Nematoides Entomopatogênicos. Entomopathogenic nematodes

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1 Revista Tropica: Ciências Agrárias e Biológicas, v.6,n. 3 p Centro de Ciências Agrarias e Ambientais-Universidade Federal do Maranhão, MA. Nematoides Entomopatogênicos ISSN Cícero Augusto Guimarães Fuga¹, Rafael Henrique Fernandes², Everaldo Antônio Lopes³ Resumo Os nematoides entomopatogênicos (NEPs) pertencem à ordem Rhabditida e compreendem famílias que são utilizadas no controle biológico de várias espécies de insetos e ácaros. Atualmente são conhecidos três gêneros de nematoides entomopatogênicos: Steinernema, Neosteinernema e Heterorhabditis. Estes nematoides carregam consigo bactérias simbióticas que infectam o inseto, assim como os nematoides, causando a sua morte e alimentando-se das reservas do cadáver. Estes organismos vêm sendo usados no Brasil e em outros países para este fim. Contudo, vários são os entraves para o uso de NEPs no controle de pragas. Dentre eles destacam-se a variação na eficiência, a dificuldade de formulação e pequena vida de prateleira dos produtos, uso de altos volumes de calda na pulverização, a própria produção dos nematoides e a especificidade das pragas controladas. Assim, a utilização de NEPs para o controle de pragas se mostra como mais uma ferramenta a ser estudada e desenvolvida no manejo integrado de pragas, aumentando as alternativas de controle e evitando o uso de pesticidas. Palavras chave Bactérias simbióticas, manejo integrado, insetos praga. Entomopathogenic nematodes Abstract The entomopathogenic nematodes (NEPs) belong to the order Rhabditida and include families that are used in biological control of several species of insects and mites. Currently there are three known genera of entomopathogenic nematodes: Steinernema, Neosteinernema and Heterorhabditis. These nematodes carry symbiotic bacteria that can infect the insect as well as nematodes, causing his death and feeding on the body's reserves. These organisms have been used in Brazil and other countries for this purpose. However, there are several barriers to the use of NEPs in pest control. Among them stand out from the variation in efficiency, the difficulty of formulating and short shelf life of products, using high spray volumes on spray, the production itself and the specificity of nematode pests controlled. Thus, the use of NEPs for pest control appears as one more tool to be studied and developed in integrated pest management, increasing the options for control and avoiding the use of pesticides. Keywords Symbiotic bacteria, integrated management, insect pests. INTRODUÇÃO Nematoides ou vermes cilíndricos não segmentados pertencem ao Filo Nematoda e estão entre os organismos mais numerosos do planeta. A ordem Rhabditida compreende famílias de nematoides entomopatogênicos (=NEPs) utilizados no controle biológico de várias espécies de insetos e ácaros. Dentro desta ordem as duas maiores famílias de ¹ Autor para correspondência: ciceroguimaraesf@hotmail.com Mestrando em Produção Vegetal - Universidade Federal de Viçosa Campus de Rio Paranaíba, Rio Paranaíba MG. Brasil. CEP Graduando em Agronomia - Universidade Federal de Viçosa Campus de Rio Paranaíba, Rio Paranaíba MG. Brasil. CEP Correio eletrônico: rafaelagro13@hotmail.com 3 Professor Universidade Federal de Viçosa, Campus Rio Paranaíba. Rio Paranaíba MG. Brasil. CEP Correio eletrônico: everaldolopes@ufv.br NEPs são Steinernematidae e Heterorhabditidae. A descoberta e a descrição de espécies de NEPs possibilitou a utilização de mais uma alternativa biológica para se controlar insetos pragas em diversas culturas, o que historicamente acompanha a evolução da agricultura. Após a descoberta inicial e subsequente desenvolvimento de Steinernema glaseri como um agente de controle biológico no início do século 20, as pesquisas sobre nematoides entomopatogênicos V. 6, N.3, pág.56,2012

2 permaneceram paradas devido a introdução de produtos químicos. Após o reconhecimento de seus efeitos ambientais negativos na década de 1960, pesticidas tornaram-se gradualmente mais restritos, menos eficazes e muito mais caros. Consequentemente, a busca de alternativas biológicas para químicos baseados em programas de manejo de pragas tem recebido renovada atenção dos cientistas (Adams; Nguyen, 2002). Atualmente são conhecidos três gêneros de nematoides entomopatogênicos: Steinernema, Neosteinernema e Heterorhabditis (Burnell; Stock, 2000). A família Steinernematidae Chitwood e Chitwood (1937) é atualmente composta por dois gêneros: Steinernema Travassos (1927) e Neosteinernema Nguyen e Smart (1994). O primeiro gênero possui 25 espécies descritas e o segundo apenas uma espécie: N. longicurvicauda. A família Heterorhabditidae Poinar, compreende somente um gênero, Heterorhabditis Poinar (1976) com H. bacteriophora como a espécie tipo e oito espécies descritas (Adams et al., 1998). Espécies de NEPs têm sido descritas principalmente utilizando-se critérios morfológicos/morfométricos. Entretanto, com o advento do uso de técnicas moleculares como padrões de isoenzima, padrões de proteína total, RFLP, RAPDs, sequenciamento de DNA genômico a descrição de novas espécies têm sido facilitadas, o que apresenta ainda certa restrição devido à falta de profissionais capacitados. O uso de técnicas moleculares podem ser usadas inclusive no estudo de afinidades filogenéticas entre NEPs (Burnell; Stock, 2000). O estádio infectivo de Steinernema carrega células de uma bactéria simbiótica na parte anterior do intestino (gênero Xenorhabdus). Quando juvenis infectivos entram na hemocele de um hospedeiro, eles liberam a bactéria. A bactéria multiplica-se rapidamente na hemolinfa do inseto e mata o inseto por septicemia, normalmente dentro de h. Os nematoides, em seguida, se alimentam e mudam para terceiro e quarto estádio juvenil, respectivamente, onde se tornam fêmeas e machos adultos de primeira geração. Após o acasalamento, as fêmeas fazem a postura de ovos que eclodem juvenis de primeira fase e que mudam sucessivamente para as fases de segundo, terceiro e quarto estádio juvenil. Os juvenis do quarto estádio se desenvolvem em fêmeas e machos adultos da segunda geração. Dessa forma, o ciclo e a reprodução do nematoide continua até que os recursos do cadáver se esgotem, geralmente permitindo duas ou três gerações. Se a oferta de alimentos é limitada, os ovos produzidos pela primeira geração de fêmeas desenvolvem diretamente em juvenis infectantes. Quando recursos do cadáver se extinguem, juvenis de segundo estádio deixam de se alimentar e incorporam um pellet de bactérias na câmara bacteriana, ou vesícula. Eles, então, mudam V. 6, N.3, pág.57,2012

3 para o estádio pré-infectivo e infectivo, mantendo a cutícula do segundo estádio como uma bainha. Os juvenis infectivos em seguida, normalmente deixam o cadáver em busca de um novo hospedeiro. Juvenis infectivos não se alimentam e podem sobreviver no solo por vários meses (Adams; Nguyen, 2002). O ciclo de vida de Neosteinernema é semelhante ao de Steinernema, exceto que Neosteinernema tem apenas uma geração. As fêmeas saem para o meio ambiente e a prole se transforma em juvenis infectivos no corpo feminino, antes de emergir a partir dele. A bactéria endossimbionte de Neosteinernema tem sido observada, mas permanece descaracterizada (Adams; Nguyen, 2002). O ciclo de vida de Heterorhabditis também é semelhante ao de Steinernema, mas a fêmea é hermafrodita e substitui a primeira geração em relação a Steinernema e a bactéria simbiótica é Photorhabdus. Este gênero possui outra particularidade em relação a Steinernema, os juvenis se desenvolvem através de um processo denominado endotoquia matricida. Os juvenis se desenvolvem dentro dos ovos ainda no corpo da fêmea hermafrodita, que ao eclodirem dentro do corpo da mãe ocasionam sua morte (Adams; Nguyen, 2002). Dentro dos gêneros Heterorhabditis e Steinernema, há uma variação considerável nas estratégias de busca do hospedeiro. Juvenis infectivos de nematoides são móveis, e seu comportamento de busca podem ser divididos em duas categorias: rastreamento (móveis) e emboscada (se mantém imóveis na maior parte do tempo, até infectarem o inseto) (Lewis et al., 2006). Nematoides que se movimentam no solo têm uma maior probabilidade de encontrar hospedeiros sedentários do que nematoides de emboscada, e estes são mais eficazes do que os móveis em busca de hospedeiros com alta mobilidade. Durante a busca pelo hospedeiro, os nematoides geralmente respondem a sinais voláteis, ou sinais dissolvidos em água, que são liberados pelo hospedeiro ou por plantas. Por exemplo, sinais que emanam das raízes das plantas podem influenciar o comportamento de nematoides entomopatogênicos. Sinais de plantas injuriadas pela alimentação do inseto fornecem informações mais específicas sobre a presença de hospedeiros em potencial. NEPs também respondem a sinais específicos produzidos pelo próprio inseto (fezes, níveis de CO 2, gradientes de temperatura e outros subprodutos do metabolismo do inseto) (Lewis et al., 2006). Uma vez que um nematoide se aproxima de um inseto hospedeiro, ele deve mudar seu comportamento para penetrar na hemocele do inseto. Esses comportamentos podem ser energeticamente caros e a penetração em um hospedeiro inadequado poderia ser fatal para um nematoide, devido a uma resposta imunológica contra o nematoide. A V. 6, N.3, pág.58,2012

4 capacidade de reconhecer hospedeiros adequados antes da penetração é comum em populações de nematoides entomopatogênicos. O termo reconhecimento do hospedeiro descreve a reação para estímulos de infecção, que em última análise, resultam em penetração na hemocele do hospedeiro (Lewis et al., 2006). Nematoides entomopatogênicos podem penetrar na hemocele de um hospedeiro através da cutícula, através da parede do intestino passando pelo ânus ou boca e através da cutícula traqueal pelos espiráculos. Dependendo do hospedeiro e as espécies de nematoides, diferentes rotas de penetração são tomadas. Uma via de entrada é através da abertura da boca ou do ânus. A entrada de juvenis infectivos pela boca pode ter a mandíbula do inseto como barreira, pois esta pode esmagar o nematoide levando-o a morte. Usando o ânus como um local de entrada evita-se este problema, entretanto, a defecação frequente pode expulsar os nematoides. Quando os nematoides atingem o cecos gástricos, túbulos de Malpighi ou a cavidade entre a membrana peritrófica e o epitélio do intestino médio, a expulsão com fezes é evitada. Outro problema com a infecção parasitária através do trato intestinal é o fluido do intestino do hospedeiro, que pode matar até 40% dos nematoides e reduz significativamente a penetração através do intestino (van Tol et al., 2001). Alternativamente, nematoides entomopatogênicos podem entrar pelo sistema traqueal através dos espiráculos. Após entrar no sistema traqueal ou no intestino do inseto, o juvenil infectivo ainda deve passar pela traquéia ou pela parede do intestino. A parede da traquéola é frágil e pode ser penetrado apenas pela pressão mecânica da cabeça pontiaguda do nematoide. A parede do intestino, no entanto, é em parte protegida pela membrana peritrófica, que pode ser um sério obstáculo para os nematoides. Há evidências de que secreções enzimáticas dos nematoides estão envolvidas na penetração, pelo menos em espécies de Steinernema (Lewis et al., 2006). Ao penetrar na hemocele do inseto, o juvenil infectivo encontra a resposta do sistema imunológico do hospedeiro. Nematoides podem ser presos em cápsulas celulares ou não celulares. As cápsulas não celulares são formadas pelo acúmulo de melanina e são formadas rapidamente (Lewis et al., 2006). Não são exatamente conhecidos todos os eventos da penetração no hospedeiro e os fatores envolvidos, entretanto tem sido intensamente estudado.os nematoides entomopatogênicos, Heterorhabditis spp. e Steinernema spp. possuem bactérias simbiontes do gênero Photorhabdus spp. e Xenorhabdus spp., respectivamente. Ambos os grupos de NEPs têm ciclos de vida semelhantes, onde o juvenil infectivo (JI), ou um terceiro estágio juvenil modificado V. 6, N.3, pág.59,2012

5 semelhante ao JI, especificamente, transmitem a bactéria simbiótica para a hemocele dos insetos hospedeiros. No entanto, existem diferenças marcantes entre esses dois gêneros de nematoides e suas respectivas interações simbióticas (Lewis et al., 2006). Uma diferença são os modos de reprodução dos nematoides. Heterorhabditis spp. são heterogônicos, tendo dois modos de reprodução: hermafrodismo e anfimixia, que parecem ser ambientalmente regulado. Steinernema spp. possuem apenas o modo de reprodução por anfimixia (Lewis et al., 2006). Outra diferença é a localização física do simbionte dentro do JI. Heterorhabditis bacteriophora Poinar apresenta bactérias simbióticas predominantemente na porção anterior do intestino, podendo estender-se ao longo de todo o intestino (Ciche; Ensign, 2003). Steinernema carpocapsae Weiser apresenta bactérias simbióticas em uma vesícula bi-lobada na porção anterior do intestino (Martens et al., 2003). Em ambos os nematoides, os simbiontes são capazes de persistir por muitas semanas dentro dos juvenis infectivos de vida livre, até se tornar patogênicas quando liberadas dentro da hemocele de insetos. Os mecanismos de liberação também são diferentes. Juvenis infectivos de H. bacteriophora liberam a bactéria simbiótica pela boca em um processo de regurgitação (Ciche; Ensign, 2003), enquanto que juvenis infectivos de S. carpocapsae defecam seus simbiontes (Martens et al., 2004). Uma vez que o complexo NEP-bactéria obteve sucesso matando um hospedeiro, cada um deles cresce e se reproduzem dentro do cadáver. Durante a infecção, nematoides crescem por 2 a 3 gerações, onde a maioria dos nematoides inicialmente evita a fase infectiva de terceiro estádio juvenil, mas depois se desenvolvem em juvenis infectivos, que se tornam colonizados por bactérias simbióticas (Gaugler, 2002). Antes da infecção de um inseto, a bactéria fica quiescente e a atividade do nematoide funciona como um vetor para o simbionte bacteriano. As bactérias são bem protegidas do meio ambiente no intestino JI até sua liberação na hemocele de insetos. Os mecanismos para a colonização simbionte do intestino do JI não são bem conhecidos. Uma hipótese é que a função digestiva do intestino é reduzida durante o estágio pré-infectivo (J2) e, assim, as células bacterianas sobrevivem no intestino, em vez de serem digeridas. Esse modelo simples não consegue explicar o alto grau de especificidade que é observado para a colonização do JI. Outra hipótese é uma forte seleção que é empregada pelo JI para selecionar a colonização simbionte específica. Portanto, simbiontes devem ter qualidades únicas que conferem resistência aos mecanismos seletivos, sendo a retenção das bactérias nos JIs na maior parte de espéciesespecíficas (Ciche et al., 2006). V. 6, N.3, pág.60,2012

6 Na fase patogênica do mutualismo, os juvenis infectivos carreiam seus simbiontes bacterianos até um inseto hospedeiro potencial. Uma vez que o nematoide entrou na hemocele, o complexo NEP-bacteria enfrenta os mecanismos de defesa do inseto, que, por exemplo, mediam o encapsulamento e melanização de invasores. Simultaneamente (entre 1 e 5h após a infecção), os simbiontes bacterianos são liberados a partir dos juvenis infectivos (Ciche; Ensign, 2003; Martens et al., 2004). Uma vez liberada, as células bacterianas podem ser fagocitadas, injuriadas por peptídeos antimicrobianos (por exemplo, cecropin), e sequestrados em nódulos por granulócitos. Os nematoides e bactérias, aparentemente, colaboram para controlar insetos. Por exemplo, o nematoide inibe a cascata pro-feniloxidase, que é necessária para não-auto-reconhecimento e melanização, bem como a atividade antimicrobiana da hemolinfa. A bactéria também tem sido implicada na influencia da imunidade de insetos por meio de atividades enzimáticas, supressão da ativação de feniloxidase, citotoxicidade a hemócitos e produção de proteases que destroem hemócitos e produção de toxinas de alto peso molecular (Brillard et al., 2001; Caldas et al., 2002; Cowles; Goodrich-Blair, 2005; Morgan et al., 2001). Assim, é óbvio que muitos fatores de virulência são empregados para NEPs e bactérias associadas que infectam insetos, no entanto, não está claro quais os mecanismos de virulência que atuam especificamente. Embora variável, a contribuição simbionte bacteriana aos hospedeiros matando insetos está bem estabelecida. Segundo Grewal e Conserve (1997), a interação entre as bactérias simbióticas e os nematoides não é tão específica como se pensava. Em seus estudos, esses autores observaram que juvenis de S. scapterisci contendo bactérias de outro nematoide foram mais patogênicos à Galleria mellonella do que carregando seu simbionte natural. Em alguns casos, o simbionte e o nematoide contribuem sinergicamente para virulência. Em outros casos, o simbionte bacteriano não parece contribuir para a virulência. Assim, Xenorhabdus poinarii pode não matar larvas de G. mellonella, mas os nematoides podem. Finalmente, há exemplos em que o nematoide confia totalmente em seu simbionte bacteriano para matar o inseto, que normalmente é o caso de Heterorhabditis spp. (Han; Ehlers, 2000). USO DE NEMATOIDES ENTOMOPATOGÊNICOS NO CONTROLE BIOLÓGICO Uso de NEPs em outros países Atualmente, existem empresas especializadas na produção em massa de NEPs e de formulações prontas para a aplicação. Um dos estudos mais recentes envolvendo a aplicação de NEPs no campo diz respeito ao controle de uma larva de mariposa que incide sobre culturas de amêndoas. A espécie de nematoide empregada é Steinernema carpocapsae, V. 6, N.3, pág.61,2012

7 abundante na América do Norte e a eficiência obtida foi bastante significativa, atingindo até 78% de morte para larvas e pupas de Cydia latiferreana (Chambers et al., 2010). Fatores como a redução do emprego de pesticidas são importantes argumentos a favor do emprego de NEPs em controle biológico. No entanto, o alto custo de produção e aplicação restringe seu uso em diversas culturas (Gaugler, 2002). A adoção de nematoides entomopatogênicos como agentes de controle de pragas pelos produtores depende de vários fatores além de uma eficácia aceitável. Fatores como custo, prazo de validade, manuseio, mistura, compatibilidade, margens de lucro para os fabricantes e distribuidores contribuem para o fracasso de nematoides serem inseridos em muitos mercados. A maioria dos mercados atuais é limitada a insetos específicos e apenas alguns países utilizam esse método de controle. Existem relatos na literatura que demonstram o potencial destes nematoides no controle de pragas em outros países nas culturas de citros, nozes, cogumelos, morango, flores ornamentais e grama em campos de golfe (Grewal et al., 2008). Larvas do mosquito Bradysia coprophila causam danos e reduzem o peso de raízes e vigor de uma grande variedade de plantas ornamentais. Acredita-se que a alimentação larval predispõe as plantas ao ataque de fungos patogênicos. S. feltiae é um substituto eficaz e econômico para inseticidas químicos na indústria da floricultura na Holanda, Inglaterra e Alemanha (Jagdale et al., 2004). Nos EUA, o sucesso comercial tem sido limitado, provavelmente devido às altas temperaturas nas casas de vegetação que afetam a viabilidade de nematoides e da disponibilidade de numerosos inseticidas registrados ao contrário da Europa Ocidental. Jagdale et al. (2004) observaram que uma única aplicação de S. feltiae (2,5 x 10 6 JIs/m 2 ) em larvas de segundo, terceiro e quarto ínstar, em temperaturas abaixo de 25 C produziu alto nível de controle. Os insetos minadores de folhas, Liriomyza spp., estão entre as principais pragas de campo e casa de vegetação de legumes e plantas ornamentais em todo o mundo. As minas causadas pelas larvas destroem o mesófilo foliar, diminuindo o nível de fotossíntese e permite a entrada de patógenos. Testes em casa de vegetação têm demonstrado o potencial do uso de nematoides, especialmente S. feltiae, para aplicação foliar contra os estágios larvais. Em geral, para conseguir o controle confiável, alto volume de pulverização é essencial para permitir que os nematoides entrem em contato com as larvas. Manutenção de umidade relativa alta (acima de 90%) na casa de vegetação de pelo menos 6-8 h após as aplicações de nematoides é fundamental para o sucesso do controle (Arthurs et al., 2004; Williams; Walters, 2000). O melhor controle de Liriomyza trifolii foi alcançado com 2-4 aplicações semanais de V. 6, N.3, pág.62,2012

8 S. carpocapsae ou S. feltiae na concentração de 1 x 10 6 JIs/m 2 contra o segundo e terceiro instares das larvas (Lebeck et al., 1993; Williams; Walters, 2000). O gorgulho da cenoura, Listronotus oregonensis, é uma praga importante da cenoura, aipo e salsa na região nordeste da América do Norte. Adultos hibernam próximos da superfície do solo, associado com material vegetal e detritos. Na primavera, rastejam sobre a superfície do solo, e mais tarde os ovos das fêmeas são depositados nos pecíolos da planta. As larvas perfuram raízes de plantas jovens e alimentam-se da superfície das raízes. Uma medida que auxilia no controle do gorgulho da cenoura é a aplicação de H. bacteriophora antes do semeio das culturas susceptíveis, visto que esta espécie de nematoide infecta as larvas do gorgulho causando a sua morte. Em estudos de laboratório as larvas foram mais suscetíveis que os adultos. Fêmeas infectadas após 2 dias pararam a oviposição. Este último efeito foi especialmente interessante para abordagens de controle que visam prevenir a oviposição por fêmeas na primavera (Miklasiewicz et al., 2002). Em Ohio, EUA, a aplicação no solo de S. carpocapsae e H. bacteriophora em cenoura e salsa à concentração de 3,3 x 10 9 JIs/ha não teve efeito sobre o rendimento, mas os tratamentos com H. bacteriophora persistiram mais tempo e resultaram em maior mortalidade de L. oregonensis e sobrevivência das plantas (Miklasiewicz et al., 2002). Apesar de os nematoides mostrar alguma promessa para o controle do gorgulho da cenoura, eles não podem competir com inseticidas químicos convencionais, mas podem auxiliar no manejo do inseto, mantendo sua população em níveis menores (Miklasiewicz et al., 2002). Várias espécies de curculionídeos alimentam das folhas e raízes de árvores cítricas. O polífago gorgulho da raíz, Diaprepes abbreviatus, é uma das maiores pragas de citros e inúmeras outras culturas na Flórida e da Bacia do Caribe (McCoy, 1999). Dados referentes à distribuição geográfica e efeito econômico do gorgulho são escassos, mas mais de ha de citros em todas as regiões produtoras da Flórida, eram conhecidos por serem infestadas, em Atualmente não há inseticidas químicos registrados na Flórida para controlar as fases larvais do gorgulho no solo, então os produtores têm adotado amplamente o uso de nematoides entomopatogênicos comercialmente formulados. Steinernema glaseri, S. carpocapsae e H. bacteriophora foram as primeiras espécies avaliadas para o controle do gorgulho (Bullock; Miller, 1994). O uso das duas últimas espécies, em concentrações que variaram de JIs/cm 2, suprimiu o surgimento de gorgulhos adultos no campo em até 60-80% durante 1 ano. Testes de campo para avaliar a eficácia de S. riobrave em solos arenosos em que as V. 6, N.3, pág.63,2012

9 árvores jovens foram tratadas com concentrações de JIs/cm 2 resultaram na redução de 77-93% do D. abbreviatus um mês após o tratamento e % de supressão dos gorgulhos adultos por mais de um ano (Duncan; McCoy, 1996). Eficácia tem sido menos evidente e mais variável quando S. riobrave e H. indica foram avaliados em árvores maduras, variando de 0 a 66% de supressão das larvas ou do adulto. Árvores maduras são tratadas com taxas mais baixas de nematoides que as árvores jovens (normalmente JIs/cm 2 ), devido ao acrescentado custo do tratamento quanto maior a área sob o dossel (Duncan et al., 2003; McCoy et al., 2002). Sphenophorus spp., são importantes pragas de gramado em grande parte do Japão e EUA. O dano é causado pela alimentação das larvas jovens no interior do pecíolo e as larvas mais velhas alimentando externamente, da parte aérea da planta. S. venatus vestitus Chittenden, uma praga de gramíneas de estação quente, no sul dos EUA e no Japão, é o inseto-praga mais importante em campos de golfe. Não há estudos detalhados sobre a interação dos nematoides com o inseto, mas parece que as larvas são mais suscetíveis a infecções do que os adultos. Em testes de campo em Ohio, EUA, dirigidas contra as larvas no solo, obteve-se controle de S. parvulus por S. carpocapsae em torno de 78% e H. bacteriophora 74% em média, sendo semelhante ao controle feito por inseticidas (Georgis et al., 2006). Uso de NEPs no Brasil No Brasil, uma das iniciativas de sucesso foi o emprego de juvenis infectantes de H. indica no controle da lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), uma praga de milho (Garcia et al., 2008). Análises conduzidas no campo mostram que esta espécie de NEP encontrada no Brasil produz resultados semelhantes àqueles decorrentes do controle utilizando Steinernema, embora no caso de Heterorhabditis as quantidades de juvenis infectivos aplicadas sejam maiores. Também já foram conduzidos experimentos com Heterorhabditis spp. para o controle do bicho da goiaba (Conotrachelus psidii), uma larva de besouro responsável por grande prejuízo econômico na produção dessa fruta (Dolinski et al., 2006). O primeiro estudo realizado no Brasil, avaliando nematoides contra adultos do bicudo das gramíneas Sphenophorus levis, mostrou o potencial desses agentes para uso como uma alternativa no controle desse inseto (Goulart et al., 2004). Tavares (2006) avaliou a ação do nematoide Steinernema sp. IBCB n6 contra larvas de S. levis em estufa, obtendo mortalidade corrigida pela fórmula de Abbott (1925), descrita a seguir, de 67% na dosagem de 2,4 JIs/cm 2. Para adultos do inseto, obtevese mortalidade de 70% quando misturado a mesma dosagem do nematoide com ¼ da dose recomendada do inseticida thiamethoxam. V. 6, N.3, pág.64,2012

10 Cabe ressaltar que a dosagem de 2,4 JI/cm 2 equivale a 1 x 10 8 JI/ha (considerando-se a aplicação somente na faixa de 30 cm de cada lado da linha de plantio), constituindo-se, portanto, uma dosagem bastante baixa comparada às dosagens de outros nematoides entomopatogênicos usados no controle de insetos do gênero Sphenophorus. Fórmula de Abbott (1925): Mc (%) = %Mo - %Mt x %Mt Mc = Mortalidade corrigida Mo = Mortalidade observada Mt = Mortalidade na testemunha Em trabalho recente com Diabrotica speciosa, Santos (2009) obteve mortalidade de larvas causada por S. glaseri variando entre 34 e 90% nas concentrações de 50 e 200 JI/inseto e entre 64 e 96% nas concentrações de 50 e 300 JI/inseto quando aplicado Heterorhabditis sp. Outros trabalhos demonstram resultados promissores para o controle de diversos insetos, como Mahanarva fimbriolata (Leite et al., 2005), M. fryanus (Machado et al., 2005), Dysmicoccus texensis (Andalo et al., 2004) e Bradysia mabiusi (Leite et al., 2007). Entretanto, nenhum produto comercial a base de nematoides foi registrado ainda para o controle de pragas e os trabalhos a campo são escassos. O desenvolvimento de nematoides eficazes no controle de insetos no contexto da agricultura sustentável é um grande desafio. Por causa do baixo impacto ambiental e seletividade de nematoides, eles têm potencial para serem componentes valiosos do manejo integrado de pragas e programas de manejo da resistência. O uso de nematoides nos tanques de pulverização em rotação com pesticidas, com outros agentes biológicos, feromônios e outros métodos de controle, aliado com menores custos de produção pode expandir o uso de NEPs nos países que já os utilizam e implementá-los em países que não adotam a tecnologia como o Brasil. As pesquisas com NEPs \no Brasil para o controle de insetos pragas tem sido realizadas recentemente com o intuito de poderem ser usadass no manejo integrado de pragas, entretanto, há poucos relatos de pesquisas aplicadas avaliando o potencial de nematoides em se transformarem em produtos aplicáveis no campo. Em relação, aos países desenvolvidos, a implementação de nematoides em programas de MIP, provavelmente irá aumentar a sua utilização em cultivos orgânicos, um mercado que está crescendo rapidamente nos EUA, Canadá e Europa Ocidental (Georgis et al., 2006) FORMULAÇÃO E TECNOLOGIA DE APLICAÇÃO Formulações para armazenamento e aplicação de NEPs Armazenamento e sobrevivência pósaplicação são os principais obstáculos para a V. 6, N.3, pág.65,2012

11 ampliação do uso de nematoides entomopatogênicos como bioinseticidas. Nenhuma formulação de nematoides atende às exigências de 2 anos de vida útil de pesticidas químicos padrão. Formulação de NEPs refere-se à preparação de um produto a partir de um ingrediente ativo (espécie de nematoide) e substâncias não-ativas (inertes). Formulações se destinam a melhorar a atividade do produto, facilidade de uso ou a estabilidade de armazenamento de um ingrediente ativo. Exemplos típicos de ingredientes de formulação de pesticidas (aditivos) incluem adsorventes, antiaglomerantes, antioxidantes, dispersantes, umectantes, conservantes, solventes, tensoativos, espessantes e protetores de UV. Embora o conceito geral de formulações de nematoides é semelhante a formulações de pesticidas tradicionais, os nematoides apresentam desafios únicos. Oxigênio, umidade, sensibilidade a extremos de temperatura, e o comportamento dos juvenis infectantes limitam a escolha do método de formulação e os ingredientes. Os principais objetivos de formulações de NEPs incluem a manutenção da qualidade, aumento da estabilidade de armazenamento, a melhoria na facilidade de transporte e utilização, redução dos custos de transporte e aumento da sobrevivência de nematoides durante e após a aplicação (Shapiro-Ilan et al., 2006; Grewal, 2002). Os NEPs são geralmente formulados em substratos não líquidos ou semi-líquidos logo depois que eles são produzidos, pois a armazenagem em água apresenta diversos fatores que influenciam a efetividade do nematoide devido estes possuírem alta demanda de oxigênio, sensibilidade de algumas espécies de nematoides a baixas temperaturas, a susceptibilidade à contaminação microbiana e toxicidade de agentes antimicrobianos (Shapiro-Ilan et al., 2006). São utilizados três processos de formulação de NEPs: formulações com nematoides móveis, formulações com nematoides com mobilidade reduzida e formulações com nematoides em anidrobiose. Formulações com nematoides ativamente móveis se baseiam na mistura de nematoides em substância inerte com pequenas quantidades de nematoides. Nessas formulações, os nematoides são totalmente ativos e movem-se livremente dentro ou sobre o substrato. É uma formulação simples, mas todos os produtos necessitam de refrigeração durante a armazenagem e transporte, tornando-a cara. As formulações com nematoides em mobilidade reduzida são desenvolvidas de forma que o movimento é minimizado através de armadilhas físicas ou usando inibidores metabólicos. Exemplos de tais formulações incluem alginato e gel fluido e um líquido concentrado contendo um inibidor metabólico. Já a formulação com V. 6, N.3, pág.66,2012

12 nematoide em anidrobiose se baseia em reduzir a taxa de consumo das reservas de energia armazenada por juvenis infectantes. NEPs são capazes de entrar somente em estado de anidrobiose parcial, sendo referida, portanto, como anidrobiose quiescente. Apesar de dessecação de nematoides em umidades relativas controladas tem sido demonstrado, este método apresenta pouco sucesso comercial. As formulações contendo nematoides em anidrobiose parcial incluem géis, pós e granulados (Shapiro-Ilan et al., 2006; Grewal, 2002). Várias formulações de nematoides entomopatogênicos podem ser utilizadas em aplicação no solo, incluindo carvão ativado, alginato, e géis de poliacrilamida, iscas, argila, turfa, esponja de poliuretano, vermiculita, e grânulos dispersíveis em água (WDG). Formulações podem estender a vida útil através da redução do metabolismo de nematoides e imobilização. Algumas formulações, como iscas têm o potencial para aumentar a eficiência de custos e podem também estender a atividade do nematoide no solo (ou outro meio) após a aplicação, protegendo os nematoides das condições ambientais prejudiciais (Navon et al., 2002). Formulações que são baseadas em nematoides não-desidratados, como pastas ou esponjas mantém alta viabilidade (percentual vivo dos nematoides), mas não podem ser embalados em altas densidades e, portanto, limita sua adequação para aplicação em grande escala. A formulação concentrada não-dessecada foi desenvolvida para nematoides produzidos in vitro baseado em vermiculita, que, por exemplo, permite uma vida útil de pelo menos 1 mês para H. megidis e 2-3 meses para Steinernematidae (Shapiro-Ilan et al., 2006). Um avanço na tecnologia de formulação foi obtido com a introdução de WDG, em que o Steinernematids entra em um estado de anidrobiose parcial, permitindo-lhes sobreviver até 6 meses a 25 C (substancialmente mais do que as formulações anteriores). Viabilidade de alguns nematoides em WDG, por exemplo, S. riobrave, pode ser baixa (abaixo de 50%) (McCoy et al., 2000), mas isso não é necessariamente um problema em relação à eficácia, porque o produtor tende a aumentar a dose para garantir excesso de nematoides viáveis (Shapiro-Ilan et al., 2006). Baur et al. (1997) relataram eficácia reduzida de WDG formulado com nematoides S. carpocapsae não-desidratados. No entanto, Shapiro e McCoy (2000) relataram nenhum efeito sobre a virulência da WDG sobre Steinernematidae. Tecnologia de aplicação Não importa o quão bem adaptado um nematoide entomopatogênico é a uma praga alvo, a aplicação falhará se o agente não for aplicado de uma forma que permite o acesso e a infecção do hospedeiro. No entanto, os aspectos técnicos de aplicação do biopesticida no campo são muitas vezes negligenciados. A efetividade e eficiência de nematoides V. 6, N.3, pág.67,2012

13 entomopatogênicos só podem ser alcançadas com uma análise cuidadosa da tecnologia de aplicação disponível, juntamente com a compreensão dos atributos e limitações desse agente de controle biológico (Gaugler, 2002). Nematoides entomopatogênicos podem ser aplicados com quase todos os equipamentos terrestres comercialmente disponíveis ou equipamento de pulverização aérea, incluindo pulverizadores de pressão, sopradores de névoa e pulverizadores eletrostáticos. O equipamento de aplicação depende do sistema de cultivo, e em cada caso, há de lidar com uma variedade de considerações incluindo: volume, agitação, pressão e tempo gasto até a aplicação, condições do sistema ambiental e padrão de pulverização de distribuição (Grewal, 2002). Uma vasta gama de tecnologia está disponível para aplicação de nematoides entomopatogênicos no solo, a partir de regadores simples ou pulverizadores para pequenos lotes ou jardins, para aplicações aéreas sobre grandes campos ou pomares (Grewal, 2002). Outros métodos utilizados na aplicação no solo incluem sistemas de irrigação diversos, tais como sobrecarga, microjet, canais de irrigação, pivô central, gotejamento, bem como equipamento de pulverização ou injeção (Grewal, 2002; McCoy et al., 2000). Para aplicação contra insetos de solo, um volume de pulverização de litros/ha é geralmente recomendado. Esta condição é satisfatória para os pulverizadores equipados com grandes bicos. No entanto, a maioria dos sistemas de pulverização é projetada para menor consumo de calda, geralmente na faixa de litros/ha. Apesar de nematoides poderem ser aplicados com baixo volume de calda, irrigações devem ser ajustadas antes e depois da aplicação para compensar a redução do volume (Shapiro-Ilan et al., 2006). A préirrigação umedece o solo, assim, facilita a circulação dos nematoides e a pós-irrigação é essencial para lavar quaisquer nematoides que podem estar na superfície das plantas para o solo. Estudos indicam que 2,5-6,5 mm de irrigação é suficiente para mover os nematoides no solo. Telas e filtros precisam ser suficientemente grandes para permitir a passagem dos nematoides. S. carpocapsae pode passar através das telas do pulverizador com aberturas tão pequenas quanto 10 mm de diâmetro, mas aberturas maiores são necessárias para as espécies maiores, como S. glaseri e H. megidis. Portanto, a remoção dos filtros e telas é geralmente recomendada, embora isso requeira recalibração do equipamento. Altas pressões da bomba de reciclagem através dos sistemas de bombeamento podem causar danos aos nematoides. Em geral, nematoides não devem ser submetidos a pressões superiores a 300 psi (2070 KPa). O uso dos equipamentos de aplicações em que os nematoides podem ser submetidos a temperaturas superiores a 30 C no tanque, mangueira ou bicos devem ser evitados. Falta de oxigênio no tanque do V. 6, N.3, pág.68,2012

14 pulverizador e nas mangueiras de entrega também podem inativar nematoides. Esta situação é agravada quando o equipamento de aplicação é exposto à luz solar, pois aumenta a temperatura e a demanda de oxigênio. Privados de oxigênio nematoides são mais propensos a danos da luz solar e dessecação, uma vez que são incapazes de escapar devido à mobilidade reduzida (Shapiro-Ilan et al., 2006). CONCLUSÃO O progresso na comercialização de nematoides na década de 1990 foi substancial em países desenvolvidos como EUA, Holanda e Canadá. Desenvolvimento de tecnologia de produção em larga escala e desenvolvimento de formulações levaram à expansão do uso de NEPs. Apesar deste progresso, a realidade é que NEPs possuem mercados bastante limitados. Esta limitação é atribuída ao custo do produto, a eficácia inconsistente, requisitos de refrigeração para a maioria das formulações, e a falta de informações detalhadas sobre como usá-los de forma eficaz. Kaya e Gaugler (1993) indicaram que há uma necessidade de conseguir informações mais aprofundadas sobre os NEPs, no que diz respeito a sua biologia, ecologia, comportamento e genética, para ajudar a compreender as razões subjacentes para o seu sucesso como agentes de controle biológico. A dificuldade na adequação dos produtos a base de nematoides tem sido a causa mais comum de fracasso na aplicação de nematoides entomopatogênicos. Além disso, alta virulência em condições de laboratório tem sido muitas vezes inadequadamente explorada para a eficácia de campo. O teste definitivo do potencial comercial de nematoides é a eficácia de condições de campo. Eficácia de campo é um dos componentes necessários para a comercialização. Outros fatores importantes são o custo, armazenamento, distribuição, manuseio, mistura, a cobertura, a concorrência, a compatibilidade com as práticas do produtor, e margens de lucro para os fabricantes e distribuidores. Historicamente um ou mais desses fatores têm impedido o desenvolvimento comercial de nematoides para algumas culturas ou mercados (Georgis, 2002). O desenvolvimento de nematoides eficazes para controle de insetos no contexto da agricultura sustentável será um grande desafio. Uma abordagem verdadeiramente integrada é necessária, em que todas as práticas agrícolas, incluindo opções de controle de outros insetos, devem ser consideradas para obter o máximo efeito de uma determinada intervenção ou da prática, sem interferir com a eficácia de outras práticas. Por causa do baixo impacto ambiental e seletividade de nematoides, eles têm potencial para serem componentes valiosos do manejo integrado de pragas e V. 6, N.3, pág.69,2012

15 programas de manejo da resistência (Georgis et al., 2006). Os benefícios de utilizar nematoides entomopatogênicos e de outros agentes de controle microbiano comparada com a de inseticidas de amplo espectro são menos evidentes quando simplesmente compara-se a eficácia e os custos trabalhistas. No entanto, a redução de impactos não-alvo, o benefício potencial como ferramentas para o manejo da resistência, segurança para os aplicadores, e a inexistência de intervalo de reentrada para pré-colheita, demonstra a importância em sistemas onde o manejo integrado de pragas é considerado (Georgis et al., 2006). REFERÊNCIAS ADAMS, B. J. Species concepts and the evolutionary paradigm in modern nematology. Journal of Nematology, v.30, p.1-21, ARTHURS, S.; HEINZ, K. M.; PRASIFKA, J. R. An analysis of using entomopathogenic nematodes against above-ground pests. Bulletin of Entomological Research, v.94, p , BAUR, M. E.; KAYA, H. K.; TABASHNIK, B. E. Efficacy of a dehydrated steinernematid nematode against black cutworm (Lepidoptera: Noctuidae) and diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economy Entomology, v.90, p , BRILLARD, J.; RIBEIRO, C.; BOEMARE, N.; BREHELIN, M.; GIVAUDAN, A. Two distinct hemolytic activities in Xenorhabdus nematophila are active against immunocompetent insect cells. Applied and Environmental Microbiology, v.67, p , ADAMS, B. J.; NGUYEN, K. B. Entomopathogenic nematoloy. In: GAUGLER, R. (Ed.). Taxonomy and Systematics. Oxon: CABI Publishing, ANDALO, V.; MONO JÚNIOR, A.; SANTA-CECÍLIA, L. V. C.; SOUZA, G. C. Seleção de isolados de fungos e nematoides entomopatogênicos para a cochonilha-da-raísdo-cafeeiro Dysmicoccus texensis (Tinsley). Arquivos do Instituto Biológico, v.71, p , BULLOCK, R. C.; MILLER, R. W. Suppression of Pachnaeus litus and Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae) adult emergence with Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Steinernematidae) soil drenches in field evaluations. Florida State Horticultural Society, v.107, p.90 92, BURNELL, A. M.; STOCK, S. P. Heterorhabditis, Steinernema and their V. 6, N.3, pág.70,2012

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