AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DÉRMICA AGUDA DE SAIS IMIDAZÓLICOS EM MODELOS EX VIVO

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1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DÉRMICA AGUDA DE SAIS IMIDAZÓLICOS EM MODELOS EX VIVO Suzana JUST 1, Pamela MABONI 1, Leonel Rosa FRIGO 2, Christofe CARNEIRO 2, Mikaela Sales de LIMA 2, Eduardo Benvenutti MORELLO 2, Mario Lettieri TEIXEIRA 3 1 Bolsista FAPESC/IFC; 2 Discente do Curso de Medicina Veterinária IFC-Campus Concórdia; 3 Orientador IFC- Campus Concórdia Introdução O grupo imidazol é frequentemente encontrado em substâncias com atividade biológica, incluindo agentes antifúngicos como o bifonazol, butoconazol, clorotrimazol, econazol, fenticonazol, isoconazol, cetoconazol, miconazol, omoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol e tioconazol. Outras medicações antifúngicas relacionadas são as triazólicas (albaconazol, fluconazol, isavuconazol, itraconazol, posaconazol, ravuconazol, terconazol, voriconazol) e as tiazólicas (abafungin). Os antifúngicos imidazólicos, triazólicos e tiazólicos inibem a enzima lanosterol 14 α-demetilase; a enzima necessária para converter lanosterol em ergosterol e assim promover a biossíntese da membrana celular fúngicas. Líquidos iônicos (LIs) são sais no estado líquido a temperaturas de até 100 ºC, que apresentam tipicamente volatilidade negligenciável. Inicialmente, LIs foram aplicados como substitutos de solventes voláteis convencionais, transformando processos perigosos em recicláveis e ambientalmente amigáveis. Especialmente, a classe de LIs com cátions imidazólicos se encontra em aplicações de uma ampla variedade de processos e materiais, principalmente devido ao fácil ajuste de propriedades por mudanças estruturais em ambos cátion e ânion (Lu et al., 2009). Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar, de forma preliminar, as propriedades citotóxicas dos sais imidazólicos (cloreto 1-n-hexadecil-3-metilimidazólio - C 16 MImCl e metanosulfonato 1-n-hexadecil-3-metilimidazólio - C 16 MImMeS) por meio do teste de toxicidade dérmica aguda. Material e Métodos Os sais imidazólicos (SI) (cloreto 1-n-hexadecil-3-metilimidazólio C 16 MImCl e metanosulfonato 1-n-hexadecil-3-metilimidazólio - C 16 MImMeS) foram disponibilizados pelo Instituto de Química da Universidade Federal do Rio Grande do

2 Sul (UFRGS). Estes sais forma dissolvidos em uma solução tampão-fosfato 10 mm (ph 7,0) na concentração de 1mg/mL. Obtenção da Curva de Ringbom A curva de Ringbom foi realizada a fim de determinar a faixa de concentração na qual o método espectrofotométrico na região do ultravioleta obedece à linearidade, ou seja, determinar qual a faixa de concentração na qual se comete o menor erro (ANVISA, 2003). Sua determinação foi feita obtendo-se, então, soluções de concentrações crescentes entre 1 µg/ml a 250 µg/ml (ANVISA, 2003). As leituras de absorbância foram feitas contra um branco de tampão-fosfato 10 mm (ph 7,0), em cubetas de quartzo de 1 cm de espessura a 202 nm. Obtenção da Curva Padrão A fim de avaliar a linearidade do método, foi obtida uma curva padrão e determinada a equação da reta e o coeficiente de correlação (ANVISA, 2003). Para a obtenção da curva padrão, foram feitas de soluções com concentrações de 3,9; 7,8; 15,625; 31,25; 62,5; 125,0 e 250,0 µg/ml e cada concentração foi feita em triplicada e levados ao espectrofotômetro (λ = 202 nm) para leitura das respectivas absorbâncias (ANVISA, 2003). Precisão Testes intra-dia e inter-dias foram realizados para determinar a precisão do método analítico proposto. Concentrações diferentes de amostras de SI foram preparadas (31,25; 62,5; 125,0 µg/ml) e analisadas em triplicata em três dias diferentes (ANVISA, 2003). Exatidão A exatidão será determinada por teste de recuperação por meio da adição de uma quantidade determinada do padrão em soluções da amostra (as concentrações escolhidas foram 31,25; 62,5; 125,0 µg/ml). O teste foi realizado em triplicata (ANVISA, 2003). Para o estudo de toxicidade dérmica aguda foi utilizado pele de orelha de suínos. Este pele foi obtida a partir de animais abatidos de acordo com as normas do Ministério da Agricultura, respeitando o bem-estar animal (Brasil, 2013). Os pêlos foram cuidadosamente retirados por um aparador elétrico. As amostras de pele foram montadas em células de difusão de Franz (Logan Instrument Corp., NJ, EUA) com a

3 área de difusão de aproximadamente 1,75 cm 2. O lado epidérmico da pele foi exposto a uma solução tampão-fosfato ph 7,0 (controle negativo) por um período de 24 horas. Esse processo se repetiu da mesma forma para as soluções de sais imidazólicos. Todos os testes foram realizados em triplicata. Após este período estas amostras de tecido epitelial foram submetidos a avaliação histopatológica, as quais foram coradas com hematoxilina-eosina e observadas por microscopia óptica com aumento de 100x e 400x (Obatomi et al., 1998). Resultados e discussão Os resultados encontrados estão expostos na Figura 1. Com base nesses dados, o método proposto é de fácil execução e baixo custo. Figura 1. Curva padrão de Sais Imidazólicos de acordo com a metodologia proposta para quantificação por ultravioleta. O resultado da avaliação histopatológica de pele de orelha de suínos incubadas com as soluções de sais imidazólicos (cloreto 1-n-hexadecil-3-metilimidazólio - C 16 MImCl e metanosulfonato 1-n-hexadecil-3-metilimidazólio - C 16 MImMeS) não mostraram lesões microscópicas (Figura 2). Os estudos de citotoxicidade de líquidos iônicos estão baseados na relação existente a dose e a estrutura química destes compostos. A literatura fornece estudos

4 utilizando modelos como plantas, invertebrados e peixes. Nestas pesquisas, as alterações na estrutura química, tal como a adição de grupos secundários, grupos alquilo, grupos insaturados demonstraram alterações na atividade citotóxica. Assim, utilizando um modelo de pele ex vivo de suíno preenche esta lacuna nos estudos de citotoxicidade dos líquidos iônicos, e a possibilidade de calcular o perfil de permeação destes compostos através do cálculo da concentração dos vários tipos de tecidos (Bubalo et al., 2015; Tsarpali et al., 2015). Figura 2. Avaliação histopatológica de pele de orelha de suíno tratada com sais imidazólicos (cloreto 1-n-hexadecil-3-metilimidazólio - C 16 MImCl e metanosulfonato 1-n-hexadecil-3-metilimidazólio - C 16 MImMeS) e tratada com solução tampão-fosfato ph 7,0 (controle negativo em aumentos de 100 e 400 vezes de magnitude. 1A. Células epiteliais de orelha de suínos tratadas com tampão-fosfato ph 7,0 em aumento de 100 vezes de magnitude. 1B. Células epiteliais de orelha de suínos tratadas com cloreto 1-nhexadecil-3-metilimidazólio (C 16 MImCl) (concentração de 1 mg/ml) em aumento de 100 vezes de magnitude. 1C. Células epiteliais de orelha de suínos tratadas com metanosulfonato 1-n-hexadecil-3-metilimidazólio (C 16 MImMeS) (concentração de 1 mg/ml) em aumento de 100 vezes de magnitude. 2A. Células epiteliais de orelha de suínos tratadas com tampão-fosfato ph 7,0 em aumento de 400 vezes de magnitude. 2B. Células epiteliais de orelha de suínos tratadas com cloreto 1-n-hexadecil-3- metilimidazólio (C 16 MImCl) (concentração de 1 mg/ml) em aumento de 400 vezes de magnitude. 2C. Células epiteliais de orelha de suínos tratadas com metanosulfonato 1-nhexadecil-3-metilimidazólio (C 16 MImMeS) (concentração de 1 mg/ml) em aumento de 400 vezes de magnitude.

5 Conclusão Ao término desta pesquisa, constatou-se que os sais imidazólicos - 1-nhexadecil-3-metilimidazólio (C 16 MImCl) e metanosulfonato 1-n-hexadecil-3- metilimidazólio (C 16 MImMeS) não apresentaram um potencial efeito citotóxico em tecido epitelial de suínos. As perspectivas deste trabalho remetem a quantificação destes compostos nas diferentes camadas da pele bem como a necessidade da realização de mais testes confirmatórios para a avaliação de toxicidade. Referências ANVISA. Resolução RE n 899, de 29 de maio de 2003b. Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. Disponível em: < Acesso em: 29.set BRASIL. Ministério da agricultura. Instrução Normativa nº 3/2000. Aprova Regulamento Técnico de Métodos de Insensibilização para Abate Humanitário de Animais de Açougue BUBALO, M. C.; RADOŠEVIĆ, K.; SRČEK, V.G.; DAS, R. N.; POPELIER, P.; ROY, K. Cytotoxicity towards CCO cells of imidazolium ionic liquids with functionalized side chains: preliminary QSTR modeling using regression and classification based approaches. Ecotoxicology and Environmental Safety, n. 112, p , LU J, YAN F, TEXTER J. Advanced applications of ionic liquids in polymer science. Progress in Polymer Science. n. 34, p , OBATOMI, D. K.; BRANT, S.; ANTHONYPILLAI, V.; BACH, P. H. Toxicity of atractyloside in precision-cut rat and porcine renal and hepatic tissue slices. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 148, p , TSARPALI, V.; BELAVGENI, A.; DAILIANIS, S. Investigation of toxic effects of imidazolium ionic liquids, [bmim][bf4] and [omim][bf4], on marine mussel Mytilus galloprovincialis with or without the presence of conventional solvents, such as acetone. Aquatic Toxicology, n.164, p , 2015.