ESTUDO QUÍMICO E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE

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1 UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BIOLÓGICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR ESTUDO QUÍMICO E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia gracillis Schauer (VERBENACEAE) VANESSA DE CARVALHO NILO BITU CRATO, CE 2010

2 VANESSA DE CARVALHO NILO BITU ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia gracillis Schauer (VERBENACEAE) Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri- URCA, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioprospecção Molecular. Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Botelho Soares Co-orientador: Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa CRATO-CE 2010

3 VANESSA DE CARVALHO NILO BITU ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia gracillis Schauer (VERBENACEAE) Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri URCA, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioprospecção Molecular. Área de concentração: Bioprospecção de Produtos Naturais. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Marco Antonio Botelho Soares - Orientador Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará- IFET Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho-Avaliador Interno Universidade Regional do Cariri-URCA Prof. Dr. Flávio Furtado de Farias- Avalidor Externo Faculdade de Ciências Aplicadas Dr. Leão Sampaio FALS Prof. Dr. Irwin Rose de Alencar- Avalidor Interno Suplente Universidade Regional do Cariri-URCA

4 Aos pequenos Heron e Virna e ao grande Vinícius, por entenderem a minha jornada e não me permitirem culpa, enquanto eu construo degraus para que no futuro, eles cheguem mais longe... À Girlene Maria Frazão Neto, de alma gigante, amiga, secretária e anjo da guarda particular, por amar os meus filhos na minha ausência e ter suspendido os seus próprios sonhos enquanto eu realizava os meus...

5 AGRADECIMENTOS A Deus, que renova as minhas forças. À Mãe de Deus, que me conforta na lida. Ao meu pai José Alves Bitu (in memorian), extraordinário professor, pela herança desse ofício que me permite realização profissional e pessoal. Às minhas mães, Pipina (in memorian), Dededa e Dadinha, por saberem dividir e completar as missões inerentes à minha formação de forma tão orquestrada que eu não sei separar onde uma mãe começa e as outras terminam. Aos meus pedaços... Vinícius que me ajuda a superar limites, Virna que me ensina a ser forte e Heron Filho que me enche de carinho. Ao meu esposo Heron Canêjo por acreditar tanto que minhas lutas geram vitórias que eu me torno forte para corresponder às suas expectativas. Aos meus irmãos de útero, Vanuska e Vernon, primeiros companheiros de livros, com quem pude dividir projetos de amores, sonhos e brincadeiras. Às minhas irmãs por escolha, Tatianne Régia e Vanúzia, que desde a infância assumem as minhas lutas quando eu preciso descansar. Ao meu orientador Prof. Marco Botelho pela sua irreverência e prontidão que me fez produzir e aprender sem pressões, e por ter despertado em nós durante as suas aulas, a ludicidade construtiva tão esquecida no meio acadêmico atual. Ao meu co-orientador Prof. Galberto Martins, que eu admiro por saber dosar a simplicidade e a elegância do saber, mostrando que os verdadeiros títulos desabrocham de dentro para fora. À amiga Profa. Fabíola Rodrigues, eu jamais conseguiria agradecer em três linhas pela sua dedicação, paciência, disposição em ajudar e principalmente por ter despertado em mim o interesse por essa área do saber. Aos professores do corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Bioprospecção Molecular: Irwin, Henrique Douglas, Marta Almeida, Marta Regina, Imeuda, Diniz e Waltécio, que contribuíram para minha formação acadêmica; e à secretária Andecielle pelo carinho e por suas orações. Aos professores Álamo Feitosa e Francinete Brito, meus primeiros professores de Biologia, fantásticos na arte de encantar alunos e domar feras. Aos amigos professores Aracélio Colares, Karine Tako e João Marcos, pela infinita bondade e disposição de ajudar em todos os momentos.

6 À Profa. Sônia Izabel Romero de Souza por ter proporcionado tantas realizações na minha vida profissional. À amiga Profa. Lindaura Torres pela afetividade com que me acolhe e pelo rigor com que me corrige. Aos amigos do Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais LPPN: tanta gente boa! Eidla, Fábio, Samara, Stefânio, Natália, Thiago, Elenice, Carla (amiga do peito!) e Erlânio (que eu admiro tanto!). Aos amigos da Faculdade Leão Sampaio: Cícero Felipe, Sâmya, Florido, Cristiane, Jacinta, Gleice, Cintya, Allan, Ana Quésia, Karina, Sandra, Liége (in memoriam), Anaile, Damian, Nyrreyne, Diego, minha torcida fiel de monitores e alunos. Às amigas da FJN: Rosângela (de todas as horas), Maria do Socorro e Francilda. À Faculdade de Ciências Aplicadas Dr. Leão Sampaio, ao Departamento de Química da Universidade Federal do Piauí, à Fundação Oswaldo Cruz, ao CEFET do Juazeiro do Norte e ao Hospital Universitário da Universidade Federal da Paraíba, pelas contribuições para que esse estudo fosse realizado.

7 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE QUADROS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS RESUMO ABSTRACT 1 INTRODUÇÃO OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS REVISÃO BIBLIOGRÁFICA GÊNERO Lippia ESPÉCIE Lippia gracillis ÓLEOS ESSENCIAIS E SEUS CONSTITUINTES QUÍMICOS ATUALIZAÇÃO SOBRE AS PROPRIEDADES E CONSTITUINTES QUÍMICOS DE ESPÉCIES DO GÊNERO Lippia MATERIAL E MÉTODOS COLETA DO MATERIAL VEGETAL OBTENÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA SCREENING ANTIMICROBIANO POR DIFUSÃO EM CAVIDADES DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MODULADORA POR CONTATO DIRETO AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MODULADORA POR CONTATO A VAPOR ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS E DISCUSSÃO ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS EFEITOS DO HORÁRIO DE COLETA NA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia gracillis RESULTADOS DO SCREENING ANTIMICROBIANO...55

8 5.4 RESULTADOS DO SCREENING ANTIFÚNGICO RESULTADOS DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) PELO MÉTODO DA MICRODILUIÇÃO EFEITO MODULADOR POR CONTATO DIRETO EFEITO MODULADOR POR CONTATO A VAPOR CONCLUSÕES...64 REFERÊNCIAS...67

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Folhas de Lippia gracillis Schauer...18 Figura 2: Coleta das folhas de L. gracillis no Horto de Plantas Medicinais e Aromáticas do LPPN/ URCA...38 Figura 3: Aparelho tipo Clevenger da marca Químis...39 Figura 4: (A) Perfuração dos orifícios nas placas com meio de cultura; (B) Semeadura dos microorganismos nas placas...41 Figura 5: (A) Inoculação da suspensão bacteriana nos poços de microdiluição; (B) Placa de microdiluição...43 Figura 6: (A) Amicacina, Tobramicina e Gentamicina; (B) Utilização dos antibióticos aminoglicosídeos...45

10 LISTA DE QUADROS Quadro 1: Dados sobre espécies de Lippia abordando constituição química e atividades nos últimos dez anos...28 Quadro 2: Estruturas químicas de metabólitos secundários de espécies do gênero Lippia...33 Quadro 3: Estruturas químicas dos constituintes majoritários presentes nos óleos essenciais de folhas frescas e secas de L. gracillis Schauer...51

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Rendimento dos óleos essenciais de folhas frescas (OEFF) e secas (OEFS) de L. gracillis...47 Tabela 2: Composição química dos óleos eesenciais obtidos das folhas frescas (OEFF) e secas (OEFS) da L. gracillis (Schauer)...49 Tabela 3: Rendimento dos óleos essenciais das folhas frescas de L.gracillis em diferentes horários de coleta...52 Tabela 4: Composições químicas e percentuais dos componentes dos óleos essenciais de L. gracillis em diferentes horários de coleta, em um mesmo dia...54 Tabela 5: Atividade antibacteriana do óleo essencial de folhas frescas de L. gracillis Schauer, determinada pelo método de contato direto...56 Tabela 6: Atividade antibacteriana do óleo essencial de folhas secas de L. gracillis Schauer, determinada pelo método de contato direto...56 Tabela 7: Atividade antifúngica do óleo essencial da folha fresca (OEFF) de L gracillis Schauer, determinada pelo método de contato direto...58 Tabela 8: Concentração inibitória mínima (CIM) do óleo essencial das folhas frescas(oeff) e secas (OEFS) de L. gracillis...60 Tabela 9: Valores de concentração inibitória minima de aminiglicosídeos na presença e ausência do óleo essencial de L. gracillis obtido de folhas frescas (OEFF) por contato direto...61 Tabela 10: Valores das médias dos halos de inibição do crescimento bacteriano do OEFF por meio do contato a vapor...62 Tabela 11: Valores das médias dos halos de inibição do crescimento bacteriano do OEFS por meio do contato a vapor...62

12 LISTA DE ABREVIATURAS ANOVA- Análise de Variância ATCC- American Type Culture Collection BHI- Brain Heart Infusion Broth ºC- Grau Celsius ºC/min- Grau Celsius/min CG/EM- Cromatografia Gasosa acoplada a Espectometria de Massas CIM- Concentração Inibitória Mínima CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute cm/seg- Centímetro por segundo DMSO- Dimetilsulfóxido ev- Eletrovolt g- grama i.d.- Indicativo de densidade IR- Índice de Retenção kpa- Quilopascal m- Metro m/z- Relação massa/carga ml- Mililitro ml/min- Milímetro por minuto Na 2 SO 4 - Sulfato de sódio OEFF- Óleo essencial de folhas frescas OEFS- Óleo essencial de folhas secas PCA- Plate Count Agar PDA- Potato Dextrose Agar UFC/ ml- Unidade Formadora de Colônias por mililitro µg/ ml- Micrograma por mililitro µl- Microlitro µm- Micrômetro NCCLS- National Committee for Clinical Laboratory Standards

13 RESUMO A Lippia gracilis Schauer, Verbenaceae, é encontrada em regiões semi-áridas do Nordeste brasileiro, sendo conhecida popularmente como alecrim de tabuleiro ou alecrim da chapada. A parte medicinal da planta de onde é extraído o óleo essencial, corresponde às folhas e flores, sendo reconhecida a sua atividade antimicrobiana devido ao alto teor de timol e carvacrol. Essa pesquisa mostra o estudo da composição química e a investigação da atividade antimicrobiana do óleo essencial de L. gracillis, obtido a partir de folhas frescas e secas, avaliando a sua interferência sobre a atividade de alguns antimicrobianos de comprovada eficácia clínica. Foi realizado ainda um estudo quantitativo e qualitativo dos óleos essenciais dessa espécie obtidos a partir de diferentes horários de coleta O óleo essencial de L. gracillis foi extraído por hidrodestilação e a identificação dos seus componentes feita por cromatografia gasosa acoplada à espectrofotometria de massas. Os constituintes foram identificados no óleo essencial de folhas frescas (OEFF) e de folhas secas (OEFS) utilizados nos ensaios microbiológicos, sendo os majoritários o timol (44,42%; 21,3%), o carvacrol (22,21%; 20,85%), o α-pineno (6,23%; 19,42%) e o p-cimeno (5,65%; 8,58%).. A atividade antimicrobiana foi analisada utilizando bactérias Gram- positivas, Gram-negativas e fungos, sendo linhagens padrão e isolados clínicos. A avaliação da atividade antimicrobiana e moduladora da ação dos antibióticos aminoglicosídeos foi realizada pelos métodos de difusão na modalidade cavidades em ágar, da microdiluição em caldo e da modulação por contato direto e por contato a vapor. O screening antimicrobiano permitiu a observação da sensibilidade de bactérias e fungos aos óleos testados. Pelo método da microdiluição em caldo, foi observada a eficácia dos óleos testados frente às bactérias Gram-negativas e Grampositivas, tanto as de linhagem padrão quanto os isolados clínicos. Pelo método do contato direto, o OEFF apresenta-se como modificador da atividade dos antibióticos aminoglicosídeos, apresentando efeito sinérgico em algumas análises. Foi observada interferência variável na atividade antibiótica dependendo da bactéria testada e do aminoglicosídeo analisado pelo método do contato a vapor. Conclui-se que a L. gracillis representa uma alternativa para a indústria farmacêutica em sua busca por produtos naturais. Palavras-chave: Lippia gracillis, óleos essenciais, atividades antimicrobiana e moduladora.

14 ABSTRACT Lippia gracillis Schauer, Verbenaceae, is found in semi-arid regions of Brazil and is popularly known as rosemary or rosemary board the plain. The medicinal part of the plant where the essential oil is extracted, corresponds to the leaves and flowers, being recognized its antimicrobial activity due to the high content of thymol and carvacrol. This study presents the analysis of chemical composition and investigation of the antimicrobial activity of essential oil of L. gracillis, obtained from fresh and dried leaves, assessing their influence on the activity of some antimicrobial drugs of proven clinical efficacy. It been realized a quantitative and qualitative study yet of the essential oils of this species obtained from different collection times. The essential oils from L. gracillis was extracted by hydrodistillation and identification of its components by gas chromatography coupled to spectrophotometry in mass. The constituents were identified in the essential oil of fresh leaves (OEFF) and dried leaves (OEFS), being the majority thymol (44.42%, 21.3%), carvacrol (22.21%, 20.85%), the α-pinene (6.23%, 19.42%) and p-cymene (5.65%, 8.58%). The antimicrobial activity were analyzed using Gram-positive, Gram-negative and fungi, the standard strains and clinical isolates. The evaluation of antimicrobial activity and modulating the action of aminoglycoside antibiotics was performed by the methods of diffusion in the mode cavities in agar, broth microdilution and modulation by direct contact and by contact steam. The antimicrobial screening allowed the observation of the sensitivity of bacteria and fungi to the tested oils. For the broth microdilution method, we observed the efficacy of the oils tested against Gram-negative and Gram-positive, lineage both standard and clinical isolates. By the method of direct contact, the OEFF presents itself as a modifier of the activity of aminoglycoside antibiotics, showing a synergistic effect in some analysis. Interference was observed variable depending on the antibiotic activity of the bacteria tested and analyzed by the method of aminoglycoside contact steam. It is concluded that L. gracillis represents an alternative to the pharmaceutical industry in its quest for natural products. Key words: Lippia gracillis, essential oils, antimicrobial activity and modulation.

15 Não esmoreçam da luta, meus filhos. Deus sempre mostrará soluções para as crises e dificuldades. (José Alves Bitu, meu pai, in memorian)