TÍTULO: PARASITOLÓGICO DIRETO DA MEDULA ÓSSEA EM CÃES REAGENTES E NÃO REAGENTES PARA LEISHMANIOSE EM REGIÃO ENDÊMICA

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1 TÍTULO: PARASITOLÓGICO DIRETO DA MEDULA ÓSSEA EM CÃES REAGENTES E NÃO REAGENTES PARA LEISHMANIOSE EM REGIÃO ENDÊMICA CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: MEDICINA VETERINÁRIA INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS AUTOR(ES): LUNA DOS SANTOS GIRÃO, SALMI CANDIDO DAMAS JUNIOR ORIENTADOR(ES): LUCILANDIA MARIA BEZERRA, VERIDIANA M BRIANEZI DIGNANI DE MOURA

2 RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar quanto à presença de formas amastigotas de Leishmania e o grau de parasitismo em amostras citológicas de medula óssea (PAA- MO) de cães não reagentes e reagentes à leishmaniose aos testes RIFI e ELISA, a diferentes titulações, com enfoque em pacientes assintomáticos e oligossintomáticos. Foram utilizados 54 cães, sendo um sintomático, cinco oligossintomáticos e 48 assintomáticos. Do total, 28 cães apresentaram parasitológico direto negativo e sorológico não reagente, compondo o grupo controle (G1). Os animais reagentes positivos e negativos ao PAA-MO foram agrupados de acordo com a titulação aos testes ELISA e RIFI, em: G2- reagente 1/40 (n=7), G3- reagente 1/80 (n=5), G4- reagente 1/160 (n=2), G5- reagente 1/320 (n=4), G6- reagente 1/640 (n=3), G7- reagente 1/1280 (n=2), G8- reagente 1/2560 (n=2). O G9 referiu-se a não reagente e positivo ao parasitológico (n=1). Ainda, 16 animais reagentes à sorologia para leishmaniose apresentaram PAA-MO negativo, enquanto nove apresentaram o PAA-MO positivo. Conclui-se que cães assintomáticos e oligossintomáticos, reagentes a altas titulações para leishmaniose podem apresentar parasitismo da MO menor do que aqueles reagentes a baixas diluições, igualmente assintomáticos ou oligossintomáticos, confirmando o grande desafio de se diagnosticar e tomar decisões quanto a animais sob tais condições clínicas. Ainda, cães reagentes à sorologia para leishmaniose apresentam maior frequência de PAA- MO positivo em contraste àqueles não reagentes, no entanto, muitos cães reagentes apresentam PAA-MO negativo, reforçando a importância da realização de mais de um teste diagnóstico para a conclusão sobre a presença da doença em cães. INTRODUÇÃO A leishmaniose canina apresenta-se como grave problema de saúde pública e atualmente está presente em inúmeros países, inclusive o Brasil, onde o cão é figura como principal reservatório doméstico para a infecção humana. No Novo Mundo, o flebotomíneo Lutzomya longipalpis é o vetor biológico da doença, que tem como agente etiológico o protozoário Leishmania infantum. No cão, a enfermidade é grave e considerada zoonose de importância mundial (GALLEGO et al., 2009; ALBUQUERQUE et al., 2017).

3 A leishmaniose visceral canina (LVC) está associada ao rápido crescimento urbano. Foi descrita em áreas rurais no passado, mas seu ciclo epidemiológico expandiu para médias e grandes cidades, determinando a ocorrência também em seres humanos em decorrência de sua proximidade com canídeos domésticos. Assim, o cão vem sendo considerado o reservatório natural mais importante da enfermidade (FIGUEIREDO et al., 2010; FERNANDES et al., 2016). Outro fator importante é a imunidade contra o parasita, que consiste em relação direta com a resposta celular efetiva, onde altos níveis de imunoglobulinas contribuem para a piora da doença clínica no paciente. Dessa forma, em animais assintomáticos há evidências de uma forma de resistência da doença pelo aumento dos níveis de linfócitos T CD4+ e CD8+. Porém, sabe-se que a partir de proteínas de membrana, a Leishmania é capaz de evadir a resposta imune por supressão do desenvolvimento das células T (REIS et al., 2006; HOLOWKA et al., 2016). Há diversos fatores que levam à resistência ou suscetibilidade do animal à infecção, pois cada vez que o parasitismo se sobrepõe aos mecanismos de defesa celulares, a doença se manifesta de forma mais grave, determinando a morte do animal devido a lesões decorrentes da infecção em órgãos vitais. Diante disso, medidas de controle e decisões sobre a sobrevida dos pacientes acometidos pela doença se tornam tão difíceis (HOLOWKA et al., 2016). O Ministério da Saúde recomenda a eutanásia de animais soropositivos a partir da titulação 1/40, determinada pelo teste de imunofluorescência indireta (RIFI), e do ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) positivo em áreas endêmicas de LVC. Contudo, estudos comprovam a baixa especificidade dos testes, favorecendo resultados falsos positivos por meio de reações cruzadas com outros patógenos filogeneticamente semelhantes. Essa questão se torna mais delicada quando os animais são assintomáticos, com a negação dos proprietários em autorizar a eutanásia dos animais, e a comprovação da ineficiência dessa medida na redução dos casos da doença em humanos (FIGUEIREDO et al., 2010; BRASIL, 2011). OBJETIVOS Este estudo teve como objetivo avaliar quanto à presença de Leishmania e o grau de parasitismo em amostras citológicas de medula óssea de cães não

4 reagentes e reagentes para leishmaniose a diferentes titulações sorológicas aos testes RIFI e ELISA. METODOLOGIA E DESENVOLVIMENTO Esta pesquisa foi autorizada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Goiás, CEUA-UFG, sob registro número 82/15, e realizada com amostras de cães provenientes da cidade de Palmas, TO, região endêmica para LVC no Norte do Brasil (SECRETARIA MUNICIPAL DE SAÚDE, 2008). Foram utilizados 54 cães de diferentes raças e idades, sem tratamento prévio para leishmaniose. Destes, 48 eram assintomáticos (AS), já que não apresentavam qualquer sinal clínico de leishmaniose, cinco eram oligossintomáticos (OS), apresentando até três sinais clínicos característicos da doença, e um era sintomático (SIN), pois apresentava mais de três sinais clínicos de leishmaniose. A utilização dos cães nesta pesquisa ocorreu mediante autorização de seus proprietários, permanecendo os animais em seus domicílios. Os cães foram submetidos a exame clínico, assim como a punção aspirativa por agulha da medula óssea (PAA-MO), hemograma, pesquisa de hematozoários, ELISA e RIFI, como triagem. Para as avaliações propostas foram considerados os resultados referentes aos testes ELISA e RIFI e ao parasitológico direto da medula óssea (PAA-MO). A colheita de sangue para o exame sorológico foi realizada a partir das veias jugular, cefálica ou femural, utilizando agulha de 25x8 mm, acoplada a seringa de 10 ml, após assepsia local. Com uma amostra do sangue colhido foi preparado um esfregaço sanguíneo em lâminas de vidro com extremidade fosca, que foram coradas com Giemsa, visando a pesquisa de hematozoários. Outra amostra do sangue colhido foi depositada em tubo de ensaio com anticoagulante EDTA, seguindo-se a homogeneização e realização do hemograma. O restante da amostra foi depositado em tubo de ensaio sem anticoagulante, centrifugado a rpm, para a obtenção do soro, que foi acondicionado em recipiente específico, congelado e enviado ao Laboratório de Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ICBUFMG), para a realização dos testes ELISA e RIFI, de acordo com técnicas de rotina do daquele laboratório. A colheita das amostras de MO foi realizada após contenção física e química dos animais. A primeira foi realizada com o auxílio de um colaborador

5 treinado e de mordaças plásticas de uso veterinário; a segunda foi realizada com sedativo à base de cloridato de dextrocetamina (10g), tramadol (2g) e midazolan (1g), na dose de 5 mg/kg. Para a punção da medula óssea foi utilizada agulha 40x12 mm acoplada a uma seringa de 10 ml, sendo a colheita realizada no osso esterno (manúbrio), após assepsia com álcool 70% e bloqueio local com cloridato de lidocaína 2% na dose de 4mg/kg. Realizada a colheita, uma gota da amostra foi depositada em três lâminas de vidro (amostra em triplicata), seguindo-se a extensão dos esfregaços. Ato contínuo, as lâminas foram secas ao ar, fixadas com metanol e coradas com Giemsa. A avaliação das amostras foi realizada em microscópio óptico à objetiva de 100x para a pesquisa de formas amastigotas de Leishmania sp. A contagem parasitária nas amostras de PAA-MO foi realizada contandose as formas amastigotas de Leishmania sp a cada 1000 células, sendo atribuídos escores para designar o grau de parasitemia, considerando uma cruz (+) para a contagem de até 50 parasitos, duas cruzes (++) para a contagem entre 51 e 150 parasitos, e três cruzes (+++) para a contagem acima de 151 parasitos, seguindo critérios adaptados de REIS et al., Para a avaliação estatística foi realizada análise comparativa utilizando o teste qui-quadrado (X 2 ) para determinar o valor de P e avaliar quanto a diferença ou não entre os grupos de cães com sorologia negativa e positiva em relação ao resultado do teste PAA-MO. RESULTADOS Dos cães avaliados aos testes sorológicos ELISA e RIFI (n=54), 29 (53,7%) eram não reagentes e 25 (46,3%) reagentes. Dentre os 29 não reagentes, 28 (96,6%) eram negativos à PAA-MO (G1) e um (3,4%) positivo (G9). Já entre os 25 reagentes, 16 (64%) eram negativos e nove (36%) positivos à PAA-MO. Dentre os 25 cães reagentes observaram-se diferentes titulações ao RIFI, sendo os cães agrupados da seguinte forma: G2- reagente 1/40 (n=7), G3- reagente 1/80 (n=5), G4- reagente 1/160 (n=2), G5- reagente 1/320 (n=4), G6- reagente 1/640 (n=3), G7- reagente 1/1280 (n=2), G8- reagente 1/2560 (n=2). Quanto ao número de amastigotas de Leishmania sp a cada 1000 células nos dez cães PAA-MO positivos (um não reagente e nove reagentes), seis (60%) apresentaram baixo parasitismo (+), sendo um não reagente, dois à titulação 1/2560,

6 dois à titulação 1/320 e um à titulação 1/160). Por outro lado, dois cães (20%) apresentaram parasitismo intermediário (++), sendo um à titulação 1/1280 e outro à titulação 1/80), enquanto outros dois (20%) apresentaram alto parasitismo, com cão à titulação 1/1280 e um à 1/40. Constatou-se que animais reagentes a titulações altas, assintomáticos e oligossintomáticos, apresentaram baixo parasitismo, em contraste àqueles reagentes a titulações baixas e assintomáticos, que apresentaram médio e alto parasitismo. Também houve casos em que o animal apresentou alta titulação e alto parasitismo, assim como houve um animal não reagente, mas positivo à PAA-MO com baixo parasitismo. De modo geral, quando agrupados em não reagentes e reagentes para a identificação dos negativos e positivos ao teste parasitológico, obtiveram-se 16 cães negativos e nove positivos à PAA-MO e reagentes à sorologia; assim como 28 negativos e um positivo à PAA-MO e não reagentes à sorologia (Tabela 1). Tabela 1- Grupos não reagente e reagente para leishmaniose à sorologia em relação à positividade à PAA-MO SOROLOGIA PAA-MO + PAA-MO - Não reagente (-) N=1 N=28 Reagente (+) N=9 N=16 As amostras foram avaliadas em igualdade de proporções com correção de continuidade (correção de Yates), sendo constatada diferença entre os grupos não reagente e regente em relação à PAA-MO, quando aplicado o teste quiquadrado (X 2 -squared=7,3943, gl=1, p=0,006543). Dessa forma, cães reagentes (+) apresentam maior frequência relativa de PAAF positivo quando comparados àqueles não reagentes, no entanto, há cães com sorologia reagente e PAA-MO negativos. CONSIDERAÇÕES FINAIS Diante da importância que os cães desempenham no ciclo epidemiológico da LVC, é consenso entre os pesquisadores interessados a busca da comprovação efetiva da sensibilidade e especificidade dos testes utilizados para o diagnóstico da

7 doença (REIS et al., 2006). O exame parasitológico direto possui sensibilidade influenciada por fatores como densidade parasitária e tipo de material colhido; no entanto, detecta formas amastigotas da leishmania, que confirma a infecção pela visualização do parasito em lâmina por microscopia direta, não deixando dúvidas com relação a sua especificidade (SILVA et al., 2013; BUTTLAR et al., 2015). Além disso, tem um custo baixo, é rápido de se realizar, e pode ser utilizado como ferramenta na confirmação da doença, embora os resultados negativos não sejam seguros no controle da doença. Sabe-se que este método não exclui a importância de se realizar testes sorológicos, sendo interessante a utilização dos dois exames como forma de diagnosticar a leishmaniose visceral canina, especialmente em animais assintomáticos que podem apresentar resultados negativos no parasitológico direto (SILVA et al., 2013). Em relação ao diagnóstico sorológico, sabe-se que é amplamente utilizado e, apesar de muitas vezes o animal apresentar resposta imune humoral (resposta Th2) com a produção de imunoglobulinas (IgG) específicas de forma intensa em áreas endêmicas, não há, nesse contexto, definição da taxa de infecção pela Leishmania. Assim, unicamente a presença de anticorpos contra a enfermidade não é sinal conclusivo da doença (BANETH et al., 2008; GALLEGO et al., 2009). A importância de se realizar mais de um teste diagnóstico para leishmaniose também está relacionada a fatores que podem interferir no resultado dos exames sorológicos, os quais podem apresentar sensibilidade a anticorpos de outras doenças, definindo reações cruzadas com outros patógenos filogeneticamente semelhantes, como o Trypanosoma cruzi e Erlichia canis. Dessa forma, é necessária a alta sensibilidade e especificidade dos testes utilizados para diagnóstico, para evitar falso-negativos e falsos-positivos (SANTOS et al., 2017). Em relação à resposta imune do tipo celular determinada pela resposta de células mononucleares do sangue periférico de animais sintomáticos, essas parecem falhar ao desenvolver resposta contra antígenos de leishmania. No entanto, a imunidade protetora está associada a uma resposta proliferativa eficaz dessas células, acompanhada da produção de IFN-y e TNF-alfa, que são citocinas necessárias para a ativação de macrófagos e eliminação de parasitas intracelulares (MAIA e CAMPINO, 2008). As células T CD4+ reconhecem os antígenos apresentados pelas células apresentadoras de antígenos, desencadeando resposta humoral, com a ativação de

8 linfócitos B. Já as células T CD8+ estão associadas com citotoxicidade (SANCHES et al., 2004) e possuem importância na resposta imune efetiva, ligadas com a forma assintomática da doença (GIUNCHETTI et al., 2008; BUTTLAR et al., 2015). Portanto, pode-se inferir que altos níveis de anticorpos circulantes associamse à presença da infecção e à forma clínica da doença, sendo ineficiente como protetora na leishmaniose visceral canina (SANCHEZ et al., 2004; REIS et al., 2006). Essa definição da resposta imune humoral é aplicada a animais oligossintomáticos que apresentaram grandes títulos de anticorpos ao teste RIFI. Com relação à resposta imune celular, segundo REIS et al., (2006), a carga parasitária na MO está relacionada às alterações fenotípicas encontradas em leucócitos no sangue periférico, que está intimamente ligada ao estado clínico em que o animal se encontra (MAIA & CAMPINO, 2008). Porém, neste estudo observou-se que animais assintomáticos e oligossintomáticos reagentes a altas titulações apresentaram baixo parasitismo no exame parasitológico direto, em contraste aos animais com baixa reatividade e parasitismo acentuado. Já de acordo com os estudos descritos por REIS (2009), animais assintomáticos geralmente possuem baixo parasitismo, e animais sintomáticos possuem alto parasitismo. Embora a técnica utilizada neste estudo tenha sido mais pelo exame direto em lâmina com células da medula óssea, os resultados demonstraram que todos os animais oligossintomáticos apresentaram baixo parasitismo, com reatividade alta ao RIFI, assim como seis animais assintomáticos reagentes e positivos no parasitológico direto, dos quais, um apresentou alto parasitismo, dois parasitismo intermediário, e três baixo parasitismo. É imperativo citar a possibilidade de ocorrer reação cruzada com outros patógenos nos animais com alta titulação, por apresentarem carga parasitária baixa (SANTOS et al., 2009), ou serem falso-negativos. Neste estudo, 16 animais do total de 27 soropositivos apresentaram PAA-MO negativo. Dessa forma, como relatado por REIS et al., (2014), a possibilidade de serem falso-positivos no teste sorológico também não pode ser descartada. Um grande número de testes sorológicos, parasitológicos e moleculares vem sendo desenvolvidos e estudados, bem como a comparação entre esses para se definir a melhor forma de diagnosticar a leishmaniose visceral canina. Conclui-se que cães assintomáticos e oligossintomáticos reagentes a altas titulações para leishmaniose podem apresentar parasitismo da medula óssea

9 menor do que aqueles reagentes a baixas diluições, igualmente assintomáticos ou oligossintomáticos, confirmando o grande desafio de se diagnosticar e tomar decisões quanto a animais sob tais condições clínicas. Ainda, cães reagentes à sorologia para leishmaniose apresentam maior frequência de PAA-MO positivo em contraste àqueles não reagentes, no entanto, muitos cães reagentes apresentam PAA-MO negativo, reforçando a importância da realização de mais de um teste diagnóstico para a conclusão sobre a presença da doença em cães. FONTES CONSULTADAS 1. ALBUQUERQUE A, CAMPINO L, CARDOSO L, CORTEZ S. Evaluation of four molecular methods to detect Leishmania infection in dogs. Parasites and Vector, v.10, n.1, p.2-5, BANETH G, KOUTINAS A, GALLEGO L, BOURDEAU P, FERRER L. Canine leishmaniosis: new concepts and insights on an expanding zoonosis. Trends in Parasitology, v.24, n.7, p , BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Vigilância em Saúde. Brasília- DF: 2º edição BUTTLAR H.V, BISMARK D, ALBER G. Peripheral canine CD4+ CD8+ doublepositive T cells- unique amongst others. Vet Immunol Immunopathol, v.168, p , FERNANDES F.R.A, PIMENTA M.L.R.C, VIDAL F.I, OLIVEIRA C.G, SARTORI S.R, ARAÚJO B.R. Risk factors associated with seropositivity for Leishmania spp. and Trypanosoma cruzi in dogs in the state of Paraiba, Brazil. Rev Bras Parasitol Vet, v.25, n.1, p.90-98, FIGUEIREDO F.B, MADEIRA M.F, NASCIMENTO L.D, ABRANTES T.R, MOUTACONFORT E, PASSOS S.R.L. Canine visceral leishmaniasis: study of methods for the detection of IgG in serum and eluate samples. Rev Inst Med Trop, v.52, n.4, p GALLEGO L, KOUTINAS B, MIRÓ G, CARDOSO L, PENNISI G, FERRER L, BOURDEAU P, OLIVA G, BANETH G. Directions for the diagnosis, clinical staging, treatment and prevention of canine leishmaniosis. Veterinary Parasitology, v.165, n.1-2, p.1-18, GIUNCHETTI, R.C.; MARTINS-FILHO, A.; CARNEIRO, C.M.; MAYRINK, W.; MARQUES, M.J.; TAFURI, W.I.; et al. Histopathology, parasite density and cell phenotypes of the popliteal lymph node in canine visceral leishmaniosis. Vet Immunol Immunopathol, v.121, n.1-2, p.23-33, HOLOWKA TOMAS, CASTILHO M.T, GARCIA B.A, SUN T, MCMAHONPRATT D, BUCALA R. Leishmania-encoded orthologs of macrophage migration inhibitory factor regulate host immunity to promote parasite persistence. The FASEB Journal, v.30, n.6, p , 2016.

10 10. MAIA C, CAMPINO L. Methods for diagnosis of canine leishmaniasis and immune response to infection. Veterinary Parasitology, v.158, n.4, p , MONTEIRO E.M. França da Silva JC, Da Costa TR, Costa DC, Barata RA, Paula EV et al. Leishmaniose visceral: estudo de flebotomíneos e infecção canina em Montes Claros, Minas Gerais. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.38, n.2, p , REIS A.B, CARVALHO-TEIXEIRA A, GIUNCHETII R.C, ROATT B.M, VITAL W.C, NICOLATO R.C, et al. Cellular immunophenotypic profile in the splenic compartment during canine visceral leishmaniasis. Vet Immun Immunopathol, v.157, n.3-4, p , REIS A.B, CARVALHO-TEIXEIRA A, VALE A.M, MARQUES J.M, GIUNCHETTI R.C, MAYRINK W, et al. Isotype patterns of immunoglobulins: Hallmarks for clinical status and tissue parasite density in brazilian dogs naturally infected by leishmania (leishmania) chagasi. Vet Immun Immunopathol, v.112, n.3-4, p , REIS A.B, MARTINS FILHO O.A, CARVALHO T.A, CARVALHO M.G, MAYRINK W, SILVA F.J.C et al. Parasite density and impaired biochemical/hematological status are associated with severe clinical aspects of canine visceral leishmaniasis. Rev Vet Sci, v.81, n.1, p.68-75, REIS A.B, MARTINS-FILHO O.A, CARVALHO A.T, GIUNCHETTI R.C, CARNEIRO C.M, MAYRINK W, et al. Systemic and compartmentalized immune response in canine visceral leishmaniasis. Vet Immun Immunopathol, v.128, n.1-3, p.87-95, SANCHEZ M.A, DIAS N.L, ZERPA O, NEGRON E, J CONVIT, TAPIA F.J. Organspecific imunity in canine visceral leishmanisis: analysis of symptomatic and asymptomatic dogs naturally infected with leishmania chagasi. Am J Trop Med Hyg, v.70, p , SANTOS H.D, GALVÃO R.S, DIAS F.E.F, RIBEIRO T.M.P, FILHO O.N, SOUSA S.A.P, MINHARTO S. High frequency of visceral leishmaniasis in dogs under veterinary clinical care in an intense transmission area in the state of Tocantins, Brazil. Ciência Rural, v.47, n.3, p.1-6, SECRETARIA MUNICIPAL de SAÚDE, SESAU/SINAN Centro de Controle e Zoonoses. Relatório de dados sobre Leishmaniose Visceral (Dados não publicados). Palmas - TO. 19. SILVA D.A, MADEIRA M.F, ABRANTES T.R, FIGUEIREDO F.B. Assessment of serological tests for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Vet J, v.195, n.2, p , 2013.