COMPARAÇÃO DE DUAS TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS NA IDENTIFICAÇÃO DE OVOS DE FASCIOLA HEPATICA

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1 COMPARAÇÃO DE DUAS TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS NA IDENTIFICAÇÃO DE OVOS DE FASCIOLA HEPATICA COMPARISON OF TWO PARASITOLOGICAL TECHNICS IN IDENTIFICACION OF EGGS WITH FASCIOLA HEPATICA Mary Jane Tweedie de Mattos 1, Fabíola Opitz Vieira da Cunha 2, Sandra Márcia Tietz Marques 3 RESUMO A fasciolose é uma doença parasitária zoonótica, cosmopolita e importante na ovinocultura por causar morbidade e mortalidade. Os objetivos deste trabalho foram de determinar a taxa de ocorrência de fasciolose ovina em cinco regiões do Rio Grande do Sul e comparar duas técnicas coproparasitológicas. Amostras fecais de 385 ovinos foram processadas pelos Métodos de Dennis-Stone & Swanson e Girão & Ueno. O tratamento estatístico dos dados foi obtido através do teste t para comparação das técnicas de diagnóstico. As prevalências nos exames parasitológicos foram de 88,8% (342/385) para o método de Girão & Ueno e de 75,6% (291/385) para o de Dennis-Stone & Swanson. O teste t mostrou diferença significativa (p=0,007) entre as técnicas, com a de Girão & Ueno apresentando maior sensibilidade na detecção de ovos de Fasciola hepatica. Conclui-se que há uma alta prevalência de Fasciola hepatica nos animais amostrados das cinco regiões do Rio Grande do Sul. Palavras-chave: Fasciola hepatica, trematódeo, ovino, diagnóstico parasitológico. ABSTRACT Fascioliasis is a ubiquitous zoonotic parasitic disease with remarkable impact on sheep farming due to its morbidity and mortality. The aims of this study were to determine the prevalence of ovine fascioliasis in five regions of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, and to compare two coproparasitological methods. Fecal samples from 385 sheep were processed 1 Profa. Dra., FAVET/UFRGS. mary.gomes@ufrgs.br 2 Médica Veterinária. opitzf@gmail.com 3 Dra., Dpto Patologia Clínica, FAVET/UFRGS. sandra.marques@ufrgs.br

2 Mattos, M.J.T. et al. 106 by the methods of Dennis-Stone & Swanson and Girão & Ueno. The prevalence rates were 88.8% (342/385) for the method of Girão & Ueno and 75.6% (291/385) for the method of Dennis-Stone & Swanson. The statistical Student s t test showed statistical significance (p=0.007) between the methods, but the method of Girão & Ueno displayed higher sensitivity for the detection of Fasciola hepatica eggs. In conclusion, the prevalence of Fasciola hepatica was high among the sampled animals in the five regions of the state of Rio Grande do Sul. Key words: Fasciola hepatica, trematode, sheep, parasitologic diagnosis. INTRODUÇÃO A fasciolose é uma parasitose cosmopolita que afeta o desenvolvimento da ovinocultura devido à redução na produção de lã, carne e leite, condenação de fígados e à morte de animais (SERRA- FREIRE et al.,1995; DALTON, 1999). No Brasil, estas perdas representam em torno de 15 a 20%. As áreas mais atingidas pela Fasciola hepatica estão localizadas no Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e Goiás (ECHEVARRIA, 1985). Dados de prevalência para fígados ovinos condenados por Fasciola hepatica à inspeção frigorífica no Rio Grande do Sul registraram valores de 9 a 11% (ECHEVARRIA, 1985) e de 4% (MÜLLER et al., 1997). Dados atuais mostram que a condenação de fígados com fasciolose variou de 2,27% a 14,57% para o período de 2000 a 2005 (CUNHA et al., 2007). Os métodos de diagnóstico para animais vivos são tradicionalmente obtidos através da contagem de ovos nas fezes. Para o diagnóstico coproparasitológico, utilizamse na rotina laboratorial as técnicas de Girão & Ueno (filtragem) ou de Dennis- Stone & Swanson (sedimentação espontânea) (UENO & GONÇALVES, 1994). A detecção de ovos nas fezes é diagnóstico de rotina, principalmente em regiões onde não há disponibilidade da realização de técnicas mais avançadas, entretanto, a sensibilidade é de até 30% para animais que apresentam pequeno número de ovos nas fezes ou naqueles em que o período pré-patente da infecção ainda não se instalou. O método da filtragem é incapaz de detectar infecções recentes porque os ovos não aparecem nas fezes até 70 dias pós-infecção (REICHEL, 2002). Mais recentemente, técnicas sorológicas que detectam anticorpos e antígenos circulantes (MOLLOY et al., 2005; MUNGUÍA-XÓCHIHUA et al, 2007; NOVOBILSKY et al., 2007; CHARLIER et al., 2008), coproantígenos (MEZO et al., 2004), ovos obtidos da

3 107 Comparação de duas técnicas... vesícula biliar (BRAUN et al., 1995) ou teste de ELISA no leite de animais suspeitos são também utilizadas (MOLLOY et al., 2005; CHARLIER et al., 2008). As técnicas sorológicas, algumas das quais utilizam antígenos recombinantes, têm se tornado popular (SANTIAGO & HILLYER, 1988; KIM et al., 2003), porém em nosso país ainda não estão disponíveis para avaliações populacionais, estando restritas a pesquisas experimentais, para as quais muitos kits ainda estão sob testes de validação para ovinos, bovinos e bubalinos. REICHEL (2002) concluiu, após testar um kit diagnóstico comercial por ELISA, na Austrália, que ele somente é recomendado para uso em bovinos, pela dificuldade em discriminar entre ovinos positivos e negativos para fasciolose. A real desvantagem dos testes imunológicos é que eles não discriminam entre infecção ativa e infecção precedente. Alguns testes indicam que níveis de anticorpos em muitos animais persistem dando resultado positivo no ELISA por até 12 semanas pós-tratamento anti-fasciola hepatica (CASTRO et al., 2000; MOLLOY et al., 2005). Para a metodologia que utiliza diagnóstico por coproantígenos de Fasciola hepatica, a validação dos kits comerciais quanto à sensibilidade e especificidade, é obtida após infecções experimentais (CORNELISSEN et al., 2001) ou pelo uso de duas distintas populações: uma positiva selecionada de áreas enzoóticas e uma população negativa em área ausente de Fasciola hepatica (MEZO et al., 2004). As técnicas que detectam ovos nas fezes ainda são importantes para selecionar animais positivos e determinar o padrão de infecção, servindo como matriz para outras análises (REICHEL, 2002). Estas técnicas, de simples execução e de custo baixo, ainda são pouco solicitadas pelos ovinocultores em nossa região. Não está, ainda, disponível no Estado, outra metodologia de análise mais sensível e acurada, como os métodos imunológicos para a identificação de animais portadores de Fasciola hepatica. Os objetivos deste trabalho foram estimar a prevalência de Fasciola hepatica em ovinos de diferentes regiões do Rio Grande do Sul e comparar duas técnicas parasitológicas na identificação de ovos de Fasciola hepatica em fezes de ovinos através da porcentagem de animais infectados e do número de ovos em cada método diagnóstico. MATERIAL E MÉTODOS Amostras fecais de 385 ovinos foram coletadas diretamente do reto, colocadas em sacos plásticos e identificadas com o número do animal, propriedade, sexo, número do lote e idade.

4 Mattos, M.J.T. et al. 108 As amostras foram provenientes de 15 municípios pertencentes ao Estado do Rio Grande do Sul e os dados foram agrupados em cinco regiões (Depressão Central, Encosta do Sudeste, Grande Porto Alegre, Litoral Norte e Serra) e obtidas no ano de Após coletadas, eram armazenadas sob refrigeração e encaminhadas ao Laboratório de Helmintologia da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. De cada amostra de fezes foram executadas duas técnicas coproparasitológicas: de Girão & Ueno (princípio da filtragem/quatro tamises) e de Dennis-Stone & Swanson (princípio da sedimentação espontânea), para a identificação e quantificação de ovos de Fasciola hepatica, usando dois gramas de fezes para cada método (UENO & GONÇALVES, 1994). O tratamento estatístico dos dados foi obtido através do teste t para comparação dos dois métodos de diagnóstico (IC 95%) (INSTAT 2). RESULTADOS E DISCUSSÃO A prevalência nos exames coproparasitológicos foi de 88,8% (342/385) para a técnica de Girão & Ueno e de 75,6% (291/385) para a técnica de Dennis-Stone & Swanson. O teste estatístico de t (IC 95%) mostrou diferença significativa (p=0,007) entre elas, com a técnica de Girão & Ueno apresentando maior sensibilidade na detecção de ovos de Fasciola hepatica (TABELAS 1 e 2). TABELA 1. Valores comparativos do número de ovos por grama de fezes (OPG) obtidos pelas técnicas de Girão & Ueno e de Dennis-Stone & Swanson, em fezes de ovinos de cinco regiões (15 municípios) do Rio Grande do Sul, em Girão & Ueno Dennis-Stone & Swanson Número de Amostras Número de Contagens 342 (88,8%)* 291 (75,6%) Positivas (%) Médias dos OPG Amplitude de variação (ovos) * teste t (p= 0,007) mostrou diferença estatística TABELA 2. Amostragem por região do Estado do Rio Grande do Sul e resultado comparativo das técnicas de Dennis-Stone & Swanson e Girão & Ueno para diagnóstico de Fasciola hepatica, em Região Geopolítica Amostras Girão & Ueno Dennis-Stone & Swanson N % N % Depressão Central % 07 53,8% Encosta do % 12 60% Sudeste Grande ,9% ,4% Porto Alegre Litoral ,5% 87 82,8% Norte Serra ,7% 54 65,8% Total ,8% ,6%

5 109 Comparação de duas técnicas... Os resultados obtidos por regiões apresentaram uma variação no percentual de animais portadores de Fasciola hepatica de 81,7% a 100% pela técnica de Girão & Ueno e 53,8% a 82,8% pela técnica de Dennis-Stone & Swanson. Estes resultados são superiores aos observados por GIRÃO & UENO (1985), que ao examinarem fezes de 164 ovinos em cinco municípios do Estado do Rio Grande do Sul, verificaram uma porcentagem de 61,6% e 57,9% pelas técnicas de Girão & Ueno e Dennis-Stone & Swanson, respectivamente. No presente estudo, observou-se que o número médio total de ovos de Fasciola hepatica foi de 34 (técnica de Girão & Ueno) e 26 (técnica de Dennis-Stone & Swanson). Esses valores foram inferiores aos observados por GIRÃO & UENO (1985), cujo OPG (ovos por grama de fezes) médio total foi de 41,6 e de 30,9 respectivamente, pelas técnicas de Girão & Ueno e de Dennis-Stone & Swanson. Ambas as pesquisas demonstraram que o número de ovos de Fasciola hepatica identificados pela técnica de Girão & Ueno foi maior quando comparado com a outra técnica de diagnóstico coproparasitológico. Para animais sob condições de campo, o diagnóstico pelo exame de amostras fecais ainda é a ferramenta mais apropriada que pode ser utilizada para demonstrar a fasciolose por não dispor de testes imunológicos. Estes métodos se prestam ainda para monitoramento e vigilância da fasciolose; entretanto é importante acrescentar estudos de fatores de risco como época do ano, áreas propícias ao desenvolvimento do hospedeiro intermediário e esquemas de tratamento anti-helmíntico. A técnica de Girão & Ueno foi melhor para detectar animais positivos, em comparação com a de Dennis-Stone & Swanson, que falhou em demonstrar ovos de Fasciola hepatica em 51 amostras fecais, resultando em falso-negativo. É correto afirmar que este resultado mostrou animais positivos e com infecção matura, nos quais os trematódeos adultos estavam liberando ovos, que passaram pelo trato intestinal juntamente com as fezes. A sensibilidade e especificidade não foram avaliadas na comparação das duas técnicas utilizadas nesta investigação porque não consideramos, para fins de predição, nenhuma das duas técnicas como padrão-ouro. Porém, pelo teste t (p= 0,007), a técnica parasitológica dos quatro tamises ou princípio da filtração mostrou maior sensibilidade em detectar ovinos positivos. A fasciolose pode, além disso, resultar em um grau de resistência adquirida, que depende da espécie hospedeira, na qual alguns animais

6 Mattos, M.J.T. et al. 110 desenvolvem um grau de resistência inata, que pode estar relacionado à baixa carga parasitária, com conseqüente liberação de ovos nas fezes. Estudos em ovelhas demonstraram que animais sem Fasciola hepatica e sensibilizados com infecção por este trematódeo geraram proteção não significativa ao desafio, enquanto a resistência inata ao parasito pode variar (TORGERSON & CLAXTON, 1999). Planos de programas de vigilância necessitam de estimativas de sensibilidade e especificidade para achar o tamanho da amostra, e epidemiologistas necessitam destes dados para poder ajustar as estimativas de prevalência e outros estudos paramétricos (GREINER & GARDNER, 2000). O conhecimento da prevalência e de zonas nas quais a fasciolose ocorre é vital para tomada de posição de médicos veterinários e produtores, determinando estratégias intervencionistas que possam colaborar para a redução da doença. As técnicas coproparasitológicas usadas neste experimento mostraram alta positividade nas amostras de ovinos das cinco regiões gaúchas investigadas. Entretanto, quando o resultado é positivo mas os animais não apresentam sinais clínicos ou clara perda de produtividade, torna-se difícil para o produtor decidir quanto ao tratamento e controle da fasciolose de seu rebanho, já que a infecção não resulta em perda de desempenho do plantel. CONCLUSÕES Na comparação das duas técnicas parasitológicas, o método de Girão & Ueno foi mais sensível para o diagnóstico da fasciolose em ovinos, em condições de campo. O percentual de infecção por Fasciola hepatica foi superior a 76%, considerado elevado para a amostragem analisada. REFERÊNCIAS BRAUN, U.; WOLFENSBERGER, R.; HERTZBERG, H. Diagnosis of liver flukes in cows: a comparison of the findings in the liver, in the feces, and in the bile. Schweizer Archiv für Tierheilkunde, v. 137, p , CASTRO, E.; FREYRE, A.; HERNANDEZ, Z. Serological responses of cattle after treatment and during natural reinfection with Fasciola hepatica, as measured with a dot-elisa system. Veterinary Parasitology, v. 90, p , CHARLIER, J. et al. Qualitative and quantitative evaluation of coprological and serological techniques for the diagnosis of

7 111 Comparação de duas técnicas... fasciolosis in cattle. Veterinary Parasitology, v. 153, p , CORNELISSEN, J.B.W.J. et al. Early immunodiagnosis of fasciolosis in ruminants using recombinant Fasciola hepatica cathpsin L-like protease. International Journal of Parasitology, v. 31, p , CUNHA, F.O.V.; MARQUES, S.M.T; MATTOS, M.J.T. Prevalence of slaughter and liver condemnation due to Fasciola hepatica among sheep in the State of Rio Grande do Sul, Brazil: 2000 and Parasitología Latinoamericana, v. 62, p , DALTON, J.P. Fasciolosis. 1st ed. Cambridge, UK: University Press, p ECHEVARRIA, F.A.M. Fasciolose: ocorrência, diagnóstico e controle. Agroquímica Ciba Geigy, n. 27, p. 4-9, GIRAO, E.S.; UENO, H. Diagnóstico coprológico quantitativo da fasciolose de ruminantes no Rio Grande do Sul. Pesquisa Agropecuaria Brasileira, v.20, n.4, p , GREINER, M.; GARDNER, I.A. Epidemiology issues in the validation of veterinary diagnostic tests. Preventive Veterinary Medicine, v. 45, p. 3-22, INSTAT 2 GraphPad Instat. GRAPHPAD SOFTWARE V2.04. KIM, K.; YANG, H. J.; CHUNG, Y.B. Usefulness of 8 kda protein of Fasciola hepatica in the diagnosis of fascioliasis. Korean Journal of Parasitology, v. 41, p , MEZO, M.; GONZÁLEZ-WARLETA, M.; CARRO, C.; UBEIRA, F. M. An ultrasensitive capture ELISA for detection of Fasciola hepatica coproantigens in sheep and cattle using a new monoclonal antibody (MM3). Journal of Parasitology, v. 90, p , MOLLOY, J.B. et al. Evaluation of a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibodies to Fasciola hepatica and Fasciola gigantica in cattle, sheep and buffaloes in Australia. Veterinary Parasitology, v. 130, p , MÜLLER, G. et al. Prevalência de fasciolose na região sul do Rio Grande do Sul. In: II Congresso de Medicina Veterinária do Cone Sul, XII Congresso

8 Mattos, M.J.T. et al. 112 Estadual de Medicina Veterinária e XXV Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, 1997, Gramado. Resumos. Gramado: COMBRAVET, p.186. SERRA-FREIRE, N.M. et al. Reinvestigação sobre Fasciola hepatica no Brasil. A Hora Veterinária, Ed. Extra, n. 1, p , MUNGUÍA-XÓCHIHUA, J.A. et al. Prevalence of Fasciola hepatica (ELISA and fecal analysis) in ruminants from a semi-desert area in the northwest of Mexico. Parasitology Research, v. 101, p , NOVOBILSKY, A. et al. Humoral immune responses during experimental infection with Fascioloides magna and Fasciola hepatica in goats and comparison of their excretory/secretory products. Parasitology Research, v. 101, p , TORGERSON, P.; CLAXTON, J. Epidemiology and control. In: DALTON, J.P. Fasciolosis. CAB International, Wallingford, p , UENO, H.; GONÇALVES, P.C. Manual para diagnóstico das helmintoses de ruminantes. Japan International Cooperation Agency, 3rd ed. JICA, Tokyo, p REICHEL, M.P. Performance characteristics of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of liver fluke (Fasciola hepatica) infection in sheep and cattle. Veterinary Parasitology, v. 107, p , SANTIAGO, N.; HILLYER, G.V. Antibody profiles by EITB and ELISA of cattle and sheep infected with Fasciola hepatica. Journal of Parasitology, v. 74, p , 1988.