ABORDAGEM METABOLÔMICA: DISCRIMINAÇÃO DE TRATAMENTO PÓS- COLHEITA DE GRÃOS DE CAFÉ VERDE (Coffea arabica L.) DO PARANÁ 1
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- Sérgio Marques Anjos
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1 ABORDAGEM METABOLÔMICA: DISCRIMINAÇÃO DE TRATAMENTO PÓS- COLHEITA DE GRÃOS DE CAFÉ VERDE (Coffea arabica L.) DO PARANÁ 1 Anna Tsukui 2 ; Ana Laura Macedo Brand 3 ; Pedro Henrique Vendramini 4 ; Marcos Nogueira Eberlin 5 ; Maria Brígida dos Santos Scholz 6 ; Claudia Moraes de Rezende 7 1 Trabalho financiado pela Embrapa Café, CNPq, CAPES 2 Bolsista Doutorado CAPES, Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos; Universidade Federal do Rio de Janeiro. annatsukui@ufrj.br 3 Bolsista Iniciação Ciêntífica PIBIC; Universidade Federal do Rio de Janeiro. alaurambrand@gmail.com 4 Bolsista Petróleo Brasileiro S/A., Programa de Pós-graduação em Química; Universidade Estadual de Campinas. ph_vendramini@yahoo.com.br 5 Pesquisador, Doutor, Programa de Pós-graduação em Química; Universidade Estadual de Campinas. 6 Pesquisador, Doutor, Instituto Agronômico do Paraná. mbscholz@iapar.br 7 Pesquisador, Doutor, Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química; Universidade Federal do Rio de Janeiro. crezende@iq.ufrj.br RESUMO: Os grãos de café verde (Coffea arabica L.) foram quantificados em cafeína e ácidos clorogênicos por CLAE/UV-Vis, teor em óleo por extração Soxhlet (4h) e análise do perfil químico por ESI(-)-QTOF-MS, em busca da relação composição química: tratamento pós-colheita para cafés naturais (CN) e cerejas descascados (CD), com auxílio da ferramenta estatística PCA e PLS-DA. Foi possível observar diferenciação entre os tratamentos com base na análise do perfil químico por ESI(-)-QTOF, além da classificação de amostras desconhecidas a partir da calibração e validação dos dados. Os resultados indicam um grande potencial do emprego da análise do perfil químico associado à estatística multivariada na diferenciação entre os tratamentos pós-colheita a partir da identificação das substâncias químicas que melhor classificam os grupos, sugerindo um possível marcador químico para esses grãos de cafés. PALAVRAS-CHAVE: Café verde, metabolômica, espectrometria de massas, pós-colheita, PCA e PLS-DA. METABOLOMIC APPROACH: DISCRIMINATION GREEN COFFEE BEANS (Coffea arabica L.) OF POST-HARVEST TREATMENT OF PARANÁ ABSTRACT: Green coffee beans (Coffea arabica L.) were quantified in caffeine and chlorogenic acid by HPLC/ UV- Vis, oil by Soxhlet extraction (4h) and chemical profile by ESI(-)-QTOF-MS. Searching on the relationship between chemical composition and post-harvest treatment, natural (CN) and peeled coffees (CD) were investigated with statistical tools as PCA and PLS-DA. Differences between the two treatments were observed on the chemical profile for ESI(-)-QTOF-MS, in addition of classifying unknown samples by calibration and validation data. The results indicate a great potential by the use of chemical profile analysis and multivariate statistics in the differentiation of post-harvest treatments from of the chemicals compounds identification that better classify the groups, suggesting a possible chemical marker for this green coffee beans. KEYWORDS: Green coffee, metabolomics, mass spectrometry, post-harvest, PCA and PLS-DA. INTRODUÇÃO O Brasil é o primeiro produtor mundial de grãos de café verde e apresenta diversas regiões de plantio de cafés arábica com importante participação na economia brasileira. O Estado do Paraná deteve cerca de 3% da produção brasileira nos anos de 2013 (CONAB, 2014). Para o aprimoramento dos cafés, diversos produtores têm estabelecido colaborações com institutos de pesquisa, visando contribuições científicas que respaldem as certificações da região como produtora de cafés de qualidade, com o intuito de fortalecer o reconhecimento da região e dos próprios cafeicultores (IAPAR, 2012). O café é uma das principais fontes de ácidos clorogênicos na dieta humana, uma classe de compostos considerados como antioxidantes e que estão presentes tanto no café cru quanto na bebida, além de ser rico em cafeína e teor em óleo. Segundo Giomo (2012), a composição química dos grãos de café verde pode sofrer variação durante as diferentes etapas do processamento pós-colheita devidos as alteraçoes bioquímicas nos grãos. Este trabalho tem como objetivo avaliar o relação dos teores de cafeína, ácidos clorogênicos (ácido 5-cafeoilquinico) e óleo, além da análise de perfil químico por técnicas modernas de análise química por ESI(-)-QTOF-MS, com base na influências dos diferentes processos pós-colheita dos grãos com auxílio de ferramentas estatísticas multivariadas e sugerir um possível marcador químico para os tratamentos pós colheita entre o café cereja natural e cereja descascado.
2 Área IX Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil MATERIAIS E MÉTODOS Os grãos verdes utilizados originara, de dois tipos de tratamento pós colheita, café natural (CN) e cereja descascado (CD). No total foram utilizadas 14 amostras CN, CD e Microlotes (mistura de CN e CD). A extração partiu de 1 g de grão moído com 4 ml de metanol à 45 C/20 minutos, seguido da filtração em membrana (42µm) e posterior diluição do extrato para análise por ESI(-)-QTOF-MS e CLAE/UV. As condições empregadas em CLAE foram de acordo com Alves et al., (2006) com adaptações: pré-coluna e coluna Regis ODS-1, 4,6 x 250mm, 5µm; fase móvel em modo isocrático com ácido acético/h 2O (5:95 v/v) e acetonitrila, em proporção de 95:5 (v/v), detecção UV-Vis em 320nm e 272nm para o ácido clorogênico e cafeína, respectivamente. Foram investigados os parâmetros de validação do método CLAE para ácidos clorogênicos e cafeína, como a precisão, limite de detecção (LD) e quantificação (LQ) e linearidade. O teor em óleo (massa óleo/100g grão) foi obtido via extração por Soxhlet (4 h) com éter de petróleo. Para análise química do extrado por ESI(-)-QTOF-MS foram utilizadas as seguintes condições: injeção de 0.20 µl da amostra em fluxo de 0,25 µl com lavagem do sistema de injeção com solução metanol e água deionizada (70:30, v/v), adicionado 0,1% hidróxido de amônio. Foram utilizadas as seguintes condições de operação: fonte de ionização electrospray, voltagem do capilar 3,5kV, temperatura de dessolvatação 225ºC, fluxo de dessolvatação 11L min -1, gás de nebulização 25 psi e gás de contra fluxo a 275ºC e 12 L min -1, com tempo de aquisição dos dados de 2 minutos para cada injeção. Os dados foram adquiridos na faixa de m/z pelo software Qualitative Analysis B Os dados de composição química e perfil químico foram processados e análises por componentes principais (PCA) e discriminação por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) foram utilizadas. RESULTADOS E DISCUSSÃO O método empregado para a quantificação de ácido clorogênico e cafeína revelou-se satisfatório em linearidade e precisão (Tabela 1). A curva analítica para ambas substâncias estão apresentadas na Figura 1. Tabela 1. Parâmetros da curva analítica para cafeína e ácido clorogênico. Parâmetros Ácido clorogênico Cafeína Equação y = 69662x 100,24 y = x + 12,405 r 0,9968 0,9980 LD 0, , LQ 0, , Precisão (CV%) < 3,7 < 5 Cafeína Concentração do padrão de Cafeína e ácido clrogênicos(mg/ml) Ácidos clorogênicos Figura 1. Curva analítica do padrão cafeína e ácido clorogênico. O teor de ácido clorogênico foi de 1,7 a 3,0 g/ 100g de grão. Para cafeína, os grãos apresentaram variação entre 0,5-0,9 g/ 100 g de grão. Para o teor de óleo, os grãos apresentaram variação 8 a 11,3 g/ 100g de grão. A Tabela 2 apresenta os valores das médias nos grãos, do desvio padrão e variância dos teores de cafeína, ácido clorogênico e óleo das amostras de tratamento pós-colheita CN, CD e microlotes. Tabela 2. Parâmetros estatísticos para os teores de cafeína, ácidos clorogênicos e óleo em relação ao tratamento póscolheita dos grãos de café verde. Amostras Média* ± Desvio Padrão Variância Café natural (CN) 0,65 ±0,10 0,01 Cafeína Café cereja descascado (CD) 0,76 ± 0,17 0,03 Microlotes (CN e CD) 0,72 ± 0,11 0,01
3 Ácidos clorogênicos Óleo *Média (g/100 g de grão). Café natural (CN) 2,31 ± 0,46 0,21 Café cereja descascado (CD) 2,26 ± 0,49 0,24 Microlotes (CN e CD) 2,18 ± 0,28 0,07 Café natural (CN) 9,69 ± 1,07 1,16 Café cereja descascado (CD) 10,30 ± 0,63 0,39 Microlotes (CN e CD) 10,78 ± 0,48 0,24 O desvio padrão e a variância dos teores mostram a dispersão das amostras em torno de sua média. As amostras tratamento CN e CD estão mais dispersas ao comparar com as amostras microlotes. Isso acarretou na não diferenciação entre as mesmas. A partir dos resultados da análise de perfil químico foi possível identificar 13 substâncias no ESI(-)-QTOF, as de maior intensidade relativa (IR) foram ácido quínico (m/z 191,0561), sacarose (m/z 341,1089) e ácido cafeoilquínico (m/z 353,0878) (Tabela 3). Sete substâncias da fragmentação da estrutura do ácidos clorogênicos (ácido cafeico, ferúlico, quínico, coumaroilquínico, cafeoilquínico, feruloiquínico e dicafeoilquínico), seguido de ácidos graxos (palmítico, oleico e linoleico). A identificação foi realizada comparando a razão massa/carga experimental e teórica e a partir da comparação com base de dados de nosso grupo e outras publicações da literatura (Garrett et al., 2014; Garrett et al, 2013; Garrett, Rezende e Ifa, 2013; Rodrigues e Bragagnolo, 2013; Amorim et al., 2009; Clifford et al., 2005; Clifford et al, 2003;). Tabela 3. Substâncias identificadas por ESI (-)-QTOF-MS. Substâncias Fórmula Teórico (m/z) Experimental Erro relativo (m/z) (ppm) IR a ácido cafeico C8H7O2 135, ,0448 1,4 2,79 ± 0,36 C9H8O4 [M-H] - 179, ,0348 0,5 1,49 ± 0,17 ácido ferúlico C10H10O4 [M-H] - 193, ,0522 8,2 4,91 ± 0,82 ácido quínico C7H12O6 [M-H] - 191, ,0560 0,5 76,18 ± 11,79 ácido palmítico C16H32O2 [M-H] - 255, ,2322 2,7 1,84 ± 0,28 ácido linoleico C18H32O2 [M-H] - 279, ,2321 2,8 4,47 ± 1,71 ácido oleico C18H34O2 [M-H] - 281, ,2475 1,7 1,63 ± 0,26 ácido coumaroilquínico C16H18O8 [M-H] - 337, ,0919 2,6 2,32 ± 0,57 sacarose C12H22O11 [M-H] - 341, ,1086 0,8 91,15 ± 12,36 [2M-H] - 683, , ,5 5,46 ± 1,10 ácido cafeoilquínico C16H18O9 [M-H] - 353, ,0873 1,4 69,62 ± 11,38 [2M-H] - 707, , ,2 1,81 ± 0,35 ácido ferúlico-hexose C16H20O9 [M-H] - 355, , ,4 2,53 ± 0,79 ácido feruloilquínico C17H20O9 [M-H] - 367, ,1025 2,4 15,27 ± 3,25 atractilosideo II C25H38O9 [M-H] - 481, ,2409 7,0 1,3 ± 0,00 ácido dicafeoilquínico C 25H 24O 12 [M-H] - 515, ,1173 3,3 8,02 ± 0,91 a Intensidade Relativa (média e desvio padrão); m/z: razão massa carga; ppm: parte por milhão. A análise de componentes principais (PCA) referente ao perfil químico por ESI(-)-QTOF-MS das substâncias identificadas (Tabela 3) levou à classificação das amostras em relação aos dois tipos de tratamento pós-colheita (CN e CD), além de indicar a maior representação das amostras Microlotes como café cereja descascado (Figura 2). É possível observar os grupos de amostras CN (em preto) na região mais abaixo da linha interna no gráfico, o qual inicia do valor zero de cada eixo, juntamente com as amostras Microlotes (em verde). As amostras CD (em vermelho) estão agrupadas mais acima dessa mesma linha. Essa tipo de análise de dados é um indicativo a respeito das informações contida nas amostras. O que leva a sugerir uma diferenciação entre os tratamentos pós-colheita, apesar de apresentar baixa variabilidade dos dados para ambos componentes principais (40 e 10%). Isso é decorrente da dispersão entre as amostras (grãos de diversos regiões produtoras), mas com valor de coeficiente de variação menor que 0,3 para 11 das 13 substâncias identificadas, assim, os dados podem ser analisados estatísticamente. A contribuição desse tipo de análise por ESI(-)-QTOF-MS na identificação rápida das substâncias químicas e análise de dados multivariados por componentes principais é aplicável para obter/tirar informações a respeito dos grãos de café verde, neste caso, o tratamento pós colheito submetido nos mesmo.
4 Figura 2. PCA as amostras de café verde (Coffea arabica L.) a partir das substâncias apresentadas na Tabela 3. Pretocafé natural; vermelho- café descascado; verde- microlotes. Outra análise de dados capaz de classificar as amostras em grupos é a análise discriminante por mínimos quadrados parcias (PLS-DA), para as mesmas amostras utilizadas no PCA, permitiu observar a discriminação entre os tratamentos pós-colheita (Figura 3). Figura 3. PLS-DA amostra calibração de grãos de café verde (Coffea arabica L.) a partir das substâncias apresentadas na Tabela 3. (a) Preto- café natural; vermelho- café descascado; (b) azul (café natural e cereja descascado), verdemicrolotes. Ao construir um modelo de calibração é necessário validar observando os seguintes parâmetros, R², RMSE de calibração e validação cruzada (cross validation) e Slope (Tabela 4). Os parâmetros foram satisfatórios para descrever adequadamente o modelo. Tabela 4. Parâmetros de validação dos dados para calibração e validação. Calibração Validação RMSE R Slope RMSE: (inglês: Root Mean Squared Erro) Erro quadrado médio; Slope: declive próximo de 1, dados bem modelados. Tipo de validação: Validação cruzada (cross validation). A partir do modelo de calibração foi aplicado para predizer as amostras desconhecidas, neste caso as microlotes. Com intuito de predizar em qual grupo (CN ou CD) essas amostras são mais representativas. Na Figura 4, observa-se o agrupamento dessas amostras na região do grupo CD, podendo caracterizá-las como pertencentes em maior proporção como cereja descascado. Pode-se constatar que a análise do perfil químico por ESI(-)-QTOF-MS e análise de dados por PCA e PLS-DA se mostraram boas ferramentas para diferenciação de tipos de tratamento pós colheita entre as amostras avaliadas produzidas no estado do Paraná. Abre-se, assim, novas possibilidades de caracterização de cafés desconhecidos, com sugestão das duas vias de tratamento pós-colheita a qual foram submetidos os grãos.
5 Figura 4. Amostras desconhecidas como forma de caracterizá-los nos grupos observados na calibração obtida por PLS-DA. CONCLUSÕES 1. A quantificação dos teores de cafeína e ácido clorogênicos não apresentou diferença das amostras em relação ao tratamento pós-colheita. 2. A análise do perfil químico dos grãos de café verde por ESI(-)-QTOF-MS levou à identificação de 13 substâncias. 3. A análise dos dados de perfil químico por ESI(-)-QTOF-MS em conjunto com PCA e PLS-DA foi capaz de classificar as amostras de acordo com o tratamento pós-colheita, café natural e cereja descascado, além de classificar amostras microlotes com maior representação por cereja descascado. REFERÊNCIAS BIBLOGRÁFICAS Conab: Página na internet da Companhia Nacional de Abastecimento, acessada em maio de IAPAR. Café especial produzido no Norte Pioneiro do Paraná recebe certificação de Indicação Geográfica, Disponível em: produzido-no-norte- Pioneiro-do-Parana-recebe-certificacao-de-Indicacao-Geografica, acessado em: 29/01/2013. GIOMO, G. S. Uma boa pós-colheita é segredo da qualidade, Disponível em: acessado em: 06/05/2015. ALVES, S. T.; DIAS, R. C. E.; BENASSI, M. T. Metodologia para análise simultânea de ácido nicotínico, trigonelina, ácido clorogênico e cafeína em café torrado por cromatografia líquida de alta eficiência. Química Nova 29: , GARRETT, R.; SCHWAB, N.V.; CABRAL, E. C.; HENRIQUE, B.V.M.; IFA, D. R.; EBERLIN, M. N.; REZENDE, C. M. Ambient Mass Spectrometry Employd for Direct Analysis of Intact Arabica Coffee Beans. Journal of the Brazilian Chemical Society 25: , GARRETT, R.; SCHMIDT, E.M.; PEREIRA, L.F.P.; KITZBERGER, C. S. G.; SCHOLZ, M.B.S.; EBERLIN, M. N.; REZENDE, C.M. Discrimination of Arabica coffee cultivars by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry and chemometrics. Food Science and Technology 50: , GARRETT, R.; REZENDE, C.M.; IFA, D.R. Coffee origin discrimination by paper spray mass spectrometry and direct coffee spray analysis. Analytical Methods 5: , RODRIGUES, N.P.; BRAGAGNOLO, N. Identification and quantification of bioactive compounds in coffee brews by HPLC-DAD-MS n. Journal of Food Compositon and Analysis 32: , AMORIM, A. C. L.; HOVELL, A. M. C.; PINTO, A. C.; EBERLIN, M. N.; ARRUDA, N. P.; PEREIRA, E. J.; BIZZO, H. R.; CATHARINO, R. R.; MORAIS FILHO, Z. B.; REZENDE, C. M. Green and roasted arabica coffees differentiated by ripeness, process and cup quality via Eletrospray Ionization Mass Spectrometry fingerprinting. Journal of the Brazilian Chemical Society 20: , 2009 CLIFFORD, M.N.; KNIGHT, S.; KUHNERT, N. Discriminating between the six isomers of dicaffeoylquinic acid by LC-MS n. Journal Agricultural and Food Chemistry 53: , CLIFFORD, M.N.; JOHNSTON, K.L.; KNIGHT, S.; KUHNERT, N. Hierarchical scheme for LC-MS n identification of chlrogenic acids. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: ,
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