Resistência a antibióticos em isolados de Salmonella enterica em alimentos de origem animal

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1 RPCV (2013) 108 ( ) Resistência a antibióticos em isolados de Salmonella enterica em alimentos de origem animal Antimicrobial resistance of Salmonella enterica isolated from food of animal origin Rui Figueiredo 1, Ana Henriques 2, Rui Sereno 2, Nuno Mendonça 1, Gabriela J. da Silva 1* 1 Centro de Estudos Farmacêuticos *, Laboratório de Microbiologia e Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra, Pólo das Ciências da Saúde, Azinhaga de Sta Comba, Coimbra, Portugal 2 ControlVet, SA, Tondela, Portugal Resumo: A resistência a antibióticos é um assunto de grande interesse para a saúde pública. O uso de antibióticos na produção animal pode conduzir ao aparecimento de estirpes bacterianas resistentes a antibióticos, nomeadamente Salmonella enterica, um agente patogénico colonizador do trato digestivo animal, sendo necessário uma monitorização restrita para evitar a entrada deste agente na cadeia alimentar. No presente trabalho, entre junho de 2011 e março de 2012, recolheramse 163 isolados de S. enterica de amostras alimentares e de produção, de aves (n=94), suínos (n=60) e bovinos (n=9). A identificação foi feita de acordo com a norma ISO 6579/A1. A avaliação da suscetibilidade aos antibióticos foi realizada pelo método de microdiluição. Foram identificados 10 serótipos, sendo S. Typhimurium o mais frequente (em aves, suínos e alimentos processados), seguido de S. Enteritidis, este último não encontrado em suínos. Estudos anteriores realizados em Portugal denotam o serótipo Enteritidis como prevalente em aves. Oitenta e sete porcento dos isolados mostravam resistência a pelo menos um antibiótico. A maior taxa de resistência foi observada para a tetraciclina (49%), seguido da ampicilina (37%). Observou-se uma baixa taxa de resistência às fluoroquinolonas. De acordo com a origem das amostras, 82% e 65% dos isolados de suínos apresentaram resistência a estes antibióticos, respetivamente, enquanto em isolados de aves foi observado uma frequência de resistência de 31% e 21%, e em bovinos 22% e 11%. Os isolados de aves mostraram resistência também à colistina (22%) e moxifloxacina (13%), e os de suínos ao cloranfenicol (25%). Nos isolados de alimentos processados para consumo, observou-se maior frequência de resistência à tetraciclina (68%), ampicilina (54%) e mezlocilina (52%). Em conclusão, os isolados de suínos apresentavam uma maior taxa de resistência aos antimicrobianos testados. Os resultados deste estudo, comparativamente com outros realizados anteriormente em Portugal, sugerem que as medidas de controlo da disseminação de Salmonella em aves instituídas no país são efetivas, mas que têm que ser estendidas aos suínos, onde o serótipo Typhimurium é prevalente, e também o mais resistente aos antibióticos. Palavras-chave: Antibióticos, Salmonella, β-lactâmicos, fluoroquinolonas. *Centro de Neurociências e Biologia Celular Correspondência: gjsilva@ci.uc.pt ; silva.gj@gmail.com Tel: Summary: Antibiotic resistance is an issue of great importance for public health. The use of antibiotic in animal production may lead to the emergence of resistant microorganisms, namely Salmonella enterica, an invasive pathogen that usually colonizes animal digestive tract, being necessary to establish several control measures to avoid the entrance of this pathogen in food chain. In this study, 163 isolates of S. enterica were recovered from alimentary and production samples of poultry (n=94), swine (n=60) and cattle (n=9), from June 2011 to March The identification was performed according ISO 6579/A1 guidelines. Antimicrobial susceptibility was tested by microdilution method. Ten serotypes were identified, S. Typhimurium being the most frequent (poultry, swines, processed food), followed by S. Enteritidis, though not found in swines. Eighty seven percent of the isolates were resistant to at least one antibiotic. The highest frequency of resistance was found for tetracycline (49%) and amoxicillin (37%). Accordingly to animal samples origin, 82% and 65% pork isolates were resistant to these antibiotics, respectively, while in poultry isolates the frequency of resistance was 31% and 21%, and in cattle 22% and 11%. Poultry isolates showed also resistance to colistin (22%) and moxifloxacin (13%), while pork isolates presented more resistance to chloramphenicol (25%). Processed food isolates showed major resistance to tetracycline (68%), ampicillin (54%) and mezlocillin (52%). Overall, the isolates from swine showed the highest frequency of resistance to the antimicrobials tested. These results, in comparison with previous studies performed in Portugal, suggest that measures to control the spread of Salmonella in poultry instituted in the country are effective, but must have to be extended to swines, where serotype Typhimurium is prevalent, and also more resistant to antibiotics. Introdução Em Portugal, o uso de antibióticos na terapêutica animal ascendeu aproximadamente às 180 toneladas em 2010, segundo a Direção Geral de Veterinária (DGV, 2010). A resistência antimicrobiana é considerada atualmente um problema de saúde pública, incluindo microrganismos que se disseminam através da cadeia alimentar. A capacidade de aquisição de resistência antimicrobiana de microrganismos patogénicos cujos 39

2 reservatórios são animais de consumo, como é o caso de Salmonella spp., diminui a eficácia terapêutica dos antibióticos, com implicações clínicas relevantes. O género Salmonella está dividido em duas espécies, S. enterica e S. bongori (Brenner et al., 2000). A espécie S. enterica está subdividida em 6 subespécies, uma das quais, S. enterica subs. enterica possui mais de 2500 serótipos, que colonizam principalmente aves, suínos, e ruminantes de médio porte. S. enterica é uma bactéria Gram-negativo com capacidade de invadir a mucosa intestinal, e provocar no Homem uma gastrenterite, denominada salmonelose, caracterizada por diarreia, náuseas, dor abdominal, e por vezes, febre (McGhie et al., 2009). A nível europeu, a salmonelose é a segunda zoonose mais frequente em humanos, afetando cerca de mil indivíduos por ano (EFSA, 2012). Em Portugal, foi considerada a segunda doença de declaração obrigatória, e a doença infeciosa intestinal mais comum em 2008 (DGS, 2010). Normalmente, a infeção ocorre através da ingestão de alimentos ou água contaminados com dejetos intestinais de animais. Embora a salmonelose seja normalmente uma doença infeciosa auto-limitante, por vezes é necessário recorrer a antibioterapia devido ao carácter invasivo da bactéria, especialmente em crianças, idosos ou doentes imunodeprimidos. O tratamento é muitas vezes feito com o recurso a antibióticos β-lactâmicos e fluoroquinolonas (Foley e Lynne, 2008). O uso de antibióticos no tratamento de animais de consumo pode levar ao aumento da resistência de microrganismos patogénicos zoonóticos (Mølbak, 2005), e comprometer a eficácia clínica destes fármacos, quer a nível animal como humano. Com o presente estudo pretendemos identificar os serótipos presentes em animais e produtos alimentares de origem animal, e determinar a suscetibilidade a diferentes classes de agentes antimicrobianos, usados na prática veterinária e clinica humana. Materiais e métodos Isolamento e identificação bacteriana Entre junho de 2011 e março de 2012, na região centro de Portugal, foram recolhidos 163 isolados de Salmonella spp. de amostras de aves (n=94), suínos (n=60) e bovinos (n=9). Os isolados foram recolhidos de amostras biológicas (n=93) como sangue, peles de pescoço, fígado, carcaças e fezes, assim como de alimentos processados (n=70) como carne picada, hamburgers ou enchidos. O isolamento foi feito de acordo com métodos padronizados (ISO 6579/A1, 2007). Sucintamente, 10 g de amostra foram suspensos em água peptonada tamponada (BPW Merck, Darmstadt, Germany) (1:10). A suspensão foi homogeneizada e incubada a 37 ºC. Após 18 h foram inoculados 0,1 ml e 1 ml em caldo Rappaport-Vassiliadis contendo peptona de soja (caldo RVS, Oxoid, Cambridge, UK) e em caldo Muller-Kauffmann tetrationato/novobiocina (caldo MKTTn, Merck, Darmstadt, Germany), respetivamente. As suspensões em RVS foram incubadas a 41,5 ºC ±1ºC durante 24h ± 3h, e as de MKTTn incubadas a 37ºC ± 1ºC durante 24h ± 3h. Numa segunda fase, uma ansa de cultura dos caldos foi inoculada nos meios seletivos Hektoen e xilose-lisina-desoxicolato (XLD) (Oxoid, Cambridge, UK). As colónias presuntivamente identificadas como Salmonella foram confirmadas por métodos bioquímicos, e o serótipo determinado de acordo com o esquema Kauffmann-White, para pesquisa dos antigénios O e H (Grimont e Weill, 2007). Determinação da suscetibilidade aos antimicrobianos A suscetibilidade aos agentes antibacterianos foi avaliada pelo sistema de microdiluição em MicroScan (Dade Behring, West Sacramento, CA, USA), cujas placas contêm os seguintes antibióticos: ampicilina, mezlocilina, amoxicilina/ácido clavulânico, tetraciclina, colistina, ciprofloxacina, moxifloxacina, levofloxacina, gentamicina, cloranfenicol e trimetroprim/sulfametoxazole. O valor da concentração mínima do antibiótico que inibe o crescimento microbiano (concentração mínima inibitória, CMI) foi usado para classificar os isolados como suscetíveis, intermédios ou resistentes, de acordo com as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2010), exceto para a colistina e moxifloxacina cujas CMIs foram interpretadas de acordo com as normas do The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, 2011), uma vez que não se encontram no CLSI. Resultados e discussão O maior número de isolados de S. enterica foi recolhido de aves, seguido de suínos e alimentos processados (Tabela 1). Foram identificados 10 serótipos, sendo o Typhimurium o mais frequente, maioritariamente isolado em amostras de aves e suínos, seguido do serótipo Enteritidis. Este último não foi identificado em suínos (Tabela 1). Ambos representam 46% dos serótipos identificados. Estes serótipos são os mais frequentemente associados a infeção humana (Humphrey, 2000; EFSA, 2010a). Nos isolados de aves estes dois serótipos representavam 42%, enquanto num estudo com isolados de produtos de origem animal recolhidos em 2003/04, estes dois serótipos somavam 59% das ocorrências em Portugal (Da Silva e Carneiro, 2006; Da Silva e Carneiro, 2005), sendo o serótipo Enteritidis representado em 44% dos isolados de aves em 1999, e em 78% em 2003/04 (Antunes et al., 2003; Da Silva e Carneiro, 2006; Da Silva e Carneiro, 2005). No presente estudo, verificou-se uma diminuição da prevalência do serótipo Enteritidis em aves em relação a anteriores estudos (Antunes et al., 2003; Da Silva e Carneiro, 2006; Da Silva e Carneiro, 2005), facto que poderá estar relacionado com a implementação em Portugal do Plano Nacional de Controlo de Salmonelas (PNCS, 2012). 40

3 Nos isolados de suínos, o serótipo Typhimurium representou 46% dos casos, contrastando com os 34,5% de 113 isolados de um estudo prévio (DGV, 2007). Neste estudo, verificou-se ainda o aparecimento dos serótipos Infantis e Virchow, não notificados em 2007 pela Direção Geral de Veterinária (DGV, 2007). De realçar, que o serótipo Infantis foi encontrado maioritariamente em produtos de origem suína, alguns dos quais poderão ser ingeridos crus ou mal cozinhados. Sendo o quarto serótipo mais frequente neste trabalho, estudos futuros poderão revelar a importância da emergência deste serótipo, visto ter sido recentemente associado a casos de gastrenterites em humanos (Najjar et al., 2012). Note-se que, alguns dos serótipos considerados menos comuns, como Infantis, Mbandaka, Virchow, Derby e Agona, estão referenciados a nível europeu, e associados como indutores de gastroenterite em vários animais não relacionados (EFSA, 2012a). A resistência pelo menos a um antibiótico foi registada em 87% dos isolados. Os isolados mostravam maior resistência à tetraciclina (49%) e ampicilina (37%) (Figura 1), o que pode estar relacionado com o facto de serem os dois antibióticos mais utilizados na terapêutica animal em Portugal (DGV, 2010). Os isolados de amostras de aves (n=94) apresentavam maior resistência à tetraciclina (31%), à colistina (22%) e à ampicilina (21%), sendo 13% resistentes à moxifloxacina, e apenas 1% à levofloxacina e ciprofloxacina. A elevada frequência de resistência à tetraciclina em isolados de aves foi também documentada em estudos anteriores, onde se verificou valores de resistência de 36% (Antunes et al., 2003). Nos isolados de suínos (n=60), observou-se uma maior frequência de resistência para a tetraciclina (82%), ampicilina (65%) e cloranfenicol (25%). Estas percentagens de resistência são um pouco mais baixas que as registadas em isolados de suínos recolhidos em 2006/07, em que se documentou 100% de resistência à tetraciclina, 93% à ampicilina e 37% ao cloranfenicol (Antunes et al., 2011). Embora o uso de cloranfenicol tenha sido banido da prática veterinária de animais de produção, continua a observar-se resistência a este agente antimicrobiano em alguns isolados. A abolição de determinados antibióticos na produção animal nem sempre se traduz num total reverter da resistência para suscetibilidade, sendo que algumas estirpes poderão continuar a manter-se em determinados nichos ecológicos, o que realça a necessidade do controlo do uso de antibióticos. A resistência às fluoroquinolonas não foi registada neste grupo. Os isolados de bovinos (n=9) apenas apresentavam resistência à tetraciclina (22%), ampicilina (11%) e mezlocilina (11%). De realçar, que foi o grupo onde se isolou o menor número de S. enterica. Relativamente aos isolados de alimentos processados para consumo (n=63) observou-se maior frequência de resistência à tetraciclina (68%), ampicilina (54%) e mezlocilina (52%), sendo a resistência à ciprofloxacina e levofloxacina pouco frequente (2%). Dentro dos produtos processados, recolheram-se 14 isolados de produtos prontos para consumo, nomeadamente enchidos ou barras de torresmos, alimentos normalmente não sujeitos a cozedura, e consequentemente, uma possível fonte de infeção para o consumidor final. Destes isolados, 64% apresentavam resistência à tetraciclina e 50% à ampicilina. É importante salientar, a elevada resistência à tetraciclina e ampicilina, também reportada anteriormente em Portugal (Antunes et al., 2011; Caleja et al., 2011). Uma vez que todos os isolados se mostraram suscetíveis às fluoroquinolonas, isto sugere que, em caso de infecção, e necessidade de antibioterapia, as fluoroquinolonas podem ser uma opção. Tabela 1 Prevalência dos serótipos de Salmonella nos diferentes tipos de amostra Serótipo Aves Suínos Bovinos Alimento Processadoª Total b Typhimurium 23 (24) 35 (62) 1 (11) 32 (51) 59 (36) Enteritidis 17 (18) (5) 17 (10) Havana 13 (14) - 1 (11) - 14 (8) Infantis 1 (1) 7 (12) 2 (22) 6 (10) 10 (6) Mbandaka 9 (10) (5) Derby 2 (1) (1) Virchow 2 (1) (1) London 1 (1) (1) Agona 1 (1) (1) Patel 1 (1) (1) Não determinado 24 (28) 18 (26) 5 (56) 22 (34) 47 (30) Total ª Isolados recolhidos de amostras processadas de aves, suínos e bovinos. b Soma de isolados de aves, suínos e bovinos. 41

4 AMP Ampicilina; MEZ Mezlocilina; AMC Amoxicilina/ácido clavulânico; GEN Gentamicina; LEV Levofloxacina; CIP Ciprofloxacina; MOX Moxifloxacina; CLOR Cloranfenicol; TET Tetraciclina; SXT Trimetroprim/Sulfametoxazole; COL Colistina. Figura 1 Resistência aos antibióticos dos isolados de amostras de aves, suínos, bovinos e alimentos processados. Os padrões de resistência aos agentes antimicrobianos em função do serótipo encontram-se na tabela 2. S. Typhimurium, para além de ser o serótipo mais comum em amostras de aves e suínos, é também o que apresenta maior frequência de resistência, nomeadamente à tetraciclina (83%) e ampicilina (76%), assim como, o maior número de isolados multirresistentes. A multirresistência é um problema emergente. A aquisição de resistência a agentes antimicrobianos de várias classes (pelo menos a três) garante à estirpe bacteriana uma elevada capacidade de sobrevivência face a diferentes terapêuticas, possibilitando a disseminação destas estirpes entre animais, e animais e humanos. Várias consequências podem advir da multirresistência. A escolha terapêutica do clínico é substancialmente reduzida, e a eficácia clínica de antibióticos é comprometida, com consequente aumento da morbilidade do hospedeiro, e eventual morte (Angulo et al., 2004). Observou-se ainda que os suínos constituem um reservatório importante de isolados de S. enterica resistentes, em especial Typhimurium. Na generalidade, a maioria dos serótipos encontrados não apresenta resistência aos antibióticos testados. Contudo, o seu número é muito menor quando comparado com S. Typhimurium. Estes dados são consistentes com os da literatura, que descreve este serótipo como o mais frequente e resistente aos antibióticos (EFSA, 2010a). De realçar, a resistência à tetraciclina, e o facto de ter sido isolado maioritariamente em suínos e alimentos processados, muitos derivados de carne suína, que poderão ser consumidos crus ou não completamente cozinhados (Tabela 2). Em forma de conclusão, no presente trabalho verificou-se uma maior diversidade de serótipos em isolados de aves quando comparada com registos anteriores (PNCS, 2012), incluindo o aparecimento do serótipo Infantis identificado em todos os grupos de amostras, tal como o Typhimurium (o mais prevalente), uma elevada taxa de resistência à tetraciclina e ampicilina, e uma baixa taxa de resistência a fluoroquinolonas. Observou-se uma diminuição na incidência de resistência às fluoroquinolonas comparativamente à resistência observada em finais do século XX após a legalização do uso destes antibióticos no uso veterinário (Threlfall et al., 1997; Malorny et al., 1999). No entanto, verificase que, mesmo após a proibição do uso de antibióticos nas rações de animais para consumo humano em 2006 nos países da União Europeia (Guardabassi e Courvalin, 2006), continuam a surgir salmonelas resistentes aos antibióticos. Tal facto mostra que, as medidas de controlo instituídas na União Europeia ao nível do uso de agentes antimicrobianos em rações poderão ser insuficientes para minimizar o aparecimento de estirpes Tabela 2 Perfis de suscetibilidade a vários antibióticos em função do serótipo de Salmonella enterica Serótipo (n.º) N.º (%) de isolados por perfil de resistência aos agentes antimicrobianosª Amp Mez AMC Gen Lev Cip Mox Clor Tet SXT Col Typhimurium (59) 45 (76) 44 (76) 2 (3) 1 (2) 0 (0) 0 (0) 5 (9) 19 (32) 49 (83) 3 (5) 5 (8) Enteritidis (17) 3 (18) 2 (12) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (6) 0 (0) 1 (6) 0 (0) 16 (94) Havana (13) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 4 (31) 1 (8) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Infantis (10) 1 (10) 2 (20) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (10) 4 (40) 2 (20) 0 (0) Mbandaka (9) 1 (11) 1 (11) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (11) 0 (0) 1 (11) Virchow (2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (50) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Derby (2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (50) 0 (0) 0 (0) Agona (2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Patel (1) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) London (1) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) ND (48) 10 (21) 6 (13) 1 (2) 1 (2) 1 (2) 1 (2) 2 (4) 6 (13) 24 (50) 5 (10) 2 (4) ª Agentes antimicrobianos: Amp, ampicilina; Mez, Mezocilina; AMC, amoxicilina com ácido clavulânico; Gen, Gentamicina; Lev, Levofloxacina; Cip, Ciprofloxacina; Mox, Moxifloxacina; Clor, Cloranfenicol; Tet, Tetraciclina; SXT, trimetoprim/sulfametoxazole; Col, colistina. b Não Determinado. c Multiresistência. 42

5 resistentes, e que, tal como em terapêutica humana, deverá haver uma avaliação cuidada da necessidade de antibioterapia em animais e uma criteriosa escolha dos antibióticos, sendo importante conhecer os perfis de susceptibilidade das estirpes que circulam em Portugal. O Programa Nacional de Controlo de Salmonella em aves parece ser efetivo, e parece estar a contribuir para a redução da incidência do serótipo Enteritidis, reportado geralmente como o mais frequente neste grupo de animais. Contudo, observou-se um aumento de S. Typhimurium em aves relativamente a estudos anteriores, um serótipo normalmente associado a suínos, sugerindo que este serótipo ubíquo e responsável pela maioria das salmoneloses poderá estar a ocupar um novo nicho biológico. De destacar que, o serótipo Typhimurium é também o que apresenta maior frequência e diversidade de resistência aos antibióticos, como demonstrado neste estudo, o que é preocupante, visto ser um serótipo com capacidade de adaptação a vários hospedeiros, e de aquisição de resistência aos antibióticos. Os resultados obtidos neste estudo, e comparativamente com dados anteriores, sugerem que as medidas de controlo da disseminação de Salmonella em aves instituídas em Portugal são efetivas, mas que têm que ser estendidas aos suínos, onde o serótipo Typhimurium é prevalente, e também o mais resistente aos antibióticos. Bibliografia Angulo FJ, Baker NL, Olsen SJ, Anderson A, Barret TJ (2004). Antimicrobial Use in Agriculture: Controlling the Transfer of Antimicrobial Resistance to Humans. Seminars in Pediatric Infectious Diseases, 15, Antunes P, Mourão J, Pestana N, Peixe L (2011). Leakage Of Emerging Clinically Relevant Multidrug-Resistant Salmonella Clones From Pig Farms. 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