EXCREÇÃO DE COMPOSTOS NITROGENADOS NAS DIFERENTES ESPÉCIES *

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1 EXCREÇÃO DE COMPOSTOS NITROGENADOS NAS DIFERENTES ESPÉCIES * Introdução As proteínas compõem cerca de 18% do peso corporal dos animais e podem ter diferentes funções como: reguladoras do metabolismo (enzimas e hormônios), elementos estruturais (membranas, músculos e tecido conjuntivo), substâncias de transporte (O 2 pela hemoglobina e elétrons pelo citrocromo c) osmorreguladores (albumina), componentes de ácido nucleico (nucleoproteínas) e defensores do organismo (imunoglobulinas e os interferons). As proteínas vindas da dieta são hidrolisadas na luz intestinal pela ação das muitas enzimas proteases e peptidases, resultando na produção de aminoácidos livres, que em sua maioria são transportados para o fígado via sangue portal. Além da proteína da dieta outra fonte de aminoácidos é o catabolismo das proteínas tissulares que devem ser constantemente repostas. O reservatório sanguíneo de aminoácidos é essencial para a síntese proteica, e ainda para a formação de muitos outros compostos nitrogenados essenciais para a função tissular adequada como as purinas, pirimidinas, neurotransmissores e heme. O catabolismo dos aminoácidos envolve a remoção do grupo amino e utilização dos α-cetoácidos resultantes para a oxidação em CO 2 e formação de ATP e síntese de glicose e lipídios. Os aminoácidos podem sofrer degradação oxidativa com liberação de grupos amino, basicamente em três situações: durante o turnover proteico com uma parte dos aminoácidos liberados na quebra das proteínas não sendo utilizados; em dietas ricas em proteína onde os aminoácidos são ingeridos em excesso o excedente não pode ser armazenado e é catabolizado; e durante o jejum severo ou no diabetes melito quando os carboidratos não estão acessíveis ou não são utilizados adequadamente ocorre hidrolise das proteínas corporais para a produção de energia. A amônia liberada nesses processos precisa ser convertida em algum composto passível de ser excretado. O acúmulo de amônia no organismo leva a intoxicação caracterizada por vômitos, recusa de alimentos ricos em proteína, ataxia intermitente, irritabilidade, letargia e atraso mental. Sendo assim, a seguir veremos as principais formas de remoção dos grupos amino dos aminoácidos e a forma na qual são convertidos e excretados em cada espécie animal. *Seminário apresentado pela aluna RAQUEL MELCHIOR na disciplina BIOQUÍMICA DO TECIDO ANIMAL, no Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, no primeiro semestre de Professor responsável pela disciplina: Félix H. D. González.

2 Liberação de grupos amino As proteínas consumidas na dieta podem servir de fonte de energia dependendo da espécie, quase 90% da energia no caso dos carnívoros e uma pequena fração nos herbívoros, ou podem ser oxidadas para a produção de energia em caso de dietas com excesso de proteína. A oxidação dos aminoácidos derivados das proteínas dos alimentos é a fonte da maioria dos grupos amino e a proteólise intracelular que ocorre normalmente em todos os tecidos contribui com uma pequena parte dos grupos amino, em situações normais. A maior parte dos aminoácidos é metabolizada no fígado, e a amônia gerada em excesso nos outros tecidos é transportada até ele para ser convertida na forma apropriada de excreção. A degradação oxidativa dos aminoácidos ocorre por rotas catabólicas diferentes para cada um dos 20 aminoácidos proteicos embora todas terminem em um dos seguintes metabolitos: piruvato, acetil-coa, ou outros compostos intermediários do ciclo de Krebs. Com exceção dos que terminam em acetil-coa, todos os aminoácidos constituem substratos precursores da gliconeogênese. O catabolismo dos aminoácidos ocorre principalmente no fígado e uma pequena parte no rim. A primeira etapa da degradação oxidativa dos aminoácidos é a remoção do grupo amino que ocorre em duas rotas integradas: a transaminação e a desaminação oxidativa Transaminação Este é o método mais comum da remoção dos grupos amino dos aminoácidos. Quando os L- aminoácidos chegam ao fígado, o primeiro passo no seu catabolismo é a remoção dos grupos α- amino promovida por enzimas chamadas aminotransferases ou transaminases. Nessas reações de transaminação, o grupo α-amino é transferido para o átomo de carbono α do α-cetoglutarato, produzindo o respectivo α-cetoácido análogo do aminoácido e glutamato. Esta é uma reação reversível e há ampla distribuição das transaminases pelos tecidos, algumas são mitocondriais outras são citossólicas e outras estão em ambos os compartimentos celulares. O glutamato conduz os grupos amino para serem utilizados por vias biossintéticas ou, então, para uma sequencia final de reações pelas quais são formados produtos nitrogenados degradados que, a seguir, são excretados. As aminotransferases requerem como coenzima o piridoxal-fosfato (forma enzimática da vitamina B 6 ), o qual se encontra como grupo prostético das transaminases. Estas enzimas catalisam as reações conhecidas como reações de pig-pong, nas quais um primeiro aminoácido se liga ao sitio ativo da enzima e perde seu grupo amino, produzindo um α- cetoácido. Esse grupo amino se incorpora a piridoxal-fosfato que se transforma em piridoxamina-fosfato. Em seguida o α-cetoglutarato se liga ao sitio ativo da piridoxamina e aceita seu grupo amino transformando-se em glutamato, como mostra a Figura 1. 2

3 Figura 1. Reações de transaminação. Fonte: Lehningher, Desaminação oxidativa É nesta rota que o glutamato que recolhe os grupos amino de vários aminoácidos nas reações de transaminação é oxidado e desaminado por ação da glutamato desidrogenase nas mitocôndrias das células hepáticas. Figura 2. Reação de desaminação oxidativa. Fonte: Champe, No caso de alguns tecidos a amônia livre é combinada ao glutamato para formar glutamina e ser transportada até o fígado, pela ação da glutamina sintetase em uma reação que requer ATP para ativar o glutamato. Quando chega a mitocôndria hepática a amônia é liberada da glutamina por ação da glutaminase e retorna a glutamato. A glutamina é um importante transportador de grupos amino no sangue, pois não possui cargas elétricas o que lhe confere capacidade de 3

4 atravessar com facilidade as membranas. A formação de glutamina é essencial para o transporte de grupos amino para muitos processos biológicos, além é claro, de conduzi-los até o ciclo da ureia para excreção, quando estão em excesso. Figura 3. Transporte de grupos amino via glutamina. Fonte: Lehningher, Os grupos amino liberados nos músculos se ligam ao glutamato e este pode ser convertido à glutamina (receber amônia) ou transferir seu grupo α-amino para o piruvato pela ação da alanina-aminotransferase formando alanina, para serem levados até o fígado. Essa reação pode ser revertida em ambos os tecidos e a alanina também não possui cargas elétricas o que lhe permite passar facilmente pelas membranas. A alanina também pode remover piruvato do músculo e leva-lo até o fígado para servir de precursor da glicose na via de gliconeogênese e a glicose produzida pode voltar para o músculo para servir de energia no ciclo conhecido como 4

5 glicose-alanina. Ocorre que no citosol hepático a alanina aminotransferase transfere o grupo amino da alanina para o α-cetoglutarato formando piruvato e glutamato. O glutamato entra na mitocôndria para liberar a amônia e o piruvato será convertido em glicose. Figura 4. Transporte de grupos amino via alanina. Fonte: Lehningher, Excreção Uma parte da amônia oriunda da desaminação dos aminoácidos é usada para a formação de compostos nitrogenados biologicamente úteis e o restante precisa ser convertido a uma forma menos tóxica pra ser excretado. Em geral a amônia é convertida em ureia ou acido úrico no fígado e só uma pequena parte pode ser coletada pelos rins. Mas quando o organismo está em acidose metabólica, os rins aumentam a capitação de glutamina que está transportando amônia dos tecidos para o fígado, nestes casos a amônia liberada ai pela ação da glutaminase e glutamato desidrogenase não é levada até o fígado ou convertido em ureia, e sim é diretamente excretada na urina. Todos os animais excretam uma pequena porção dos compostos nitrogenados na forma de amônia. No entanto, a excreção nesse caso se da na forma de amônio (NH + 4 ), ou seja, a molécula de amônia (NH 3 ) precisa ganhar mais um hidrogênio e passar a amônio para poder ser 5

6 excretada. Esse mecanismo, se utilizado para excretar toda a amônia produzida pelo organismo, levaria a um processo de alcalose metabólica. O destino da amônia produzida pelas diferentes reações de desaminação varia com o tipo de animal e seu habitat. Como a amônia é altamente tóxica, os tecidos animais são equipados com diferentes mecanismos para converter amônia em substâncias atóxicas ou para posterior utilização no anabolismo pelo animal ou excreção. Os meios mais importantes para a excreção do excesso de nitrogênio são: formação e excreção de ureia em vertebrados terrestres (ureotélicos); síntese de acido úrico em aves e repteis que vivem no solo (uricotélicos) e eliminação direta em animais aquáticos (amonotélicos). Formação de ureia O ciclo da ureia foi descoberto em 1932 por Krebs e Henseleit, antes mesmo da descoberta do ciclo do ácido cítrico. Este processo ocorre no fígado e é nele que a através de uma série de reações dois grupos amino são incorporados a uma molécula de CO 2 para formar uma molécula de ureia. A desaminação dos aminoácidos ocorre principalmente no fígado e os íons amônio resultantes podem ser transformados em ureia no fígado na maioria dos vertebrados terrestres. Os íons amônio e o dióxido de carbono (originário basicamente do ciclo de Krebs) interagem com ATP, formando fosfato de carbamoil nas mitocôndrias. Os geradores primários de íons amônio mitocondriais são a glutamato-desidrogenase e a glutaminase. O fosfato de carbamoilsintetase I requer N-acetilglutamato para sua atividade. O N-acetilglutamato é um composto produzido a partir de acetil-coa e glutamato e é sintetizado em quantidades maiores quando estão presentes quantidades maiores de aminoácidos, fornecendo assim um sinal para aumentar a síntese de ureia durante o excesso de aminoácidos. O grupo carbamoil é transferido do fosfato de carbamoil para a ornitina formando citrulina, uma reação catalisada pela ornitina-transcarbamoilase das mitocôndrias. Após o transporte da citrulina ao citossol, a arginino-succinato-sintetase catalisa então a condensação de aspartato com citrulina para produzir arginino-succinato. Esta síntese é regida por clivagem do ATP em AMP e pirofosfato inorgânico (PPi) e pela subsequente hidrolise de PPi em dois Pi. A argininosuccinase rompe então o arginino-succinato em fumarato e arginina. Esta ultima é rompida hidroliticamente pela arginase para formar ureia e ornitina, completando assim o ciclo. A arginase é encontrada em grandes quantidades apenas no fígado em animais que excretam ureia. O fumarato gerado na reação de arginino-succinase é prontamente hidratado em malato e reoxidado em oxalacetato para aceitar um grupo amino, em geral proveniente do glutamato, a fim de regenerar aspartato. 6

7 Figura 5. Ciclo da ureia. Fonte: Schmidt-Nielsen, Em resumo o ciclo da ureia ocorre em 5 passos: 1. Grupo amino + CO 2 carbamil fosfato (catalisada pela carbamil fosfato sintetase I e consome 2 moléculas de ATP). 2. Ornitina + grupo carbamil citrulina + Pi (catalisada pela ornitina transcarbamilase). 3. Aspartato + citrulina argininossuccinato (catalisada pela argininossuccinato com consumo de 1 molécula de ATP). 4. Argininossuccinato arginina + fumarato (hidrolise pela argininossuccinato liase). 5. Arginina ornitina + ureia (hidrolise pela arginase). O fumarato produzido é um intermediário do ciclo do acido cítrico, então os ciclos são interconectados em um processo dito bicicleta de Krebs. Cada ciclo pode funcionar de maneira independente dependendo do transporte de intermediários entre a mitocôndria e o citosol para estabelecer comunicação. O fumarato pode ser convertido em malato e este, em oxalacetato no citosol, esses intermediários podem sofrer metabolização no próprio citosol ou ser transportado para o interior da mitocôndria para uso no ciclo de Krebs. Também o aspartato formado na mitocôndria pode ser transportado no citosol e servir como doador de nitrogênio na reação do ciclo da ureia. Nos animais ruminantes os níveis de ureia são mais elevados (15-40 mg/dl) devido a absorção de amônia pelo rúmen. Além disso, nos ruminantes a amônia é metabolizada no fígado a ureia e esta deve voltar ao rúmen via sangue ou via saliva. Isto significa uma poupança de energia para a produção de ureia e água. Quando a amônia alcança o rúmen ela é rapidamente desdobrada em amônia e CO 2 pela enzima uréase, produzida pelas bactérias. Os micro- 7

8 organismos ureolíticos e proteolíticos utilizam esta amônia para a síntese da sua própria proteína. À medida que o bolo alimentar avança no processo de digestão estes microorganismos são arrastados junto. Quando chegam ao abomaso (estômago químico) em função do baixo ph e ação das enzimas as proteínas inclusive a dos micro-organismos é degradada e os aminoácidos vão para a corrente sanguínea via sistema portal para serem usados na síntese proteica. É raro, mas podem ocorrer distúrbios metabólicos da síntese da ureia se qualquer uma das cinco enzimas do ciclo for deficiente. A toxicidade da amônia faz com que as primeiras reações do ciclo ocorram dentro da mitocôndria para que os íons amônia não caiam na corrente sanguínea. A toxicidade da amônia se deve ao fato de sua capacidade de ligação com o α- cetoglutarato que é um composto intermediário do ciclo de Krebs. Em caso de excesso de amônia pode ocorrer uma grande utilização do α-cetoglutarato, diminuindo sua disponibilidade para o ciclo de Krebs e eventualmente este e a cadeia de transporte de elétrons podem parar. Além disso, a ureia é uma base forte e pode provocar alcalose. A sintomatologia clinica da intoxicação por amônia são: vômitos, irritabilidade, letargia, ataxia intermitente e retardamento mental. As dietas pobres em proteínas e pequenas refeições frequentes resultam em concentrações mais baixas de amônia sanguínea, e, portanto, em menos sintomas. Formação e excreção do acido úrico A excreção de ureia obriga a excreção conjunta de água. No caso dos repteis que vivem em solo e as aves que possuem seu desenvolvimento embrionário em ovos com cascas impermeáveis a água não é possível à excreção de ureia, pois não há excreção de água. Além disso, a reserva de água no interior desse ovo é limitada e a excreção precisou ser adaptada para ocorrer na forma de produtos insolúveis (acido úrico precipitado). A via do ácido úrico é uma importante rota para a eliminação dos compostos nitrogenados em aves e repteis. Nesses animais a via biossintética das purinas foi adaptada para fazer a excreção de N na forma de ácido úrico. Uma vez que o acido úrico também é o principal subproduto da degradação das purinas (adenina e guanina) nos primatas, pássaros e repteis. O acido úrico nas aves é formado no fígado a partir da amônia. A hepatotectomia provoca acumulo de amônia e aminoácidos no sangue das aves, exatamente como ocorre nos mamíferos. Acredita-se também que o rim, assim como o fígado, possa ser um local de síntese de acido úrico nas aves. Para a formação de acido úrico há considerável gasto energético uma vez que inicialmente são formadas adenina e guanina a partir do nitrogênio de alguns aminoácidos e carbono oriundo de moléculas doadoras. Posteriormente adenina e guanina são transformadas em acido úrico por uma via em que o grupo fosfato é perdido pela ação da 5 -nucleotidase. O adenilato libera a 8

9 adenosina, que é então desaminada para inosina pela adenosina desaminase. A inosina é hidrolisada para liberar a D-ribose e a base purínica hipoxantina. A hipoxantina é oxidada sucessivamente para xantina e para ácido úrico pela xantina oxidase, uma flavoenzima que contém um átomo de molibdênio e quatro centros ferro-enxofre em seu grupo prostético, como se pode ver na Figura 6. O mesmo ocorre com a guanina, esta sofre remoção hidrolítica do seu grupo amino para liberar xantina que também é convertida em ácido úrico pela xantina oxidase. Figura 6. Síntese de ácido úrico (principais reações). Enzimas: (1) ribose 5-fosfato pyrophosphokinase, (2) glutamina fosforribosil pirofosfato amidotransferase, (3) fosforribosil sintetase glicinamida, (4) amido-ligase, (5) sintetase específica, (6) xantina oxidase. Fonte: D Mello, O acido úrico é filtrado livremente no glomérulo e é também secretado pelos túbulos. A secreção tubular é o processo dominante e é responsável por 90% da excreção total. A presença do sistema porta renal fornece uma grande fonte de sangue para os túbulos para ser depurado em vez de serem fornecidas pelas arteríolas eferentes, e assim maiores quantidades podem ser secretadas para os túbulos. As grandes quantidades de acido úrico nos túbulos superam a sua 9

10 solubilidade, e a precipitação ocorre. O acido úrico continua através dos túbulos na forma precipitada e aparece na urina como um coágulo esbranquiçado. Como o acido úrico não permanece na solução, ele não contribui para a pressão osmótica efetiva do fluido tubular, e a perda obrigatória de água é evitada. Segundo Sonne et al. (1946), citados por Waldroup et al. (2005), o aumento do requerimento da glicina em aves jovens ocorre em função da maior excreção de nitrogênio, pois cada molécula de ácido úrico excretada representa a perda de uma molécula de glicina pelas aves. O metabolismo das purinas e purimidinas, bases nitrogenadas, possuem uma independência celular. Isto é, já no intestino delgado aquelas que não foram utilizadas no metabolismo normal são convertidas em ácido úrico que é excretado ou quando em excesso pode acumular-se nas articulações no processo conhecido como Gota. No entanto, esta não é a principal via de excreção, uma vez que grande parte das purinas é absorvida para o fígado e, este sim, encarregase de convertê-las em ácido úrico e excretá-lo por via urinária. A doença conhecida como gota, que nada mais é do que um processo inflamatório doloroso resultante do acúmulo de ácido úrico nas articulações, pode ser resultado de uma hiperatividade da enzima PRPP-sintetase ou por redução da atividade da enzima HGPRTase. Mas ambos são problemas hereditários, reversíveis mediante a diminuição de alimentação rica em material celular (carnes vermelhas, principalmente) e uso de medicamentos bloqueadores da síntese de ácido úrico, como por exemplo, a droga conhecida como alopurinol um inibidor da xantina oxidase responsável pela conversão das purinas em ácido úrico. Figura 7. Formação de ácido úrico no intestino e no fígado. Fonte:Vieira,

11 Excreção direta O amônio urinário origina-se nos túbulos distais dos rins de mamíferos, em grande parte da hidrolise de glutamina por glutaminase e em segundo lugar da desaminação de outros aminoácidos. Os cetoácidos resultantes são usados principalmente para gliconeogênese. A amônia formada em células tubulares renais reage com íons hidrogênio, produzindo íons amônio durante a acidose metabólica. A excreção de íons amônio é negligível durante a alcalose. A excreção de íons amônio ajuda a conservar íons sódio, que são os principais cátions na regulação da concentração eletrolítica e do equilíbrio acidobásico no sangue. Tal reposição de íons sódio com íons amônio verifica-se em maior proporção durante a cetose, quando estão sendo eliminados corpos cetônicos pela urina. Os animais aquáticos que excretam excesso de nitrogênio como íons amônio produzem a maior parte da amônia excretora pela ação da glutaminase sobre a glutamina. Nos animais amoniotélicos (excretores de amônia) o catabolismo dos aminoácidos inicia com uma transaminação envolvendo o α-cetoglutarato formando-se glutamato. Glutamato igualmente pode ser formado pela desidrogenase glutâmica utilizando-se de amônia livre. No entanto, o glutamato não pode atravessar as membranas celulares devido as suas cargas negativas em ph fisiológico sendo necessário a ligação com mais amônia, processo catalisado pela glutamina sintetase. A molécula de glutamina formada é neutra, não toxica e capaz de se translocar e transportar N na forma amídica para o fígado ou para as guelras no caso dos peixes. Nas guelras a glutamina sofre ação da glutaminase aí presente e libera o N na forma de amônia que é excretada para o meio exterior. Existem 4 mecanismos conhecidos para a excreção da amônia via epitélio branquial, que podem ser observados na Figura 8. 11

12 Figura 8. Mecanismos de excreção de amônia do sangue para a água através da superfície mucosa do epitélio branquial. Fonte: Bombardelli, Considerações finais De maneira geral o metabolismo proteico dos animais consiste na ingestão, digestão e absorção e os aminoácidos absorvidos são direcionados para a síntese proteica ou para a síntese de compostos não proteicos, ou ainda podem ser desviados para vias de degradação para a geração de energia. Os grupos amino liberados dos processos de degradação sejam oriundos da proteína da dieta ou degradação tissular precisam ser convertidos em compostos menos tóxicos para serem excretados, exceto os peixes que conseguem excretar amônia junto a grande volume de água. A amônia é um composto tóxico para o organismo por se liga aos intermediários do ciclo de Krebs promovendo a depleção de ATP ou por precisar de íons H+ o que pode desencadear quadros de alcalose metabólica. Referências bibliográficas BOMBARDELLI, R. A.; MEURER, F.; SYPERRECK, M. A. Metabolismo proteico em peixes. Arquivos de Ciência Veterinária e Zoologia Unipar, v. 7, p , CHAMPE, P. C.; HARVEY, R. A.; FERRIER, D. R.; Tradução: DALMAZ, C.; et al. Bioquímica Ilustrada. 3º ed. Porto Alegre: Artmed, 2006, 544p. REECE, W.O. Dukes Fisiologia dos animais domésticos. 12º Ed. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S.A., 2006, 926p. GONZALEZ, F. H. D., SILVA, S. C. Introdução à bioquímica clinica veterinária. 2º Ed. Porto Alegre, 2006, 360p. 12

13 GOULART, C. C. Utilização de aminoácidos industriais e relação aminoácidos essenciais: não essenciais em dietas para frangos de corte. (Tese) Programa de Doutorado Integrado em Zootecnia, da Universidade Federal da Paraíba. Areia, Paraíba, 2010, 115p. NELSON, D. L.; MICHAEL M. COX: Lehninger Princípios de Bioquímica. 3º ed. New York : W. H. Freeman and Company, 2002, 907p. SCHMIDT-NIELSEN, K. Fisiologia animal: adaptacao e meio ambiente. Editora Santos. 1996, 600p. VIEIRA, R. Fundamentos de Bioquímica. Textos didáticos. Belém do Pará. 2003, 159p. WALDROUP, P.W.; JIANG, Q.; FRITTS, C. A. Effects of glycine and threonine supplementation on performance of broiler chicks fed diets low in crude protein. International Journal of Poultry Science, v.4, n.5, p ,