TRATAMENTO DO BAMBU USANDO NANOPARTÍCULAS DE PRATA: I- SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA COM PROPRIEDADES ANTIFUNGICAS

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1 TRATAMENTO DO BAMBU USANDO NANOPARTÍCULAS DE PRATA: I- SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA COM PROPRIEDADES ANTIFUNGICAS Aluno: Eric Luz Orientadores: Omar Pandoli e Fatima Ventura Pereira Meirelles Apresentação Este trabalho dá início a uma parceria entre o Grupo de Pesquisa em Materiais e Tecnologias não Convencionais, do Departamento de Engenharia Civil e o Departamento de Química da Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-Rio) 1. Introdução A prata coloidal, ou solução de nanopartículas de prata (NPs-Ag) de tamanho de nm, é um excepcional bactericida e germicida por excelência. Sabe-se que esta elimina mais de 650 espécies de, vírus, bactérias, parasitas, fungos e micoplasmas em poucos minutos[1]. Nos últimos anos tem sido uma constante na área da construção civil a preocupação pelo estudo de materiais, equipamentos e técnicas que possibilitem o barateamento da habitação popular. Os países em desenvolvimento possuem uma grande reserva de materiais potencialmente utilizáveis, mas faz-se necessário o desenvolvimento e implantação de técnicas de baixo consumo de energia, ao mesmo tempo em que se incentive a renovação dos produtos naturais. O bambu é uma gramínea cuja macroestrutura e mesoestrutura possibilitam sua classificação como material compósito inteligente. O baixo consumo de energia em sua produção, a grande abundância e seu baixo preço o caracterizam como material potencialmente promissor para esta finalidade, além de evitar a poluição, mantendo-se a conservação dos recursos naturais. Assim, a utilização do bambu pode ser de fundamental importância para o desenvolvimento sustentável, principalmente no que diz respeito às habitações populares [2]. A preservação do bambu pode ser alcançada por diferentes métodos, a depender do tempo em que está sendo feito o tratamento e da infra-estrutura disponível [3]. Dentre estes métodos, podem ser citados o tratamento com fumaça (fumegação) e a aplicação de soluções químicas impregnadas com aplicação de pressão (método boucherie) o por imersão. O tratamento do bambu com objetivo de preencher os canais meso e microestruturados internos das fibras vegetais usando soluções coloidais de prata (materias nanoestruturados) poderá levar ao desenvolvimento de materiais não-convencionais com propriedades antifúngicas capazes de preservar a matriz biológica do bambu e com isso aumentar a durabilidade do bambu e melhorar suas propriedades mecânicas. Os principais agressores microscópicos do bambu são os fungos. Micro-organismo bem diferente das bactérias, os fungos são eucariotos formados por hifas, estruturas filamentosas e cilíndricas com diâmetro inferior a 10nm. Além de apresentarem duas principais partes: o micélio, um conjunto de hifas, (parte celular) e os esporângios, responsável pela esporulação e parte reprodutiva do fungo. Os fungos por apresentarem maior resistência do que as bactérias e o pouco estudo da ação das nanopartículas sobre estas espécies, tornam esse trabalho inédito e de mais difícil comparação com a literatura.

2 2. Materiais e Métodos Experimentais 2.1 Síntese da nanopartículas de prata (NP-Ag) A síntese das nanopartículas de prata (NPs-Ag) foi executada por redução química convencional do nitrato de prata (AgNO 3 ) na presença do agente redutor borohidreto de sódio (NaBH 4 ) e de agentes ligantes como tartarato de sódio (Na 2 C 4 H 4 O 6 ) [4] e citrato trissódico (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) [5]. A reação pode ser simplificadamente representada abaixo. AgNO 3 + Ligante + NaBH 4 Agº /Ligante + ½ H 2 + ½ B 2 H 6 +NaNO 3 Foram utilizadas duas diferentes formas de condução: em batelada e fluxo continuo. As condições são apresentadas nas Tabelas 1 e 2 respectivamente. Tabela 1: Síntese de NP-Ag em batelada Cód. Ligante Ag+:Lig. ph R18 Citrato 1:10 6,7 R19 Tartarato 1:10 6,7 R20 Citrato 1:1 6,7 R21 Tartarato 1:1 6,7 R23 Citrato 1:8 6,7 R24 Citrato 1:6 6,7 R25 Citrato 1:4 6,7 R59 Tartarato 1:1 6,7 R71 Ac. Tartárico 1:1 10,0 R72 Ac. Tartárico 1:1 9,0 R74 Ac. Tartárico 1:1 7,0 Tabela 2: Síntese de NP-Ag em fluxo Cód. Ligante Ag+:Lig. Ag+ (ml/min) Lig. (ml/min) R99 Tartarato 1:1 1 1 R102 Citrato 1:1 1 1 R103 Citrato 1:2 0,5 1 R104 Citrato 1:4 0,25 1 R105 Citrato 1:1 0,5 0,5 R106 Citrato 2:1 0,5 0, Síntese da NP-Ag em batelada: No processo em batelada, coloca-se uma mistura de AgNO 3 em concentração fixa e ligante em concentração variada, ao abrigo da luz e agitação constante, até formação do complexo metal-orgânico. Em seguida a mistura transferida para uma seringa (Figura1) e gotejada num recipiente contendo NaBH 4 na sob agitação constante (figura 2) e temperatura controlada. Ao final avoluma-se a 8,5 ml com água. Utilizou-se diferentes razões molares (1:1; 1:2; 1:5 e 1:10) Ag + /Ligante.

3 Figura 1: Bomba Seringa Figura 2: Nanopartículas sob agitação Síntese da nanopartícula de prata em fluxo [6]: Na síntese em fluxo (Figura 3), a solução de AgNO 3 e ligante são sugadas por duas bombas peristálticas (Figura 4) e injetas no microreator de vidro (Figura 5) aonde ocorre a formação do complexo prata-ligante. A proporção equivalente entre prata e o ligante é determinada pela velocidade parcial de cada reagente no sistema reacional microfluidico. No recipiente de coleta, encontra-se o NaBH 4 aonde ocorrerá a redução da prata sobre agitação constante. Figura 3: Síntese em Fluxo [6] Figura 4: Bombas Peristálticas Figura 5: Microreator

4 2.2 Caracterização parcial das nanopartículas de prata: A solução coloidal preparada de acordo com o item 1é caracterizada pela determinação de tamanho e dispersão das NPs-Ag. A caracterização morfológica e dimensões das nanopartículas de prata foram estimadas por um espectrômetro UV-Vis da marca Perkin (Figura 6). O diâmetro das nanopartículas é proporcional ao comprimento de onda λ máximo de absorbância característico a 400 nm (Figura 7) [6-7]. Figura 6: Espectrômetro UV-Vis 2.3 Testes Microbiológicos: Figura 7: Esquema da oscilação de um plasmão para uma esfera, e o deslocamento eletrônica dos elétrons [7] Micro-organismo: Neste estudo utilizou-se o fungo Aspergillus niger. Pode-se observar as células como uma massa branca e os esporos como as partes escuras Preparo de meios de cultura e esterilização de materias: Dissolve-se o Agar Saubourad ou Agar PDA (meios de cultura especifico para fungos) em água destilada mantendo a concentração descrita no rotulo. Despeja-se o conteúdo num erlenmeyer, lacrando-o com uma rolha de algodão. Todo material (ponteiras, placas, erlenmeyer com o meio) deverá ser embrulhado com papel apropriado e colocado na autoclave (Figura 8) durante 20 minutos na temperatura de 121 ºC a pressão de 1 atm. Após termino da esterilização, na câmara de fluxo laminar (Figura 9), um ambiente estéril, despeja-se o meio de cultura nas placas Petri, antes que ocorra seu endurecimento do meio.

5 Figura 8: Autoclave Figura 9: Câmara de Fluxo Laminar Repique (inóculo) do Fungo: Os testes antimicrobianos utilizaram o fungo do gênero Aspergillus como agente de prova. A fim de manter o fungo vivo foi necessário fazer um repique a cada quinze dias, isto é, transferi-lo para uma nova placa com meio de cultura e deixa-lo crescer. O repique poder ser feito por dois métodos: Técnica de esgotamento: Este método [7] é utilizado para isolar células pois devido à sua praticidade é muito utilizado para fazer repiques de manutenção de estirpes: Flamba-se a alça de inóculo, Raspa-se um pouco da estirpe mãe, Numa nova placa faz-se linhas de estrias (rabiscos) tentado ocupar o máximo da superfície da placa e obtendo-se diferentes concentrações celulares. (Figura 10). Figura 10: Técnica de esgotamento para obtenção de cultura pura: (a) modo espalhamento do inóculo; (b) aspecto da placa estriada após incubação. Notar a presença de crescimento na região correspondente ao início do procedimento e de colônias isoladas no final do processo [7]

6 Diluições Sucessivas: Este método [7] é usado para testar efeitos de uma determinada substância sobre o micro-organismo. Pode-se controlar a quantidade de células inoculadas através de diluições sucessivas a partir de uma suspensão inicial (Figura 11). Por meio de alça de inoculo, raspa-se um pouco da estirpe mãe e suspende-se em tampão. Realiza-se diluições sucessivas da suspensão celular até que alcance a concentração desejada. Espalha-se o volume desejado (100 µl), com a alça de Drigalski, de forma uniforme na placa com meio de cultura Incuba-se na temperatura de crescimento do fungo pelo tempo desejado. Figura 11: Ilustração método das Diluições Sucessivas [7] Atividade microbiana: As suspensões diluídas sucessivamente, conforme item , foram espalhadas em placas de Petri contendo diferentes soluções de NP. A saber: Diferentes ligantes Diferentes ph Diferentes proporções de ligantes Obtidas por diferentes formas de condução As placas são incubadas a 37ºC durante uma semana e a observação do crescimento microbiano é feita diariamente ao longo deste tempo.

7 Foram utilizadas duas abordagens: Teste (Figura 12) com NP diluídas, espalhadas uniformemente na placa Teste (Figura 13) com NP concentradas no papel de filtro Figura 12: Placa com NP diluídas Figura 13: Placa com NP concentrada 3. Resultados e Discussão: Os experimentos foram realizados em duplicata e os resultados típicos são apresentados. 3.1 Síntese e caracterização das nanopartículas Na síntese das nanopartículas de prata (NPs-Ag) foram utilizados agentes ligantes como citrato e tartarato em diferentes proporções. A figura 15 demonstra diferentes soluções coloidais de nanopartículas apresentando colorações diferentes. Tais cores indicam NPs com diferentes diâmetros, como será verificado na Tabela 3. Figura 15: Exemplos de soluções coloidais de nanopartículas Os espectros de absorção de cada NP utilizada nesta fase do trabalho encontram-se agrupadas nos gráficos 1 e 2 para os experimentos em batelada com citrato e tartarato respectivamente e no gráfico 3 para os experimentos em fluxo. Na tabela 3 encontram-se os resultados obtidos na síntese e caracterização das nanopartículas de pratas utilizadas nesta fase do projeto.

8 Em Batelada Em Fluxo (F) Tartarato Citrato Tartarato Citrato Tabela 3: Características das NP obtidas Ag+ : ligante 1:1 1:4 1:6 1:8 1:10 NP R20 R25 R24 R23 R18 λ máximo(nm) 404,19 402,99 405,78 405,61 417,17 Diâmetro (nm)* 29,397 27,882 31,379 31,168 44,778 NP R21/R59 R19 λ máximo(nm) 401,63/394,88 405,05 Diâmetro (nm)* 26,146/17,235 30,472 Ag+ : ligante 1:1 1:1 1:2 1:4 2:1 NP R102 R105 R103 R104 R106 λ máximo(nm) 420,50 392,91 400,08 412,21 407,89 Diâmetro (nm)* 48,428 14,541 24,144 39,116 33,967 Fluxo(mL\min) 1 0,5 0,5:1 0,25:1 0,5:0,25 NP R99 λ máximo(nm) 397,52 Diâmetro (nm)* 20,7796 Fluxo (ml\min) 1 *Diâmetro da nanopartícula estimado de acordo com a FlowChemistryPracticalCourse [2], utilizando λ máximo no espectro UV-Vis Gráfico 1: Espectro UV-Vis das Nanopartículas em batelada, citrato como ligante Pela valores da tabela 3 e do gráfico 1 observa-se a importância da proporção entre Ag+ : ligante. Utilizando o citrato como agente ligante obtém-se nanopartículas com diferentes λ máximo de absorbância. Encontra-se NP com médias de pico em 402,98nm conferindo um tamanho próximo a 27nm a nanopartículas grande com absorbância máxima em 417,17nm caracterizando um diâmetro aproximadamente de 45nm [6].

9 Gráfico 2: Espectro UV-Vis das Nanopartículas em batelada, tartarato como ligante Pelos valores da tabela 3 e do gráfico 2 comprova-se um deslocamento dos picos de absorção máxima de duas nanopartículas, ambas obedecendo condições idênticas de preparo, a R21 e R59: apresentaram uma grande diferença no λ máximo de absorbância (394,88 a 491,63). Observa-se que no caso do tartarato a proporção de Ag+ : ligante, 1:10 (R19), apresenta nanopartículas maiores do que a proporção 1:1 (R21 e R59). Gráfico 3: Espectro UV-Vis das nanopartículas em fluxo continuo

10 Pelos valores da tabela e do gráfico 3 verifica-se a influência da velocidade de fluxo na síntese de NP. Comparando-se R102 com R105, obtidas com a mesma proporção equivalente de prata e agente ligante, 1:1, verifica-se diferentes tamanhos: nanopartículas grandes, com pico no espectro em 420,50nm, e nanopartículas pequenas com λ máximo de absorbância de 392,91nm. Tal diferença pode ser decorrente dos diferentes fluxos utilizados 1 e 0,5mL/min. Constatou-se também uma diferença de resultados para os dois ligantes tartarato e citrato. A R99 e R102, ambas com a mesma velocidade de fluxo e mesma proporção equivalente Ag+ : ligante (1:1), apresentaram resultados extremos. A R99 com o pico no espectro na casa dos 397,52nm resultou numa das menores nanopartículas obtida no estudo e a R102 com λ máximo de 420,50nm caracteriza uma das maiores nanopartículas obtidas. Na síntese em fluxo essa variação é menor, provavelmente devido ao encontro de Ag+ e ligante na proporção desejada. Verifica-se que velocidade de fluxo, de mesma proporção e- quivalente, menores favorecem sínteses de NP menores. Segundo a literatura as menores nanopartículas são os agentes antimicrobianos mais eficientes [5]. Assim, pode dizer que todas as nanopartículas R21, R99 e R59, utilizando o tartarato como agente ligante podem ser as mais promissoras para estudos futuros do que as sintetizadas com citrato, tanto em batelada e como em fluxo continuo. Em alguns casos a síntese em batelada forneceu nanopartículas (R59 e R20) menores do que fluxo, mas essa diferença está dentro da margem de variação da síntese em batelada, mencionado anteriormente para as nanopartículas R21 e R59. Um fator de bastante peso a favor da síntese em fluxo é o tempo total do processo: em batelada a síntese pode demorar uma semana devido a formação do complexo prata-ligante, enquanto no caso de fluxo continuo a formação do complexo é imediata e controlada. Nesta forma de condução a síntese leva apenas alguns minutos.

11 Departamento de Química 3.2 Testes microbiológicos Efeito da proporção de Ag+: ligante Na literatura, um dos ligantes orgânicos mais utilizados em sínteses de nanopartículas de prata é o citrato [5]. Foram realizados testes microbiológicos com NP-Ag (figura 16), sintetizadas em batelada, variando a proporção do ligante (Tabela 3). As imagens são apresentadas na Tabela 4. Figura 16: Nanopartículas sintetizadas com citrato Tabela 4: Efeito da proporção Ag+:Citrato utilizada na síntese de NP em batelada, sobre o crescimento e a esporulação do fungo Ag+:Citrato 1:1 1:4 1:6 1:8 1:10 NP R20 R25 R24 R23 R18 24h 48h 120h ph da solução de nanopartícula: 6,7 Em ph 6,7 o aumento da proporção Ag+ : citrato afetou o crescimento microbiano e a esporulação. Nas primeiras 24 horas, verifica-se uma relação diretamente proporcional entre a quantidade de ligante e o crescimento, isto é, quanto maior a quantidade de ligante, maior o crescimento celular. Além disso observa-se o efeito das nanopartículas na esporulação a partir de 48 horas, acelerado pelas nanopartículas com proporções entre Ag+ : Ligante superiores 1:6. No período de 120 horas ocorreu a esporulação completa em todas as seis placas.

12 Departamento de Química Efeito do ligante Outro possível ligante orgânico citado na literatura é o tartarato [4]. Nos testes microbiológicos compararam-se esses dois ligante em duas proporção de Ag+ : Ligante diferentes (Figura 17) (Tabela 5). Figura 17: Nanopartículas sintetizadas com diferentes ligantes, citrato ou tartarato Tabela 5: Efeito da proporção Ag+:Citrato e Ag+:Tartarato utilizada na síntese de NP em batelada, sobre o crescimento e a esporulação do fungo Ag+ : Lig. Citrato 1:1 Tartarato 1:1 Citrato 1:10 Tartarato 1:10 NP R20 R21 R18 R19 24h 48h 120h Observa-se pela tabela 5 que o crescimento do fungo tanto nas soluções com citrato quanto com tartarato na proporção Ag+: ligante 1:1 parece ter sido levemente inibido em 24h. Quando aumenta-se a proporção metal: ligante para 1:10, ou seja, quanto menos prata, proporcionalmente, verifica-se que o tartarato além de inibir o crescimento nas primeiras 24h retarda a esporulação pelo menos até as 48h. Em 120 horas ocorreu a esporulação completa em todas as cinco placas.

13 3.2.2 Efeito do ph da preparação de Ag+ : ligante Um outro fator importante constatado na literatura é o ph [5] no preparo das nanopartículas de prata. Realizou-se dois testes para avaliar o efeito do ph das soluções de NP (Figura_18) na atividade microbiana utilizando duas diferentes abordagens como previamente a- presentadas: Teste com NP diluídas (Tabela 6) Teste com NP concentradas (Tabela 7) Figura 18: Nanopartículas sintetizadas em diferentes ph Tabela 6: Efeito do ph da preparação 1:1 de Ag+ : tartarato utilizada na síntese de NP em batelada, sobre o crescimento e a esporulação do fungo ph 10,0 9,0 7,0 Sem NP R71 R72 R74 24h 48h 120h Observa-se pela tabela 6 que nas primeiras 24 horas, na proporção 1:1 de Ag+: tartarato, em ph 10,0 não houve efeito da NP no crescimento. Porém em ph 9,0 e 7,0 o crescimento parece ter sido menor. Em 48 horas a NP R74, com ph 7,0, parece ter atrasado a esporulação.

14 Em 120 horas embora tenha ocorrido esporulação em todas as placas, uma menor densidade de esporos é observada na placa contendo nanopartícula R74. Tabela 7: Efeito do ph da preparação 1:1 de Ag+ : tartarato utilizada na síntese de NP em batelada, sobre o crescimento e a esporulação do fungo ph 10,0 9,0 7,0 Sem NP R71 R72 R74 24h 72h 120h Utilizando a técnica de halos de difusão onde a nanopartícula é concentrada sobre um papel de filtro, observa-se nitidamente um halo, sendo este mais pronunciado em ph 7,0. Tais resultados corroboram os anteriores de que algumas nanopartículas afetam a esporulação do fungo Efeito da forma de condução da síntese das NP A figura 19 apresenta as nanoparticulas testadas nesta etapa do trabalho, enquanto a tabela 8 os resultados com os λ máximos. Foram utilizadas soluções de Ag+ : tartarato 1:1 com seus respectivos picos de absorbância de λ máximo. Figura 19: Nanopartículas sintetizadas em diferentes formas de condução

15 Departamento de Química Tabela 8: Resultados da comparação entre sínteses, tartarato como ligante Tartarato 1:1 Batelada Fluxo NP / λ máx. R59 / 394,88nm R21 / 401,63nm R99 / 397,52nm 24h Placa 1 72h 120h Analisando os resultados dos experimentos em batelada pode-se dizer que em 72 horas verifica-se o nítido aparecimento de halos entorno do papel filtro contendo as NP. Tanto NP obtidas em batelada quanto aquelas obtidas em fluxo atuaram sobre o fungo. As diferenças nos halos são provavelmente devidas aos diferentes tamanhos das NP, como previamente discutido neste relatório. No marco de 120 horas ocorreu a esporulação completa de todas as quatro placas Efeito da velocidade de fluxo e da proporção Ag+ : Citrato Testes realizados com NP obtidas em fluxo (Figura 20) foram realizados. A avaliação microbiológica dos efeitos destas NP é apresentada na Tabela 9. Foram utilizados aqui citrato como agente ligante em diferente proporções e e velocidades de fluxo. Figura 20: Nanopartículas sintetizadas em fluxo, com citrato

16 Tabela 9: Resultados do efeito da proporção Ag+: Citrato, em fluxo Observa-se no período de 72h, um pequeno halo de indução de esporulação sendo estes mais pronunciados nas nanopartículas R102 e R104. Quando se mantém a proporção e varia-se o fluxo (R105 e R102), obtém-se NP de diferentes tamanhos e com efeitos de diferentes intensidades sobre o fungo. R105 e R106 foram menos efetivas. 4. Conclusões A técnica de síntese das NPs-Ag em fluxo continuo em comparação à técnica em batelada permitiu a diminuição do tempo pela síntese de nanopartículas, facilitando a reprodutividade do processo e consequentemente da obtenção de NPs-Ag com características físicoquímicas mais uniformes. Durantes os testes microbiológicos verificaram-se uma relação de proporcionalidade entre o a capacidade na nanopartícula atrapalhar crescimento celular e proporção de prata e a- gente ligante. Aparentemente o melhor ligante, o tartarato, apresentou melhores propriedades microbiológicas, sendo a proporção 1 de prata para 1 de ligante a mais adequada. Foi comprovado a influência do ph durante o processo de síntese nanopartículas, na atividade antimicrobiana. Na faixa de ph testada, o ph 7,0, neutro, apresentou melhores atividades antimicrobianas do que as nanopartículas sintetizadas a partir de ph mais elevados (9,0 e 10,0). Ainda não foram encontradas nanopartículas realmente com propriedades fungicidas, em alguns casos observam-se um efeito fungo estático principalmente em relação a etapa de esporulação que ainda precisam de mais estudos. Comprovou-se que a resposta do fungo é inversamente proporcional ao tamanho das nanopartículas, neste caso a lambda máximo de absorbância. 5. Referências

17 1. Rai M., Yadav A., Gade A., Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials; Biotechnology Advances Ghavami, K. E Fang, H.Y. (editor) Low Cost and Energy Saving Construction Materials, Vol.1 ENVO Publishing Company, Lehigh, Estados Unidos, Ashori, A.; Nourbakhsh, A. Effect of press cycle time and resin content on physical and mechanical properties of particleboard panels made from the underutilized low-quality raw materials. Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Iran. Industrial Crops and Products, Amsterdam, v. 28, n. 2, p , Dias Garcia M. V. Síntese, caracterização e estabilização de nanopartículas de prata para aplicações bactericidas em têxteis, Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia dos Materiais) Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 89p Agnihotri S. Mukherji S. Mukherji S. Size-controlled silver nanoparticles synthesized over the range nm using the same protocol and their antibacterial efficacy. RSC Adv., 4, FlowChemistryPracticalCourse, 2ª ed. FutureChemistry Holding BV Vermelho, A. B. - Pereira, A. F. - Coelho, R. R. R. Práticas de Microbiologia 1ª ed. Rio de Janeiro Editora Guanabara Kogran (Grupo Gen) 2006