PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS EM ESCHERICHIA COLI: ESTADO ATUAL E SUPERAÇÃO DE DESAFIOS COM BASE EM MODELOS IN SILICO.

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1 PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS EM ESCHERICHIA COLI: ESTADO ATUAL E SUPERAÇÃO DE DESAFIOS COM BASE EM MODELOS IN SILICO. Johanna K. Bocanegra-Rodrigues 1, Marilda K. Taciro 1, Karel Olavarria-Gamez 1, Luiziana F. Silva 1, José Geraldo C. Pradella 1 e José Gregório C. Gomez 1 1 Universidade de São Paulo, Departamento de Microbiologia. 2 Centro de Ciência e Tecnologia do Bioetanol. para contato: jgcgomez@usp.br RESUMO A produção de poli-3-hidroxibutirato (P3HB) em linhagens recombinantes de E. coli foi avaliada em cultivos em biorreator. O acúmulo expressivo do polímero foi observado apenas em condição de crescimento celular simultâneo, provavelmente devido a limitações na oferta de NADPH. Análise in silico demonstrou que a expressão simultânea de glicealdeido 3-fosfato desidrogenase NAD e NADP dependentes poderia proporcionar melhora na eficiência de produção de P3HB, ou mesmo de polihidroxialcanoatos contendo outros monômeros. Além disso, a síntese de P3HB poderia ocorrer em condições limitantes do crescimento celular. 1. INTRODUÇÃO Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres acumulados por diversas bactérias na forma de grânulos intracelulares de reserva de carbono e energia. Estes polímeros têm atraído interesse industrial por apresentarem propriedades termoplásticas, serem biodegradáveis e biocompatíveis (Anderson & Dawes, 1990). Cerca de 150 monômeros diferentes já foram identificados como constituintes de PHA produzidos por bactérias, permitindo a obtenção de materiais com propriedades diversificadas e atendendo os requisitos para diferentes aplicações. Poli-3- hidroxibutirato (P3HB) é o mais conhecido e estudado dos PHA. Ralstonia eutropha é a linhagem modelo de produção de P3HB (Reinecke & Steinbüchel, 2009). A síntese de P3HB a partir de acetil- CoA é realizada em três passos enzimáticos catálisados por β-cetotiolase (phaa), acetoacetil-coa redutase NADPH dependente (phab) e PHA sintase (phac). Escherichia coli é a bactéria mais estuda genética e fisiologicamente. Esta bactéria tem sido utilizada para produção de diversos compostos principalmente em linhagens recombinantes. E. coli

2 não é capaz de acumular PHA naturalmente. Entretanto, linhagens expressando os genes phacab de R. eutropha acumulam P3HB (Slater et al., 1988). Segundo Lee (1996), diferente de produtores naturais, E. coli não requer limitação de nutrientes para produzir P3HB. Neste trabalho, linhagens recombinantes de E. coli foram avaliadas com relação à produção de P3HB a partir de glicose. Um modelo metabólico foi utilizado para estimar a distribuição de fluxos que melhor representa os dados experimentais, bem como aquela que permitiria maximizar a eficiência de conversão de glicose em P3HB. Análise de modos elementares foi utilizada para estimar a eficiência máxima de conversão de glicose em diferentes monômeros constituintes de PHA (3HB, 3HHx, 3HO, 3HD e 3HDd), considerando diferentes cenários de especificidades de enzimas por coenzimas (NAD/NADH e NADP/NADPH). Cenários estes factíveis de serem realizados em linhagens de E. coli. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Microrganismos Neste trabalho, foram utilizadas as linhagens E. coli XL1 Blue ou LS5218, abrigando os plasmídeos psk::phacab ou pbbr1mcs-2::phacab. O primeiro foi construído utilizando o plasmídeo pbluescript SK - (Stratagene), enquanto o segundo utilizando o plasmídeo pbbr1mcs Cultivos em biorreator Os cultivos foram realizados em biorreator B.Braum modelo Biostat B (2,5 litros de volume de trabalho). A temperatura foi controlada em 37,0+0,1 o C. O ph foi controlado em 7,00+0,05 utilizando NaOH (0,5 M) ou H 2 SO 4 (0,5 M). Foram retiradas amostras periódicas para determinar massa seca celular, teor e composição de PHA, concentração de glicose e ácido acético Modelo metabólico, análises de fluxos e de modos elementares A rede metabólica foi construída considerando as seguintes vias metabólicas: via Embden- Meyerhof-Parnas, via das pentose, complexo piruvato desidrogenase, ciclo de Krebs, ciclo do glioxilato, síntese de acetato e P3HB a partir de acetil-coa, síntese de biomassa residual. Foram determinado modos elementares utilizando o software Metatool (Pfeiffer et al., 1999). Programa em MatLab (função fmincon) foi utilizado para busca da combinação de modos elementares que melhor representava os dados experimentais. Alterações na rede foram realizadas considerando novas especificidades por coenzimas (NAD/NADH e NADP/NADPH) das enzimas gliceraldeido 3- fosfato desidrogenase (G3PDH) e glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) Métodos analíticos A massa seca celular foi determinada gravimetricamente após filtração, lavagem e secagem de volume conhecido da cultura. Teor e composição de PHA foi determinada por cromatografia gasosa de propil-ésteres de 3HA. Concentrações de glicose e ácido acético foram determinadas por HPLC utilizando coluna Aminex HPX-87H e H 2 SO 4 5 mm como fase móvel.

3 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Escherichia coli é considerada um cavalo de batalha para o desenvolvimento de processos biotecnológicos. A clonagem e expressão dos genes phacab de R. eutropha permitiu a produção de P3HB em linhagens recombinantes de E. coli (Slater et al., 1988). Há relatos de processos de produção de P3HB atingindo altas produtividades utilizando linhagens recombinantes de E. coli (Choi & Lee, 1997), entretanto, tem sido de grande dificuldade a reprodução desses resultados. Neste trabalho, foi avaliada a produção de P3HB por linhagens recombinantes de E. coli abrigando os genes phacab de R. eutropha. Lee (1996) afirma que, diferente de produtores naturais, E. coli não requer limitação de nutrientes para produzir P3HB. Inicialmente, foram avaliadas condições de cultivo em que o meio de cultura foi balanceado de forma a oferecer todos os nutrientes para o crescimento celular. Foram avaliadas duas linhagens de E. coli (XL1 Blue e LS5218) e dois plasmídeo (psk::phacab e pbbr1mcs-2::phacab). Em todos os cultivos, o que se observou foi o crescimento exponencial das bactérias, mas o acúmulo de P3HB foi inexpressivo (Figura 1). Figura 1. Produção de P3HB a partir de glicose por linhagens recombinantes de E. coli. A. E. coli XL1 Blue psk::phacab. B. E. coli LS5218 psk::phacab. C. E. coli LS5218 pbbr1mcs-2::phacab. Uma vez que o acúmulo de P3HB é muito mais expressivo em cultivos em agitador rotativo, foi formulada a hipótese que o acúmulo mais expressivo dependeria de limitação de oxigênio. Assim, a linhagem E. coli LS5218 pbbr1mcs-2::phacab foi cultivada sob duas condições: i. o oxigênio dissolvido foi mantido acima de 30% da saturação; ii. permitiu-se a redução do oxigênio dissolvido no início do cultivo até 1% da saturação, mantendo-se nesse valor. Sem a limitação de oxigênio (acima de 30% da saturação), observou-se um crescimento exponencial e acúmulo inexpressivo de P3HB (Figura 2A). Sob limitação de oxigênio, observou-se um crescimento linear da cultura e acúmulo expressivo de P3HB (Figura 2B). Surgiu então a questão se acúmulo de P3HB era mais expressivo devido à limitação de oxigênio ou devido a crescimento linear que proporcionava crescimento celular e acúmulo de P3HB simultâneos. Assim, foi proposto um novo experimento no qual no início do cultivo eram adicionadas quantidades reduzidas da fonte de carbono e nitrogênio. Quando esses nutrientes estavam praticamente exauridos, iniciava-se a alimentação das fontes de carbono e nitrogênio com uma vazão constante de forma proporcionar um crescimento linear. Foram testadas duas

4 condições: sem limitação de oxigênio (> 30% da saturação) e com limitação (1% da saturação). Nas duas condições testadas observou-se acúmulo de P3HB em quantidades expressivas, embora com limitação de oxigênio o acúmulo foi um pouco maior (Figura 3). Esse resultado sugere que o acúmulo de P3HB é favorecido quando ocorre simultaneamente o crescimento celular, embora a limitação de oxigênio possa favorecê-lo. Figura 2. Produção de P3HB a partir de glicose por E. coli LS5218 pbbr1mcs-2::phacab. Cultivo com alimentação apenas da fonte de carbono por pulsos. A Sem limitação de oxigênio (> 30% da saturação). B Com limitação de oxigênio (controlado em 1% da saturação). Figura 3. Produção de P3HB a partir de glicose por E. coli LS5218 pbbr1mcs-2::phacab. Cultivo com alimentação constante da fonte de carbono e nitrogêno. A Sem limitação de oxigênio (> 30% da saturação). B Com limitação de oxigênio (controlado em 1% da saturação). Os cultivos apresentados na Figura 3 foram utilizados para determinação da distribuição de fluxos no metabolismo central (Figura 4 A e B). Verificou-se um baixo fluxo na via das pentoses, principal supridora de NADPH para o metabolismo. A síntese de P3HB depende de NADPH. A análise de modos elementares indicou que seria necessário um aumento do fluxo de glicose pela via das pentoses para aumentar a eficiência de conversão de glicose em P3HB (Figura 3 C e D).

5 Figura 4. Distribuição de fluxos nas vias EMP (Embden-Meyerhoff-Parnas) e VP (Via das pentoses) em cultivos de E. coli. A e B. valores de distribuição estimados a partir de dados experimentais. C e D. valores máximos teóricos. A e C. acúmulo de P3HB correspondendo a 17% da massa seca celular. B e D. acúmulo de P3HB correspondendo a 50% da massa seca celular. Tabela 1. Eficiência máxima de conversão de glicose em 3HB, 3HHx, 3HO, 3HD ou 3HDd a partir de dados da análise de modos elementares. Especificidade enzimas Máxima eficiência de conversão de glicose no 3HA (mol/mol) G3PDH G6PDH 3HB 3HHx 3HO 3HD 3HDd NADH NADPH 0,9231 0,5714 0,4138 0,3243 0,2667 NADPH NADPH 0,5000 0,6667 0,4800 0,3750 0,3077 Dual NADPH 1,0000 0,6667 0,5000 0,4000 0,3333 NADH NADH 0,8571 0,5000 0,3529 0,2727 0,2222 NADH Dual 0,9231 0,5714 0,4138 0,3243 0,2667 Dual Dual 1,0000 0,6667 0,5000 0,4000 0,3333 G3PDH gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. G6PDH glicose 6-fosfato desidrogenase. 3HB 3-hidroxibutirato, 3HHx 3-hidroxihexanoato, 3HO 3-hidroxioctanoato, 3HD 3-hidroxidecanoato, 3HDd 3-hidroxidodecanoato. Diante dos resultados obtidos, foi formulada a hipótese que o baixo fluxo na via das pentoses levaria a uma baixa oferta de NADPH impedindo uma produção mais efetiva de P3HB, seja sob condições de não crescimento, seja aquela em que crescimento e acúmulo de P3HB ocorrem

6 simultaneamente. Assim, foi avaliado in silico o impacto de mudanças na especificidade por coenzimas (NAD/NADH e NADP/NADPH) das enzimas glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase (G3PDH). A máxima eficiência na produção de P3HB foi identificada com a expressão simultânea de G3PDH NAD e NADP dependentes, obtida com fluxos iguais nessas duas enzimas (Tabela 1). A co-expressão dessas enzimas também proporcionaria melhora na eficiência de síntese de outros monômeros (Tabela 1). A mudança na especificidade da G6PDH nativa (NADP dependente), ou mesmo a expressão de uma enzima com atividade pelas duas coenzimas (dual) não proporcionaria aumento na eficiência de qualquer dos monômeros. 4. CONCLUSÃO A produção de P3HB em linhagens recombinantes de E. coli depende do acúmulo ocorrendo simultaneamente ao crescimento celular, provavelmente devido a limitação na disponibilização de NADPH para biossíntese do polímero. Melhoras expressivas na produção desse polímero, ou mesmo de outros PHA, poderão ser atingidas com a co-expressão de G3PDH NAD e NADP dependentes. Essa alteração deverá proporcionar o acúmulo de P3HB mesmo sob condições limitantes do crescimento celular. 5. AGRADECIMENTOS Este trabalho foi financiado pela FAPESP (Processo 2013/ ). 6. REFERÊNCIAS Anderson, A.J., Dawes, E.A Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoats. Microbiol. Rev. 54, Choi, J.I., Lee, S.Y Process analysis and economic evaluatin for Poly(3-hydroxybutirate) production by fermentation. Bioprocess Eng. 17, Lee, S.Y Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotech. Bioeng. 49, Pfeiffer, T., Sanchez-Valdenebro, I., Nuño, J.C., Montero, F., Schuster, S Metatool: for studying metabolic networks. Bioinformatics 15, Reinecke, F., Steinbüchel, A Ralstonia eutropha strain H16 as model organism for PHA metabolism and for biotechnological production of technically interesting biopolymers. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 16, Slater, S.C., Voige, W.H., Dennis, D.E Cloning and expression in Escherichia coli of the Alcaligenes eutrophus H16 poly-b-hydroxybutyrate biosynthesis pathway. J. Bacteriol. 170,