PRODUÇÃO DE AMILASES PELO PATÓGENO Rhizoctonia solani AG1-IA ISOLADOS DE CULTURAS DE BRAQUIARIA E SOJA

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1 1 PRODUÇÃO DE AMILASES PELO PATÓGENO Rhizoctonia solani AG1-IA ISOLADOS DE CULTURAS DE BRAQUIARIA E SOJA PRODUCTION OF AMYLASE BY PATHOGEN Rhizoctonia solani AG1-IA ISOLATED FROM BRACHIARIA AND SOY Aline Aparecida Reis 1 Erica Aparecida de Oliveira Santos 2 ; Paulo Cezar Ceresini 3 ; Heloiza Ferreira Alves do Prado 4 ; Abstract Rhizoctonia solani is a cosmopolitan fungus which causes important diseases in most of the cultivated plants in the whole world. R. solani AG1-IA is an emerging pathogen which infects originally rice, has a worldwide distribution and has emerged as a pathogen of brachiaria in the Brazilian Amazon and too soybean. For a pathogen to infect a plant it is necessary that it can penetrate and colonize the tissues of its host, removing the nutrients necessary for their survival. Enzymes are a substance type that is related on infection process of plants. The enzyme can act independently of the cell that produced it, even "in vitro", since the factors as ph, temperature and substrate are suitable. The cellular components of the forage plants involve substances soluble in water or sparingly soluble in water, such as starch, lipids and some proteins. It are digested by enzymes derived from micro-organisms or those secreted by the digestive tract of animals. Amylases are hydrolytic enzymes that break glycosidic linkages in the main chain of starch. This enzymes among the most important industrial enzymes and are of great importance in current biotechnology process. Keywords: Enzyme. Starch. Fungal. 1 Mestranda em Microbiologia pela UNESP, Campus de São José do Rio Preto-SP; 2 Doutoranda em Microbiologia pela UNESP, Campus de São José do Rio Preto SP; 3,4 Univ. Estadual Paulista UNESP, Campus de llha Solteira- SP. contato: aline.ap.reis@gmail.com 1 Introdução Rhizoctonia solani é um fungo cosmopolita, com vasto número de hospedeiros, e causa importantes doenças na maioria das plantas cultivadas em todo o mundo (CASTRO et al, 2009). R. solani AG1-IA é um patógeno emergente o qual originalmente infecta arroz, tem distribuição mundial e emergiu como patógeno de braquiária na Amazônia Brasileira e na maioria das culturas da soja [Glycine max L. (Merrill)] no Brasil (FENILE; MEYER, 2001). Além de necrose foliar, o fungo causa lesões nas hastes e pecíolos reduzindo drasticamente a produção da soja (SINCLAIR, 1982). Em determinados estados brasileiros onde as condições ambientais são favoráveis para o patógeno (como Maranhão, Mato Grosso, Piauí, Tocantins, Pará e Roraima), perdas causadas pela mela podem variar de 31 a 60% (YORINORI apud BASSETO, 2007). Para

2 2 um patógeno infectar uma planta é preciso que o mesmo consiga penetrar e colonizar os tecidos do seu hospedeiro, retirar os nutrientes necessários para sua sobrevivência, bem como neutralizar as reações de defesa da planta. Para isso, o patógeno utiliza-se de substancias tais como enzimas, toxinas e hormônios. Portanto enzimas estão entre as substâncias relacionadas com o mecanismo de patogênese (BUENO, 2009). A enzima, uma vez elaborada, poderá atuar independentemente da célula que a produziu, mesmo in vitro, desde que o ph, a temperatura e o substrato, entre outros fatores, sejam adequados (COLEN, 2006). Os componentes do conteúdo celular de plantas forrageiras envolvem substâncias solúveis em água ou levemente solúveis em água, tais como: amido, lipídios e algumas proteínas que são digeridas tanto por enzimas de microorganismos, quanto por aquelas secretadas pelo aparelho digestivo dos animais (VAN SOEST, 1994). As amilases são enzimas hidrolíticas que quebram ligações glicosídicas na cadeia principal do amido. Segundo PANDEY apud OLIVEIRA (2007), as amilases estão entre as mais importantes enzimas industriais e são de grande importância na biotecnologia atual. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de amilases de isolados de R. solani das culturas de braquiária e soja e verificar se há variação significativa da produção da enzima de uma cultura para outra. 2 Material e Métodos Nos estudos foram cultivados 52 isolados do patógeno de planta Rhizoctonia solani AG-1 IA, os quais foram coletados em duas diferentes culturas, braquiária e soja de plantas sintomáticas de diferentes estados brasileiros como Rondônia, Pará, Maranhão, Tocantins, Mato Grosso. O processo de produção da enzima foi sob fermentação em estado sólido (FES) utilizando farelo de trigo como fonte de carbono e incubada a 25 C durante 92 h. O substrato foi umedecido com 5 ml de solução salina (1.5 g l -1 (NH 4 ) 2 SO 4, 2.0 g l -1 KH 2 PO 4, 0.3 g l -1 uréia, 0.03 g l -1 CaCl 2, 0.2 g l -1 MgSO 4.7H 2 O), buscando manter umidade em torno de 50 %. A solução enzimática bruta foi extraída com a adição de 40 ml de água estéril e o substrato cultivado filtrado em outro frasco, obtendo assim uma solução livre de células, a qual foi utilizada paras as análises enzimáticas. A atividade para amilase (1,4-α-D-gucano glucanohidrolase, E.C ) foi analisada utilizando os métodos Dextrinizante descrito por FUWA (1954), no qual a mistura da reação foi composta por 0,1 ml da solução enzimática, onde foi adicionado a 0,3 ml de solução de amido solúvel a 0,5%, em tampão acetato 0,1 M, ph 5,5. Após incubação a 50 C, por 10 minutos, a reação foi paralisada pela adição de 4,0 ml de solução de HCl 0,2 M. Em seguida, a reação

3 3 recebeu 0,5 ml de reativo de Iodo (0,30% de KI e 0,03% de I 2 ). A mistura de reação foi diluída com 10 ml de água destilada. O controle foi preparado conforme o processo descrito, substituindo-se a enzima pelo volume equivalente de enzima inativa. A absorbância foi determinada a 700 nm em espectrofotômetro. Uma unidade de atividade foi definida como sendo a quantidade de enzima necessária para reduzir em 10% a intensidade da cor azul do complexo Iodo-Amido por minuto. 3 Resultados e Discussão Os isolados foram incubados a 25ºC por 92 horas de cultivos. Após a extração do extrato bruto enzimático, os mesmo foram submetidos ao ensaio para dosagem de atividade amilase pelo método Dextrinizante (FUWA, 1954), cujos resultados estão descritos nas tabelas 1 e 2. Tabela 1. Atividades enzimáticas (U g -1 ) das linhagens de Rhizoctonia solani isoladas de braquiária, cultivados sob fermentação em estado sólido, após 92 horas de cultivo a 25ºC. Linhagens Amilase (U g -1 ) Linhagens Amilase (U g -1 ) Linhagens Amilase (U g -1 ) PA_B1F6 800,00 ROB3A2 215,40 ROB1E7 86,35 PA_B1B6 800,00 ROB2C3 211,70 ROB1A7 70,48 RO_B1E3 699,00 ROB2C5 208,64 ROB3A6 63,07 ROB2D5 596,18 ROB1D7 199,36 ROB2D2 53,55 ROB4B8 500,24 ROB2E2 191,08 ROB2E7 46,15 ROB2E1 396,18 ROB2B6 162,51 ROB1C2 43,50 ROB4D3 352,58 ROB3B3 150,82 ROB3B4 28,17 ROB2C6 323,81 ROB2C1 129,19 ROB1B3 23,93 ROB2A1 310,83 ROB4D1 116,50 ROB1A3 18,64 ROB2C2 298,73 ROB2D4 112,26 RO_PV_SOB3 3,31 ROB4D7 253,06 ROB2E6 109,09 ROB2C8 ND ROB3D4 248,05 ROB4C5 93,75 ROB1A2 ND ND: Não determinado. Tabela 2. Atividades enzimáticas (U g -1 ) para linhagens de Rhizoctonia solani isoladas de soja, cultivados sob fermentação em estado sólido, após 92 horas de cultivo a 25ºC. Linhagens Amilase (U g -1 ) Linhagens Amilase (U g -1 ) Linhagens Amilase (U g -1 ) TO_ ,10 MA_ ,67 MA_ ,88 MT_S ,10 MT_S_ ,28 TO_ ,01 TO_ ,69 TO_ ,00 TC98BR_S_ ,52 MA_ ,65 MA_ ,66 MT_S ,49 MT_S ,17 MA_ ,85 TO_ ,11 MT_S ,68 MT_S ,23 TC98BR_S_ ,45 PA_ ,68 TO_ ,35 MA_ ,81 MA_ ,55 TO_ ,11 MA_275 ND MA_ ,54 ND: Não determinado. Figura 1. Linhagens de Rhizoctonia solani isoladas de braquiária 1a) e soja 1b) com as melhores atividades enzimática, cultivados sob fermentação em estado sólido, após 92 horas de cultivo a 25ºC.

4 4 As figuras 1a) e 1b) mostram as 12 linhagens com maior produção de amilase em braquiária e soja onde os níveis atingiram 800 U g -1 em culturas de braquiária e ultrapassaram 900 U g -1 nas culturas de soja. A avaliação da produção de amilases em fermentação em estado sólido utilizando diferentes tipos de sojas (orgânica, transgênica e convencional) com o fungo Aspergillus niger foi feita por PARIS et al. (2012) que sugerem que uma otimização do meio fermentativo pela adição de fonte de nutrientes à soja seria indicada para melhor produção da amilase fúngica. No trabalho foi observado que as maiores atividades específicas com a utilização da soja orgânica e convencional após 96h de fermentação (aproximadamente 1,5 U). Um valor de atividade semelhante foi observado para a soja convencional com 144h de fermentação. No entanto, como os valores de atividade são semelhantes, em termos de rendimento o melhor tempo de fermentação é 96h. KUNAMNENI et al. (2005) obtiveram uma atividade enzimática de 534 U g-1 de farelo de trigo, na produção de amilase por FES, utilizando o fungo Thermomyces lanuginosus, após um período de 120h de fermentação, com 90% de umidade inicial a 50ºC. Verificaram que a produção de amilase duplicou com a adição no meio fermentativo de 1% de amido solúvel (m m-1) e 1% de peptona (m m-1). SU et al. (2005) observaram máxima atividade de protease de 1150,0 U/g de substrato em molho de soja fermentado por A. oryzae e A. sojae, a 55ºC, por um período de incubação de 48h. 4 Conclusão As linhagens fúngicas de R. solani isoladas de culturas de braquiária e soja, apresentaram grande potencial na degradação de resíduos agroindustriais, sendo que os isolados fúngicos de soja apresentaram maior produção de amilases das enzimas testadas, quando comparados aos isolados de braquiária.

5 5 Referências BASSETO, M.A; CERESINI, P.C.; VALÉRIO FILHO, W.V. Severidade da mela da soja causada por Rhizoctonia solani AG-1 IA em função de doses de potássio. Summa Phytopathologica, v.33, n.1, p.56-62, BUENO, C. J.; FISCHER, I.H.; ROSA, D.D.; FURTADO, E.L. Produção de enzimas extracelulares por Fusarium solani de maracujazeiro amarelo. Tropical Plant Pathology, v. 34, n.5, p , CASTRO, C.V.B.; MIRANDA, V.S.; BRIOSO, P.S.T.; POLTRONIERI, L.S.; REIS, I.N.R.S.; et al. Variabilidade genética de isolados de Rhizoctonia solani, de parte aérea, analisadas por meio de marcadores RAPD. Rev. Ciênc. Agrár., Belém-PA, n. 52, p , COLEN, G. Isolamento e produção de fungos filamentosos produtores de lípases. Tese (Doutorado em Ciências de Alimentos) Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte-MG, FENILLE, R. C. Caracterização citomorfologica, cultural, molecular e patogênica de Rhizoctonia solani Kühn associado à soja no Brasil, f. Tese (Doutorado em Concentração em Proteção de Plantas) Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista, Botucatu-SP, FUWA, H. A new method for microdetermination of amylase activity by the use of amylase as the substrate. Journal of Biochemistry. v. 41, p , KUNAMNENI, A.; PERMAUL, K.; SINGH, S. Amylase production in solid state fermentation by the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 100, n.2, p , 2005, MEYER, M. C. Caracterização de Rhizoctonia solani KUHN, agente causal da mela da soja [Glicine max (l.) MERRIL], seleção de genótipos e controle químico, f. Tese (Doutorado em Proteção de Plantas) - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, OLIVEIRA, A. N.; OLIVEIRA, L. A.; ANDRADE, J. S.; CHAGAS-JÚNIOR, A. F. Produção de amilase por rizóbios, usando farinha de pupunha como substrato. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, p , PARIS, L.D.; SCHEUFELE, F.B.; JÚNIOR, A.T.; GUERREIRO, T.L.; HASAN, S.D.M. Produção de complexos enzimáticos por A. niger a partir de soja por fermentação em estado sólido. Acta Scientiarum. Technology Maringá, v. 34, n. 2, p , SINCLAIR, J. B.; (Ed). Compendium of soybean diseases. 2.ed. St. Paul: The American Phytopathological Society, 1982, 104p. SU, N.W.; WANG, M.L.; KWOK, K.F.; LEE, M.H. Effects of temperature and sodium chloride concentration on the activities of proteases and amylases in soy sauce koji. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.53, n.5, p , VAN SOEST, P. J. Nutritional ecology of the ruminant. New York, 1994, 476p.