Poliidroxialcanoatos: biopoliésteres produzidos a partir de fontes renováveis

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1 Poliidroxialcanoatos: biopoliésteres produzidos a partir de fontes renováveis FORMOLO, M. C. 1 DUARTE, M. A. T. 2 ; SCHNEIDER, A. L. 1 ; FURLAN, S. A. 1 ; *PEZZIN, A. P. T. 1 1 Laboratório de Biotecnologia Universidade da Região de Joinville UNIVILLE Campus Universitário, s/n. o Bom Retiro Caixa Postal 246 CEP Joinville SC Brasil 2 Centro de Ciências Tecnológicas UDESC Caixa Postal 631 CEP Joinville SC Brasil * paulapezzin@univille.edu.br Entrada: Aceite: Resumo: Desde o início do século passado, o uso de plásticos tem se tornado cada vez mais freqüente na sociedade. Basta olhar ao redor para perceber a incrível quantidade de artefatos produzidos pelo homem que utiliza polímeros como matéria-prima. Infelizmente, esse fato os transforma em um grande problema ambiental. A maior parte desses artefatos é descartada muito rapidamente, gerando um sério impacto ambiental, pois os plásticos convencionais levam cerca de meio milênio para serem degradados. Somente na cidade de Joinville, recolhem-se diariamente 600 toneladas de lixo, e essa produção cresce 6% ao ano. A quantidade de lixo plástico é estimada em cerca de 30% desse valor. Alternativamente, os polímeros biodegradáveis vêm sendo pesquisados, despertando grande interesse, pois possuem propriedades similares aos plásticos convencionais (de origem petroquímica), além da vantagem de serem degradados no solo pela ação de microrganismos em questão de poucos meses, sendo totalmente transformados em água e gás carbônico. Uma classe de polímeros bacterianos que vem se destacando são os poliidroxialcanoatos (PHAs), que são produzidos e acumulados como reserva de energia por inúmeras bactérias, na forma de grânulos localizados no interior das células. O acúmulo de polímero na forma de grânulos geralmente ocorre quando existe excesso de fonte de carbono e limitação de algum nutriente essencial à multiplicação das bactérias. Trata-se de uma síntese que ocorre em duas etapas. Na primeira procura-se favorecer ao máximo o crescimento celular e assegurar, ao mesmo tempo, que a síntese do polímero seja a menor possível. Inversamente, na segunda etapa, interrompe-se o crescimento celular e estimula-se o acúmulo de polímero nas células. O poli(3-hidroxibutirato), P(3HB), é um poliéster pertencente à classe dos PHAs produzido principalmente pela bactéria Ralstonia eutropha, que apresenta características termoplásticas semelhantes ao polipropileno. Este trabalho tem como proposta a revisão sobre a biossíntese de PHAs. Palavras-chave: poliidroxialcanoatos; polímero biodegradável. Abstract: Since the beginning of the last century, use of plastics has increased and become each time more frequent in the society. It can be noticed by the incredible quantity of artifacts produced by men that use polymers as raw materials. Unfortunately, these same quantities turn into an environmental problem. Most of these artifacts is disposed very rapidly, generating a serious environmental impact, due to the fact that the conventional plastics take about half millenium to be degraded. Only in the city of Joinville, 600 tons of garbage are collected daily, and this production grows 6% per year. The estimated quantity of plastic waste is around 30% of this amount. Alternatively, biodegradable polymers are being studied and attracting great interest, because they hold similar properties to the conventional plastics (originated from petroleum). They also have the advantage of being degraded in the soil by the action of microorganisms in some months, being totally transformed in water and carbonic gas. One class of bacterial polymers that has been standing out is the polyhydroxyalkanoates (PHAs), that are produced and accumulated as energy reserve for several bacteria, in the form of granules located in the interior of the cells. The accumulation of polymer in the form of granules usually occurs when there is an excess of carbon source and limitation of some essential nutrient for the bacteria growth. It is a synthesis that occurs in two phases. In the first phase the cellular growth is favored at the maximum and, at the same time, as low as possible production of polymer must be assured. On the other hand, in the second phase the cellular growth is interrupted and the accumulation of polymer in the cells is stimulated. The poly(3-hydroxybutyrate), P(3HB), is a polyester which belongs to the PHAs family and is produced mainly by the Ralstonia eutropha bacteria. This polymer presents thermoplastic characteristics similar to polypropylene. Keywords: polyhydroxyalkanoates; biodegradable polymer. Introdução A família dos poliésteres microbiológicos, classificada como poli(hidroxialcanoatos) (PHAs), tem recebido considerável atenção graças ao uso potencial desses polímeros como termoplásticos ambientalmente amigáveis (DOI, 1990, apud MARANGONI, 2000). Os PHAs constituem uma classe geral de polímeros 14

2 Revista Saúde e Ambiente / Health and Environment Journal, v. 4, n. 2, dez. 03 produzidos e acumulados como reserva de carbono e energia por inúmeros microrganismos (JENDROSSEK et al., 1996). São poliésteres alifáticos formados por carbono, hidrogênio e oxigênio, cuja fórmula geral é mostrada na figura 1. Figura 1 Fórmula geral dos PHAs A composição da cadeia lateral ou átomo R e o valor de χ determinam juntos a identidade da unidade monomérica (LEE, 1996). Uma grande variedade de microrganismos é capaz de acumular poli(hidroxialcanoatos). A estrutura da cadeia lateral pode ser modificada pela escolha do microrganismo e do substrato de carbono. Os PHAs são armazenados na forma de grânulos pelas bactérias, como se observa na figura 2. Figura 2 Grânulos de polímero biodegradável do P(3HB) no interior das bactérias (BRAUNEGG et al., 1998) A observação em microscópio desses grânulos em células bacterianas foi feita por Beijerink em 1888 (BRAUNEGG et al., 1998), enquanto a primeira determinação da composição do PHA foi realizada somente em 1927 por Lemoigne, um microbiologista do Instituto Pasteur em Paris (DOI, 1990, apud MARANGONI, 2000). Ao observar um bacilo semelhante ao Bacillus megaterium, Lemoigne notou que este degradava anaerobicamente e excretava ácido 3-hidroxibutírico. Esse poliéster foi identificado como poli(3-hidroxibutirato), (P(3HB)) (LEMOIGNE, 1925). Em 1958, Macrae e Wildinson (apud Braunegg et al., 1998) observaram que Bacillus megaterium acumulava o polímero, especialmente quando a razão glicose/nitrogênio no meio era elevada. Eles também observaram que esse material era degradado rapidamente na ausência de fontes externas de carbono e energia, concluindo que o P(3HB) era uma forma de reserva de carbono e energia. Durante os 30 anos subseqüentes, o interesse no P(3HB) ficou restrito somente à pesquisa de métodos de estimativa do conteúdo das células e sobre as condições de cultivo que permitem a síntese e degradação do polímero dentro das células do bacilo. Entretanto, nas últimas décadas, dezenas de ácidos hidroxialcanóicos foram identificadas (STEINBÜCHEL e VALENTIM, 1995). Hoje, aproximadamente 150 diferentes ácidos hidroxialcanóicos são conhecidos. Somente a partir da década de 70, a Imperial Chemical Industries (ICI), uma companhia inglesa, iniciou pesquisas e patentes para a produção de PHAs por intermédio de diversos processos (MARANGONI, 2000). Essa mesma indústria criou um copolímero poli(3-hidroxibutirato)-co-(3- hidroxivalerato), P(3HB-co-3HV), que era sintetizado por Alcaligenes eutrophus (hoje, Ralstonia eutropha) a partir de glicose e ácido propiônico. Desde então, uma variedade de copolímeros tem sido produzida por Ralstonia eutropha e outros microrganismos através de várias fontes de carbono (LEE e CHANG, 1995). Como produto do cultivo microbiano, obtém-se um polímero totalmente natural e biodegradável que, lançado no meio ambiente, sofre a ação de microrganismos, podendo ser degradado completamente em CO 2 e H 2 O. A degradação é ainda mais rápida se o material for depositado no solo, onde existe maior concentração de bactérias e fungos, tanto aeróbios quanto anaeróbios (JUSTI, 1991). É interessante ressaltar que, dentro da célula, o polímero permanece em um estado amorfo e não-cristalino, e quando o polímero é extraído uma rápida cristalização ocorre e altos níveis de cristalinidade são desenvolvidos. Alguns autores tentam explicar esse fenômeno pela cinética do mecanismo de nucleação (BONTHRONE et al., 1992). Isso implica que os grânulos do polímero dentro da célula são muito pequenos, de modo que a probabilidade de a nucleação dar início à cristalização é muito baixa. Apenas quando a célula é rompida e os grânulos podem coalescer, uma rápida nucleação heterogênea se torna possível. 15

3 Poliidroxialcanoatos: biopoliésteres produzidos a partir de fontes renováveis As aplicações dos PHAs em geral estão diretamente ligadas às propriedades específicas desses polímeros. Todos os PHAs compartilham algumas propriedades que os recomendam para determinadas aplicações e os tornam interessantes para a indústria. Eles são termoplásticos e/ou elastoméricos, insolúveis em água, não-tóxicos, biocompatíveis, exibem propriedades piezelétricas, como revelado para o P(3HB) e para o P(3HB-co-3HV). Tais aplicações incluem desde artigos de higiene e saúde até embalagens (REHM e REED, 1988). O P(3HB) e blendas de P(3HB) com poli(ε-caprolactona) foram estudados por nosso grupo para aplicação em embalagens de produtos agrícolas no transporte de pequenas mudas, por exemplo (VOGELSANGER et al., 2002). Ainda que os PHAs tenham considerável potencial na produção de artigos de primeira necessidade, como por exemplo para o uso em embalagens de alimentos com baixa difusão de oxigênio (BYROM, 1987; WEBB e BROWN, apud REHM e REED, 1988), muitos estudos para aplicações nos campos médico e farmacêutico também têm sido realizados, particularmente na confecção de cápsulas para liberação controlada de drogas de uso humano e agrícola (fertilizantes e pesticidas) e como próteses e enxertos de tecidos humanos e veterinários (REHM e REED, 1988), suporte para engenharia de tecido (WILLIAMS et al., 1999), entre outros. O elevado grau de cristalinidade com grandes esferulitos e a alta fragilidade do P(3HB), além da desvantagem econômica e temperatura de processamento limitada, restringem suas aplicações. A fim de obter um material com melhores características, o P(3HB) pode ser modificado ou podem-se preparar misturas físicas com outros polímeros que sejam também biodegradáveis, resultando numa maior gama de aplicações (VOGELSANGER et al., 2003). O P(3HB) apresenta características similares ao polipropileno (PP). A tabela 1 compara as principais características dos dois polímeros. Ambos fundem a temperaturas muito próximas, 180 o C para o P(3HB) e 174 o C para o PP. Os valores de temperatura de transição vítrea (Tg) dos dois polímeros indicam que o PP, por possuir Tg = -17 C, mostra-se mais flexível que o P(3HB) (Tg = 5 o C). A maior flexibilidade do PP em relação ao P(3HB) é confirmada pelo módulo de elasticidade do PP (1700 MPa), que é bem inferior ao do P(3HB) (3500 MPa). No entanto ambos os polímeros apresentam alto grau de cristalinidade (FORMOLO et al., 2003). O grau de cristalinidade e a temperatura de fusão podem ser reduzidos por incorporação de outros hidroxialcanoatos dentro da cadeia do P(3HB), como o 3-hidroxivalerato (3HV), para formar o copolímero P(3HB-co-3HV) via fermentação (ORTS et al., 1991). Bloembergen et al. (1986) observaram um decréscimo na taxa de cristalização com o aumento da quantidade de 3HV. A variação do conteúdo de 3HV permite obter uma grande variedade de propriedades termomecânicas. O módulo de Young do P(3HB) decresce consideravelmente com o teor de 3HV, indicando que a adição de 3HV aumenta de forma significativa a flexibilidade do copolímero. Industrialmente, o P(3HB-co-3HV) com até 24% de 3HV produzido pela bactéria Ralstonia eutropha é comercializado com o nome de Biopol pela Monsanto. Tabela 1 Comparação entre as principais características do P(3HB) e do PP isotático (GOMES e BUENO NETTO, 1997) Características P(3HB) (PP) O O Temperatura de fusão 180 C 174 C Temperatura de transição vítrea (Tg) o 5 C O -17 C Densidade g/cm 3 0,91 g/cm 3 Grau de cristalinidade 70% 68% Permeabilidade de oxigênio 45(cm 3 /m 2 /at/dia) 1700 (cm 3 /m 2 /at/dia) Módulo de elasticidade (Módulo de 3500MPa 1700MPa Young) Tensão de cisalhamento 40MPa 38MPa Resistência à ruptura 5% 400% Massa molar ,

4 Revista Saúde e Ambiente / Health and Environment Journal, v. 4, n. 2, dez. 03 Além dos copolímeros, muitos estudos estão em andamento a fim de melhorar as propriedades físicas do P(3HB), como obtenção de blendas com outros polímeros biodegradáveis, tais como ésteres celulósicos, poli(ε-caprolactona) (PCL) (VOGELSANGER et al., 2003; KUMAGAI e DOI, 1992) e amido (ABE e DOI, 1999). O propósito das blendas não é somente para melhorar propriedades inferiores do P(3HB), mas também para controlar o perfil de biodegradação (KUMAGAI e DOI, 1992). No Brasil, o desenvolvimento de tecnologia para obtenção do plástico biodegradável começou em 1991, por meio de um acordo de cooperação entre o Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT), de São Paulo, a Cooperativa dos Produtores de Cana, Açúcar e Álcool do Estado de São Paulo (Copersucar) e o Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. Em 1996, começou a funcionar a fábrica piloto, em Serrana. Em 1997, a Copersucar estabeleceu parceria com diversos processadores de plásticos e instituições de pesquisa e desenvolvimento, no Brasil e no exterior, com o propósito de desenvolver aplicações comerciais do P(3HB) e viabilizar sua produção comercial em larga escala. O interesse da indústria em viabilizar a produção de polímeros biodegradáveis em escala industrial pode ser constatado pelos investimentos em plantas para esse fim. Na Inglaterra, a Imperial Chemical Industries (ICI) lançou, em 1983, a produção do Biopol, nome comercial de um dos polímeros biodegradáveis mais comercializados, inicialmente produzido a partir do açúcar de beterraba em instalação de 50 t/ano. Posteriormente, em 1992, a planta foi ampliada para 300 t/ano, e já em 1995 o custo do polímero no mercado era de US$ 15,00/kg. A Monsanto (formalmente Zeneca Bio Products), sucessora da ICI, a partir de 1993, aumentou a produção do Biopol para 600 t/ano. Hoje a Zeneca produz o polímero a cerca de US$ 10 a 12,00/kg. No Brasil, a Copersucar produz o polímero a partir do açúcar da cana por cerca de US$ 5,00/kg em instalação de 50 t/ano, custo esse significativamente inferior ao concorrente internacional, pois já existe tecnologia na produção de derivados de cana-de-açúcar, matériaprima abundante no Brasil. Apesar de esse valor ser quatro vezes superior ao dos plásticos convencionais, como o poli(cloreto de vinila), o polipropileno e o polietileno, é competitivo quando comparado aos termoplásticos de Engenharia, tais como o copolímero de estireno e acrilonitrila (SAN), o poli(tereftalato de butila) (PBT), entre outros. Mas isso pode ser revertido no futuro com a redução de custos por intermédio do aumento da escala de produção (ganhos em escala). Microrganismos produtores Os microrganismos capazes de acumular PHAs são geralmente bactérias gram-positivas e gramnegativas, existindo mais de 75 gêneros diferentes (REDDY et al., 2003). De um modo geral, as bactérias produtoras de PHAs podem ser divididas em dois grupos, de acordo com as características de acúmulo de PHA (LEE, 1996; LEE e CHANG, 1995). O primeiro grupo de bactérias começa a acumular PHA quando o crescimento celular é interrompido pela limitação de algum nutriente essencial, como N, P, Mg, K, O ou S, e na presença de excesso de carbono. O segundo grupo produz PHA de forma associada ao crescimento. A bactéria Ralstonia eutropha pertence ao primeiro grupo, enquanto Alcaligenes latus, Azotobacter beijerinckii e Escherichia coli recombinante pertencem ao segundo. De qualquer forma, é importante desenvolver uma estratégia adequada de fermentação para cada um desses microrganismos para conseguir alta produtividade de PHA. Para a cultura de bactérias que acumulam PHA sob condição limitante de nutriente, o método de cultura em batelada em duas etapas tem sido largamente empregado. Para os produtores de PHA associados ao crescimento, utiliza-se a estratégia de alimentação ótima de nutriente, a qual atende tanto à fase de crescimento celular quanto à fase de acúmulo de PHA (LEE, 1996). É desejável que as cepas tenham velocidade específica de crescimento e de produção de PHA elevados, que possam utilizar substratos de baixo custo, apresentem uma porcentagem elevada de polímero em relação à massa total seca e, finalmente, é importante que haja um fator de conversão de substrato em polímero bastante elevado (RAMSAY et al., 1990). As bactérias que apresentam as características mais favoráveis para a produção industrial são Azotobacter sp, Methylobaterium sp e Ralstonia eutropha (BYROM, 1987), essencialmente em razão da variedade de substratos que elas podem utilizar. Além disso existe também a possibilidade da utilização de genes recombinantes em Escherichia coli (LEE, 1996) ou em plantas transgênicas para a produção de PHAs (BYROM, 1992). 17

5 Poliidroxialcanoatos: biopoliésteres produzidos a partir de fontes renováveis Alguns dos microrganismos produtores de PHAs são citados a seguir. Ralstonia eutropha Ralstonia eutropha, anteriormente denominada de Hidrogenomonas eutropha e depois de Alcaligenes eutrophus, é um microrganismo procariótico, do tipo gram-negativo, encontrado naturalmente no solo e água. Essa espécie possui células na forma de bastonete, é móvel, tendo de 1 a 4 flagelos peritríquios. As células podem tornar-se esféricas na fase estacionária de crescimento (MARANGONI, 2000). Essa bactéria produz um polímero de alta massa molar, utilizando uma variedade de compostos orgânicos como única fonte de carbono, entre os quais estão incluídos glicose (espécie mutante), frutose, formiato, acetato, propionato, lactato, glutamato, succinato, fenobenzoato, entre outros. Pode crescer autotroficamente em atmosfera de gases H 2, O 2 e CO 2 (TANAKA et al., 1994). R. eutropha é capaz de crescer em condições de quimiolitoautotrofia ou heterotrofia (REUTZ et al., 1982). A quimiolitoautotrofia é a capacidade de os microrganismos utilizarem os compostos inorgânicos como doadores de elétrons e o dióxido de carbono como fonte de carbono. A heterotrofia é a capacidade de utilizar compostos orgânicos como fonte de carbono e energia (DOELLE, 1975, apud MARANGONI, 2000). Os PHAs sintetizados por R. eutropha contêm monômeros de 3-hidroxivalerato (3HV), 3- hidroxibutirato (3HB), 4-hidroxibutirato (4HB), 5- hidroxivalerato (5HV) quando ácido valérico ou propiônico são fornecidos (REE et al., 1992). É o microrganismo mais atraente para a produção industrial. Ele pode acumular mais de 80% de sua massa celular em P(3HB) com alta massa molar e utilizar diferentes tipos de substratos (BYROM, 1987) como a glicose ou a frutose, o soro de leite fermentado e os açúcares invertidos de cana-de-açúcar (RAMSAY et al., 1990). A produção de PHAs por Ralstonia eutropha é conduzida em duas fases: uma de crescimento, sem condição limitante, objetivando a geração de biomassa, e outra com limitação de algum nutriente, favorecendo o acúmulo de polímero de acordo com a fonte de carbono oferecida (DOI et al., 1992). A síntese de P(3HB) e de P(3HB-co-3HV) normalmente ocorre quando há excesso de fonte de carbono e energia disponível e limitação de pelo menos um nutriente necessário à multiplicação das células bacterianas (N, P, Mg, Fe) (GOMES e BUENO NETTO, 1997). Alcaligenes latus Alcaligenes latus tem sido considerada uma boa candidata para produção de P(3HB), porque é capaz de utilizar diferentes substratos de carbono, como por exemplo a sacarose, com uma velocidade específica de crescimento elevada. Trabalhando em condições não limitantes, Yamane et al. (1996) obtiveram menos de 50% de polímero em biomassa. Ao contrário, trabalhando sob limitação de nitrogênio, Wang e Lee (1997) conseguiram um conteúdo de P(3HB) em biomassa de 88%. A desvantagem dessa cepa é a sua sensibilidade aos precursores utilizados para a produção do copolímero P(3HB-co-3HV), ou seja, o crescimento de A. latus é completamente inibido em presença de ácido propiônico na concentração de 0.5 g.l-1 (BRAUNEGG et al., 1995; RAMSAY et al., 1990). Bactérias do gênero Pseudomonas De Smet et al. (apud ANDERSON e DAWES, 1990) observaram a presença de grânulos intracelulares de P(3HB) em P. oleovorans. Subseqüentemente, descobriu-se que, ao alimentar P. oleovorans com n- octano, havia a produção de um polímero contendo 3- hidroxioctanoato e 3-hidroxiexanoato em maior e menor quantidade, respectivamente, demonstrando que P. oleovorans não sintetiza somente P(3HB) (LAGEVEEN et al., 1988). Haywood et al. (1988, apud ANDERSON e DAWES, 1990) examinaram várias espécies de Pseudomonas. O acúmulo de polímero foi demonstrado em P. aeruginosa, P. putida, P. fluorensces e P. testosteroni em extensa variedade de substratos. Escherichia coli Existem inúmeros relatos do emprego de E. coli recombinante para a produção de vários biopolímeros, principalmente proteínas. Os genes da biossíntese de PHA de Ralstonia eutropha foram clonados em E. coli por três grupos independentes em 1988 e Esses 18

6 Revista Saúde e Ambiente / Health and Environment Journal, v. 4, n. 2, dez. 03 genes foram seqüenciados e caracterizados em detalhes (SCHUBERT et al., 1988). O uso de E. coli recombinante para a biossíntese de PHAs é atrativo, e essa bactéria é capaz de acumular cerca de 90% de sua biomassa em polímero (LEE e CHANG, 1995). Além disso, E. coli pode utilizar várias fontes de carbono, o que permite a produção de P(3HB) a partir de matérias-primas de custo reduzido (MARANGONI, 2000). Existem relatos de culturas com alta densidade celular de E. coli recombinante e não recombinante. O maior problema do emprego de E. coli recombinante em culturas de alta densidade celular é a necessidade de oxigênio purificado, o que eleva os custos de produção do polímero (LEE e CHANG, 1995). Azotobacter sp Azotobacter sp foi a primeira bactéria escolhida para a síntese industrial de P(3HB). Mas foi rejeitada por produzir, paralelamente ao P(3HB), um polissacarídeo, tornando o processo de difícil controle (BYROM, 1987). Os organismos metilotróficos foram estudados por Bourque et al. (1992), considerando o metanol um substrato interessante, por ser de custo relativamente baixo e de fácil manuseio. Entretanto, Byrom (1992) afirma que o processo de produção é lento, gera baixa quantidade de polímero, com baixa massa molar, e a extração é difícil. Outras bactérias, incluindo Rhodococcus, Corynebacterium e Nocardia, produzem o copolímero P(3HB-co-3HV) utilizando somente a glicose como única fonte de carbono. Rhodococcus sp produz quantidades substanciais de poli(3-hidroxivalerato), poliéster também produzido por Ralstonia eutropha (ANDERSON e DAWES, 1990). Conclusão Nos últimos anos, as pesquisas relacionadas com a biossíntese de poliidroxialcanoatos (PHAs) giraram em torno do conhecimento dos mecanismos de armazenamento, da cinética e do metabolismo das culturas microbianas. A capacidade máxima de armazenamento do PHA e a taxa de produção dependem do substrato utilizado e das estratégias de síntese. Fatores como o uso de substratos puros elevam o custo de produção desses biopolímeros. Entretanto uma perspectiva otimista e uso de culturas mistas e substratos baratos como resíduos da agricultura podem reduzir o custo de produção dos PHAs em mais de 50%. Aliado a isso, a pesquisa de novas aplicações industriais contribui para o aumento da produção do polímero, tornando seu preço final mais competitivo. Referências bibliográficas e outras fontes de pesquisa ABE H, DOY Y (1999). Structural effects on enzymatic degradabilities for poly[r-3-hydroxybutyric acid] and its copolymers. Int. J. of Biol. Macromol., 25: ANDERSON A J, DAWES E A (1990). Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev., 54: BLOEMBERGEN S D A, HOLDEN G K, HAMER T L B, ROBERT H (1986). Studied of composition and cristallinity of bacterial poly(ß-hydroxybutyrate-co-ß-hydroxyvalerate). Macromolecules, 19: BONTHRONE K M, CLAUSS J, HOROWITZ D M, HUNTER B K, SANDERS J K (1992). The biological and physical chemistry of polyhydroxyalkanoates as seen by NMR spectroscopy. FEMS Microbiol. Rev., 103: BOURQUE D, OUELLETTE B, ANDRE G, GROLEAU D (1992). Production of poly-β-hydroxybutyrate (PHB) from methanol: characterization of a new isolate of Methylobacterium extorquens. Appl. Microbiol. Biotechnol., 37:

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