FABRICAÇÃO DE ARCABOUÇOS TRIDIMENSIONAIS PARA REGENERAÇÃO GUIADA DE TECIDO ÓSSEO. *

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1 FABRICAÇÃO DE ARCABOUÇOS TRIDIMENSIONAIS PARA REGENERAÇÃO GUIADA DE TECIDO ÓSSEO Fabrício Dingee 1*, Ana Paula M. Casadei 1, Guilherme Jenovêncio 1, Tatiane E. Silva 1, Eliana A. R. Duek 2, Gean V. Salmoria 1, Márcio C. Fredel 1 1 Departamento de Engenharia Mecânica, UFSC, Florianópolis (SC), Brasil 2 Centro de Ciências Médicas e Biológicas, PUC, Sorocaba (SP), Brasil * dingee@emc.ufsc.br Resumo. Arcabouços constituídos por materiais bioreabsorvíveis, tal como o poli(l-ácido láctico), podem ser utilizados para regeneração guiada de tecidos danificados, sendo degradados e metabolizados pelo organismo. O processo de sinterização apresenta-se como potencialmente interessante para fabricação de arcabouços tridimensionais, pois permite controlar porosidade e tamanho de poro, além de dispensar a presença de solventes orgânicos, geralmente tóxicos para o organismo. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi o de fabricar arcabouços tridimensionais por meio da sinterização de PLLA e de compósitos PLLA-HA com matriz polimérica. O polímero (PLLA) foi cominuído, caracterizado por DSC e TGA e misturado mecanicamente com hidroxiapatita (HA). Posteriormente, o polímero PLLA cominuído e os compósitos PLLA-HA5, PLLA-HA10 e PLLA-HA20 (onde 5, 10 e 20 representam o percentual mássico de HA, respectivamente) foram submetidos à sinterização. Os arcabouços obtidos foram então caracterizados por MEV e ensaio de compressão. Os arcabouços PLLA e PLLA-HA20 apresentaram interconectividade entre poros, faixa de tamanho de poro conveniente para regeneração de tecido ósseo e resistência à compressão equivalente à faixa de resistência à compressão do osso trabecular. Os resultados indicam que os arcabouços PLLA e PLLA-HA20 fabricados neste estudo apresentam grande potencial para serem aplicados na regeneração guiada de tecido ósseo. Palavras-chave: Arcabouço, Hidroxiapatita, Poli(L-ácido láctico), Sinterização, Tecido ósseo. 1. INTRODUÇÃO Polímeros bioreabsorvíveis possuem a capacidade de serem degradados e totalmente eliminados por rotas metabólicas do organismo [Vert et al., 1992]. O poli(l-ácido láctico) (PLLA) é um polímero desse tipo, pois degrada-se em ácido láctico, substância já produzida e metabolizada naturalmente pelo corpo humano. Adicionalmente, o PLLA apresenta uma larga faixa de temperatura de processamento (entre 170 e 250 C) [Doi e Steinbüchel 2002 e Hollinger, 1995]. Alguns estudos sugerem que o PLLA é ainda mais interessante quando acrescido com hidroxiapatita, visto que essa pode melhorar a degradação do polímero. No estudo in vivo realizado por Shikinami et al. [2005], implante de PLLA se degradou em macrofragmentos de tamanhos desiguais em intervalos de tempo irregulares, resultando em picos de irritação física, que pode levar a respostas inflamatórias indesejáveis no local do implante. No mesmo estudo, implante de PLLA acrescido com partículas de hidroxiapatita se degradou em pequenos fragmentos em intervalos de tempo regulares, sem provocar respostas adversas. Atualmente, diversos estudos visando o desenvolvimento de arcabouços para regeneração guiada de tecidos têm sido realizados. Arcabouço (do inglês, scaffold) é um suporte, veículo de liberação, ou matriz que facilita a migração, adesão ou transporte de células ou moléculas bioativas utilizadas para substituir, reparar ou regenerar tecidos [ASTM F2312]. Tendo em vista o potencial apresentado pelo polímero PLLA associado com hidroxiapatita, surge o interesse em estudar a fabricação de arcabouços tridimensionais para regeneração guiada de tecido ósseo, constituídos por uma matriz polimérica de PLLA e acrescidos com hidroxiapatita. Adicionalmente, um arcabouço desse tipo assemelha-se ao

2 tecido ósseo, visto que o mesmo é constituído por uma matriz de colágeno tridimensional acrescida com fosfato de cálcio. O processo de sinterização de polímeros ou compósitos polímero-cerâmica de matriz polimérica, juntamente com outros processos, tem sido estudado para a fabricação de arcabouços tridimensionais [Borden et al., 2002; Borden et al., 2003; Mizutani et al., 2005 e Yao et al., 2005]. Em materiais particulados, esse processo ocorre simultaneamente entre várias partículas, gerando uma rede interligada com um certo grau de porosidade [Thümmler e Oberacker, 1993]. Durante a sinterização, a união das partículas pela formação de pescoços ocorre através de um transporte de massa. Na maioria dos polímeros esse transporte de massa ocorre por sinterização com fase líquida, pelos mecanismos de fluxo viscoso e difusão volumétrica [Narkis e Rosenzweig, 1995]. 2. METODOLOGIA Os materiais utilizados neste estudo para a fabricação dos arcabouços foram poli(l-ácido láctico) (PLLA), sintetizado na empresa PURAC, adquirido e fornecido pelo Centro de Ciências Médicas e Biológicas/PUC, com MM de g/mol, faixa de tamanho de partícula entre 1 mm e 4 mm e tamanho médio de partícula de 2,4 ± 0,7 mm; hidroxiapatita, sintetizada e fornecida pelo Grupo de Biomateriais/UFSCar, constituída por partículas com tamanho menor que 5 µm, aglomerados e pequena quantidade de partículas com maior tamanho (~ 100 µm). 2.1 Moagem Com o intuito de se obter partículas micrométricas a partir do PLLA fornecido, 20g desse polímero foram cominuídas durante 4h por um processo de moagem a seco em um triturador doméstico da marca ARNO, modelo OPTMIX. Após esse processo, o PLLA cominuído foi colocado em uma embalagem plástica e armazenado em dessecador sob vácuo à temperatura ambiente. 2.2 Peneiramento Com o intuito de se obter partículas de PLLA com faixa de tamanho entre 106µm e 212µm, o PLLA cominuído foi peneirado em um agitador eletromagnético da marca BERTEL, com freqüência de 7 vibrações/min durante 15min. Após o processo de peneiramento, as partículas obtidas foram colocadas em embalagens plásticas e armazenadas em dessecador sob vácuo à temperatura ambiente. 2.3 Mistura Para se obter compósitos constituídos por matriz polimérica de PLLA e acrescidos com 5 %, 10 % ou 20 % em massa de hidroxiapatita, partículas de PLLA com faixa de tamanho entre 106 µm e 212 µm e partículas de hidroxiapatita conforme fornecidas foram misturadas mecanicamente durante 2h em um misturador em Y. Após o processo de mistura, os compósitos obtidos foram colocados em embalagens plásticas e armazenados em dessecador sob vácuo à temperatura ambiente.

3 2.4 Calorimetria Diferencial de Varredura e Análise Termogravimétrica O PLLA cominuído e peneirado, com faixa de tamanho de partícula entre 106 µm e 212 µm, foi caracterizado por calorimetria diferencial de varredura (DSC) em um equipamento da marca SHIMADZU, modelo 50, e por análise termogravimétrica (TGA) em outro equipamento da mesma marca e do mesmo modelo, utilizando-se atmosfera de N 2, taxa de fluxo de N 2 de 50 cm 3 /min e taxa de aquecimento de 10 C/min. 2.5 Sinterização O processo de sinterização foi realizado em um forno, constituído de gesso com 80 mm de diâmetro externo, 80 mm de altura, 70mm de diâmetro interno e 40mm de profundidade, equipado com termômetro digital e controlador de temperatura microprocessado. Os arcabouços foram fabricados com dimensões de 3 ± 0,3 mm de diâmetro e 14 ± 1 mm de altura, utilizando-se os parâmetros apresentados na Tabela 1. Tabela 1. Parâmetros utilizados na fabricação dos arcabouços. material PLLA PLLA-HA5 PLLA-HA10 PLLA-HA20 percentual em massa de hidroxiapatita 0 % 5 % 10 % 20 % percentual em massa de PLLA 100 % 95 % 90 % 80 % 175 ± 0,3 C, temperatura final 176 ± 0,3 C ou média de aquecimento 177 ± 0,3 C 176 ± 0,3 C 176 ± 0,3 C 179 ± 0,3 C massa de material particulado 70 mg tempo na temperatura final de aquecimento 1 min taxa de aquecimento 10 C/min resfriamento ao ar até a temperatura ambiente Os arcabouços obtidos foram colocados em embalagens plásticas e armazenados em dessecador sob vácuo à temperatura ambiente. Para a identificação desses arcabouços, cada embalagem foi marcada com um código: PLLA, PLLA-HA5, PLLA-HA10 ou PLLA-HA20, significando arcabouço de PLLA acrescido com 0 %, 5 %, 10 % ou 20 % em massa de hidroxiapatita, respectivamente. 2.6 Microscopia Eletrônica de Varredura Os arcabouços PLLA, PLLA-HA5, PLLA-HA10 e PLLA-HA20 foram caracterizados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) em um equipamento da marca PHILIPS, modelo XL30. Amostras desses arcabouços foram previamente resfriadas em nitrogênio líquido, fraturadas por flexão e recobertas com ouro na superfície e na seção de fratura.

4 2.7 Ensaio Mecânico Amostras dos arcabouços PLLA, PLLA-HA5, PLLA-HA10 e PLLA-HA20 foram submetidas a ensaio de compressão em uma máquina universal de ensaios mecânicos da marca EMIC, modelo DL2000. Os parâmetros utilizados no ensaio de compressão seguiram a norma ASTM D695 e são apresentados na Tabela 2. Tabela 2. Parâmetros utilizados no ensaio de compressão. diâmetro da amostra altura da amostra célula de carga velocidade de deformação 3 mm 6 mm 2 kn 1,3 mm/min 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Calorimetria Diferencial de Varredura Os valores obtidos para Tg, Tm e grau de cristalinidade do PLLA são apresentados na Tabela 3. Tendo em vista que o PLLA apresentou Tg e Tm, pode-se afirmar que esse material tratava-se de um polímero semicristalino. Adicionalmente, esse polímero apresentou um alto grau de cristalinidade. Tabela 3. Valores de temperatura de transição vítrea (Tg), temperatura de fusão (Tm) e grau de cristalinidade do poli(l-ácido láctico). 3.2 Análise Termogravimétrica Tg Tm grau de cristalinidade ~ 63ºC ~ 183ºC ~ 53 % ~62ºC ~ 181ºC ~ 53 % O PLLA apresentou uma temperatura inicial de degradação (T onset ) de ~ 375ºC e temperatura final de degradação (T endset ) de ~ 413ºC. Diante disso, pode-se afirmar que as temperaturas entre 175 e 179 C, utilizadas no processo de sinterização, não promovem degradação significativa no PLLA.

5 3.3 Microscopia Eletrônica de Varredura As micrografias, com aumento de 50X, das superfícies dos arcabouços PLLA fabricados em diferentes temperaturas são apresentadas na Figura 1. Essa figura mostra que as três diferentes temperaturas (175 C, 176 C e 177 C) utilizadas permitiram a fabricação de arcabouços PLLA com poros aparentemente interconectados. No entanto, apenas o arcabouço fabricado em 176 C (Figura 1b) apresentou, ao mesmo tempo, alta porosidade e grande presença de pescoços. A Figura 1a mostra que o arcabouço PLLA fabricado na temperatura de 175 C apresentou alta porosidade, porém pouca presença de pescoços, indicando que nessa temperatura pouca energia foi fornecida para sinterizar as partículas de PLLA. Devido a essa pouca presença de pescoços, esse arcabouço não apresentou resistência mecânica suficiente para ser extraído do molde e manuseado sem rompimento. A Figura 1c que o arcabouço PLLA fabricado na temperatura de 177 C apresentou grande presença de pescoços, porém regiões com baixa porosidade. Diante disso, pode-se afirmar que nessa temperatura foi fornecida energia suficiente para sinterizar as partículas de PLLA, porém a porosidade do arcabouço foi comprometida. Adicionalmente, o arcabouço PLLA apresentou empenamento. Diante dos resultados descritos acima, pode-se afirmar que apenas na temperatura de 176 C foi fornecida uma energia suficiente para sinterizar as partículas de PLLA sem comprometer a porosidade do arcabouço. (a) (b) (c) Figura 1. Micrografias das superfícies dos arcabouços de poli(l-ácido láctico) fabricados em diferentes temperaturas: (a) 175 C, (b) 176 C e (c) 177 C.

6 As micrografias das superfícies dos arcabouços de PLLA acrescidos com diferentes percentuais de hidroxiapatita são apresentadas na Figura 2, com aumento de 50X. Essa figura mostra que todos os arcabouços apresentaram superfícies porosas com distribuição de poros aparentemente homogênea. No entanto, os arcabouços PLLA, PLLA-HA10 e PLLA-HA20 apresentaram características diferentes, embora tenham sido fabricados na mesma temperatura (176 C). O arcabouço PLLA (arcabouço que não apresentava hidroxiapatita) apresentou uma superfície com tamanho de poro e tamanho de pescoço maiores em relação à superfície do arcabouço PLLA-HA5 (arcabouço que apresentava 5 % em massa de hidroxiapatita). Esse mesmo resultado foi encontrado para a superfície do arcabouço PLLA-HA5 em relação à superfície do arcabouço PLLA-HA10 (arcabouço que apresentava 10 % em massa de hidroxiapatita). Diante desses resultados, pode-se afirmar que o aumento da quantidade de hidroxiapatita promoveu uma redução no tamanho de poro e no tamanho de pescoço. A redução no tamanho de poro está relacionada com a invasão das partículas de hidroxiapatita no interior dos poros formados entre as partículas de PLLA, visto que as partículas de hidroxiapatita possuíam menor tamanho em relação às partículas de PLLA. A redução no tamanho de pescoço está relacionada com o obstáculo que as partículas de hidroxiapatita promovem para a formação de pescoços quando posicionadas entre as partículas de PLLA. (a) (b) (c) (d) Figura 2. Micrografias, com aumento de 50X, das superfícies dos arcabouços de poli(l-ácido láctico) acrescidos com diferentes percentuais em massa de hidroxiapatita: (a) 0 %, (b) 5 %, (c) 10 % e (d) 20 %.

7 3.4 Ensaio Mecânico Os valores de resistência à compressão encontrados são apresentados na Tabela 4. Essa tabela mostra que o arcabouço PLLA apresentou maior resistência à compressão em relação ao arcabouço PLLA-HA5 e que esse último apresentou maior resistência à compressão em relação ao arcabouço PLLA-HA10, embora esses três arcabouços tenham sido fabricados na mesma temperatura. Esses resultados podem ser relacionados com as micrografias obtidas pela caracterização por MEV (Figura 2). Essas micrografias mostram que a redução da quantidade de hidroxiapatita promoveu um aumento no tamanho de pescoço das superfícies dos arcabouços fabricados na mesma temperatura. Esse aumento no tamanho de pescoço resultou na formação de uma fase polimérica com maior continuidade, aumentando a capacidade dessa fase para resistir às solicitações mecânicas. Ainda na Tabela 4, observa-se que o arcabouço PLLA-HA20 apresentou a maior resistência à compressão. Esse resultado está relacionado com a maior temperatura utilizada na fabricação do arcabouço PLLA-HA20. Segundo Kokubo [2003], o osso trabecular apresenta uma faixa de resistência à compressão entre 2 MPa e 12 MPa. Considerando os valores médios da Tabela 4, observa-se que todos os arcabouços apresentaram resistência à compressão nessa faixa. Considerando os valores mínimos e máximos, os arcabouços PLLA e PLLA-HA20 apresentaram resistência à compressão nessa faixa. Tabela 4. Resistência à compressão dos arcabouços de poli(l-ácido láctico) acrescidos com diferentes percentuais em massa de hidroxiapatita. arcabouços temperatura de resistência à compressão fabricação média valor mínimo valor máximo PLLA 176 C 4,8 ± 1,4 MPa 2,9 MPa 7,4 Mpa PLLA-HA5 176 C 3,1 ± 1,4 MPa 1,1 MPa 5,1 Mpa PLLA-HA C 2,2 ± 1,3 MPa 0,8 MPa 4,9 Mpa PLLA-HA C 5,5 ± 1,3 MPa 3,6 MPa 7,8 Mpa 4. CONCLUSÕES Os arcabouços PLLA e PLLA-HA20 fabricados neste estudo apresentam grande potencial para serem aplicados na regeneração guiada de tecido ósseo, pois apresentaram interconectividade entre poros que, segundo Olivier et al. [2004], permite a migração de células, vasos e nutrientes por todo o volume do arcabouço; apresentaram tamanho de poro equivalente à faixa de tamanho de poro (entre 100 e 400 m) sugerida por Yoneda et al. [2005] como conveniente para regeneração de tecido ósseo e apresentaram resistência à compressão equivalente à faixa de resistência à compressão do osso trabecular. Adicionalmente, o arcabouço PLLA-HA20 apresentou uma distribuição aparentemente homogênea de partículas de hidroxiapatita, as quais contribuem para a bioatividade e a osteocondutividade, segundo Olivier et al. [2004], e para o processo de degradação, segundo Shikinami et al. [2005].

8 REFERÊNCIAS ASTM F2312. (2004), Standard Terminology Relating to Tissue Engineered Medical Products. Borden, M. D., et al. (2002), Tissue engineered microsphere-based matrices for bone repair: design and evaluation, Biomaterials, 23, Borden, M. D., et al. (2003), Structural and human cellular assessment of a novel microsphere based tissue engineered scaffold for bone repair, Biomaterials, Doi, Y. and Steinbüchel, A. (2002), Biopolymers: polyesters III - Applications and Commercial Products, vol.4, Wiley-VCH, Weinheim. Hollinger, J. O. (1995), Biomedical applications of synthetic biodegradable polymers, CRC Press, Boca Raton. Kokubo, T., Kim, H. and Kawashita, M. (2003), Novel bioactive materials with different mechanical properties, Biomaterials, 24, Mizutani, Y., et al. (2005), Poly(L-lactic acid) short fibers prepared by solvent evaporation using sodium tripolyphosphate, Polymer, 46, Narkis, M. and Rosenzweig, N. (1995), Polymer Powder Technology, John Wiley & Sons, England. Olivier, V., Faucheux, N. and Hardouin, P. (2004), Biomaterial challenges and approaches to stem cell use in bone reconstructive surgery, Drug Discovery Today, 9, Shikinami, Y., Matsusue, Y. and Nakamura, T. (2005), The complete process of bioresorption and bone replacement using devices made of forged composites of raw hydroxyapatite particles/poly L-lactide (F-u-HA/PLLA), Biomaterials, 26, Thümmler, F. and Oberacker, R. (1993), An introduction to powder metallurgy, The Institute of Materials, London. Vert, M., et al. (1992), Bioresorbability and biocompatibility of aliphatic polyesters, Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 3, Yao, J., et al. (2005), The effect of bioactive glass content on synthesis and bioactivity of composite poly (lactic-co-glycolic acid)/bioactive glass substrate for tissue engineering. Biomaterials,. 26: Yoneda, M., et al. (2005 ), Repair of an intercalated long bone defect with a synthetic biodegradable boneinducing implant, Biomaterials, 26, MANUFACTURE OF THREE-DIMENSIONAL SCAFFOLDS FOR BONE TISSUE GUIDED REGENERATION Fabrício Dingee 1*, Ana Paula M. Casadei 1, Guilherme Jenovêncio 1, Tatiane E. Silva 1, Eliana A. R. Duek 2, Gean V. Salmoria 1, Márcio C. Fredel 1 1 Departamento de Engenharia Mecânica, UFSC, Florianópolis (SC), Brasil 2 Centro de Ciências Médicas e Biológicas, PUC, Sorocaba (SP), Brasil * dingee@emc.ufsc.br Abstract. Scaffolds constituted by bioresorbable materials, such as poly(l-lactic acid), can be used for damaged tissues guided regeneration, being degraded and metabolized by the body. The sintering process he is presents as potentially interesting for manufacture of three-dimensional scaffolds, since allows to control porosity and pore size, besides to dispense the presence of organic solvents, generally toxic to the organism. In this context, the objective of this study was to manufacture three-dimensional scaffolds by sintering of PLLA and PLLA-HA composites with polymeric matrix. The polymer (PLLA) was dry milled, characterized by DSC and TGA and mechanically mixed with hydroxyapatite (HA). Subsequently, the grinded PLLA and the PLLA-HA5, PLLA-HA10 and PLLA-HA20 composites (where 5, 10 e 20 represent the HA massic percentage, respectively) were submitted to sintering. The scaffolds obtained were then characterized by SEM and compression test. The PLLA and PLLA-HA20 scaffolds presented interconnectivity between pores, pore size range convenient for bone tissue regeneration and compression resistance equivalent to the compression resistance range of the trabecular bone. These results indicate that the PLLA and PLLA-HA20 scaffolds manufactured in this study present great potential to be employed in the bone tissue guided regeneration. Keywords: Scaffold, Hydroxyapatite, Poly(L-lactic acid), Sintering, Bone Tissue.