise comportamental Os comportamentos foram avaliados pela análise das fitas gravadas, por um observador treinado. Os comportamentos analisados envolveram tanto os parâmetros convencionais quanto os etológicos (Rodgers e Johnson, 1995). Medidas Convencionais: freqüência de entradas nos braços abertos e fechados (a entrada em um braço é definida pelo cruzamento com todas as quatro patas para dentro do braço) e duração do tempo gasto nestes compartimentos e na plataforma central. Esses dados foram usados para o cálculo da porcentagem de entradas e do tempo de permanência dos animais nos braços abertos (Entradas: [aberto/total] x 100; Tempo: [tempo no compartimento/300] x 100).

32 Histologia Após o término dos experimentos todos os animais receberam injeção central de 0,1 µl de uma solução de 1% de azul de metileno, de acordo com o procedimento descrito para a injeção das drogas. Os animais foram, então, decapitados e seus cérebros removidos e acomodados em recipientes contendo solução de formalina (10%) para posteriormente sofrerem secções coronais (Figura 4) ao longo do trajeto da cânula. Tais Figura 4. Localização dos sítios de injeção de acordo com o Atlas para cérebro de camundongos de Franklin e Paxinos (1997). A área achurada representa os sítios de injeção dos tratamentos com Veículo ou 8-OH-DPAT para os animais expostos à avaliação da ansiedade no LCE. secções foram feitas através da utilização de um micrótomo criostato (Micrótomo Criostato 300, ANCAP: Equipamento Eletro-Eletrônicos Ltda, Foto 5). As secções foram inspecionadas com o uso de um microscópio (Foto 6) e a visualização da dispersão do azul de metileno indicou o local da injeção.

33 Foto 5. Micrótomo Criostato. Foto 6. Microscópio.

34 Estatística Os resultados foram analisados pela análise de variância (ANOVA) e quando pertinente seguida pelo teste de comparações múltiplas apropriado (Teste de Duncan). Os valores de P < 0,05 ou igual foram considerados significativos.

35 RESULTADOS Os resultados apresentados neste trabalho são referentes aos animais cuja injeção intracerebral apresentou controle histológico positivo. As Figuras 5 e 6 mostram os efeitos da microinjeção de 8-OH-DPAT (5,6 e 10,0 nmol/0,1µl) no hipocampo ventral de camundongos expostos ao labirinto em cruz elevado VEÍCULO 5, OH-DPAT (NMOL/0,1UL) Figura 5. Avaliação do 8-OH-DPAT (veículo, 5,6 e 10nmol/0,1µl) microinjetado no hipocampo ventral de camundongos expostos ao LCE (n=8-10). As barras representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) do número de entradas nos De braços acordo fechados com no a LCE. ANOVA, o tratamento com o agonista 5-HT 1A alterou significativamente tanto a porcentagem de entradas nos braços abertos (F 2,25 = 5,01, p < 0,05) como a porcentagem de tempo gasto (F 2,25 = 5,73, p < 0,01) neste compartimento do labirinto (Figura 6), enquanto não modificou a freqüência de entradas nos braços fechados (F 2,25 = 0,72, p = 0,49)( Figura 5). Comparações entre grupos (teste de Duncan) revelaram que a dose mais baixa (5,6 nmol) de 8-OH-DPAT diminuiu as porcentagens de entradas (p

36 < 0,05) e de tempo gasto (p < 0,01) nos braços abertos do labirinto. Além disso, a dose mais alta deste agonista 5-HT 1A (10 nmol), também diminuiu a porcentagem de tempo gasto (p < 0,05) nos braços abertos do LCE. 60 ENTRADAS NOS BAs TEMPO GASTO NOS BAs * * * 10 0 VEÍCULO 5, OH-DPAT (NMOL/0,1UL) Figura 6. Efeitos do 8-OH-DPAT (veículo, 5,6 e 10nmol/0,1µl) microinjetado no hipocampo ventral de camundongos expostos ao LCE (n=8-10). As barras representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) as porcentagens de entrada e do tempo gasto nos braços abertos (BAs) no LCE. *P<0,05 comparado ao grupo veículo.

37 DISCUSSÃO Os resultados apresentados neste estudo mostraram que a administração intrahipocampal de (+) 8-OH-DPAT, agonista seletivo dos receptores 5-HT 1A, provocou alteração no comportamento dos camundongos expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE). As microinjeções do agonista no hipocampo ventral de camundongos diminuíram a porcentagem de entradas e de tempo gasto nos braços abertos do labirinto, sendo que a dose mais baixa (5,6 nmol) alterou a porcentagem de entradas nos braços abertos e a porcentagem de tempo gasto nestes mesmos braços e, a dose mais alta (10,0 nmol) diminuiu a porcentagem de tempo gasto nos braços abertos, sem afetar as entradas nos braços fechados (Figura 5 e 6). Estes resultados sugerem que a serotonina exerce um papel ansiogênico ao atuar nos receptores 5-HT 1A no hipocampo ventral de camundongos da cepa suíço-albino. Efeitos opostos sobre a ansiedade têm sido relatados com agonistas de receptores 5- HT 1A, dependendo da estrutura do sistema nervoso central estudado. Neste sentido, vários autores têm demonstrado que a ativação desse subtipo de receptor serotonérgico produz efeitos ansiolíticos quando aplicado no núcleo mediano da rafe (File et al., 1996; File e Gonzalez, 1996) e no hipocampo dorsal (Menard e Treit, 1998), e ansiogênicos em outras estruturas cerebrais, tais como, núcleos dorsal da rafe, amígdala e basolateral da amígdala ou septo (Zangrossi e Graeff, 1994; File et al., 1996; File e Gonzalez, 1996; Gonzalez et al., 1996; Menard e Treit, 1998), em ratos. Além disso, segundo Nunes-de-Souza et al. (2000) a microinjeção de 8-OH-DPAT na amígdala provoca efeitos ansiogênicos, sugerindo que a ativação dos receptores 5-HT 1A dessa estrutura em camundongos, leva ao aumento da ansiedade.

38 Segundo a teoria de Deakin e Graeff (1991), a serotonina apresenta um papel dual no sistema de defesa, podendo atuar como ansiolítica ou ansiogênica, dependendo das características do estímulo aversivo (se proximal ou distal, condicionado ou incondicionado). Neste sentido, é razoável supor que a exposição ao LCE (estímulo aversivo incondicionado) resulte na estimulação de vias serotonérgicas do sistema nervoso central, com projeções, por exemplo, para o hipocampo ventral e dorsal, resultando, respectivamente, no aumento e na diminuição da ansiedade. Resultados da literatura têm demonstrado que a formação hipocampal recebe inervação serotonérgica dos núcleos dorsal e mediano da rafe (Azmitia e Segal, 1978; Vertes, 1991) e contem altas concentrações de receptores 5-HT 1A (Hoyer et al., 1986; Pazos et al., 1987; Laporte et al., 1994). Neste sentido, autores demonstraram (Nunes-de-Souza et al., 1999, 2002) que infusões de WAY (antagonista seletivo dos receptores 5-HT 1A ) dentro do hipocampo ventral de camundongos, atenuaram os principais índices de ansiedade (% entradas e de tempo gasto nos braços abertos) sem afetar de modo significativo à freqüência de entradas nos braços fechados, uma medida usada para avaliar a atividade locomotora dos animais expostos ao LCE (Cruz et al., 1994; File, 1992; Rodgers e Johnson, 1995). O efeito ansiolítico provocado pelo bloqueio dos receptores 5-HT 1A no hipocampo ventral observado por Nunes-de-Souza et al. (2000) somados ao efeito ansiogênico obtido neste trabalho sustenta a hipótese de que a serotonina exerce um papel dual neste sítio pós-sináptico. Embora no nosso estudo a administração de ambas as doses de 8-OH-DPAT no HV de camundongos tenha produzido efeito ansiogênico, isto não se deve a possível alteração na atividade locomotora dos animais porque não houve alteração no número de entradas nos braços fechados do LCE.

39 CONCLUSÃO As microinjeções de 8-OH-DPAT, agonista dos receptores 5-HT 1A, no HV produziu efeito ansiogênico em camundongos submetidos ao LCE. O presente estudo corrobora resultados obtidos anteriormente na literatura e reforça a teoria do papel dual da serotonina neste sítio pós-sináptico.