UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL ELIANE LEAL CANDEIAS FORMAÇÃO DE COLEÇÃO E VARIABILIDADE MORFOMÉTRICA DE ISOLADOS DE Microcyclus ulei NA BAHIA ILHÉUS BAHIA 2012

2 ELIANE LEAL CANDEIAS Engenheira Agrônoma FORMAÇÃO DE COLEÇÃO E VARIABILIDADE MORFOMÉTRICA DE ISOLADOS DE Microcyclus ulei NA BAHIA Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, para obtenção do título de Mestre. Linha de Pesquisa: Proteção de Plantas Orientador: Prof. Drª Edna Dora Martins Newman Luz Co-orientadores: Dr. Givaldo Rocha Niella Drª Karina Peres Gramacho ILHÉUS BAHIA 2012

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4 À minha querida FAMÍLIA, que é responsável por toda minha formação e que me ensinou a lutar pela concretização dos meus sonhos. Ofereço À Dra. Edna Dora Luz, minha querida orientadora, juntamente com os seus filhos de coração - Dene, Marcinha, Cenilda, Titã, Marquinhos, Cris, Milde, Carol, Marcelinha, Lurdinha e Joel que me acolheram, estando presentes principalmente nos momentos em que eu achava que não tinha mais força pra seguir; ergueram-me, mostrando que eu não estava só e que da união surgem as vitórias. Homenageio À minha FAMÍLIA linda: minha mãe/rainha Elizabete, meu Pai, Antonio, irmãos Elizete, Adelmo, Adenilson; ao meu amor Ronaldo; às minhas cunhadas Adnair e Romilda; ao meu cunhado Wesley; às minhas sobrinhas: Sophia, Mylena e Gisele e à minha querida voinha Cândida (em memória), pelo carinho, incentivo e por serem as pessoas que mais amo: personagens principais de toda minha história. Dedico

5 AGRADECIMENTOS A Deus e à Nossa Senhora por todo amor, carinho e proteção, demonstrado diariamente, por toda a minha vida, de modo que nunca permitiram que perdesse a fé de lutar por dias melhores. À minha família por ser composta pelas pessoas que mais me incentivam, que mais celebram as minhas vitórias e que estão sempre comigo em todos os momentos da minha vida. À minha amada orientadora Dra. Edna Dora Martins Newman Luz, por todo amor e carinho transmitido, pelos conhecimentos que me foram oferecidos, tanto profissionais quanto pessoais. Serei eternamente grata por tudo. Ao meu namorado Ronaldo, pelo amor, carinho, paciência e incentivo. Aos velhos e eternos amigos/irmãos Cris, Aninha, Eline, Ciro, Marisa, Sandra, Elielson, Márcia, Roberval, Reginaldo, Carol, Fabiana, Suzarte, Thâmara, Emanuel, Zazá, Ricardo e todos aqueles que acreditaram e contribuíram, direta ou indiretamente, para a concretização desse sonho. Aos AMIGOS/ REVELAÇÃO do mestrado os quais tenho orgulho de ter conquistado e que me proporcionaram muitos momentos de alegria: Carol (muito especial, vivemos muitas emoções juntas), Marcelinha, Mariana, Lígia, Leo, Flávia, Viviane, Joca, Verônica, Patrícia, Viviane (Lora), Ane, Irina, Marquinhos, Nadja, Kátia, Joelma, Jefferson. Aos queridos amigos da Seção de Fitopatologia: Joel, Tita, Magui, Deni, Cenilda, Lurdinha, Clelinha, Marcinha, Milde, Virgínia, Ana Rosa, Neto e Dilze. Ao meu querido professor, Dr. Bezerra, pelo carinho e conhecimentos transmitidos. Aos operários de campo da Seção de Fitopatologia, pela grande ajuda nas atividades de campo, carinho e harmoniosa convivência em especial Srs. Pintado, Elenísio, Orlando, Nane e Belmiro. Aos colegas do Mestrado, pela agradável convivência. Ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal. Às secretárias do Mestrado, Caroline e Liliane, pela competência e o carinho que me foi destinado.

6 Ao Dr. José Luiz Pires a quem serei eternamente grata pelos ensinamentos e colaboração nas análises estatísticas. Aos meus co-orientadores, Dr. Givaldo, Niella e Karina Gramacho pelo apoio no desenvolvimento da pesquisa. À CEPLAC, por me conceder toda a infraestrutura para realização deste Projeto. CAPES e CNPq pelo financiamento concedido no período de desenvolvimento do projeto OBRIGADA

7 Vou continuar em busca de tudo aquilo que Deus já escolheu pra mim, vou persistir, e mesmo nas marcas daquela dor, do que ficou, vou me lembrar e realizar o sonho mais lindo que Deus sonhou em meu lugar: estar na espera de um novo que vai chegar; vou persistir, continuar a esperar e crer e mesmo quando a visão se turva e o coração só chora, mas na alma, há certeza da vitória... porque posso, tudo posso Naquele que me fortalece, nada e ninguém no mundo vai me fazer desistir... Padre Fábio de Melo

8 SUMÁRIO EXTRATO... viii ABSTRACT... x 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Histórias da seringueira Mal-das-folhas da Seringueira Etiologia Sintomatologia Epidemiologia Ciclo da doença Controle Melhoramento genético da seringueira CAPÍTULO RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS Coletas Obtenção dos isolados RESULTADOS DISCUSSÃO CAPÍTULO RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS Experimento I e II Experimento III Experimento IV Experimento V Experimento VI DISCUSSÃO CONCLUSÃO GERAL REFERÊNCIAS... 73

9 viii FORMAÇÃO DE COLEÇÃO E VARIABILIDADE MORFOMÉTRICA DE ISOLADOS DE Microcyclus ulei NA BAHIA EXTRATO O fungo Microcyclus ulei é o agente do mal-das-folhas da seringueira, principal problema fitossanitário no pólo heveícola baiano. O presente trabalho visou através de coletas e isolamento i) formar uma coleção representativa da população de M. ulei do pólo heveícola Sul da Bahia e ii) avaliar a variabilidade morfométrica existente entre os isolados desta coleção. Folíolos jovens infectados foram coletados em cinco sub-polos heveícolas da Bahia correspondendo aos seguintes municípios: SP1 - Ituberá/Igrapiúna, SP2 - Porto Seguro/Guaratinga/Eunápolis, SP3 - Itamarajú, SP4 - Uruçuca e SP5 - Una. As amostras foram oriundas de cinco fazendas de cada sub-polo, sendo georeferen-ciadas 30 plantas/fazenda. No Laboratório de Micologia do CEPEC realizou-se o isolamento das amostras, transferindo-se conídios presentes nas lesões em folíolos, diretamente para placas de Petri com o meio de cultura MC8. A caracterização morfométrica de 134 isolados foi realizada em seis experimentos com cinco repetições conduzidos a 24º±1ºC e luz constante. Avaliou-se o diâmetro das colônias nos dois sentidos perpendiculares, tomados a cada cinco dias, a partir dos 15 até o quadragésimo dia de cultivo. Ao final de cada experimento, quantificou-se a esporulação no campo visual do microscópio (objetiva 40x), usando a seguinte escala convencional de conídios por campo: 0 - ausência, 1- menos de 30, 2 - entre 30 e 50 e 3 - acima de 50, sendo também mensurado o comprimento e a largura dos conídios. O peso seco das colônias foi aferido após a retirada do meio e secamento em estufa a 70 ºC por 24 h. Das 515 amostras processadas foram obtidos 132 isolados: 14 do SP1, 52 do SP2, 5 do SP3, 45 do SP4 e 16 do SP5. Maior sucesso nos isolamentos foi obtido das amostras dos SP2 (64,2%) e SP4 (49,5%), que eram compostas por folíolos jovens e com lesões novas e foram processadas 24 h depois da coleta. Menores números de isolados foram obtidos em amostras processadas com mais de 48 h de coleta em função, principalmente, das contaminações com outros fungos. O patógeno está amplamente disseminado no polo heveícola da Bahia tendo sido encontrado em Ituberá o maior percentual de plantas infectadas e em Una o menor Obteve-se assim, uma coleção representativa da diversidade do patógeno na região. Constatou-se ampla variabilidade morfométrica entre os isolados para as áreas de colônias nos seis idades avaliadas e dimensões dos conídios que foram significativos em todos os experimentos, bem como para sub-polos de origem e municípios dentro do sub-polo. Isolados do SP3 desenvolveram as maiores e os do SP2 as menores colônias e com menores pesos secos. Estes podem ser indicativos da possível existência de variabilidade genética e patológica na população do patógeno.

10 Palavras-chave: Hevea brasiliensis, seringueira, mal-das-folhas, diversidade do patógeno, caracterização morfométrica. ix

11 x COLLECTION FORMATION AND MORPHOMETRIC VARIABILITY OF Microcyclus ulei ISOLATES IN BAHIA ABSTRACT Microcyclus ulei is the causal agent of South American leaf blight (SALB) of the rubber tree, the main phytossanitary problem of the culture in South of Bahia. The present research aimed to collect and isolate M. ulei from rubber plantations of South Bahia in order to i) to obtain a culture collection that represents the pathogen population of that region; ii) to know the morphometric variability existing among the population. The rubber tree growing pole of South Bahia was divided in five sub-poles (SP) comprising the following municipalities: SP1 - Ituberá/Igrapiúna, SP2 - Porto Seguro/Guaratinga/Eunápolis, SP3 - Itamarajú, SP4 - Uruçuca and SP5 - Una. From each SP five farms were sampled and young leaflets infected by the fungus were collected from 30 georefered plants per farm. The isolations were done at the mycology laboratory of CEPEC transferring conidia from the leaf lesions directly to Petri dishes containing MC8 culture medium. Six experiments with five replications each were conducted under constant light and 24º±1ºC to perform the morphometric characterization of 134 isolates. The colonies diameter were evaluated in two perpendicular directions at each five days from the 15 th to the 40 th day of cultivation, when conidia length and width were measured as well as the sporulation through the following scale: 0- no spores; 1 less than 30 conidia; 2 between 30 and 50 conidia and 3 50 above conidia per microscope field. The dry weight of the colonies was measured after removal from the medium and drying at 70 C for 24 h. From 515 processed samples 132 isolates were obtained: 14 from SP1, 52 from SP2, 5 from SP3, 45 from SP4 and 16 from SP5. Better success on isolation were obtained from samples of SP2 (64.2%) and SP4 (49.5%) in which young leaflets with new lesions were collected and processed within 24 h. Smaller numbers of isolates were obtained from samples processed over 48 h of collection due mainly from contamination with other fungi. The pathogen is widespread in Bahia rubber tree plantations and the highest percentage of infected plants was observed in Itubera and lowest in Una. A culture collection was obtained with isolates representing the pathogen diversity in the region. It was observed wide morphometric variability among the 134 isolates in all six experiments for colonies sizes and conidia measurements. Significant variability was found also for sub-poles and municipalities inside

12 xi sub-poles. The largest colonies were from isolates of SP3 and the smaller colonies with lower dry weights from SP2. These may be indicatives that genetic and pathologic variability exists in the pathogen population. Keywords: Hevea brasiliensis, rubber tree, South American leaf blight, isolates diversity, morphometric characterization.

13 1 1. INTRODUÇÃO A cultura da seringueira [Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell. Arg.] expandiu-se da Amazônia, que é o seu centro de origem, para outras áreas, sendo cultivada em climas distintos aos das condições nativas. O plantio em regiões com estação seca definida, ao mesmo tempo em que favorece o escape ao Mal-das-Folhas, causado pelo fungo Microcyclus ulei (P. Henn.) v. Arx, gera a necessidade da obtenção de conhecimentos a respeito da resistência e produtividade da seringueira em diferentes condições edafoclimáticas (CONFORTO, 2008). A seringueira é uma árvore da família Euphorbiaceae de folhas compostas, flores pequenas e reunidas em amplas panículas, com fruto em uma grande cápsula tripartida, geralmente apresentando três sementes ricas em óleo. Sua madeira é branca e leve, e exuda látex, do qual se origina a borracha. O melhoramento genético tem contribuído para o desenvolvimento da heveicultura, elevando o nível da produção de 400 kg para kg/ha/ano de borracha seca. Hibridações seletivas entre clones superiores de seringueira, seguidas da multiplicação vegetativa do material selecionado e posteriormente avaliado, têm sido à base do melhoramento genético tanto no Estado de São Paulo (DALL ANTONIA et al., 2009), como na Amazônia (GASPAROTTO et al., 1997). O mal-das-folhas tem grande importância por estar presente em todas as áreas de plantio de seringueira no Brasil, sendo responsável por grandes danos à produção, pois a desfolha por ela causada provoca, inicialmente, a redução da produção de látex e, na ocorrência de desfolhamentos sucessivos, as plantas ficam debilitadas e podem vir a morrer.

14 2 O fungo M. ulei possui elevada capacidade de recombinações sexuais, o que lhe permite adaptar-se a diferentes condições climáticas. Isso é um fato preocupante, por colocar em risco as áreas de cultivo recentes, as chamadas zonas de escape, nas quais a cultura desenvolveu-se devido às condições de temperatura e umidade desfavoráveis à doença (MELO et al., 2008). Estas condições são encontradas nas regiões Sudeste e Centro-Oeste do Brasil, onde a cultura tem tido um bom desempenho, o que incentivou os produtores no uso de clones adaptados e produtivos em condições adequadas de manejo. Essas mudanças é que têm garantido o sucesso da heveicultura nessas áreas, responsáveis atualmente por mais de 90% da produção brasileira de borracha natural (DALL ANTONIA et al., 2009). O mal-das-folhas representa o principal problema ao desenvolvimento da heveicultura no Sul da Bahia. Há necessidade de se conhecer a variabilidade do patógeno para subsidiar estudos de avaliação e seleção de clones resistentes a esta doença. O presente trabalho visou através de coletas e isolamentos formar uma coleção representativa da população de M. ulei do pólo heveícola Sul da Bahia e avaliar a variabilidade morfométrica existente entre os isolados desta coleção.

15 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 História da seringueira A cultura da seringueira há muitos anos vem sem sendo explorada, não se sabendo ao certo quando foi descoberta, porém o cientista francês, Charles Marie de La Condamine, realizou estudos na América do Sul e escreveu a respeito de uma árvore que os nativos chamavam Cau-chu, que significa pau que dá leite, da qual, com o látex, fabricavam uma goma que usavam para fazer diversos artefatos. Na mesma época, o naturalista francês François Fresnau, em estudos na Guiana Francesa, também se interessava pelas árvores cujo leite era utilizado pelos índios de formas variadas. Esse estudo resultou na descrição de Hevea guianensis, que foi a primeira espécie a ser descrita neste gênero (COSTA, et. al., 2001). O nome Hevea está fundamentado no Código Internacional de Nomenclatura Botânica para designação do gênero (SECCO, 2008). O centro primário de diversidade genética do gênero Hevea é o rio Negro, na confluência com o rio Amazonas. Já o centro secundário abrange uma vasta área nas proximidades do município de Borba, no baixo rio Madeira (WYCHERLEY, 1977; GOUVÊA, 2009). A seringueira cultivada Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell.-Arg., expandiu-se da Amazônia, para outras áreas, sendo cultivada em climas distintos aos das condições nativas. No entanto, em outras regiões para onde a cultura foi levada visando favorecer o escape ao mal-das-folhas, tornaram-se necessários conhecimentos sobre a resistência à doença, produtividade da cultura e adaptabilidade às diferentes condições edafoclimáticas (CONFORTO, 2008). A heveicultura tem no látex o seu subproduto de maior importância. A borracha oriunda do látex da seringueira foi descoberta no século XVII e até hoje continua sendo a principal fonte natural em todo o mundo. O aumento da demanda pela borracha aconteceu no século XIX, no início da revolução industrial com a invenção do processo de vulcanização,

16 4 processo este em que a borracha reage com enxofre para produzir uma rede de ligações cruzadas entre as cadeias poliméricas. No final daquele mesmo século, surgiram as indústrias automotivas que foram as mais beneficiadas, contribuindo para a exploração dos seringais nativos da região Amazônica (ALVARENGA; CARMO, 2008). Logo no início do século XX, a borracha natural passou a ser uma matéria-prima imprescindível às economias desenvolvidas, transformando o controle de seus suprimentos em elemento de peso na disputa político-econômica (PINTO, 1984). Sendo assim, a extração de látex dos seringais nativos da região amazônica proporcionou e sustentou um dos maiores ciclos de desenvolvimento do Brasil, o Ciclo da Borracha (MORCELI, 2004). Em 1841, a borracha natural passa a ter papel extremamente importante na economia nacional, atingindo o auge entre 1880 e 1910, e passou a ser o segundo produto mais importante na lista brasileira de produtos exportados, com participação de 28% do total. Entre os séculos XIX e XX, grandes empresas e bancos instalaram-se em regiões produtoras de seringueira, especificamente em Manaus e Belém, que passaram a ser exportadoras da borracha natural (ALVARENGA; CARMO, 2008). Essas duas capitais tornaram-se o centro econômico do País e foram beneficiadas em vários aspectos, ganhando sistemas de abastecimento de água, luz elétrica e grandes construções a exemplo do Teatro Amazonas, em Manaus, que permanece como um símbolo da riqueza advinda da borracha. Belém foi contemplada, na época, com o título de Paris d América, já que vivenciou momentos de luxo e glamour (SINDIBOR, 2010). Na Ásia, o início da domesticação da seringueira aconteceu há cerca de 120 anos, sendo considerada mais uma espécie selvagem da Amazônia. Após esse período, o melhoramento genético contribuiu para seu desenvolvimento, aumentando o nível da produção de 400 kg para kg/ha/ano de borracha seca (GONÇALVES et al., 1983; DALL ANTONIA, et al., 2009). Em 1921 iniciou-se o declínio da produção da borracha natural no Brasil, quando as plantações racionalizadas do Oriente, tiveram um aumento significativo, passando a produzir 1,5 milhão de toneladas de borracha, contra 20 mil toneladas da Amazônia. Sendo assim, as exportações brasileiras perderam mercado e não suportaram a concorrência da borracha extraída na Ásia, que era comercializada com menor valor (SINDIBOR, 2010). O Brasil, que era o maior produtor e exportador e não queria perder a sua posição no mercado da borracha, necessitava de medidas de ação imediata para atender a demanda americana de borracha natural, e sua primeira atitude foi investir em uma produção que não fosse extrativista, já que na Ásia, o modelo racional estava gerando bons resultados, ao ponto

17 5 de ameaçar a produção brasileira. A primeira iniciativa do cultivo de seringueira no Brasil teria ocorrido na Bahia, no ano de Ao final dos anos 20 o Brasil persistia em tentativas para inverter a situação da crise, realizando uma parceria com o industrial norte-americano Henry Ford, que era responsável por uma fração significativa da produção mundial de veículos. A Ford fez um grande investimento realizando o plantio de 70 milhões de mudas de seringueira no Estado do Pará, cuja região ficou conhecido como Fordlândia (ROCHA, 1972; SINDIBOR, 2010). Porém, em 1934, o mal-das-folhas destruiu dois milhões de plantas. Ainda assim, houve persistência do empresário que começou tudo outra vez, a 80 quilômetros dessa mesma área e, novamente, não obteve sucesso, sendo novamente, o principal fator o mal-das-folhas (SINDIBOR, 2010). O primeiro plantio de seringueira na Bahia foi introduzido por Leo Zehntner na Ilha de Java, na Escola Agrícola de São Bento das Lages. Em 1909 foram importadas 150 mil mudas do Ceilão por Guilherme Behrmann, agente do Loyd, sendo 30 mil plantadas no Sul da Bahia (VIRGENS FILHO, 2006). Rocha (1973) diz que, em 1946, praticamente 50% dos seringais da Bahia ficaram improdutivos devido ao severo ataque do M. ulei, também responsável pelo abandono dos seringais de Fordlândia e da Good Year (GASPAROTTO et al., 1997). Em 1951, após a Segunda Guerra Mundial, quando o Brasil passou a ser importador de borracha natural e a família Almeida-Fuchis fez uma doação de uma área ao Governo Federal para instalação de uma Estação de Plantas Tropicais, que hoje é conhecida por Estação Experimental Djalma Bahia, na cidade de Una, clones amazônicos e asiáticos foram introduzidos na referida estação para início dos trabalhos de pesquisa visando atender às necessidades da região. Na época haviam hectares de seringueiras cultivadas em solo baiano e, apesar de muitos estudos e formulação de políticas, não houve muito progresso no desenvolvimento da heveicultura neste período (VIRGENS FILHO, 2006). Ainda na década de 1950, a Firestone S.A., uma empresa de grande porte, se instalou na Bahia. Nesse mesmo período, outras áreas plantadas se destacaram, a exemplos da CIA. Policultura de Una, Manoel Joaquim de Carvalho e o Núcleo Colonial de Una. Em 1960, haviam seringueiras plantadas em solo baiano e outros projetos governamentais foram se instalando na década de 1960 com incentivos governamentais. Em 1967, o Governo Federal aprovou a Lei nº que instituiu a Superintendência da Borracha (SUDHEVEA), criando a política de contingência do produto. A SUDHEVEA e o Programa de Incentivo à Produção de Borracha Vegetal (PROBOR) nas versões I, II e III, no ano de 1973, contribuíram para a recuperação dos seringais existentes e aumento da área plantada (VIRGENS FILHO, 2006).

18 6 A seringueira também é a principal fonte de borracha natural na Ásia, porém, em 1998, a Tailândia, Indonésia e Malásia, que são os maiores produtores em ordem decrescente, foram responsáveis por 72% da produção mundial. A estimativa da área de seringal no globo é maior que 9 milhões de hectares, sendo cultivada na região equatorial, situada entre 10º Norte e 10º Sul do Equador. Nesse mesmo ano a produção brasileira foi estimada em 70 mil toneladas, para um consumo de 195 mil toneladas, sendo que menos de 5% da borracha produzida no país foi proveniente de seringais nativos (GONÇALVES et. al., 2001). Mesmo com as várias tentativas de investimento para recuperar o domínio da produção de borracha natural, o Brasil não obteve resultados positivos, passando a ser importador e dependendo de 75% da produção externa para suprir a sua demanda, sendo esta a realidade até presente. Porém, mesmo com todos os desafios ainda a serem vencidos, a heveicultura vem aos poucos se restabelecendo, caminhando para a auto-suficiência dessa matéria-prima, devido aos conhecimentos adquiridos com as pesquisas desenvolvidas nos estados produtores (FURTADO, 2008). A produção brasileira de borracha natural (135,1 mil t (4,8%) em 2010) está concentrada nos estados de São Paulo (58,2%), Bahia (14,2%) e Mato Grosso (8,7%) seguidos por Espírito Santo (4,4%), Goiás (4,1%), Amazonas (1,6%), Pará (1,2%), Mato Grosso Sul (1,1%), Paraná (0,7%), Acre (0,5%) e Tocantins (0,2%) (IBGE, 2011). São Paulo é o estado que possui os seringais mais produtivos e a sua média é de a kg/ha/ano. Estes valores são maiores do que aqueles dos tradicionais países produtores - Tailândia, Indonésia e Malásia - em que as produtividades médias variam de 750 a kg ha -1 ano -1. Logo, o cultivo de seringueira em São Paulo é referencial por ser o mais produtivos do mundo (INSTITUTO AGRONÔMICO DE CAMPINAS, 2002). A Bahia em 2006 tinha hectares de seringueira plantados, com um total de 771 produtores, produção de ton. de borracha seca e produtividade média de 750 kg de borracha seca/ha/ano. A região heveicultora na Bahia apresenta precipitação de 1800 a mm/ano, com umidade relativa > 80%; temperatura média de 24ºC, latitude 13º 00 a 18º 13 LS e longitude 39º 00 a 41º 00 WG (VIRGENS FILHO, 2006). 2.2 Mal-das-folhas da Seringueira O mal-das-folhas pode ser comparado a outras doenças de grande importância econômica em outros cultivos, como por exemplo, a ferrugem do cafeeiro, e a requeima da batatinha (ROCHA, 1972).

19 7 O maior prejuízo causado pelo mal-das-folhas é a queda prematura dos folíolos, pois, em condições favoráveis ao patógeno, a planta pode perder totalmente as folhas. Esse fenômeno, em um seringal em produção, pode significar uma redução na produção de látex. A perdas de folhas, acima de 20%, acarretará apenas em redução da produtividade, enquanto uma desfolha, que represente 75% da copa, resultará em uma diminuição de 30 a 50% da produção de látex. Existem outras enfermidades da seringueira que causam danos ao cultivo, à extração do látex, porém nenhuma causa prejuízos tão significativos quanto aos que são causados pelo mal-das-folhas (ROCHA, 1972) Etiologia O botânico Jan Kuyper, 1911, em viveiros e plantações comerciais encontrou um fungo, que foi classificado como Fusicladium macrosporum J. Kuijper. Um micologista francês, Victor Cayla, coletou folhas em plantios em Belém e enviou a Paris para diagnose. Foi constatado que se tratava de uma espécie de fungo já encontrada há 30 anos no Amazonas, por Ernst Ulei, cuja descrição foi publicada em 1904, por Paul Hennings, que o determinara como Dothidella ulei. O mesmo micologista, Cayla, concluiu que Fusicladium macrosporum era uma fase de vida de Dothidella ulei; outros nomes foram descritos para o mesmo fungo como Aposphaeria ulei, que corresponde a fase espermogonial desenvolvida durante o ciclo sexual. Em 1962, os micologistas Müller e von Arx fizeram a revisão do gênero e o classificaram como Microcyclus ulei, sendo aceito por todos, como o agente causal da doença, queima das folhas sul americana (SALB, em inglês), ou simplesmente mal-dasfolhas, conforme denominada por Stahel (FURTADO, 2008). O fungo Microcyclus ulei pertence ao filo Ascomycota e à família Mycosphaerellaceae. Apresenta ciclo biológico completo na seringueira (ROMERO, et. al., 2006), produzindo ascósporos (inóculo primário) durante a reprodução sexuada ou fase teleomórfica, que dá início ao ciclo da doença, e conidiósporos (inóculo secundário) durante a reprodução assexuada ou fase anamórfica, na fase epidêmica da doença (SILVEIRA; FURTADO, 1995). Este patógeno é extremamente ameaçador por ter alta variabilidade genética, rápida capacidade de disseminação, potencial alto para causar danos severos e por apresentar várias fases em seu ciclo biológico, dificultando o seu controle (GASPAROTTO et al.,1997).

20 Sintomatologia A expressão dos sintomas iniciais do mal-das-folhas nos folíolos é caracterizada por pequenos pontos deprimidos, formando áreas mais claras, que evoluem para lesões necróticas com deformação dos folíolos que, consequentemente, caem prematuramente. Nos clones mais suscetíveis, a idade das folhas influi na manifestação dos sintomas, porém a idade da planta não tem influência na suscetibilidade (ROCHA, 1973). As folhas dos clones suscetíveis são passíveis de queda desde a emergência até a idade de 7 a 10 dias, adquirindo resistência com idade de 12 a 20 dias. Nessa mesma idade é possível observar lesões levemente escurecidas, irregularmente retangulares, ou losangulares e circulares, que provocam deformações e enrugamento nos limbos e, quando essas lesões são muitas nessa região, elas se interligam aparecendo sintomas de queima ou encarquilhamento dos folíolos, provocando a queda dos mesmos (GASPAROTTO et al.,1997). Quando o folíolo é infectado depois dos 12 dias de idade, as lesões não se desenvolvem muito e a esporulação é muito reduzida. Nos clones suscetíveis, ocorre abundância de produção de conídios principalmente na face abaxial em um período de cinco a oito dias após a infecção e os sintomas macroscópicos aparecem dois a três dias após a infecção; nos folíolos com 12 a 20 dias de idade os sintomas macroscópicos aparecem 10 a 25 dias após a infecção. Nos clones tolerantes a esporulação do patógeno somente aparece de 8 a 15 dias após a infecção, e um folíolo pode tolerar muitas lesões sem cair (ROCHA, 1973). A esporulação é facilmente perceptível na face inferior dos folíolos novos, ainda com uma coloração avermelhada, e os sinais são constituídos pela acumulação de conídios que em massa apresentam uma coloração verde-escura. A formação de estromas negros e duros ocorre à medida que a lesão evolui e a folha se desenvolve. Em geral, na fase mais adiantada, os tecidos do centro da lesão se desprendem, deixando orifícios, cujas bordas são cobertas por estromas os quais recebem o nome sintomático de lixa. A infecção também ocorre em ramos e pecíolos novos em crescimento, flores e também em frutos jovens (ROCHA, 1973; GASPAROTTO et al.,1997) Epidemiologia Para o estabelecimento do mal-das-folhas, os fatores que predominam são: suscetibilidade do hospedeiro, quantidade de inóculo e clima favorável ao patógeno. As condições ambientais mais favoráveis para os surtos de doença são períodos prolongados de

21 9 chuvas, umidade relativa e temperatura elevadas, além do tamanho e densidade da plantação (ROCHA, 1973). O aumento do potencial de inóculo está diretamente relacionado com o aumento do número de folíolos jovens, o que ocorre durante a troca de folhas nos seringais com ciclo fenológico definido. Em geral, a brotação de um seringal adulto ocorre num período de 45 a 60 dias, coincidindo com o período de maior incidência da enfermidade (ROCHA, 1973). A disseminação dos esporos ocorre através da água da chuva e pelo vento, tanto em curtas quanto longas distâncias. Para o início do desenvolvimento da doença, os conídios depositados nos folíolos precisam de pelo menos oito horas de orvalho (BATISTA FILHO, et al., 2011) Ciclo da doença A seringueira a partir dos quatro a cinco anos de idade em um determinado período do ano passa por um fenômeno fenológico de perda natural das folhas para a renovação da copa. É após esse evento que ocorre o lançamento de novos folíolos, sendo também o momento em que o patógeno atua infectando as folhas jovens, ocasionando a fase explosiva da doença que pode causar a queda consecutiva dos folíolos. Os estromas molhados por água de chuva ou orvalho, que provoca aumento da tensão interna dos pseudotécios cujos ascos ejetam ascósporos na atmosfera, que são disseminados pelo vento, atingindo folíolos novos, recém-lançados, especialmente de outras plantas. Sendo assim, a fonte de inóculo primário são as folhas velhas onde se encontram os pseudotécios maduros. A infecção pode ocorrer também em folhas maduras, que resistem à queda, permanecendo na planta e dando início à fase estromática do patógeno, o estádio de lixa. Estas folhas infectadas passam a ser novas fontes de inóculo que, em condições favoráveis, dão início a um novo ciclo da doença. A derrubada sucessiva dos folíolos pode ocasionar a morte da planta (GASPAROTTO et al., 1997). A penetração direta dos esporos através da cutícula dos folíolos independe da presença de aberturas naturais ou ferimentos, e, o período latente dura cerca de cinco a seis dias (BATISTA FILHO, et al., 2011).

22 10 Figura 1 - Ciclo de vida do Microcyclus ulei na seringueira. Fonte: Gasparotto; Ferreira, Controle Quanto às práticas de controle do mal-das-folhas recomenda-se que se utilizem várias técnicas de manejo para obtenção de um resultado satisfatório como plantar em locais desfavoráveis ao desenvolvimento do patógeno, e observar a temperatura e a umidade relativa, pois estes são aspectos de grande importância no momento da escolha do local para iniciar um plantio de seringueira. Deve-se, ainda, evitar o plantio em regiões de baixada, já que a desfolha ocasionada pelo M. ulei é sempre maior nessas regiões (HONORATO JUNIOR, 2010). É importante, também, utilizar clones resistentes, com troca regular das folhas, efetuar controle químico em viveiros, jardins clonais e em plantios novos. Recomenda-se, ainda, usar o controle biológico com o fungo hiperparasita Dicyma pulvinata, pois revelou-se excelente antagonista ao patógeno (BATISTA FILHO, et al., 2011). Porém o principal método recomendado, por apresentar maior eficiência, é o uso de clones resistentes ao mal-das-folhas.

23 Melhoramento genético da seringueira Dentre as 11 espécies do gênero Hevea, que se sobressaem na extração de látex, as que possuem maior importância para o melhoramento são a H. brasiliensis, por ter alta capacidade produtiva e alguma resistência ao M. ulei; a H. benthamiana, por possuir resistência ao M. ulei e capacidade para produção de látex; e a H. pauciflora, por ser altamente resistentes ao M. ulei (GONÇALVES et al., 1983). Em relação ao processo fenológico da troca de folhas, a primeira espécie é considerada caduca, a segunda, parcialmente caduca e a última apresenta folhas persistentes de ano para ano (FURTADO, 1996). Fatores ecológicos, fisiológicos e genéticos determinam a produtividade das espécies de seringueira. É necessário conhecer mais sobre o comportamento da seringueira nas diferentes condições edafoclimáticas em que estão estabelecidos os plantios, pois um cultivo bem adaptado diminui o período improdutivo do seringal, proporcionando maior ganho econômico ao produtor. Logo, novas cultivares adaptadas às diferentes regiões constituem mais um fator de importância para o desenvolvimento da heveicultura no Brasil (GONÇALVES 1998; CAVALCANTE; CONFORTO, 2006). Nos estados em que o cultivo da seringueira está presente, as pesquisas a respeito do melhoramento genético vêm crescendo, e o foco principal é o desenvolvimento de clones que sejam resistentes à doença e produtivos ao mesmo tempo. Pereira (2006) destaca as pesquisas com avaliação de clones de seringueira que vêm sendo desenvolvidas na Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC) e nas plantações Michelin, na Bahia. O programa de melhoramento da CEPLAC avaliou e selecionou clones com sigla SIAL, sendo SIAL 893 e SIAL 1005 recomendados para plantio na região Sul da Bahia (MARQUES, 2007). As Plantações Michelin da Bahia também lançaram vários clones, porém, apenas três foram recomendados para plantio na referida região (PMB 1, CDC 312 e FDR 5788) (MATTOS, 2010).

24 12 3. CAPÍTULO 1 COLEÇÃO DE ISOLADOS DE Microcyclus ulei ORIUNDA DO POLO HEVEÍCOLA DA BAHIA RESUMO O fungo Microcyclus ulei é o agente do mal-das-folhas da seringueira, principal problema fitossanitário no pólo heveícola baiano. Este trabalho objetivou estabelecer no CEPEC (Centro de Pesquisas do Cacau) uma coleção de isolados do patógeno para estudos de variabilidade genética, morfológica e patológica, determinação de raças fisiológicas e seleção de clones para resistência a doença. Folíolos jovens infectados foram coletados em cinco subpolos (SP) heveícolas da Bahia correspondendo aos seguintes municípios: SP1 Ituberá e Igrapiúna; SP2 - Porto Seguro, Guaratinga e Eunápolis; SP3 Itamarajú; SP4 - Uruçuca e SP5 - Una. As amostras foram oriundas de cinco fazendas de cada sub-polo, sendo georeferenciadas 30 plantas/fazenda. No Laboratório de Micologia do CEPEC realizou-se o isolamento das amostras, transferindo-se conídios presentes nas lesões em folíolos, diretamente para placas de Petri com o meio MC8. Processaram-se 515 amostras resultando na obtenção de 132 isolados: 14 no SP1, 52 no SP2, cinco no SP3, 45 no SP4, 16 no SP5. Melhor aproveitamento das amostras registrou-se no SP2 (64,2%) e SP4 (49,5%), demonstrando que o sucesso nos isolamentos depende da qualidade dos folíolos (jovens e com lesões novas) e da rapidez com que as amostras são processadas. Menores números de isolados foram obtidos em amostras processadas com mais de 48 h de coleta em função, principalmente, das contaminações. O patógeno está amplamente disseminado nos sub-polos avaliados, porém em Ituberá encontrou-se o maior percentual de plantas infectadas e em Una o menor. Obteve-se uma coleção representativa da diversidade do pólo heveícola da Bahia. Palavras-chave: Hevea brasiliensis, mal-das-folhas, micoteca, biogeografia.

25 13 COLLECTION OF Microcyclus ulei ISOLATES FROM RUBBER TREE PLANTATIONS OF BAHIA ABSTRACT Microcyclus ulei is the causal agent of South American leaf blight the main disease problem of rubber tree in plantations of Bahia. The present research aimed to collect and isolate M. ulei from rubber plantations of South Bahia in order to obtain a culture collection that represents the pathogen population of that region as a subsidy for further studies of genetic, morphologic and pathologic variation, determination of physiological races and selection of clones for disease resistance. The rubber tree growing pole of South Bahia was divided in five sub-poles (SP) comprising the following municipalities: SP1 Ituberá and Igrapiúna; SP2 - Porto Seguro, Guaratinga and Eunápolis; SP3 Itamarajú; SP4 - Uruçuca and SP5 - Una. From each SP five farms were sampled and young leaflets infected by M. ulei were collected from 30 georeferenced plants per farm. The isolations were done at the mycology laboratory of CEPEC transferring conidia from the leaf lesions directly to Petri dishes containing MC8 culture medium. From 515 processed samples 132 isolates were obtained: 14 from SP1, 52 from SP2, 5 from SP3, 45 from SP4 and 16 from SP5. Better success on isolation were obtained from samples of SP2 (64.2%) and SP4 (49.5%) in which young leaflets with new lesions were collected and processed within 24 h. Smaller numbers of isolates were obtained from samples processed over 48 h of collection due mainly from contamination with other fungi. The pathogen is widespread in Bahia rubber tree plantations and the highest percentage of infected plants was observed in Itubera and lowest in Una. A culture collection was obtained with isolates representing the pathogen diversity in the region. Keywords: Hevea brasiliensis, South American leaf blight, mycological collection, biogeography

26 INTRODUÇÃO A seringueira [Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell. Arg.] planta nativa da Amazônia, foi introduzida na Bahia, no ano 1908, como uma estratégia de escape à doença mal-das-folhas, que havia devastado os plantios comerciais do Norte do Brasil (ROCHA, 1972). Atualmente, a cultura se encontra distribuída em vários municípios baianos que constituem mais um polo heveícola no Brasil, sendo responsável por 14,2% da produção nacional (IBGE, 2011). Os plantios comerciais no Sul da Bahia são formados só com seringueira ou são consorciados com o cacaueiro e/ou com outras culturas em Sistemas Agroflorestais (SAFs) proporcionando maior estabilidade econômica aos produtores (MARQUES et al., 2005). Existem outras doenças que estão presente nos plantios de seringueira, mas nenhuma delas limita a expansão da heveicultura na Bahia tanto quanto o mal-das-folhas, causado pelo Ascomycota Microcyclus ulei. É fácil entender a importância econômica desta doença, ao rever a história do cultivo da seringueira verificando os fracassos nas tentativas de implantação da heveicultura em vários países das Américas do Sul e Central (Brasil, Suriname e República Cooperativa da Guiana, Trinidad, Panamá e Costa Rica) (GASPAROTTO et al., 1997). Na Bahia, o entusiasmo dos produtores foi desestimulado com o aparecimento dessa doença, que, somente no município de Una, tornou improdutivos cerca de dos hectares plantados com seringueira. A situação não foi diferente nos demais municípios do Sul da Bahia, principalmente devido à existência de grande quantidade de clones altamente suscetíveis e às condições climáticas muito favoráveis ao desenvolvimento da enfermidade (ROCHA, 1972). Na década de 1980, a Bahia ocupou o primeiro lugar na produção nacional, classificação atualmente ocupada pelo Estado de São Paulo. Segundo dados do IBGE (2011), a Bahia ocupa o segundo lugar na produção nacional de borracha natural com 14,2%.

27 15 Segundo Mattos et al. (2003), o Sul da Bahia possui condições favoráveis ao desenvolvimento do ciclo do patógeno durante todo o ano e, Honorato Junior (2010), relata que este fato contribui para um aumento na exposição dos folíolos suscetíveis a M. ulei por um período maior porque as plantas localizadas nas baixadas e nas encostas estão mais vulneráveis à infecção do fungo. Comumente a seringueira apresenta apenas um fluxo de reenfolhamento ao ano (FURTADO, 1990). Porém, nas condições do Sul da Bahia, devido à alta severidade da doença, ocorre um segundo reenfolhamento, causando alteração da fenologia da cultura (HONORATO JUNIOR, 2010). Em estudos sobre o zoneamento agroclimático para a heveicultura Cecílio et al. (2006) determinou uma classificação (Classes de A a G), desde as áreas aptas às inaptas ao plantio comercial da seringueira, considerando as condições climáticas e os riscos da ocorrência do mal-das-folhas. A Classe A, considerada área apta a heveicultura, apresenta condições térmicas e hídricas satisfatórias, estando praticamente livre do mal-das-folhas. Possui evapotranspiração real anual (ETR) superior a 900 mm, déficit hídrico anual (Da) entre 0 e 200 mm, precipitação total anual (Pa) entre 1400 e 1600 mm e excedente hídrico anual (Ea) inferior a 200 mm. No sentido Norte-Sul hà duas grandes áreas plenamente aptas à heveicultura, com probabilidade de ocorrência do mal-das-folhas praticamente nula. A primeira, localizada mais ao norte da Bahia, e estendendo-se na direção leste, desde o município de Coração de Maria até o litoral e na direção norte até a divisa com o Estado de Sergipe, e a segunda localizada mais ao Sul da Bahia, indo desde o município de Ibirapitanga até atingir o litoral nas proximidades de Porto Seguro. Outras duas pequenas áreas também dessa mesma classe estão presentes nos município de Teolândia e de Alcobaça. Pensando nas possibilidades de expansão da heveicultura na Bahia, principalmente com o enfoque dado aos SAFs, que têm boa adequação para a vocação agrícola da região Sul do Estado, objetivou-se com esta pesquisa coletar folhas infectadas para isolamento de M. ulei e formação de uma coleção de isolados representativos do polo heveícola da Bahia para subsidiar futuros estudos sobre a sua variabilidade genética, morfológica e patológica reforçando o programa de melhoramento genético da seringueira na Bahia.

28 MATERIAL E MÉTODOS Coletas As coletas foram realizadas no polo heveícola da Região Sul da Bahia que para facilitar o desenvolvimento do trabalho foi dividido em cinco sub-polos formados, por um ou mais municípios localizados próximos, onde haviam plantios de seringueira, sendo: SP1 - Ituberá/Igrapiúna, SP2 - Porto Seguro/Guaratinga/Eunápolis, SP3 - Itamarajú, SP4 - Uruçuca e SP5 Una (Figura1). Cinco fazendas em cada município foram visitadas durante os meses de fevereiro a setembro de 2011 e coletadas 30 amostras de folíolos infectados por fazenda (150 por sub-polo), aleatoriamente dentro do plantio utilizando o método de caminhamento em W e levando em consideração apenas as plantas que apresentavam sintomas em folhas jovens, aproximadamente no mesmo estádio de desenvolvimento. Coletou-se com podão amostras compostas (folíolos de vários ramos) por planta. Todos os pontos de coleta foram georefenciados. As amostras foram colocadas em sacos de papel, identificadas, armazenadas em caixa de isopor e transportadas para o laboratório de micologia do CEPEC para isolamento de M. ulei Obtenção dos isolados O isolamento foi realizado transferindo-se conídios presentes nas lesões em folíolos jovens, diretamente para placas de Petri com o meio MC8 [ágar 20g, sacarose 10g, batata 250g, cloranfenicol 0,15 g, KH 2 PO 4 2g, treonina 0,25mg (1µL de solução estoque), triptofano 0,25g (1µL de solução estoque) e cloridrato de lisina 10mg (1mL de solução estoque) e água para completar 1L], com o ph foi ajustado para 5±0,2 (JUNQUEIRA et al., 1984).

29 17 Municípios em que ocorreram as coletas Figura 1 - Localização dos sub-polos heveícolas do Estado da Bahia, onde foram coletados folíolos de seringueira infectados por Microcyclus ulei. Ituberá/Igrapiuna (SP1) Uruçuca (SP4) Una (SP5) Porto Seguro/Guaratinga Eunápolis (SP2) Itamarajú (SP3) Para todas as amostras foram utilizadas três placas com meio de cultura, cada uma delas com três pontos de transferência. Em seguida as placas foram incubadas à temperatura de 24 ºC em luz constante (Figura 2). Após o crescimento, fragmentos de 0,3 ± 0,1cm das bordas das colônias puras foram transferidos para tubos de ensaio com MC8 em quatro replicas por isolado, sendo levemente pressionados sobre uma perfuração feita no centro do meio para garantir a sua fixação. As placas foram mantidas em BOD á temperatura de 24ºC no escuro (Figura 3).

30 A B 18 C D Figura 2 - Isolamento de Microcyclus ulei: A - folíolo jovem com lesões conidiais; B - captura de conídios em uma lesão no folíolo; C - transferência de conídios para placa de Petri contendo o meio MC8; D - colônias após 12 dias de incubação. A B C D E F Figura 3 - Culturas de Microcyclus ulei: A-B colônias do fungo em placa e em tubo de ensaio; C-D repicagem para multiplicação do isolado; E- colônia original e repicada; F- armazenamento dos isolados em BOD a 24 ºC.

31 19 Para identificação dos isolados utilizaram-se códigos compostos de letras e números que indicam o local de plantio e a fazenda de onde foram isolados, assim, todos os isolados com a mesma letra e número foram obtidos do mesmo plantio, a exemplo dos isolados B4.24B e B4.1B, onde o número subsequente refere-se ao número da árvore que foi georeferenciada e de onde as amostras de folíolos infectados foram coletadas.

32 RESULTADOS Durante as coletas observou-se que o patógeno está disseminado nos sub-polos visitados, não sendo difícil encontrar plantas infectadas em todos eles. De 25 fazendas visitadas apenas em uma, conjunto Santa Rita, localizada no município de Itamarajú, não foram encontradas árvores com sintomas do mal-das-folhas. Era um seringal ainda não produtivo, com aproximadamente três anos de idade. O estádio de desenvolvimento da infecção nas plantas variou muito de local para local, o que impossibilitou as coletas em algumas fazendas no município de Eunápolis, pois as folhas já estavam no estágio de lixa. Nas amostras em que os folíolos não estavam no estágio inicial de infecção, fase conidial do patógeno, o procedimento de isolamento de M. ulei não obteve sucesso devido, principalmente, a contaminações. As colônias do patógeno começaram a ficar visíveis no meio de cultura entre oito e 20 dias do isolamento e quando estabelecidas eram transferidas para tubos de ensaio com MC8 para evitar o ressecamento do meio nas placas e também contaminações. Após 20 dias, não se notando crescimento nos pontos onde os conídios foram aderidos ao meio de cultura, as placas eram descartadas. Foram processadas 515 amostras procedentes dos diferentes locais de coleta que resultaram na obtenção de 132 isolados sendo: 14 no SP1 (Ituberá e Igrapiúna), 52 no SP2 (Porto Seguro, Guaratinga e Eunápolis), cinco no SP3 (Itamarajú), 45 no SP4 (Uruçuca) e 16 no SP5 (Una) (Tabela 1 e 2). O melhor aproveitamento das amostras registrou-se no SP2 (64,2%) e no SP4 (49,5%), demonstrando que o sucesso nos isolamentos depende da qualidade dos folíolos (jovens e com lesões novas) e da rapidez com que as amostras foram processadas. Para estes sub-polos o tempo entre a coleta e o processamento das amostras ficou entre 24 e 48 horas. Enquanto para os demais excedeu às 48 horas. Menores números de isolados foram obtidos em amostras processadas com mais de 48 h de coleta em função das contaminações, pois, embora acondicionados em sacos de papel e

33 21 Tabela 1 - Municípios, fazendas de onde foram coletados folíolos, números de amostras e isolados de Microcyclus ulei obtidos. Sub-polo Município Fazendas Total de amostra Total isolado Pinha 29 0 Primavera 14 8 SP1 Ituberá Lagoa Santa 26 1 Canta Galo 30 0 Morro Alto 29 5 Sub-total Porto Seguro Lucikátia 11 0 Guaratinga Nova Aurora 12 0 SP2 Porto Seguro Nascente 11 7 Eunápolis Bubalina Eunápolis Batalha 17 0 Sub-total Estância e Prata 30 3 Conjunto Amizade 26 2 SP3 Itamarajú 13 Pontos 11 0 Conjunto Santa Rita 1 0 Reserva Santa Helena 30 0 Sub-total 98 5 Sempre Viva 22 9 Dois de Ouro SP4 Uruçuca Reunidas Mucambo de Junho 14 7 Divisão Sub-total Bolandeira 12 2 Estação Experimental (CEPLAC) 30 2 SP5 Una Gislânia/Esmeralda 15 9 Piruna 30 2 Colônia Japonesa 30 1 Sub-total Total

34 22 Tabela 2 - Isolados de Microcyclus ulei obtidas para a Micoteca do CEPEC. (Continuação) Sup-polo Codificação S/W* Clone Tipo de plantio Nº da planta SP1 ITUB2.13A 13º º09.50 Desconhecido Comercial 2.13 SP1 ITUB2.14A 13º º09.47 Desconhecido Comercial 2.14 SP1 ITUB2.14B 13º º09.47 Desconhecido Comercial 2.14 SP1 ITUB2.5A 13º º09.55 Desconhecido Comercial 2.5 SP1 ITUB2.5B 13º º09.55 Desconhecido Comercial 2.5 SP1 ITUB2.5C 13º º09.55 Desconhecido Comercial 2.5 SP1 ITUB2.6A 13º º09.54 Desconhecido Comercial 2.6 SP1 ITUB2.6B 13º º09.54 Desconhecido Comercial 2.6 SP1 ITUB3.17A 13º º10.49 Desconhecido Comercial 3.17 SP1 ITUB5.11A 13º º16.37 IAM 717 Comercial 5.11 SP1 ITUB5.2A 13º º16.33 IAM 717 Comercial 5.2 SP1 ITUB5.2B 13º º16.33 IAM 717 Comercial 5.2 SP1 ITUB5.7A 13º º16.35 IAM 717 Comercial 5.7 SP1 ITUB5.7C 13º º16.35 IAM 717 Comercial 5.7 SP2 B4.10A 16º Fx 985 Comercial 4.10 SP2 B4.13C 16º Fx 985 Comercial 4.13 SP2 B4.13D 16º Fx 985 Comercial 4.13 SP2 B4.16A 16º Fx 985 Comercial 4.16 SP2 B4.17A 16º Fx 985 Comercial 4.17 SP2 B4.18A 16º Fx 985 Comercial 4.18 SP2 B4.19A 16º Fx 985 Comercial 4.19 SP2 B4.1A 16º RIMM 600 Comercial 4.1 SP2 B4.1B 16º RIMM 600 Comercial 4.1 SP2 B4.22A 16º Fx 985 Comercial 4.22 SP2 B4.23A 17º Fx 986 Comercial 4.24 SP2 B4.24A 16º Fx 985 Comercial 4.24 SP2 B4.24B 16º Fx 985 Comercial 4.24 SP2 B4.25A 16º Fx 985 Comercial 4.25 SP2 B4.25B 16º Fx 985 Comercial 4.25 SP2 B4.25C 16º Fx 985 Comercial 4.25 SP2 B4.26A 16º Fx 985 Comercial 4.26 SP2 B4.27A 16º Fx 985 Comercial 4.27 SP2 B4.28A 16º Fx 985 Comercial 4.28 SP2 B4.28B 16º Fx 985 Comercial 4.28 SP2 B4.28C 16º Fx 985 Comercial 4.28 SP2 B4.28D 16º Fx 985 Comercial 4.28 SP2 B4.29A 16º Fx 985 Comercial 4.29 SP2 B4.29A 16º Fx 985 Comercial 4.29 SP2 B4.29B 16º Fx 985 Comercial 4.29 SP2 B4.29C 16º Fx 985 Comercial 4.29 SP2 B4.29D 16º Fx 985 Comercial 4.29 SP2 B4.2A 16º RIMM 600 Comercial 4.2 SP2 B4.2B 16º RIMM 600 Comercial 4.2 *S/W =Sul/Oeste.

35 23 Tabela 2 - Isolados de Microcyclus ulei obtidas para a Micoteca do CEPEC. (continua) Sup-polo Codificação S/*W* Clone Tipo de plantio Nº da planta SP2 B4.30A 16º Fx 985 Comercial 4.30 SP2 B4.30B 16º Fx 985 Comercial 4.30 SP2 B4.49C 16º Fx 985 Comercial 4.9 SP2 B4.4A 16º RIMM 600 Comercial 4.4 SP2 B4.4B 16º RIMM 600 Comercial 4.4 SP2 B4.4C 16º RIMM 600 Comercial 4.4 SP2 B4.5A 16º Fx 985 Comercial 4.5 SP2 B4.5B 16º Fx 985 Comercial 4.5 SP2 B4.5C 16º Fx 985 Comercial 4.5 SP2 B4.8A 16º Fx 985 Comercial 4.8 SP2 B4.8B 16º Fx 985 Comercial 4.8 SP2 B4.9A 16º Fx 985 Comercial 4.9 SP2 B4.9B 16º Fx 985 Comercial 4.9 SP2 B4.9C 16º Fx 985 Comercial 4.9 SP2 B4.9D 16º Fx 985 Comercial 4.9 SP2 B4.9E 16º Fx 985 Comercial 4.9 SP2 N3.11A 16º º04.66 Desconhecido Comercial 3.11 SP2 N3.11B 16º º04.66 Desconhecido Comercial 3.11 SP2 N3.2A 16º º04.81 Desconhecido Jardim Clonal 3.2 SP2 N3.5A 16º º04.83 Desconhecido Jardim Clonal 3.5 SP2 N3.5B 16º º04.83 Desconhecido Jardim Clonal 3.5 SP2 N3.6A 16º º04.82 Desconhecido Jardim Clonal 3.6 SP2 N3.7A 16º º04.83 Desconhecido Jardim Clonal 3.7 SP3 ITA1.20A Desconhecido Jardim Clonal 1.20 SP3 ITA1.2A CDC 312 Jardim Clonal 1.2 SP3 ITA1.2B CDC 312 Jardim Clonal 1.2 SP3 ITA2.18A º48.35 Desconhecido Comercial 2.18 SP3 ITA2.2A º48.69 Pé franco Jardim Clonal 2.2 SP4 EXTRA 2A Desconhecido Comercial 2 SP4 EXTRA 2B Desconhecido Comercial 2 SP4 EXTRA 3A Desconhecido Comercial 3 SP4 EXTRA 5A Desconhecido Comercial 5 SP4 EXTRA 5B Desconhecido Comercial 5 SP4 EXTRA 5C Desconhecido Comercial 5 SP4 F1.14A Desconhecido Comercial 1.14 SP4 F1.14B Desconhecido Comercial 1.14 SP4 F1.16A Desconhecido Comercial 1.16 SP4 F1.2A Desconhecido Comercial 1.2 SP4 F1.2B Desconhecido Comercial 1.2 SP4 F1.2C Desconhecido Comercial 1.2 SP4 F1.3A Desconhecido Comercial 1.3 SP4 F1.3B Desconhecido Comercial 1.3 SP4 F1.5A Desconhecido Comercial 1.5 SP4 F2.15A Desconhecido Comercial 2.15 SP4 F2.15B Desconhecido Comercial 2.15 *S/W =Sul/Oeste.

36 24 Tabela 2 - Isolados de Microcyclus ulei obtidas para a Micoteca do CEPEC. Sup-polo Codificação S/W* Clone Tipo de plantio Nº da planta SP4 F2.16A Desconhecido Comercial 2.16 SP4 F2.18A Desconhecido Comercial 2.18 SP4 F2.18B Desconhecido Comercial 2.18 SP4 F2.20A Desconhecido Comercial 2.20 SP4 F2.22A Desconhecido Comercial 2.22 SP4 F2.22B Desconhecido Comercial 2.22 SP4 F2.23A Desconhecido Comercial 2.23 SP4 F2.23B Desconhecido Comercial 2.23 SP4 F2.23C Desconhecido Comercial 2.23 SP4 F2.30A Desconhecido Comercial 2.30 SP4 F1.16B Desconhecido Comercial 1.16 SP4 UR4.11A Desconhecido Comercial 4.11 SP4 UR4.13A Desconhecido Comercial 4.13 SP4 UR4.13B Desconhecido Comercial 4.13 SP4 UR4.1A Desconhecido Comercial 4.1 SP4 UR4.1B Desconhecido Comercial 4.1 SP4 UR4.5A Desconhecido Comercial 4.5 SP4 UR4.5B Desconhecido Comercial 4.5 SP4 UR5.10A Desconhecido Comercial 5.10 SP4 UR5.11A Desconhecido Comercial 5.11 SP4 UR5.12A Desconhecido Comercial 5.12 SP4 UR5.15A Desconhecido Comercial 5.15 SP4 UR5.16A Desconhecido Comercial 5.16 SP4 UR5.16B Desconhecido Comercial 5.16 SP4 UR5.2A Desconhecido Comercial 5.2 SP4 UR5.3A Desconhecido Comercial 5.3 SP4 UR5.3B Desconhecido Comercial 5.3 SP4 UR5.5A Desconhecido Comercial 5.5 SP5 UN1.26A 15º º03.17 Desconhecido Jardim Clonal 1.26 SP5 UN1.29A 15º º03.15 Desconhecido Jardim Clonal 1.29 SP5 UN3.13A 15º º04.54 Desconhecido Comercial 3.13 SP5 UN3.3A 15º º04.49 Desconhecido Comercial 3.3 SP5 UN5.27A 15º º10.54 Desconhecido Comercial 5.27 SP5 UN6.3A Pé franco Jardim Clonal 6.3 SP5 UN6.3B Pé franco Jardim Clonal 6.3 SP5 UN7.3A FDR 5788 Jardim Clonal 7.3 SP5 UN7.4A FDR 5788 Jardim Clonal 7.4 SP5 UN7.4B FDR 5788 Jardim Clonal 7.4 SP5 UN7.4C FDR 5788 Jardim Clonal 7.4 SP5 UN7.4E FDR 5788 Jardim Clonal 7.4 SP5 UN7.8A Pé franco Jardim Clonal 7.8 SP5 UN7.8B Pé franco Jardim Clonal 7.8 SP5 UN7.8C Pé franco Jardim Clonal 7.8 SP5 UNPA7A CDC 312 Jardim Clonal 7.1 *S/W =Sul/Oeste (conclusão)

37 25 mantidos em caixas de isopor, os folíolos liberavam umidade nos sacos possibilitando a formação de ambiente propício ao desenvolvimento de micélio de outros fungos presentes nas folhas ou de esporos que estavam no ar nos locais de coleta. Sugere-se que se faça o isolamento in loco nas próximas coletas em locais distantes. Quanto à ocorrência da doença, foi possível notar que o maior percentual de plantas com sintomas visuais foi observado no município de Ituberá, enquanto que em Una, este percentual foi duas vezes menor. Cento e trinta e duas culturas puras de M. ulei (Tabela 2) foram depositadas na micoteca do Cepec, representando, em parte, a diversidade da população do patógeno presente no pólo heveícola da Bahia.

38 DISCUSSÃO A formação de uma coleção contendo isolados de locais os mais diversificados possíveis dentro de uma região é um importante passo para a realização de estudos sobre a diversidade de qualquer patógeno. No caso específico da presente pesquisa se buscou obter isolados de Microcyclus ulei, importante patógeno da seringueira, visando viabilizar estudos futuros. Como a expressão dos sintomas do mal-das-folhas depende diretamente da idade dos folíolos e da suscetibilidade clonal, e o patógeno apresenta diferentes fases em seu ciclo de vida (GASPAROTTO et al.,1997), é necessário que, para realizar isolamento com sucesso, se tenha o cuidado de escolher no campo as folhas em estado adequado, tendo em vista os esporos que se pretende isolar. Em folíolos jovens, pós-caducifolismo, que foram infectados por ascósporos, inóculo primário para infecção nos seringais (HOLLIDAY, 1970), formam-se lesões levemente escurecidas de formato circular angular, que causam enrugamento no limbo. Geralmente nessas lesões é possível observar uma massa de conídios (Fusicladium macrosporum), verde-oliva ou cinza-escuro, com aspecto feltroso, muito fácil de diferenciar da fase de lixa, comumente encontrada em folíolos maduros que apresentam aspecto áspero devido aos estromas, onde se formam primeiro a fase espermogonial e, depois, a fase pseudotecial, com ascos e ascósporos. Utilizar a fase conidial para isolamento do patógeno, que consiste na transferência de conídios para meio de cultura em placa de Petri (isolamento direto) é essencial para a obtenção de maior número de isolados. O isolamento a partir de ascósporos é possível, porém, mais trabalhoso e demorado. Gasparotto et al., (1997), já afirmavam que o isolamento de M. ulei deve ser feito com folíolos novos, recém coletados, com lesões bem esporuladas e secas que estejam isentas de água de chuva, orvalho ou umidade proveniente de câmara úmida. Junqueira, et al., (1984) atestam que para obter maior porcentagem de germinação de conídios é recomendável que se faça a inoculação/isolamento em meio de cultura o mais rápido possível.

39 27 No presente trabalho foi notado que quanto mais rápido foi o processamento das amostras maior foi o sucesso na obtenção dos isolados, tendo ocorrido mais contaminações nas amostras provenientes dos sub-polos mais distantes da sede ou que demoraram mais de 48 horas para serem processadas. Por este motivo, recomenda-se que, na impossibilidade de processar rapidamente as amostras em laboratório, que o isolamento seja tentado no campo improvisando as condições assépticas e transportando binocular estereoscópica e placas com meio de cultura para o próprio local da coleta. O atraso no isolamento das amostras também pode causar perda na viabilidade dos conídios, embora, Holliday (1970), assegure que a habilidade de germinação dos conídios, não decresça mais que 50% após dois ou três dias, desde que os conídios secos não sejam expostos diretamente à luz, mesmo que de baixa intensidade. O autor afirma também que sob condição experimental, após 10 dias de deposição em uma lâmina de vidro, no escuro e sob temperatura moderada, acima de 25% dos conídios germinaram. As amostras coletadas neste trabalho permaneceram no escuro durante todo o período de transporte, porém estiveram expostas à luz durante o processo de seleção dos melhores folíolos e lesões para isolamento. Chee (1976) afirma que os conídios de M. ulei mantiveram-se viáveis por mais tempo quando as folhas com lesões foram mantidas em um dessecador. Esta precaução pode ser também adotada quando for necessário manter as folhas no laboratório até se ter certeza que a tentativa de isolamento resultou em sucesso, o que pode demorar cerca de 15 dias, conforme observado neste trabalho. As contaminações com outros fungos foram a principal causa do baixo número de isolados obtidos (Tabela 1). Microcyclus ulei cresce muito vagarosamente em meio de cultura, independentemente do tipo de meio e das variações de ph, temperatura e regime luminoso (HOLLIDAY, 1970; CHEE, 1978; LIEBERI et al., 1983; JUNQUEIRA et al.,1984). Foi observado que no município de Itamarajú, um seringal com plantas de cerca de três anos de idade não apresentava sintomas de mal-das-folhas. Como as seringueiras somente a partir do quarto ou quinto ano de idade apresentam o fenômeno anual de caducifolismo (GASPAROTTO et al., 1997), explica-se o fato observado pela ausência de folíolos jovens em quantidade suficiente para infecção, por conídios ou ascósporos provenientes de plantios adjacentes, uma vez que não existiam pseudotécios nas folhas de seringueira caídas ao solo até então. A coleção constituída pelos 132 isolados resultantes destas coletas e mais 41 disponibilizados por Plantações Michelin da Bahia, representa um importante acervo para

40 28 estudos com M. ulei no Sul da Bahia, pois, ela contém parte da diversidade da população deste fungo existente na região. Futuros estudos para detecção de raças fisiológicas visando resistência à doença, além de estudos epidemiológicos e fisiológicos, com este peculiar patógeno serão beneficiados pela existência dessa coleção de isolados de M. ulei.

41 29 4. CAPÍTULO 2 FORMAÇÃO DE COLEÇÃO E VARIABILIDADE MORFOMÉTRICA DE ISOLADOS DE Microcyclus ulei NA BAHIA RESUMO O fungo Microcyclus ulei é o agente do mal-das-folhas da seringueira, principal problema fitossanitário no pólo heveícola baiano. O presente trabalho visou através de coletas e isolamento i) formar uma coleção representativa da população de M. ulei do pólo heveícola Sul da Bahia e ii) avaliar a variabilidade morfométrica existente entre os isolados desta coleção. Folíolos jovens infectados foram coletados em cinco sub-polos heveícolas da Bahia correspondendo aos seguintes municípios: SP1 - Ituberá/Igrapiúna, SP2 - Porto Seguro/Guaratinga/Eunápolis, SP3 - Itamarajú, SP4 - Uruçuca e SP5 - Una. As amostras foram oriundas de cinco fazendas de cada sub-polo, sendo georeferen-ciadas 30 plantas/fazenda. No Laboratório de Micologia do CEPEC realizou-se o isolamento das amostras, transferindo-se conídios presentes nas lesões em folíolos, diretamente para placas de Petri com o meio de cultura MC8. A caracterização morfométrica de 134 isolados foi realizada em seis experimentos com cinco repetições conduzidos a 24º±1ºC e luz constante. Avaliou-se o diâmetro das colônias nos dois sentidos perpendiculares, tomados a cada cinco dias, a partir dos 15 até o quadragésimo dia de cultivo. Ao final de cada experimento, quantificou-se a esporulação no campo visual do microscópio (objetiva 40x), usando a seguinte escala convencional de conídios por campo: 0 - ausência, 1- menos de 30, 2 - entre 30 e 50 e 3 - acima de 50, sendo também mensurado o comprimento e a largura dos conídios. O peso seco das colônias foi aferido após a retirada do meio e secamento em estufa a 70 ºC por 24 h. Das 515 amostras processadas foram obtidos 132 isolados: 14 do SP1, 52 do SP2, 5 do SP3, 45 do SP4 e 16 do SP5. Maior sucesso nos isolamentos foi obtido das amostras dos SP2 (64,2%) e SP4 (49,5%), que eram compostas por folíolos jovens e com lesões novas e foram processadas 24 h depois da coleta. Menores números de isolados foram obtidos em amostras processadas com mais de 48 h de coleta em função, principalmente, das contaminações com outros fungos. O patógeno está amplamente disseminado no polo heveícola da Bahia tendo sido encontrado em Ituberá o maior percentual de plantas infectadas e em Una o menor Obteve-se assim, uma coleção representativa da diversidade do patógeno na região. Constatou-se ampla variabilidade morfométrica entre os isolados para as áreas de

42 30 colônias nos seis idades avaliadas e dimensões dos conídios que foram significativos em todos os experimentos, bem como para sub-polos de origem e municípios dentro do sub-polo. Isolados do SP3 desenvolveram as maiores e os do SP2 as menores colônias e com menores pesos secos. Estes podem ser indicativos da possível existência de variabilidade genética e patológica na população do patógeno. Palavras-chave: Hevea brasiliensis, seringueira, mal-das-folhas, diversidade do patógeno, caracterização morfométrica.

43 31 COLLECTION FORMATION AND MORPHOMETRIC VARIABILITY OF microcyclus ulei ISOLATES IN BAHIA ABSTRACT Microcyclus ulei is the causal agent of South American leaf blight (SALB) of the rubber tree, the main phytossanitary problem of the culture in South of Bahia. The present research aimed to collect and isolate M. ulei from rubber plantations of South Bahia in order to i) to obtain a culture collection that represents the pathogen population of that region; ii) to know the morphometric variability existing among the population. The rubber tree growing pole of South Bahia was divided in five sub-poles (SP) comprising the following municipalities: SP1 - Ituberá/Igrapiúna, SP2 - Porto Seguro/Guaratinga/Eunápolis, SP3 - Itamarajú, SP4 - Uruçuca and SP5 - Una. From each SP five farms were sampled and young leaflets infected by the fungus were collected from 30 georefered plants per farm. The isolations were done at the mycology laboratory of CEPEC transferring conidia from the leaf lesions directly to Petri dishes containing MC8 culture medium. Six experiments with five replications each were conducted under constant light and 24º±1ºC to perform the morphometric characterization of 134 isolates. The colonies diameter were evaluated in two perpendicular directions at each five days from the 15 th to the 40 th day of cultivation, when conidia length and width were measured as well as the sporulation through the following scale: 0- no spores; 1 less than 30 conidia; 2 between 30 and 50 conidia and 3 50 above conidia per microscope field. The dry weight of the colonies was measured after removal from the medium and drying at 70 C for 24 h. From 515 processed samples 132 isolates were obtained: 14 from SP1, 52 from SP2, 5 from SP3, 45 from SP4 and 16 from SP5. Better success on isolation were obtained from samples of SP2 (64.2%) and SP4 (49.5%) in which young leaflets with new lesions were collected and processed within 24 h. Smaller numbers of isolates were obtained from samples processed over 48 h of collection due mainly from contamination with other fungi. The pathogen is widespread in Bahia rubber tree plantations and the highest percentage of infected plants was observed in Itubera and lowest in Una. A culture collection was obtained with isolates representing the pathogen diversity in the region. It was observed wide morphometric variability among the 134 isolates in all six experiments for colonies sizes and conidia measurements. Significant variability was found also for sub-poles and municipalities inside sub-poles. The largest colonies were from isolates of SP3 and the smaller colonies with lower

44 32 dry weights from SP2. These may be indicatives that genetic and pathologic variability exists in the pathogen population. Keywords: Hevea brasiliensis, rubber tree, South American leaf blight, isolates diversity, morphometric characterization.

45 INTRODUÇÃO A seringueira [Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell. Arg.], embora atualmente não tenha a mesma relevância para o Brasil como já teve no passado, ainda é um cultivo importante no Sul da Bahia, onde a doença mal-das-folhas, causada pelo fungo Microcyclus ulei (P. Henn.) v. Arx, é o principal problema fitossanitário assim como para todas as regiões produtoras do país. Entre as doenças foliares da seringueira, o mal-das-folhas é a que mais causa danos. O patógeno provoca a redução da área foliar e, consequentemente, diminui a absorção de luz interferindo no processo de fotossíntese do qual depende toda a fisiologia da planta. Deste modo, M. ulei interfere na produção de látex e causa grande impacto na economia brasileira devido à redução da oferta de borracha natural (CAVALCANTE, 2006). O Brasil já foi o maior produtor e exportador de borracha natural, mas atualmente importa a maior parte do produto que consome (GONÇALVES et. al., 2001). A produção brasileira de borracha natural foi de 135,1 mil t em 2010 (IBGE, 2011). Após a expansão do plantio de seringueiras em São Paulo entre 1983 e 1992, houve uma baixa no preço da borracha natural em função da concorrência do produto asiático e o produtor brasileiro perdeu o interesse pela heveicultura. A partir de 2003, os plantios de seringueira voltaram a crescer em São Paulo, motivado pelo Plano de Expansão da Heveicultura Paulista dirigido pela Associação Paulista de Produtores e Beneficiadores de Borracha. O resultado desse investimento foi o crescente número de plantas em produção, que atingiu 20,34 milhões em 2009 (DALL ANTONIA et al., 2009). O fungo M. ulei possui elevada capacidade de variação que lhe permite adaptar-se a diferentes condições climáticas. Isso é um fato preocupante, por colocar em risco as áreas de cultivo recente, as chamadas zonas de escape, nas quais a cultura desenvolveu-se devido às condições de temperatura e umidade desfavoráveis à doença (MELO et al., 2008).

46 34 No Sul da Bahia, então considerada zona de escape do mal-das-folhas, a cultura se estabeleceu no inicio do século XX. Atualmente, no entanto, o patógeno está adaptado às condições climáticas dos diversos municípios produtores que compõem o polo heveícola da Bahia dentre eles, Porto Seguro, Guaratinga, Eunápolis, Igrapiúna, Ituberá, Itamarajú, Uruçuca e Una. Surtos do mal-das-folhas no sudeste da Bahia, no período de 2008 a 2010, comprovaram uma diferenciação da severidade da doença em função da localização topográfica do plantio, sendo sempre maior a desfolha ocasionada pelo M. ulei nas regiões de baixada (HONORATO JUNIOR, 2010). A ocorrência de epidemias do mal - das - folhas está diretamente relacionada à: fatores climáticos; virulência do patógeno; suscetibilidade e densidade de plantio do hospedeiro; disponibilidade de inóculo; localização topográfica do plantio e período de troca das folhas (GASPAROTTO, 1988). A seringueira em um determinado período do ano passa pelo fenômeno da perda natural das folhas para a renovação da copa. Após esse evento, com o lançamento de novos folíolos ocorre a infecção das folhas jovens pelo patógeno ocasionando a fase explosiva da doença e a queda repetida de novos folíolos num período que varia de 5 a 16 dias (JUNQUEIRA et al., 1988). A infecção pode ocorrer também em folhas maduras, que permanecem na planta, dando início à formação dos estromas do patógeno (estádio de lixa). Estas folhas infectadas passam a produzir ascósporos que, em condições de temperatura e umidade relativa favoráveis, dão inicio a novo ciclo da doença. A derruba sucessiva dos folíolos pode ocasionar a morte da planta (GASPAROTTO et al., 1997). Na superfície abaxial das folhas jovens as lesões apresentam revestimento fúngico de cor verde-oliva, cinzaesverdeado, ou escuro, com aspecto feltroso resultante da esporulação conidial de M. ulei (GASPAROTTO et al., 1997). O patógeno apresenta estádio pseudotecial (teleomorfo), espermogonial e conidial (anamórfico) (BRIGNANI NETO et al., 1991; SILVEIRA; FURTADO, 1995; BERGAMIN FILHO; AMORIM, A reprodução sexual confere a M. ulei alta variabilidade genética que dificulta o seu controle (BERGAMIN FILHO,1982). O conhecimento da variabilidade de M. ulei na região Sul da Bahia é importante para a seleção de materiais resistentes, que é a medida mais eficiente para o controle da doença. Este trabalho teve como objetivo conhecer a variabilidade morfométrica existente em 134 isolados de M. ulei do polo heveícola do Sul baiano para selecionar isolados a serem usados em testes futuros de avaliação da variabilidade patogênica e identificação de raças fisiológicas.

47 MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram desenvolvidos nas dependências do Laboratório de Micodiversidade do Centro de Pesquisa do Cacau (CEPEC) na sede da Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC), Ilhéus, BA. Foram avaliados 134 isolados de Microcyclus ulei da Micoteca do CEPEC, sendo 26 doados pela Michelin e 108 oriundos de diferentes fazendas produtoras localizadas em cinco sub-polos do polo heveícola do Sul da Bahia correspondendo cada um a um ou mais municípios localizados próximos, sendo: SP1 - Ituberá/Igrapiúna, SP2 - Porto Seguro/Guaratinga/Eunápolis, SP3 - Itamarajú, SP4 - Uruçuca e SP5 Una. A avaliação morfométrica dos isolados cultivados em MC8 com ph ajustado para 5±0,2 (JUNQUEIRA et al., 1984) foi realizada em seis experimentos (Tabela 1), todos com cinco repetições por isolado e incubados a 24 ºC com luz constante. As variáveis avaliadas foram: crescimento das colônias medindo o diâmetro em sentidos opostos, a ocorrência de crescimento externo (para cima) e interno ao meio (para baixo) e o peso seco das colônias no final do experimento. As mensurações do crescimento ocorreram de cinco em cinco dias, dos 15 aos 40 dias da repicagem, totalizando seis leituras. Para obtenção do peso seco as colônias foram retiradas do meio de cultura, ao final do experimento e colocadas em estufa a 70 ºC por 24 horas (Figura 1). O comprimento e largura das colônias medidos nos diferentes períodos de incubação foram transformados em área das colônias utilizando a formula A = π x C x L 2 onde: C = comprimento da colônia, L = largura da colônia. As áreas obtidas para cada período de incubação foram analisadas pelo procedimento de medidas repetidas (GLM-REPETEAD). Os efeitos de tempo e isolados foram comparados pelo teste Lambda de Wilks (p < 0,01). Utilizou-se a análise de variância multivariada (GLM-MANOVA), com as seis variáveis

48 36 acima mencionadas (áreas médias das colônias) e mais: crescimento externo e interno (considerado, quando positivo igual a 1 e quando negativo igual 0); e peso seco das colônias. Foram realizados os contrastes entre os isolados com o programa SAS (SAS INSTITUTE INC, 1988). Para quantificar a esporulação no campo visual do microscópico ótico usando objetiva de 40x a seguinte escala foi convencionada: 0 - ausência de conídios; 1- menos de 30 esporos por lâmina; 2 - entre 30 e 50 esporos por lâmina e 3 - acima de 50 esporos por lâmina. A B C D E F Figura 1 - Avaliação morfométrica das culturas de Microcyclus ulei: A-B repicagem das culturas em placas (cinco repetições), C - incubação em BOD a 24 ºC por 40 dias, D - montagem das lâminas com conídios, E - culturas após secagem na estufa a 70ºC/24 h e F- pesagem das colônias secas.

49 37 Tabela 1 - Isolados de Microcyclus ulei utilizados nos seis experimentos. Iso.* Sub./Ex.** Iso.* Sub./Ex.** Iso.* Sub./Ex.** Iso.* Sub./Ex.** Iso.* Sub./Ex.** Iso.* Sub./Ex.** Iso.* Sub./Ex.** B4.13D SP2/ I G38 SP1/ I B4.9C SP2/ II G37 SP1/ III ITUB5.11A SP1/ IV F1.3A SP4/ V F1.5A SP4/ VI B4.1B SP2/ I G40 SP1/ I B4.9D SP2/ II G60 SP1/ III ITUB5.2B SP1/ IV F2.15B SP4/ V F2.16A SP4/ VI B4.22A SP2/ I G5 SP1/ I G1 SP1/ II UN1.26A SP5/ III ITUB5.7B SP1/ IV F2.23C SP4/ V F2.18B SP4/ VI B4.24B SP2/ I G6 SP1/ I G19 SP1/ II UN1.29A SP5/ III UN3.13A SP5/ IV F2.30A SP4/ V F2.22A SP4/ VI B4.28A SP2/ I G8 SP1/ I G59 SP1/ II B4.26A SP2/ IV UR4.5A SP4/ IV ITA1.2A SP3/ V F2.23B SP4/ VI B4.28B SP2/ I N3.11B SP2/ I G7 SP1/ II B4.29D SP2/ IV UR5.10A SP4/ IV ITA2.18A SP3/ V ITA1.20A SP3/ VI B4.28C SP2/ I N3.7A SP2/ I N3.5B SP2/ II EXT2B SP4/ IV UR5.2A SP4/ IV ITA2.2A SP3/ V ITA1.2B SP3/ VI B4.2B SP2/ I B4.10A SP2/ II N3.6A SP2/ II F1.16A SP4/ IV UR5.3A SP4/ IV ITUB2.5C SP1/ V ITUB2.14 SP1/ VI B4.30B SP2/ I B4.18A SP2/ II B4.13C SP2/ III F1.2C SP4/ IV UR5.5A SP4/ IV ITUB2.6A SP1/ V ITUB2.5B SP1/ VI B4.9B SP2/ I B4.24A SP2/ II B4.17A SP2/ III F1.3A SP4/ IV B4.13C SP2/ V ITUB5.7C SP1/ V ITUB2.6B SP1/ VI B4.9E SP2/ I B4.25A SP2/ II B4.29B SP2/ III F1.5A SP4/ IV B4.25A SP2/ V UR4.5B SP4/ V ITUB5.2A SP1/ VI G11 SP1/ I B4.25B SP2/ II B4.4A SP2/ III F2.15A SP4/ IV B4.49C SP2/ V UR5.11A SP4/ V ITUB5.2B SP1/ VI G14 SP1/ I B4.25C SP2/ II B4.4C SP2/ III G10 SP1/ IV B4.4B SP2/ V UR5.3A SP4/ V UN3.13A SP5/ VI G17 SP1/ I B4.27A SP2/ II F2.22B SP2/ III ITUB2.13A SP1/ IV EXT3A SP4/ V UR5.16B SP4/ VI UR4.1A SP4/ VI G18 SP1/ I B4.29A SP2/ II G04 SP1/ III ITUB2.14A SP1/ IV EXT5A SP4/ V B4.28D SP2/ VI UR4.1B SP4/ VI G20 SP1/ I B4.29D SP2/ II G13 SP1/ III ITUB2.5A SP1/ IV EXT5B SP4/ V B4.4A SP2/ VI UR5.10A SP4/ VI G23 SP1/ I B4.5A SP2/ II G18 SP1/ III ITUB2.5B SP1/ IV EXT5C SP4/ V EXT2A SP4/ VI UR5.12A SP4/ VI G24 SP1/ I B4.5C SP2/ II G28 SP1/ III ITUB2.6A SP1/ IV F1.14A SP4/ V F1.16B SP4/ VI UR5.16A SP4/ VI G25 SP1/ I B4.8B SP2/ II G35 SP1/ III ITUB3.17A SP1/ IV F1.14B SP4/ V F1.2B SP4/ VI UR5.5A SP4/ VI G34 SP1/ I * Iso. = isolado **Sub./Ex. = sub-polo e número do experimento no qual o isolado foi avaliado.

50 RESULTADOS Experimentos I e II Em relação aos Experimentos I e II, o efeito de isolados foi altamente significativo, assim como a interação tempo (períodos de incubação avaliados) e isolado, o que pode ser observado pela variação das curvas de áreas dos isolados ao longo do tempo (Figuras 2 e 3). Houveram isolados que se destacaram apresentando curvas de crescimento continuo, enquanto outros apresentaram estabilidade de crescimento em alguns períodos seguido de ascensão nos subsequentes, além de diferenças na velocidade de crescimento. Estas variações podem ser melhor observadas na Tabela 3 para o Experimento I. Na primeira leitura, realizada 15 dias após a repicagem, observou-se as maiores áreas de colônias para os isolados G34, G11, G24 e G18. Na segunda leitura, aos 20 dias, embora estes quatro isolados ainda fossem os que apresentaram maiores colônias, ocorreram alternâncias na ordem dos mesmos com os isolados G11, G18 e G24, separando-se do isolado G34. Na terceira leitura aos 25 dias, G24 supera numericamente os demais, seguido de G18, G11 e G34. As posições novamente se invertem aos 30 dias, onde G18 supera os demais, seguido por G34, G24 e G11. Na quinta leitura G18 apresenta o maior valor para área de colônia, seguido por G38 (o segundo maior valor), G34, G11 e G24. Na sexta e última leitura, aos 40 dias, por ordem numérica dos valores vêm os isolados, G18, G34, G23, G38 e G24, nas primeiras posições. Ressalta-se que estas observações não se baseiam em diferenças estatísticas entre os isolados, mas apenas em ordem numérica. Para o Experimento II o isolado G59, da primeira até a última leitura destacou-se dos demais em áreas de colônias e, embora, a oscilação entre as áreas de colônia de uma leitura para outra também tenha ocorrido (Tabela 4 e Figura 3), os isolados que se destacaram dos demais, além de G59 foram sempre os mesmos: G19, G1, B4.5A, B4.25B e N3.6A.

51 39 B4.13D B4.1B Diâmetro médio das colônias (cm) 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Dias B4.22A B4.24B B4.28A B4.28B B4.28C B4.2B B4.30B B4.9B B4.9E N3.11B N3.7A G11 G14 G17 G18 G20 G23 G24 G25 G34 G38 G40 G5 G6 G8 Figura 2 - Curvas de áreas de colônias dos 27 isolados de Microcyclus ulei em meio MC8 avaliados entre 15 e 40 dias após incubação para o Experimento I. 3 B4.10A B4.18A Diâmetro médio das colônias(cm) 2,5 2 1,5 1 0,5 B4.24A B4.25A B4.25B B4.25C B4.27A B4.29A B4.29D B4.5A B4.5C B4.8B B4.9C B4.9D G1 G19 G59 0 G N3.5B Dias N3.6A Figura 3 - Curvas de áreas de colônias dos 20 isolados de Microcyclus ulei em meio MC8 avaliados entre 15 e 40 dias após incubação para o Experimento II.

52 40 Tabela 2 - Médias das áreas de colônias (cm) entre 15 e 40 dias de repicadas e pesos seco (g) dos isolados de Microcyclus ulei testados no Experimento I. Dias Isolado Peso Seco (g) N3.11B 0,432 0,554 0,624 0,852 1,025 1,206 0,100 N3.7A 0,314 0,407 0,540 0,672 0,867 0,971 0,038 B4.13D 0,331 0,430 0,506 0,518 0,591 0,752 0,026 B4.1B 0,441 0,481 0,570 0,587 0,631 0,842 0,020 B4.22A 0,432 0,526 0,635 0,710 0,768 0,847 0,041 B4.24B 0,336 0,419 0,553 0,586 0,641 0,790 0,032 B4.28A 0,341 0,372 0,465 0,504 0,533 0,594 0,033 B4.28B 0,283 0,396 0,479 0,534 0,565 0,675 0,051 B4.28C 0,253 0,332 0,403 0,491 0,538 0,638 0,029 B4.2B 0,256 0,324 0,407 0,445 0,482 0,576 0,016 B4.30B 0,245 0,364 0,390 0,423 0,434 0,470 0,025 B4.9B 0,229 0,286 0,314 0,335 0,347 0,401 0,017 B4.9E 0,256 0,457 0,594 0,710 0,870 1,018 0,046 G11 0,550 0,803 0,833 0,977 1,063 1,170 0,066 G14 0,330 0,374 0,429 0,478 0,540 0,565 0,013 G17 0,262 0,350 0,396 0,441 0,529 0,613 0,031 G18 0,496 0,748 0,875 1,049 1,211 1,436 0,061 G20 0,349 0,543 0,674 0,757 0,814 0,963 0,026 G23 0,371 0,545 0,729 0,842 0,937 1,364 0,041 G24 0,540 0,679 0,905 0,997 1,019 1,266 0,057 G25 0,322 0,394 0,489 0,478 0,569 0,636 0,022 G34 0,570 0,642 0,807 1,004 1,148 1,409 0,048 G38 0,292 0,506 0,696 0,961 1,186 1,327 0,058 G40 0,330 0,385 0,412 0,444 0,444 0,581 0,015 G5 0,344 0,492 0,630 0,873 0,974 1,090 0,050 G6 0,353 0,528 0,622 0,823 1,021 1,227 0,036 G8 0,363 0,430 0,517 0,624 0,697 0,762 0,043 DMS 0,211 0,291 0,395 0,431 0,48 0,534 0,045 Para os dois experimentos foram constatadas diferenças significativas pelo teste Lambda de Wilks (p < 0,01) entre sub-polos de coleta, e entre isolados e municípios dentro dos sub-polos (Tabela 3). Quanto ao crescimento para cima (externo ao meio) houve variação entre os isolados (Tabelas 3 e 4). Todos os isolados a exceção de G40 (Tabela 3), B4.10A e B4.8B (Tabela 4) apresentaram crescimento para o interior do meio, para baixo. As variações dentro dos sub-polos podem ser observadas nas Figuras 5 e 6.

53 41 Tabela 3 Comparação entre médias de áreas (cm) e peso seco (g) de colônias de isolados de Microcyclus ulei nos SP1 e SP2 da região Sul da Bahia de onde foram obtidos. Experimentos I e II. Exp.* Subpolo Peso Seco (g) Áreas de colônias**(cm)/dias I SP1 0,392 A 0,532 A 0,642 A 0,768 A 0,872 A 1,026 A 0,041 A SP2 0,319 B 0,409 B 0,497 B 0,564 B 0,634 B 0,748 B 0,035 A II SP1 0,601 A 0,793 A 1,011 A 1,115 A 1,364 A 1,624 A 0,043 A SP2 0,348 B 0,416 B 0,482 B 0,551 B 0,651 B 0,737 B 0,032 A *Exp. = Experimento **Medias em coluna seguidas da mesma letra não diferiram entre si quando comparadas pelo teste Tukey (p < 0,01). Tabela 4 - Médias das áreas de colônias entre 15 e 40 dias de repicadas e pesos seco dos isolados de Microcyclus ulei testados no Experimento II. Dias Isolado Peso Seco (g) B4.10A 0,284 0,313 0,333 0,358 0,408 0,429 0,013 B4.18A 0,245 0,281 0,331 0,39 0,396 0,47 0,018 B4.24A 0,303 0,328 0,445 0,492 0,542 0,581 0,024 B4.25A 0,25 0,264 0,335 0,368 0,438 0,54 0,077 B4.25B 0,47 0,598 0,608 0,787 0,948 1,062 0,041 B4.25C 0,267 0,322 0,388 0,474 0,784 0,613 0,028 B4.27A 0,385 0,503 0,591 0,699 0,729 0,79 0,024 B4.29A 0,305 0,357 0,459 0,565 0,652 0,732 0,031 B4.29D 0,245 0,264 0,273 0,314 0,357 0,427 0,011 B4.5A 0,54 0,746 0,846 0,995 1,084 1,304 0,057 B4.5C 0,393 0,503 0,628 0,749 0,866 1,008 0,037 B4.8B 0,314 0,363 0,43 0,49 0,573 0,666 0,02 B4.9C 0,289 0,339 0,371 0,413 0,553 0,674 0,02 B4.9D 0,313 0,396 0,407 0,44 0,584 0,763 0,032 G1 0,613 0,85 0,971 1,092 1,271 1,436 0,052 G19 0,622 0,837 1,137 1,255 1,462 1,876 0,041 G59 0,833 1,068 1,422 1,552 2,158 2,565 0,063 G7 0,338 0,416 0,514 0,562 0,565 0,62 0,018 N3.5B 0,477 0,538 0,624 0,738 0,833 1,011 0,036 N3.6A 0,529 0,65 0,737 0,785 0,935 1,043 0,048 DMS 0,254 0,289 0,358 0,432 0,581 0,61 0,076

54 42 Para a análise multivariada foram utilizadas as variáveis áreas de cultura para os seis tempos de avaliação, crescimento externo ou interno no meio de cultura (Figura 4: para cima (A) e para baixo (B)) e peso seco das colônias (Tabelas 6 e 4). Os valores de peso seco das colônias variaram entre 0,013g (isolado G14) e 0,1g (N3.11B) para o Experimento I (Tabela 3), notando-se que os isolados com maiores áreas de colônia não foram aqueles que numericamente obtiveram o maior valor de peso seco. No Experimento II as variações em peso seco dos isolados foram de 0,011 (B4.29D) a 0,063g (G59), tendo sido também o isolado G59 aquele que destacou-se em área de colônia. A B Figura 4: Colônias de Microcyclus ulei apresentando crescimento externo (A) e interno (B) ao meio de cultura MC8, aos 40 dias de incubação. Nos contrastes entre os isolados do Experimento I (Tabela 5) os isolados N3.11B e B4.9B foram significativamente diferentes de todos os demais isolados testados provenientes dos dois sub-polos. No entanto, todos os contrastes para o isolado N3.11B foram altamente significativos (p < 0,01) e para B4.9B contrastado com os isolados B4.28A, B4.28C, B4.2A, B4.30B e G17 a diferença foi (p < 0,05) de probabilidade. Entre os 13 isolados do SP2 testados neste experimento, apenas seis tiveram contrastes significativos com os demais isolados. Os dois isolados de Porto Seguro N3.11B e N3.7A tiveram comportamentos contrastantes, tendo diferido entre si, porém, N3.7A não diferiu estatisticamente dos isolados B4.22A, B4.24B e B4.9E do seu sub-polo e também de G17, G23, G38, G5, G6 e G8 do SP1. Entre os isolados de Eunápolis B4.9B também diferiu de todos os demais coletados no mesmo município. No SP1, dos 14 isolados testados destacaram-se dos demais G34, G11, G38, G24 e G18 que diferiram de todos os isolados do SP1 ( G11, G18, G34 ), bem como da

55 43 Diâmetro médio das colônias (cm) 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 A Dias G11 G14 G17 G18 G20 G23 G24 G25 G34 G38 G40 G5 G6 G8 Diâmetro médio das colônias (cm) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 B Dias B4.13D B4.1B B4.22A B4.24B B4.28A B4.28B B4.28C B4.2B B4.30B B4.9B B4.9E N3.11B N3.7A Figura 5: Curvas de áreas de colônias dos isolados de Microcyclus ulei do Experimento I em meio MC8 avaliados entre 15 e 40 dias após incubação para os dois sub-polos SP1 (A) e SP2 (B).

56 44 Diâmetro médio das colônias (cm) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 A G1 G19 G59 G7 Diâmetro médio das colônias (cm) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 B Dias B4.10A B4.18A B4.24A B4.25A B4.25B B4.25C B4.27A B4.29A B4.29D B4.5A B4.5C B4.8B B4.9C B4.9D N3.5B N3.6A Figura 6: Curvas de áreas de colônias dos isolados de Microcyclus ulei do Experimento II em meio MC8 avaliados entre 15 e 40 dias após incubação para os dois sub-polos SP1 (A) e SP2 (B). maioria daqueles que representaram, neste experimento, o SP2. Houve, portanto, ampla variação morfométrica entre os isolados testados entre e dentre os sub-polos SP1 e SP2 (Tabela 2). Comparando as Tabela 3 e 4, com a Figura 2 é possível observar que normalmente os isolados que se destacaram com maior número de contrastes significativos tiveram as maiores (G34, G38, G24, G18 e G11) ou as menores (B4.9B) áreas de colônias em relação aos demais.

57 45 Em relação aos contrastes entre os isolados do Experimento II constatou-se que G59 e G19 diferiram estatisticamente de todos os demais (p < 0,01), à exceção do isolado B4.5C (p < 0,05) sendo significativamente diferentes entre si (Tabela 6). Os quatro isolados procedentes de Igrapiúna G1, G19, G7 e G59 foram todos diferentes entre si (Figura 6A). Isto demonstra alta variabilidade para estes marcadores dentro do SP1 e também em relação aos isolados do SP2, testados no presente experimento. Entre os isolados do SP2, os que maior variabilidade apresentaram, em relação aos demais, foram B4.9D e B4.5A que também diferiram entre si (p < 0,05) (Tabela 6). Houve, portanto, variação também entre os isolados obtidos em Eunápolis. Quanto aos dois isolados de Porto Seguro, também pertencentes ao SP2, não diferiram entre si, porém, apresentaram diferenças em relação a isolados provenientes de Eunápolis (sete para N3.5B e oito para N3.6A, considerando os valores de 1 e 5% de probabilidade) bem como dos de Igrapiúna, pois ambos foram significativamente diferentes de G19, G59 e N3.6A. Apenas em relação ao isolado G1, também proveniente do município de Igrapiúna (SP1), estes isolados não diferiram estatisticamente. Nas Figuras 2 e 5, observa-se que os isolados G59, G19 e G1 para o SP1 (Figuras 3 e 6A) e B4.5A (Figura 6B) para SP2 com maior número de contrastes significativos, foram os que apresentaram maiores áreas de colônias distinguindo-se visualmente dos demais. Independente do experimento foi observado que todos os isolados apresentaram colônias com coloração escura, caracterizada por uma borda de coloração mais clara, denunciando a formação de hifas novas no movimento radial de expansão das colônias que tinham aspecto e consistência estromatosas. Os isolados G59 e G19, por exemplo, apresentaram halos de coloração esverdeada (Figura 7). Com o passar dos dias a coloração da superfície das colônias sofreu mudanças que corresponderam à formação da massa de esporos que tinha geralmente cor cinza, cinza esbranquiçado ou cinza esverdeado (Figura 8).

58 46 A B Figura 7 - Halo de coloração branca esverdeada em colônias de Microcyclus ulei. A isolado G59; B isolado G19. A B C D E F Figura 8 - Formação de massa de conídios de cor cinza (A, B) cinza esbranquiçada (C, D) ou cinza esverdeado (E, F) sobre as colônias de Microcyclus ulei em meio de cultura. O desenvolvimento desta massa esporulante ocorreu em diferentes épocas, sendo também um caráter de variação entre os isolados. Por exemplo, N3.11B, G5, G34, G18, G6,

59 47 G20, B4.1B, N3.11B, G24, B4.9E, G23 e G38 deram início a esta mudança de coloração aos 15 dias de incubação, enquanto para os demais isolados só ocorreu aos 25 ou 30 dias. No Experimento II G7, G19, B4.5A, B4.9C, B4.27A e B4.29D não esporularam durante todo o período de tomada de dados (40 dias). Supõe-se que estes isolados requerem mais tempo para esporulação. Os conídios dos isolados que esporularam tiveram o comprimento e largura determinados, medindo-se o maior número possível de esporos/isolado. No Experimento I as variações médias mínimas e máximas de comprimento e largura dos conídios foram 10,9 80,4 x 4,0 11,9 µm com médias de 22,63 46,97 x 6,0 7,8 µm. Houve variação no formato dos conídios. Apenas cinco isolados G6, G8, G18, G23 e G24 não apresentaram esporulação nota 3, que foi a predominante entre os isolados deste experimento (Tabela 7). No Experimento II as variações médias mínima e máxima de comprimento e largura foram 16,1 88,4 x 38 11,6 µm com médias de 30,98 55,48 x 5,43 7,72 µm. Houve grande variação no formato dos conídios (Figura 9). Os isolados com esporulação nota 3 foram: G1, G59, B4.5C, B4.24A, B4.25A, B4.29D, N3.5B e N3.6A (Tabela 8).

60 48 Tabela 5. Contrastes entre 27 isolados de M. ulei avaliados no Experimento I quanto aos sete critérios morfométricos de crescimento das colônias. SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP1 SP1 SP1 SP1 SP1 SP1 SP1 SP1 SP1 SP1 SP1 SP1 SP1 SP1 SP2 SP2 B B B B B B B B B B B G G G G G G G G G G G G G G N N 4.13D 4.1B 4.22A 4.24B 4.28A 4.28B 4.28C 4.2B 4.30B 4.9B 4.9E B 3.7A B4.13D ** * ** ** ** ** ** * ** ** * B4.1B ** ** ** ** ** * ** * ** ** ** ** ** * ** ** B4.22A * ** * * ** ** * * ** B4.24B ** ** ** * ** ** ** ** ** B4.28A * * ** ** * ** ** ** ** * ** ** * B4.28B ** ** ** * ** ** ** ** * ** ** * B4.28C * * ** ** ** ** ** ** ** * ** * B4.2B * * ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** * B4.30B * ** ** ** * ** ** ** ** ** ** ** ** ** B4.9B ** ** ** * ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** B4.9E ** ** ** ** * ** * ** ** * ** G11 ** ** ** * ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** G14 ** ** ** ** ** ** ** ** * G17 ** * ** ** ** ** * ** ** G18 ** ** * * ** * ** ** ** G20 ** ** ** ** * ** ** G23 ** * * ** * ** G24 ** * ** ** ** ** ** ** ** G25 ** ** ** ** ** * G34 ** ** ** ** ** ** ** G38 ** ** ** G40 ** ** * ** ** G5 * ** G6 * ** G8 * ** N3.11B ** N3.7A * Significativo a 5% de probabilidade, pelo teste Lambda de Wilks (1988) ** Significativo a 1% de probabilidade, pelo teste Lambda de Wilks (1988). SP2- Porto Seguro/Eunápolis/Guaratinga e SP1 Ituberá/Igrapiúna

61 49 Tabela 6. Contrastes entre 20 isolados de M. ulei avaliados no Experimento II quanto aos sete critérios morfométricos de crescimento das colônias. SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP2 SP1 SP1 SP1 SP1 SP2 SP2 B B B B B B B B B B B B B B G G G G N N 4.10A 4.18A 4.24A 4.25ª 4.25B 4.25C 4.27A 4.29A 4.29D 4.5A 4.5C 4.8B 4.9C 4.9D B 3.6A B4.10A ** ** ** * ** * * ** ** ** ** ** B4.18A * * ** ** * ** ** ** ** * ** B4.24A ** * ** ** * ** ** ** ** ** * ** B4.25A ** * * * ** * ** ** ** ** ** * * ** B4.25B ** * * ** * ** * ** ** ** B4.25C * ** * * ** ** ** * ** B4.27A * ** ** ** B4.29A ** ** ** ** B4.29D ** * * ** ** ** ** ** ** B4.5A ** ** * ** ** ** B4.5C * * * * B4.8B ** ** ** ** ** ** B4.9C ** ** ** * B4.9D ** ** ** ** G1 ** ** ** G19 ** ** ** ** G59 ** ** ** G7 * N3.5B N3.6A * Significativo a 5% de probabilidade, pelo teste Lambda de Wilks (1988) ** Significativo a 1% de probabilidade, pelo teste Lambda de Wilks (1988). SP2- Porto Seguro/Eunápolis/Guaratinga e SP1 Ituberá/Igrapiúna

62 Experimento III Houveram diferenças estatísticas entre isolados e sub-polos para o Experimento III em relação às seis medidas de área de colônia e também para peso seco das colônias (Tabela 9). Destacaram-se entre os isolados com maiores números de contrastes significativos G04 e G35 do SP1 que diferiram de 12 isolados e inclusive entre si, eles foram seguidos pelos isolados B4.13C, G28, UN1.26A e UN1.29A que diferiram cada um de 10 isolados, sendo o primeiro do SP2, o segundo SP1 e os dois últimos do SP5, levando em consideração indistintamente os valores de p < 0,05 e p < 0,01 (Tabela 10). Observando a Figura 10 destacam-se em primeiro plano, quatro isolados G35, G28, G04 e G60, seguidos de B4.13C, vindo logo em seguida UN1.26A e UN1.29A. Apenas G60 não aparece no grupo daqueles com maior número de contrastes significativos (sete isolados foram estatisticamente diferentes dele) justamente por não haver diferido de G35, G28 e G04. Três isolados deste experimento (G18, G28 e G35) não esporularam. Com relação à variação das dimensões dos conídios (Tabela 11), G37, G04, G60, B4.17A e G13 foram os que tiveram maior número de contrastes significativos que variou de 10 (G37) a 8 (B4.17A e G13). Estes isolados pertencem aos sub-polos SP1 e SP2, mostrando que também para este caráter os subpolos diferiram Experimento IV No Experimento IV foram testando 24 isolados dos sub-polos SP1, SP2, SP4 e SP5 que mostraram significância aos valores de F pelo teste Lambda de Wilks para isolados e também para sub-polos em relação a todas as variáveis à exceção do peso seco (Tabela 12). Analisando a Figura 11 observa-se além da variação entre as curvas de áreas de colônias que no ponto superior do gráfico aos 40 dias de cultivo destacaram-se pela ordem os isolados UR4.5A, ITUB5.11, UR5.5A e ITUB.52B. No ponto inferior, bem destacado dos demais, o isolado B4.29D, que foi significativamente diferente dos demais isolados, à exceção de B4.26A que foi obtido do SP2.

63 Figura 9 -Variação no formato dos conídios de Microcyclus ulei. Barra de escala é de 9 µm. 51