Epidemiologia e Controle de Fasciola hepatica / BANPESQ/THALES FASCIOLA HEPATICA E QUALIDADE DO LEITE EM BOVINOS NO ESTADO DO PARANÁ

Transcrição

1 Marcelo Beltrão Molento / Departamento de Medicina Veterinária Epidemiologia e Controle de Fasciola hepatica / BANPESQ/THALES FASCIOLA HEPATICA E QUALIDADE DO LEITE EM BOVINOS NO ESTADO DO PARANÁ RESUMO A Fasciola hepatica é o agente responsável pela doença denominada fasciolose, que acomete o fígado de bovinos. Devido à pré-fixação deste trematódeo pode ocorrer morte do hospedeiro pela hemorragia induzida pelas lesões. Portanto, é uma doença de grande impacto econômico para a sanidade de rebanhos bovinos, além de ser uma importante zoonose que se tem tentado elevar a condição para a lista de enfermidades prioritárias. As condições de temperatura no sul do Brasil, inclusive no Paraná, favorecem a sobrevivência do hospedeiro intermediário do parasito, o molusco do gênero Lymnaea. Foram analisadas 1802 amostras de leite de animais com controle leiteiro, oriundas da Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa de propriedades e lacticínios das 10 mesorregiões do Estado do Paraná para testes de ELISA para detecção de anticorpos anti-fasciola hepatica, resultando em uma prevalência de 9,9% (180). Dentre as amostras positivas; 26,11% (47) pertencem a Região Metropolitana de Curitiba; 18,33% (33) Oeste; 16,66% (30) Região Noroeste; 13,33% (24) Centro Sul; 6,11% (11) Centro Oriental; 5,55% (10) Sudoeste; 4,44% (8) do Norte Pioneiro; 3,33% (6) Centro Ocidental; 3,33% (6) Norte Central e 2,77% (5) Sudeste. Dentre as regiões analisadas, a Região Metropolitana de Curitiba apresentou maior número de amostras positivas. 1. INTRODUÇÃO 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA A Fasciola hepatica é um helminto da classe Trematoda que parasita o fígado do hospedeiro definitivo, podendo infectar ruminantes, equinos, suínos e humanos. Mede entre 20 a 50 mm de comprimento e 6 a 12 mm de largura. Para completar seu ciclo de vida, F. hepatica precisa de um hospedeiro intermediário, o caracol Lymnaeidae, o qual apresenta três

2 representantes no Brasil, Lymnaea columella, L. viatrix e L. cubensis (MAURE et al e MAS- COMA, 2005), eliminando a fase infectante de cercária. F. hepatica é o agente responsável pela doença denominada fasciolose, que ocorre principalmente em regiões temperadas, com temperatura entre 10 a 25ºC, além da presença de áreas alagadas e criação animal extensiva, contribuindo para o desenvolvimento deste organismo. Devido à sua grande incidência, a fasciolose tem alto impacto na economia mundial prejudicando a produção de carne bovina. Além de provocar perda de peso nos animais e diminuição da produção de leite, em alguns casos a doença pode causar a morte dos animais. Fêmeas grávidas que tenham ingerido a forma infectante da Fasciola spp também podem ter seus fetos infectados e assim ocasionar perdas financeiras significativas para os criadores de gado (MEZO et. al. 2011). Na figura 1, vê-se através das cores, o número de anos de prevalência de Fasciola hepatica no Brasil, entre 2002 e Figura 1. Distribuição e intensidade de Fasciola hepatica no Brasil. Fonte: Bennema, et al Rev. Inst. Med. Trop. v.56 n.1, São Paulo. O ciclo de vida do parasito pode ser visto na figura 2. A transmissão da doença inicia-se com a eliminação dos ovos da F. hepatica juntamente com as fezes do hospedeiro para o meio exterior. O tempo necessário para eclosão do ovo depende das condições ambientais (SILVA, 2012). Em coleções de água como lagoas ou riachos de águas calmas, o miracídio liberado após a eclosão encontra seu hospedeiro intermediário (caramujo) e penetra ativamente nele. Dentro do caramujo, evolui passando pela forma de esporocisto, depois rédia, até atingir a forma de cercária. Depois, as cercarias são liberadas ficando no fundo da água ou aderidas à vegetação ribeirinha onde se transformam em formas infectantes chamadas metacercárias. Normalmente estes locais servem de bebedouros para o gado que é apascentado nessas áreas (SILVA, 2012).

3 Figura 2. Ciclo de vida de Fasciola hepatica. A fasciolose é considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) uma doença tropical negligenciada, apesar de ocorrer também em regiões temperadas. A transmissão da doença em seres humanos inicia-se do mesmo modo que em bovinos, ou seja, por meio do consumo de verduras cruas e ingestão de água que contenham a forma infectante do parasito. Os bovinos são infectados através da ingestão de água ou alimentos contendo a metacercária. Nos seres humanos a fasciolose afeta principalmente crianças a partir de um a dois anos e mulheres, com prevalência por volta de nove a onze anos, diminuindo depois. A alta prevalência pode ser mantida em adultos, sendo de até 40% em algumas comunidades (MAS-COMA et al., 2009). A fasciolose animal está em expansão no Brasil, apesar da maioria dos casos serem diagnosticados nos estados do Sul. Além de provocar perda de peso nos animais e diminuição da produção de leite, em alguns casos a doença pode causar a morte dos animais. Fêmeas grávidas que tenham ingerido a forma infectante da Fasciola spp também podem ter seus fetos infectados e assim ocasionar perdas financeiras significativas para os criadores de gado (MEZO et. al. 2011). A expansão de casos de fasciolose em animais pode facilitar a transmissão e a disseminação da doença ao ser humano. Gavinho et al. (2008) verificaram a prevalência de F. hepatica em fígado de bovinos abatidos entre agosto de 2007 a março de 2008, quando foram abatidos animais no Paraná. Os autores revelaram que o município de Castro apresentou o maior número de animais positivos, representando 61,6%. Foi demonstrado que seis bovinos de corte moderadamente parasitados com F. hepatica, comparados a outros seis sadios de mesma origem destinados ao abate, obtiveram média de peso de 200 Kg (+/-5,25) e 212,3Kg (+/-12,4), respectivamente. Esta

4 diferença representou uma perda significativa de 5,8% (P=0,004) e um prejuízo de R$ 74,00 por animal no período amostrado. Charlier et al., (2007) em um estudo utilizando amostra de leite a granel-tanque de rebanhos leiteiros, analisaram os níveis de anticorpos contra a F. hepática e associaram com parâmetros de produção (volume, % de proteína, % de gordura do leite) e intervalo entre parto. Observou-se nesse estudo uma diminuição da produção de leite média anual de 0,7 (kg /vaca / dia) com redução de 0,06% no percentual da média de gordura do leite e com um aumento do intervalo entre parto significativo de 4,7 dias nos animais positivos para F. hepática. Em outro estudo mostra que rebanhos altamente positivos (resultado teste de ELISA - anticorpos contra a F. hepatica) produziram uma média de 1,5 (kg / vaca / dia) a menos do que os rebanhos negativos (MEZO et. al. 2011). Os principais sinais clínicos da enfermidade nos animais são a diminuição gradual de peso, fraqueza, anemia, hipoproteinemia e edema subcutâneo, particularmente na região submandibular e no abdômen (BOWMAN 1995). A abrasão causada pelas espinhas e a ação da pré-fixação das fasciolas parece representar a maioria dos danos causados no fígado, e a morte do hospedeiro ocorre em consequência da hemorragia induzida por tais lesões. O trematódeo normalmente é encontrado a partir de exame histopatológico e exame do conteúdo fecal a procura de ovos. (RIET-CORREA et al., 2001). O teste de análise de fezes de ruminantes para detecção de infecção parasitária por Fasciola hepatica é denominado Técnica de quatro tamises, modificada descrita por Girão e Ueno (1994). O material laboratorial para esta análise consiste de um conjunto de quatro tamises confeccionados com telas metálicas de 100, 180, 200 e 250 malhas/polegada, com aberturas de 174, 96, 87 e 65 (micrômetros), respectivamente. Os três primeiros tamises permitem a passagem de ovos de F. hepatica retendo fibras vegetais e restos fecais de acordo com as aberturas das malhas, sendo que o último tamis retém os ovos do parasito juntamente com resíduos finos. A partir do material recuperado é possível a detecção e contagem dos ovos de F. hepatica após a coloração com verde de metila a 0,5%. No entanto, exames coproparasitológicos podem ser aplicados somente após o período de pré-patência, além de que, animais infectados podem não ser detectados pelo teste, constituindose em fonte de infecção responsável pela manutenção da doença nos rebanhos (SÁNCHEZ- ANDRADE et al. 2000). Diante desta dificuldade foram desenvolvidos testes ELISA para detecção de anticorpos tanto em soro quanto em leite que são mais sensíveis permitindo um diagnóstico precoce (REICHEL 2002, SALIMI-BEJESTANI et al. 2005a, MEZO et al. 2007, 2010, SALIMI- BEJESTANI et al. 2007,) e assim mais úteis para a diminuição dos efeitos deletérios acarretados pela fasciolose (BERNARDO, 2013). Os testes baseados em antígenos realizados no soro ou nas fezes podem evitar os inconvenientes associados à presença de anticorpos por longos períodos após o tratamento. Os níveis de antígenos no soro podem ser detectados a partir do sexto dia pós-infecção e assim

5 estes testes podem ser muito úteis no diagnóstico precoce da fasciolose no período pré-patente (LECLIPTEUX et al., 1998), demonstrando que teste baseado em anticorpo monoclonal é um método sensível, específico e adequado para a detecção de F. hepatica no soro e fezes de animais e seres humanos com fasciolose ativa (DUMÉNIGO e MEZO, 1999). O protocolo descrito por Salimi-Bejestani (2005a e 2005b) é baseado na sensibilidade e especificidade para detectar anticorpos em rebanhos com mais de 25% de vacas infectadas, contudo um estudo prévio da ocorrência de fasciolose aumenta a sensibilidade e a especificidade em 96% e 80% respectivamente com base nos resultados de ELISA. Sendo assim detecta baixos níveis de anticorpos liberados no leite, auxiliando a identificação de rebanhos que estão propensos a sofrer perdas de produção por causa da fasciolose (CHARLIER et al., 2007). O nível de exposição a F. hepatica é determinado pela quantidade de anticorpos detectados pelos testes de ELISA aplicados as amostras de leite de tanques de expansão (BENNEMA, 2011). Com os recentes avanços na detecção de anticorpos para F. hepatica em amostras de leite por meio dos testes de ELISA, esta ferramenta vem sendo considerada cada vez mais importante para o monitoramento da distribuição da doença em áreas cada vez maiores, auxiliando na identificação de propriedades onde as medidas de controle devem ser mais efetivas (CHARLIER et al., 2007 e BENNEMA, 2011). Outro fator contribui para isso e que as mesmas amostras de leite que são recolhidas para o monitoramento de rotina da produtividade animal e qualidade do leite pode ser usada para o teste de detecção de anticorpos para F. hepatica, reduzindo assim os custos associados e de perturbação para os animais como resultado de manipulação e de amostragem (MEZO et. al. 2011). 3. MATERIAIS E MÉTODOS Coleta das amostras de leite na APCBRH Foram analisadas 1802 amostras de leite individual de animais com controle leiteiro, oriundas da Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa de propriedades das 10 mesorregiões do Estado do Paraná, para testes utilizando a técnica de ELISA com a finalidade de detectar anticorpos anti-fasciola hepática. As análises foram realizadas no Laboratório de Doenças Parasitárias da Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias Técnica de ELISA O teste de ELISA Indireto é uma técnica utilizada para a detecção de anticorpos, sendo assim, usa-se uma placa contendo antígenos aderidos na parte sólida, e então, coloca-se o soro nos poços presentes na placa. Se existir presença de anticorpos, esses se ligarão aos antígenos presentes na placa formando um complexo: antígeno - anticorpo. Após esse processo é realizada uma lavagem da placa para retirar os anticorpos não ligados e, em seguida, adiciona-se um antianticorpo conjugado, assim formará um complexo anticorpo antígeno anticorpo antianticorpo conjugado. Após um período de incubação, realiza-se outra lavagem da placa, para

6 retirar os anticorpos que não formaram o complexo. Nos casos em que o conjugado é uma enzima, adiciona-se um substrato para a enzima (cromógeno), formando um produto colorido. Por fim, adiciona-se uma solução de parada e a placa é lida com ajuda de um Espectrofotômetro. Os procedimentos operacionais para rmfhcl1 ELISA usados neste trabalho foram escritos e fornecidos pelo Dr. Andreas L. Chryssafidis, da University College Dublin (UCD DUBLIN), atualizado em 13/01/2014 e foram adaptados no Laboratório de Doenças Parasitárias da Universidade Federal do Paraná para uso com soro e leite de bovinos Análise dos dados e confecção de mapas Os resultados obtidos por meio da análise das amostras de leite através da técnica de ELISA serviram na confecção de mapas das regiões paranaenses positivas para F. hepatica. O levantamento georreferenciado (SIG) foi feito através de programa específico (TerraView) para determinar a prevalência e as áreas de risco epidemiológico. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO O diagnóstico de F. hepatica por técnicas tradicionais de sedimentação pode ser feita somente depois do período de pré-patência (8 a 10 semanas após infecção) quando a maioria das lesões patológicas já se desenvolveu (CARNEVALE et. al., 2001). Além disso, esses métodos não são suficientemente sensíveis para detectar infecções de baixa carga parasitária ou quando há vermes imaturos abrigados no parênquima hepático ou ductos biliares (HAPPICH & BORAY, 1969). Entretanto, métodos de imunodiagnóstico, como o ELISA, mostram possuir adequada sensibilidade e especificidade para contornar estes fatores (PHIRI et. al., 2005; SALIMI- BEJESTANI et al., 2008; ARIAS et al., 2012). No presente estudo, para detecção da presença de anticorpos contra Fasciola hepatica no soro do leite bovino foi necessário realizar a padronização da técnica de ELISA. Esta padronização teve por finalidade verificar qual a concentração de soro e conjugado (antianticorpo) é mais eficaz para detectar a presença dos anticorpos. A técnica foi padronizada através do controle positivo de soro de sangue bovino. Sendo assim, foram testadas oito diluições de soro, das quais, as melhores diluições encontradas foram: 1:20 para soro de sangue bovino e 1:6000 para o conjugado (Figura 3), utilizado o cromógeno ABTS (2,2 -diazino do ácido betilbenzotiazolino sulfônico). Após a padronização da técnica de ELISA, foi realizada uma busca para encontrar vacas positivas para F. hepatica (soro de sangue positivo), para que dessa forma, a técnica de ELISA fosse padronizada para a detecção de anticorpos no soro do leite. Sendo assim, foram coletadas amostras (sangue, leite e fezes) de três vacas em uma propriedade localizada em São José dos Pinhais. Todas as amostras foram positivas no exame de fezes e soro de sangue. O soro de leite foi testado por meio da técnica de ELISA empregando as concentrações previamente testadas com soro de sangue, no qual, todas as amostras foram positivas.

7 Absorbância 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Validação Soro - ABTS Diluição do Soro.1:6000.1:8000.1:10000 Figura 3. Validação do soro de sangue bovino utilizando o ABTS como cromógeno. Dessa forma, foi possível padronizar a técnica de ELISA para a análise de soro de leite bovino. Para isso, foram testadas as diluições seriadas, utilizando o cromógeno TMB (tetrametilbenzidina), tendo em vista a maior sensibilidade deste reagente. Através da padronização, constatou-se que a melhor concentração para o soro do leite é usá-lo puro, e para o conjugado a melhor diluição encontrada foi 1:4000 (Figura 4 e 5). Portanto, essas concentrações foram as utilizadas nas análises das 1802 amostras de leite provenientes da Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa. Validação Leite - TMB Absorbância 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000-0, Diluição do Leite 1 : : : Figura 5. Validação do soro de leite bovino utilizando o TMB como cromógeno. O limite de detecção foi calculado a partir da triplicata de 14 amostras das vacas da Fazenda Canguiri, ou seja, dos controles negativos, através das médias da densidade ótica (DO),

8 acrescido de quatro desvios padrão. O ponto de corte foi então estabelecido em 0,1188 e as leituras da DO iguais ou menores do que este ponto de corte foram considerados negativas, enquanto as leituras superiores ao ponto de corte foram consideradas positivas. Das 1802 amostras analisadas, a prevalência de amostras positivas foi de 9,8% (180). Dentre as amostras positivas; 26,11% (47) pertencem a Região Metropolitana de Curitiba; 18,33% (33) Oeste; 16,66% (30) Região Noroeste; 13,33% (24) Centro Sul; 6,11% (11) Centro Oriental; 5,55% (10) Sudoeste; 4,44% (8) do Norte Pioneiro; 3,33% (6) Centro Ocidental; 3,33% (6) Norte Central e 2,77% (5) Sudeste (Mapa 1). Mapa 1. Amostras positivas por mesorregião. A partir dos resultados obtidos, percebe-se que não há correlação de positividade para F. hepatica das vacas leiteiras com os dados de fígados de bovinos de corte condenados pelo Serviço de Inspeção Federal (MAPA/SIF) devido à presença de F. hepatica. BENNEMA et al. (2014), analisaram dados entre 2002 a 2011 de 1032 municípios do Brasil onde fígados bovinos foram condenados em consequência a F. hepatica e o Paraná está na lista dos estados mais acometidos, porém o maior foco da doença se mostrou ao longo do litoral, diferentemente dos dados obtidos pela análise do leite. Contrastando também de Gavinho et al. (2008), em que os autores revelaram que o município de Castro apresentou o maior número de animais positivos através da prevalência de F. hepatica em fígado de bovinos abatidos entre agosto de 2007 a março de A detecção de anticorpos em amostras coletivas de leite em rebanhos que apresentem poucos animais com títulos de anticorpos pode estar condicionada a uma maior ou menor produção de leite desses animais em relação aos demais (CAMILLO, et al., 2011), já que as amostras são provenientes de tanques de resfriamento de lacticínios. Nesse sentido, BARTELS et

9 al. (2007) analisaram amostras coletivas de leite e observaram que o principal fator atribuído para a variação dos níveis de anticorpos foi a proporção de animais positivos que contribuem com o volume do leite. Os títulos de anticorpos no leite podem variar conforme os níveis séricos de anticorpos, estágio de lactação, produção leiteira e presença de reações inflamatórias na glândula mamária (PERINO et al., 1995). 5. CONCLUSÕES A identificação de vacas leiteiras positivas para Fasciola hepatica se torna muito importante devido à diminuição da qualidade e da produção de leite que essa doença causa nos rebanhos, gerando perdas econômicas consideráveis. Através da técnica de ELISA é possível diagnosticar a fasciolose nas mesorregiões e municípios do Paraná, contribuindo para o monitoramento da distribuição da doença e auxiliando na identificação das propriedades onde as medidas de controle devem ser mais efetivas. 6. REFERÊNCIAS ALEIXO, M.; FREITAS, D.F.; DUTRA, L.H.; MALONE, J.B.; MARTINS, I.V.F.; MOLENTO, M.B. Fasciola hepatica: epidemiologia, perspectivas no diagnóstico e estudo de prevalência com uso de programas de geoprocessamento. Semina: Ciências Agrárias, v. 36, n. 3, p , ARIAS, M. S. et al. Enzyme- linked immunosorbent assays for the detection of equine antibodies specific to a recombinant Fasciola hepatica surface antigen in an endemic area. Parasitol. Res. v. 110, p BARTELS, C.J.M. et al. Factors associated with variation in Neospora caninum bulk-milk S/P ratios in initially bulk-milk negative testing Dutch dairy herds. Preventive Veterinary Medicine, v.81, p , BENNEMA, S. The use of bulk tank milk ELISAs to assess the spatio-temporal distribution of helminths in dairy cattle, Thesis for obtaining the degree of Doctor in Veterinary Science (PhD), Universiteit Gent, BENNEMA, S.; SCHOLTE, R.G.C.; MOLENTO, M.B.; MEDEIROS, C.; CARVALHO, O.S. Fasciola hepatica IN BOVINES IN BRAZIL: DATA AVAILABILITY AND SPATIAL DISTRIBUTION. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo. v. 56, n. 1, p , BORAY, J. C.; TAIRA, N.; YOSHIFUJI, H. Zoonotic Potencial of Infection with Fasciola ssp. By consumption of Freshly Prepared Raw Liver Containing Immature Flukes. International Journal for Parasitology. v.27, p , BOWMAN D.D. Parasitology for Veterinarians. 6th ed. EUA. 430p CAMILLO G. et al. Reação de imunofluorescência indireta para detecção de anticorpos anti-neospora caninum em amostras coletivas de leite. Cienc. Rural, v. 41, n. 9, p CARNEVALE, S., M. I. RODRIGUEZ, E. A. GUARNERA, C. CARMONA, T. TANOS, S. O. ANGEL. Immunodiagnosis of fasciolosis using recombinant procathepsin L cysteine proteinase. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. V. 41, p CHARLIER, J.; DUCHATEAU, L.; CLAEREBOUT, E.; WILLIAMS, D.; VERCRUYSSE, J. Associations between anti-fasciola hepatica anti body levels in bulk-tank milk samples and production parameters in dairy herds. Preventive Veterinary Medicine. v. 78, p , 2007.

10 CHARLIER, J.; DE MEULEMEESTER, L.; CLAEREBOUT, E.; WILLIAMS, D.; VERCRUYSSE, J. Qualitative and quantitative evaluation of coprological and serologicalt echiniques for the diagnosis of fasciolosis in cattle. Veterinary Parasitology. v. 153, p , FAIRWEATHER I. Reducing the future threat from (liver) fluke: realistic prospect or quixotic fantasy? Vet. Parasitol. v. 180, p CÍNTIA DAS C. BERNARDO, BARBARA R. DE AVELAR, MARIANA D.C. IGNACCHITI, ISABELLA V.F. MARTINS E MARIA J.S. PEREIRA. Comparação de kits ELISA comerciais para anticorpos no soro e leite com um teste coproparasitológico em bovinos naturalmente infectados por Fasciola hepatica. Pesq. Vet. Bras. v. 33, n. 1, p , GAVINHO, B.; KULEK, A.C.G.; MOLENTO, M.B. Determinação quantitativa e distribuição geográfica de Fasciola hepatica em bovídeos abatidos no frigorífico Argus, São José dos Pinhais, PR. Relatório técnico, Universidade Federal do Paraná. Curitiba, Outubro, CD - Rom pp. HAPPICH, F. A., J. C. BORAY. Quantitative diagnosis of chronic fasciolosis. Comparative studies on quantitative faecal examinations for chronic Fasciola hepatica infection in sheep. infection in sheep. Aust. Vet. J. v. 45, p LECLIPTEUX, T.; TORGERSON, P.R.; DOHERTY, M.L.; Mc COLE, D.; PROTZ, M.; FARNIR, F.; LOSSON, B. Use of excretory/secretory antigens in a competition test to follow the kinetics of infection by Fasciola hepatica in cattle. Veterinary Parasitology, v. 77, p MAS-COMA, S. Epidemiology of fascioliasis in humane demicareas. Journal of Helminthology. v.79, p , MAS-COMA, S.; VALERO, M. A.; BARGUES, M. D. Fasciola, Lymnaeids and Human Fascioliasis, with a Global Overview on Disease Transmission, Epidemiology, Evolutionary Genetics, Molecular Epidemiology and Control. Advances in Parasitology. v.69, p.44-68, MAURE, E. A. P.; BUSTAMANTE, M.; SERRA-FREIRE, M. N.; GOMES, C. D. Dinâmica de Lymnaea columella (Say, 1817), hospedeiro intermediário de Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) em municípios do Estado de São Paulo, Brasil. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, 35, 4, MEZO M., GONZÁLEZ-WARLETA M., CASTRO-HERMIDA J.A., MUIÑO L, CARRO C. & UBEIRA F.M. Association between anti-f. hepatica antibody levels in milk and production losses in dairy cows. Parasitol veterinário. v. 180, p MEZO M., GONZÁLEZ-WARLETA M., CASTRO-HERMIDA J.A., CARRO C. & UBEIRA F.M.. Kinetics of anti-fasciola IgG antibodies in serum and milk from dairy cows during lactation, and in serum from calves after feeding colostrum from infected dams. Vet. Parasitol. v. 168, p MOLLOY J.B., ANDERSON G.R., FLETCHER T.I., LANDMANN J. & KNIGHT B.C. Evaluation of a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibodies to Fasciola hepatica and Fasciola gigantica in cattle, sheep and buffaloes in Australia. Vet. Parasitol. v. 130, p PERINO L.J. et al. Effects of various risk factors on plasma protein and serum immunoglobulin concentrations of calves at post partum hours 10 and 24. American Journal of Veterinary Research, v.56, p , PHIRI, A. M., I. K. PHIRI, S. SIZIYA, C. S. SIKASUNGE, M. CHEMBENSOFU, J. MONRAD. Seasonal pattern of bovine fasciolosis in the Kafue and Zambezi catchment areas of Zambia. Vet. Parasitol. v. 134, p

11 QUEIROZ, V. S.; LUZ, E.; LEITE, L. C.; CÍRIO, S. M. Fasciola hepatica (Trematoda, Fasciolidae): estudo epidemiológico nos municípios de Bocaiúva do Sul e Tunas do Paraná (Brasil). Acta Biol. Par., Curitiba, v. 31, n. 1, 2, 3, 4, p RAPSCH, C.; SCHWEIZER, G.; GRIMM, F.; KOHLER, L; BAUER, C.; DEPLAZES, P.; BRAUN, U.; TORGERSON, P.R. Estimating the true prevalence of Fasiola hepaticain cattles laughtered in Switzerland in the absence of anabsolute diagnostic test. International Journal of Parasitology. v. 36, , RIET-CORREA, F.; SCHILD, A.L.; MÉNDEZ, M.C.; LEMOS, R.A.A. Doenças de Ruminantes e Eqüinos. 2ª ed. Varela. São Paulo. 2001, 658p. ROKNI, M.B.; MASSOUD, J.; O NEILL, S.M.; PARKINSON, M.; DALTON, J.P. Diagnosis of Human fasciolosis in the Gilan providence of Northern Iran: application of cathepsin L_ELISA. Parasitology. v.44, p , SALIMI-BEJESTANI M.R., DANIEL R., CRIPPS P., FELSTEAD S. & WILLIANS D.J.L. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to Fasciola hepatica in milk. Vet. Parasitol. v. 149, p SALIMI-BEJESTANI, M.R.; McGARRY, J.W.; FELSTEAD, S.; ORTIZ, P.; AKCA, A.; WILLIAMS, D.J. Development of anantibody-detection ELISA for Fasciola hepatica and its evaluation against a commercial lyavailable test. Research Veterinary Science. v. 78, p a. SALIMI-BEJESTANI, M.R.; McGARRY, J.W.; FELSTEAD, S.; ORTIZ, P.; AKCA, A.; WILLIAMS, D.J.L. Prevalence of Fasciola hepatica in dairy herds in England and Wales measured with ELISA applied to bulktank milk. Veterinary Research. v. 156, p b. SALIMI-BEJESTANI, M. R., P. CRIPPS, D. J. L. WILLIAMS. Evaluation of an ELISA to assess the intensity of Fasciola hepatica infection in cattle. Vet. Rec. v. 162, p SÁNCHEZ-ANDRADE R., PAZ-SILVA A., SUÁREZ J., PANADERO R., DÍEZ-BAÑOS P. & MORRONDO P. Use of a sandwich- enzyme-linked immunosorbent assay (SEA) for the diagnosis of natural Fasciola hepatica infection in cattle from Galicia (NW Spain). Vet. Parasitol. v. 93, p SILVA, A. E. P., Fasciolose Bovina no Rio Grande do Sul: Distribuição Espacial e Estimativa do Risco usando Análise de Regressão, Técnica de Reconhecimento de Padrões e Geoprocessamento. Dissertação de Mestrado, Programa de Pós Graduação em Sensoriamento Remoto, Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais, INPE, TORGERSON, P.; CLAXTON, J. Epidemiology and Control, p In: DALTON J.P. Fasciolosis. Londres. Cab international. 1999, 543p. VON HOLTUM, C.; STRUBE, C.; SCHINIEDER, T.; von SAMSON-HIMMELSTJERNA, G. Development and evaluation of a recombinant antigen-based ELISA for ser o diagnosis of cattle lungworm. Veterinary Parasitolgy. v. 151, p