ALINE DIAS PAIVA PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS PARA DETECÇÃO DE BOVICINA HC5 POR ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS

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1 ALINE DIAS PAIVA PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS PARA DETECÇÃO DE BOVICINA HC5 POR ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae. VIÇOSA MINAS GERAIS BRASIL 2007

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3 ALINE DIAS PAIVA PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS PARA DETECÇÃO DE BOVICINA HC5 POR ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae. Aprovada: 28 de junho de 2007 Prof. Sérgio Oliveira de Paula Co-orientador Profª. Maria Cristina Baracat Pereira Co-orientadora Profª. Célia Alencar de Moraes Profª. Flávia Maria Lopes Passos Prof. Hilário Cuquetto Mantovani Orientador

4 AGRADECIMENTOS À CAPES, pela concessão da bolsa. À Universidade Federal de Viçosa, pela oportunidade de vivenciar o ensino, a pesquisa e a extensão. Ao Departamento de Microbiologia, pela possibilidade de participação no Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola. Ao Professor Hilário Cuquetto Mantovani, pela orientação, dedicação, incentivo, pelos ensinamentos e por confiar em mim e em meu trabalho. Ao Professor Sérgio Oliveira de Paula, pela co-orientação, disponibilidade e amizade, essenciais na conclusão desse trabalho. À Professora Maria Cristina Baracat Pereira, pela co-orientação e pelo carinho. Às Professoras Célia Alencar de Moraes e Flávia Maria Lopes Passos pela participação na banca de defesa e pelas sugestões. A todos os professores, por contribuírem para meu crescimento intelectual e pessoal. Ao Professor José Mário da Silveira Mezêncio, pela orientação durante a graduação, incentivo e pelos primeiros ensinamentos na área de Imunologia. Ao Jorge, técnico do Laboratório de Imunologia, pela ajuda com a imunização dos animais. Aos estudantes de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola pela boa convivência e pela amizade. ii

5 Às meninas da República e aos amigos de Viçosa, pela torcida e momentos de descontração. Aos novos amigos, Agenor, Meire e Camila, pelos conselhos, paciência e pelo enorme auxílio na realização desse trabalho. A todos os queridos amigos do Laboratório de Microbiologia de Anaeróbios, em especial Ana Andréa, Claudinha, Fernanda, Isabela, Janaína, José Carlos e Marcelinho, pela amizade, risadas compartilhadas e ajuda na realização dos experimentos finais. Aos amigos dos laboratórios de Microbiologia de Alimentos, Patógenos Alimentares, Fisiologia de Microrganismos e Proteômica por tornarem a convivência tão agradável. À grande amiga Ana Karina, pela cumplicidade e pela presença em todos os momentos ao longo desses dois anos de Mestrado. Ao Filipe, pelo companheirismo, carinho e por tornar mais feliz meu último semestre. Aos meus pais, Odília e Hélio, pelo amor incondicional, incentivo e por sempre me apoiarem em minhas decisões. E especialmente a Deus, que se faz presente em todos os momentos de minha vida, transformando todas as fraquezas em força, agradeço por tudo que fui, pelo que sou e pelo que ainda serei. iii

6 BIOGRAFIA ALINE DIAS PAIVA, filha de Hélio de Assis Paiva e Odília Dias Paiva, nasceu em 08 de Junho de 1983, em Juiz de Fora - Minas Gerais. Iniciou o curso de Nutrição, na Universidade Federal de Viçosa, em Março de 2001, pelo qual graduou-se Nutricionista em Julho de Em Agosto de 2005 ingressou no curso de Mestrado em Microbiologia Agrícola, na Universidade Federal de Viçosa, defendendo a dissertação em Junho de iv

7 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS vii LISTA DE TABELAS x RESUMO xi ABSTRACT xiii 1. INTRODUÇÃO 1 2. REVISÃO DE LITERATURA Bacteriocinas Caracterização e classificação Síntese e transporte Imunidade Mecanismo de ação Aplicação industrial de bacteriocinas Bovicina HC Detecção de bacteriocinas Imunidade e Resposta Imunológica Tipos de imunidade Resposta imune primária e secundária Antígenos 20 v

8 2.3.4 Resposta imune a antígenos protéicos extracelulares Anticorpos Reações antígeno-anticorpo Anticorpos policlonais e monoclonais MATERIAIS E MÉTODOS Microrganismos e condições de cultivo Extração e determinação da atividade de bovicina HC Atividade inibitória de sobrenadantes de culturas lácticas bacteriocinogênicas Purificação de bovicina HC Produção de anticorpos policlonais Determinação do título de anticorpos policlonais anti-bovicina HC Análise da especificidade dos anticorpos Análise da capacidade de neutralização da atividade inibitória de bovicina HC5 pelos anticorpos policlonais Monitoramento da produção e quantificação de bovicina HC Efeito citotóxico RESULTADOS Purificação de bovicina HC Titulação dos anticorpos policlonais anti-bovicina HC Especificidade dos anticorpos policlonais anti-bovicina HC Neutralização da atividade antimicrobiana de bovicina HC5 por anticorpo policlonal anti-bovicina HC Produção e quantificação de bovicina HC5 em meio basal Efeito citotóxico de bovicina HC5 sobre células Vero DISCUSSÃO CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS 76 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 78 vi

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Perfil cromatográfico do extrato de bovicina HC5 estocado sob refrigeração por 4 semanas. 44 Figura 2. Perfil cromatográfico otimizado de purificação do extrato de bovicina HC5. 44 Figura 3. Sobreposição dos perfis cromatográficos após otimização do processo de purificação de extratos de bovicina HC5. 45 Figura 4. Separação de amostras de bovicina HC5 purificada e extrato bruto liofilizado em SDS-Tricina-PAGE, 16,5 % de acrilamida. Bioensaios com bovicina HC5 e SDS-Tricina- PAGE. 47 Figura 5. Titulação, por ELISA indireta, do soro pré-imune dos coelhos utilizados para a produção de anticorpos policlonais anti-bovicina HC5. 48 Figura 6. Titulação, por ELISA indireta, dos antissoros coletados após 10, 20 e 30 dias da primeira imunização. 49 vii

10 Figura 7. Titulação, por ELISA indireta, dos antissoros anti-bovicina HC5 produzidos em coelhos New Zealand e coletados ao final dos procedimentos de imunização. 50 Figura 8. Análise da especificidade dos anticorpos policlonais antibovicina HC5, por Western blotting. 52 Figura 9. Análise da especificidade dos anticorpos policlonais antibovicina HC5, por ELISA indireta. 53 Figura 10. Neutralização da atividade de bovicina HC5 pelos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 produzidos em coelho New Zealand. 55 Figura 11. Efeito da neutralização da atividade de bovicina HC5 diluída 1:256 pelos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 produzidos em coelho. 56 Figura 12. Crescimento de S. bovis HC5 (A) e S. bovis JB1 (B) em meio basal contendo glicose (16 g L -1 ) como fonte de carbono e energia. 57 Figura 13. Atividade de bovicina HC5 no extrato e no sobrenadante da cultura de S. bovis HC5 incubada por 24 h em meio basal a 39 ºC, expressa em UA/mL, medida pelo método de difusão em ágar (A) e por ELISA indireta, utilizando anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 produzidos em coelho (B). 59 Figura 14. Absorvância das amostras de sobrenadante da cultura e extrato de células de S. bovis JB1, incubada por 24 h em meio basal a 39 ºC, por ELISA indireta. 60 viii

11 Figura 15. Correlação entre os métodos de bioensaio e ELISA indireta para detecção de bovicina HC5 no sobrenadante das culturas de S. bovis HC5 (A) e no extrato de células (B). 61 Figura 16. Percentual de células Vero viáveis após tratamento com solução fosfato de sódio (5 mm, ph 2,0) ( ), acetonitrila 40 % (+), bovicina HC5 ressuspendida em água MilliQ estéril ( ) e bovicina HC5 ressuspendida em solução fosfato de sódio (5 mm, ph 2,0) ( ). 63 Figura 17. Efeito citotóxico de bovicina HC5 sobre células Vero. Células Vero controle, não tratadas com bovicina HC5 (A) e células Vero após 48 h de incubação com 98 μg ml -1 (B), 100 μg ml -1 (C) e 300 μg ml -1 (D) de bovicina HC5 purificada. Aumento de 10X. 65 Figura 18. Efeito citotóxico de bovicina HC5 sobre células Vero após adição de solução estoque de MTT. Células Vero controle, não tratadas com bovicina HC5 (A) e células Vero anteriormente incubadas por 48 h com 98 μg ml -1 (B), 100 μg ml -1 (C) e 300 μg ml -1 (D) de bovicina HC5, após adição de MTT às placas. Aumento de 10X. 66 ix

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Classificação de bacteriocinas 6 Tabela 2. Funções das imunoglobulinas 25 x

13 RESUMO PAIVA, Aline Dias, M.Sc. Universidade Federal de Viçosa, junho de Produção de anticorpos policlonais para detecção de bovicina HC5 por ensaios imunoenzimáticos. Orientador: Hilário Cuquetto Mantovani. Coorientadores: Sérgio Oliveira de Paula e Maria Cristina Baracat Pereira. Algumas bactérias produzem peptídeos antimicrobianos denominados bacteriocinas, que apresentam ação bactericida ou bacteriostática sobre bactérias da mesma espécie ou de espécies filogeneticamente relacionadas. Esses peptídeos têm sido estudados principalmente devido ao potencial para aplicação na indústria de alimentos, na medicina e na agropecuária. Bovicina HC5, uma bacteriocina produzida por Streptococcus bovis HC5, apresenta similaridade com os lantibióticos e possui amplo espectro de ação. Apesar do grande potencial de aplicação das bacteriocinas, a produção destes peptídeos é frequentemente limitada pelos métodos de detecção, quantificação e purificação utilizados. Entretanto, os ensaios imunoenzimáticos podem ser utilizados como uma alternativa mais eficiente para a detecção e purificação de peptídeos antimicrobianos. Este trabalho teve como objetivo produzir anticorpos policlonais para detectar e quantificar a bacteriocina bovicina HC5 por meio de ensaios imunoenzimáticos e determinar o efeito citotóxico da bacteriocina sobre células Vero. A produção de anticorpos policlonais foi realizada com o peptídeo purificado em HPLC seguido da imunização de coelhos New Zealand e camundongos BALB/c e coleta periódica de sangue por até 60 dias. A análise imunoenzimática foi realizada por ELISA indireta e Western blotting em amostras coletadas de soro sanguíneo, extrato de células de S. bovis HC5 ou xi

14 sobrenadante das culturas cultivadas em meio basal. Bovicina HC5 foi capaz de gerar resposta imunológica, de intensidade moderada. Nenhuma reação inespecífica dos anticorpos foi observada com o sobrenadante de outras culturas lácticas nos ensaios de Western blotting e ELISA indireta, sendo detectada somente a bovicina HC5 purificada. No ensaio de difusão em meio sólido, o antissoro anti-bovicina HC5 neutralizou a atividade da bacteriocina em 75 %. Bioensaios indicaram que a bovicina HC5 começou a ser produzida durante o crescimento exponencial de S. bovis HC5 e a atividade biológica da bacteriocina aumentou quando a cultura atingiu a fase estacionária de crescimento. A bovicina HC5 foi detectada no extrato de células e no sobrenadante da cultura de S. bovis HC5 pela técnica de ELISA indireta, a qual apresentou correlação com a atividade determinada por meio de bioensaios. A bovicina HC5 apresentou efeito tóxico sobre células Vero em concentrações iguais ou superiores a 100 μg ml -1. Esses resultados indicam que ensaios imunoenzimáticos podem ser utilizados para a detecção de bovicina HC5, porém outros trabalhos deverão ser realizados para aumentar a sensibilidade da técnica. O efeito de bovicina HC5 sobre diferentes linhagens celulares deverá ser determinado para avaliar o potencial tóxico deste peptídeo e sua possível aplicação na produção animal. xii

15 ABSTRACT PAIVA, Aline Dias, M.Sc. Universidade Federal de Viçosa, June, Production of polyclonal antibodies for the detection of bovicin HC5 by immunoenzymatic assays. Adviser: Hilário Cuquetto Mantovani. Co-Advisers: Sérgio Oliveira de Paula and Maria Cristina Baracat Pereira. Some bacteria produce antimicrobial peptides called bacteriocins that show bactericidal or bacteriostatic effect against other bacteria from the same species or species that are phylogenetically related. These peptides have been studied mainly due to their potential application in food industry, in medicine and in livestock production. Bovicin HC5, a bacteriocin produced by Streptococcus bovis HC5, is similar to the lantibiotics and has a wide spectrum of action. Despite the great potential for practical applications, the production of bacteriocins is frequently limited by the methods used for detection, quantification and purification. However, immunoenzymatic assays can be used as an effective alternative to detect and purify antimicrobial peptides. This work aimed to produce polyclonal antibodies to detect and quantify the bacteriocin bovicin HC5 by immunoenzymatic assays and also to determine the cytotoxic effect of this bacteriocin on Vero cells. Production of the polyclonal antibodies was performed using HPLC-purified peptide followed by immunization of New Zealand rabitts and BALB/c mice. Periodical blood harvests were performed for up to 60 days. Immunoenzymatic analysis was carried out by indirect ELISA and Western blotting with samples from blood serum, S. bovis HC5 cell extracts or supernatants from cultures grown in basal media. Bovicin HC5 generated a immune response of moderated intensity. Nonspecific reactions were not xiii

16 observed between the antibody and the supernatants of other lactic acid cultures by Western blotting and indirect ELISA analysis. Only the purified bovicin HC5 was detected using these techniques. Agar diffusion assays indicated that the anti-bovicin HC5 anti-serum could neutralize 75 % of the bacteriocin activity. The bioassay also indicated that production of bovicin HC5 by S. bovis HC5 started during exponential phase and the biological activity of the bacteriocin increased when the culture reached stationary phase. Bovicin HC5 could be detected in the cell extract and in the supernatant of the S. bovis HC5 culture using the indirect ELISA technique. There was a direct relationship between the activity determined by the ELISA technique and the bioassays. Bovicin HC5 showed toxic effect against Vero cells at concentrations equal to or greater than 100 μg ml -1. These results indicated that immunoenzymatic assays can be used to detect bovicin HC5, but further work is needed to improve the sensitivity of the technique. The effect of bovicin HC5 on different cell lineages must also be investigated to evaluate the toxicity of the peptide and its potential application in animal production. xiv

17 1. INTRODUÇÃO A descoberta e caracterização de compostos antimicrobianos produzidos por organismos isolados de ambientes diversos são de relevância para a indústria, uma vez que contribuem para a inibição do crescimento de microrganismos patogênicos ou deterioradores de alimentos (NOVOTNY JR e PERRY, 1992). Peptídeos antimicrobianos constituem a primeira linha de defesa e fazem parte da imunidade inata, sendo encontrados em várias espécies de organismos eucariotos e procariotos. Algumas vezes, os peptídeos atuam contra grupos específicos de organismos competidores; outras vezes, possuem amplo espectro de atividade, atuando como mecanismo de defesa mais geral (NISSEN-MEYER e NES, 1997). As bactérias apresentam vários sistemas de defesa antimicrobianos, como a produção de antibióticos e de subprodutos do metabolismo, exotoxinas e a síntese de peptídeos biologicamente ativos, denominados bacteriocinas (RILEY e WERTZ, 2002). As bacteriocinas são peptídeos sintetizados nos ribossomos, não são letais para as células produtoras e apresentam ação bactericida ou bacteriostática sobre bactérias da mesma espécie ou de espécies filogeneticamente relacionadas (McAULIFFE et al., 2001; BALAKRISHNAN et al., 2002; HALE et al., 2004). As bacteriocinas são sintetizadas por várias espécies de Eubacteria e por algumas linhagens do domínio Archaea (TORREBLANCA et al., 1994), tendo sido inicialmente caracterizadas em bactérias Gram-negativas (como as colicinas de Escherichia coli). Dentre as bactérias Gram-positivas, as bactérias do ácido láctico têm sido largamente exploradas como um reservatório para peptídeos 1

18 antimicrobianos em função do seu potencial para aplicação na indústria de alimentos, na agropecuária e na medicina (JACK et al., 1995; HELANDER et al., 1997; HOOVER, 1997). Dentre os peptídeos de bactérias lácticas caracterizados, a bacteriocina denominada bovicina HC5, produzida por Streptococcus bovis HC5, tem sido estudada devido ao amplo espectro antimicrobiano, a estabilidade ao calor e a baixos valores de ph (MANTOVANI et al., 2002). A ampliação e legalização do uso de bacteriocinas ainda são limitadas por questões como baixos níveis de produção, dificuldade de purificação e instabilidade das bacteriocinas (GEORGALAKI et al., 2002). Desta forma, o desenvolvimento de procedimentos de detecção, quantificação e purificação eficientes para bacteriocinas, como os baseados em métodos imunológicos, podem facilitar sua aplicação industrial (MARTÍNEZ et al., 1997; MARTÍNEZ et al., 1999). Embora a imunogenicidade das bacteriocinas venha sendo testada e utilizada para o desenvolvimento de anticorpos policlonais (PAbs) e monoclonais (MAbs), o uso de métodos imunológicos na pesquisa sobre bacteriocinas ainda é limitado. A informação relacionada a esse assunto é pequena e os resultados obtidos são contraditórios e insatisfatórios (BHUNIA e JOHNSON, 1992; BHUNIA, 1994; MARTÍNEZ et al., 1998). O objetivo deste trabalho foi produzir anticorpos policlonais anti-bovicina HC5, detectar e quantificar a produção da bacteriocina por meio de ensaios imunoenzimáticos, e determinar o efeito citotóxico da bacteriocina sobre células Vero. 2

19 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Bacteriocinas Caracterização e classificação As bacteriocinas exercem papel importante no sistema de defesa natural de algumas espécies bacterianas, podendo conferir vantagens ecológicas em comunidades bacterianas complexas (JACK et al., 1995; BALAKRISHNAN et al., 2002). As bacteriocinas podem influenciar a dinâmica de populações bacterianas, concedendo vantagens à linhagem produtora, em habitats onde há competição por nutrientes, por inibir ou causar a morte de outras bactérias (WHITFORD et al., 2001). Bacteriocinas de bactérias Gram-positivas diferem daquelas sintetizadas por bactérias Gram-negativas em duas características fundamentais: a produção de bacteriocina não é um evento letal e a liberação do peptídeo é controlada por mecanismos regulatórios específicos (não estando sob controle de mecanismos regulatórios do hospedeiro, como ocorre para bactérias Gram-negativas) (RILEY e WERTZ, 2002). No caso de bactérias lácticas, as bacteriocinas são geralmente peptídeos hidrofóbicos, estáveis ao calor e degradadas pela ação de enzimas proteolíticas do trato intestinal humano, características que conferem interesse especial, em função do potencial biopreservativo em alimentos, possibilitando o aumento da vida de prateleira dos produtos e podendo substituir ou atuar em combinação com métodos 3

20 tradicionais de conservação de alimentos (SHILLINGER et al., 1996; ONDA et al., 2003). A primeira bacteriocina sintetizada por bactérias lácticas a ser caracterizada foi a nisina, em Desde então, várias outras bacteriocinas já foram identificadas (HURST, 1981). A nisina é sintetizada por algumas linhagens de Lactococcus lactis subsp. lactis, sendo a bacteriocina mais extensamente estudada dentre aquelas produzidas por bactérias do ácido láctico (SUÁREZ et al., 1996). Trata-se de uma bacteriocina com 34 aminoácidos e largo espectro de ação, que exibe atividade contra várias células vegetativas de microrganismos patogênicos e deterioradores de alimentos, incluindo Bacillus, Staphylococcus, Clostridium e Listeria, além de algumas bactérias Gram-negativas (KLAENHAMMER, 1988; HARRIS et al., 1992). As bacteriocinas constituem um grupo heterogêneo de peptídeos em termos de tamanho, alvos microbianos, modos de ação e mecanismos de imunidade. Anteriormente, eram classificadas em quatro grupos, de acordo com suas características bioquímicas e estruturais: grupo I, lantibióticos, com resíduos de aminoácidos não usuais, tais como lantionina, 3-metil lantionina, 2,3-dideidroalanina e 2,3-dideidrobutirina, formados pós-tradução; grupo II, peptídeos pequenos, termoestáveis, não modificados e denominados de não lantibióticos; grupo III, proteínas grandes (peso molecular acima de 30 kda), termolábeis; grupo IV, proteínas que formam grandes complexos contendo mistura indefinida de proteínas, lipídeos e carboidratos, que são requeridos para exibir atividade biológica (KLAENHAMMER, 1993; MONTVILLE e CHEN, 1998; MOLL et al., 1999). Recentemente, um novo esquema de classificação foi proposto por COTTER et al. (2005), agrupando as bacteriocinas em duas classes distintas: lantibióticos contendo lantionina (Classe I) e bacteriocinas não lantibióticos, que não apresentam lantionina (Classe II). Esse esquema de classificação também alterou a denominação das bacteriocinas anteriormente classificadas como bacteriocinas da Classe III, designando-as de bacteriolisinas e constituindo um grupo à parte; como nenhum membro da Classe IV foi ainda identificado, este grupo não foi proposto na nova classificação (Tabela 1). Os lantibióticos são pequenos peptídeos (19-38 aminoácidos, com peso molecular inferior a 5 kda), termoestáveis e extensamente modificados póstraducionalmente, resultando na formação de aminoácidos não usuais, como 4

21 lantionina, metil lantionina, deidrobutirina e deidroalanina, os quais formam pontes covalentes, resultando em anéis internos e conferindo características estruturais específicas. Substituições pós-traducionais, de D-alaninas por L-serinas também podem ocorrer (COTTER et al., 2005; DEEGAN et al., 2006). A maioria das bacteriocinas da classe I já identificadas permanece ativa após tratamento térmico e quando estão presentes em alimentos; são degradadas por enzimas proteolíticas do trato gastrintestinal e parecem não ser tóxicas para animais (DAESCHEL, 1985; BHUNIA et al., 1988). Os lantibióticos podem ser divididos em classes de acordo com sua estrutura e modo de ação. Em geral, os lantibióticos catiônicos anfifílicos alongados (Classe Ia, como a nisina) apresentam estrutura mais flexível quando comparados às demais bacteriocinas e promovem a formação de poros nas células sensíveis, levando à dissipação do potencial de membrana (Δψ) e, ou do gradiente de ph, com conseqüente efluxo de pequenos metabólitos (OKEREKE e MONTVILLE, 1992). Já os lantibióticos globulares (Clase Ib, como a mersacidina) não apresentam carga líquida e exercem sua ação por interferirem em reações enzimáticas essenciais nas células-alvo. Entretanto, alguns lantibióticos podem apresentar ambos os mecanismos de ação, sendo atualmente proposto a subdivisão em 11 grupos, baseada no alinhamento das seqüências de pró-peptídeos não modificados (COTTER et al., 2005). Bacteriocinas da classe II são peptídeos pequenos, com peso molecular menor que 10 kda (37-48 aminoácidos), termoestáveis e hidrofóbicos, mas não são submetidas a intensas modificações pós-traducionais. A maioria das bacteriocinas dessa classe atua induzindo um aumento na permeabilização da membrana de células alvo, com conseqüente perda de moléculas intracelulares (DEEGAN et al., 2006). Diferentes grupos de bacteriocinas da Classe II são sugeridos, mas sua natureza heterogênea dificulta a subclassificação (DIEP e NES, 2002). De acordo com a nova classificação, essa categoria inclui: Classe IIa, com peptídeos pediocinlike ou ativos contra Listeria, com uma sequência N-terminal conservada Tyr-Gly- Asn-Gly-Val e duas cisteínas formando uma ponte dissulfeto na metade N-terminal do peptídeo; Classe IIb, que inclui bacteriocinas compostas por dois peptídeos diferentes, essenciais para sua atividade bacteriocinogênica completa (as seqüências primárias de aminoácidos de tais peptídeos são diferentes, cada uma é sintetizada por seus próprios genes adjacentes e somente um gene de imunidade é necessário); 5

22 Classe IIc, compreende peptídeos ativados por tiol, que requerem resíduos de cisteína reduzida para tornarem-se ativos, e apresentam regiões N e C terminais covalentemente ligadas, resultando em estruturas cíclicas; as demais bacteriocinas são comumente agrupadas na Classe IId, que inclui peptídeos únicos e lineares (CLEVELAND et al., 2001; DIRIX et al., 2004; COTTER et al., 2005). As bacteriocinas da classe III pertencem à classe denominada bacteriolisinas (proteínas líticas). Seu mecanismo de ação é distinto do mecanismo de ação das bacteriocinas, já que promovem a lise de células sensíveis catalisando a hidrólise da parede celular; além disso, nem sempre apresentam genes específicos de imunidade acompanhando o gene estrutural da bacteriocina (COTTER et al., 2005). Tabela 1- Classificação das bacteriocinas (adaptado de COTTER et al., 2005). Grupo Características Exemplos Classe I Lantibióticos; pequenos peptídeos (< 5 Peptídeos únicos: kda) contendo lantionina e β-metil lantionina; nisina, mersacidina, lacticina 481; Inclui lantibióticos com um ou dois Dois peptídeos: peptídeos; mais de 11 subclasses tem lacticina 3147, sido propostas. citolisina. Classe II Bacteriocinas que não apresentam Classe lla: pediocina resíduos de lantionina em sua estrutura; PA-1, leucocina A; Classe heterogênea de pequenos Classe llb: lactacina F; peptídeos, incluindo as subclasses: IIa Classe llc: enterocina (pediocin-like); IIb (dois peptídeos); IIc AS48, reuterina 6; (estruturas cíclicas); IId (peptídeos Classe lld: lactococina lineares, únicos). A, divergicina A. Bacteriolisinas Proteínas líticas não bacteriocinas; Grandes, termossensíveis e, geralmente, hidrolases de mureína. Lisostafina, enterolisina A. 6

23 2.1.2 Síntese e transporte Enquanto outras substâncias inibitórias, incluindo enzimas bacteriolíticas e produtos metabólicos, como ácidos orgânicos, diacetil e peróxido de hidrogênio, são formadas durante o crescimento bacteriano (JACK et al., 1995), as bacteriocinas geralmente são sintetizadas por células bacterianas ao final da fase exponencial de crescimento e início da fase estacionária, podendo funcionar como uma estratégia competitiva das células produtoras (ten BRINK et al., 1994; HÉCHARD e SAHL, 2002; DEEGAN et al., 2006). Todas as classes de bacteriocinas são sintetizadas nos ribossomos, entretanto o resultado da transcrição pode ser modificado, como ocorre com as bacteriocinas da classe I, que são modificadas pós-tradução para produzir a forma ativa. Tais modificações são necessárias para a secreção e transporte da bacteriocina através da membrana da célula (ENGELKE et al., 1992). Os genes que codificam as bacteriocinas estão geralmente em operons, que podem estar localizados no cromossomo bacteriano, em um plasmídeo ou transposon (ALTENA et al., 2000). Normalmente, as bactérias possuem genes que codificam a bacteriocina (genes estruturais), proteínas que auxiliam no processamento da bacteriocina para a forma ativa, proteínas responsáveis pelo transporte da bacteriocina através da membrana (KLEIN et al., 1992), proteínas regulatórias (KLEIN et al., 1993) e proteínas que conferem imunidade à bactéria produtora (DIEP et al., 1996; QIAO et al., 1996). No caso das colicinas produzidas por Escherichia coli, além dos genes estruturais e de imunidade, há um gene de lise, que codifica uma proteína envolvida na liberação de colicina através da lise da célula produtora. A produção de colicina ocorre principalmente sob condições de estresse e é mediada pelo regulon SOS. Seu modo de ação compreende a formação de poros na membrana celular e a atividade de nuclease contra DNA, rrna e trna (RILEY e WERTZ, 2002). A regulação da produção de bacteriocinas pode ser mediada por um sistema de transdução de sinal, como parte de um mecanismo de quorum sensing. Juntamente com a bacteriocina, são sintetizadas as proteínas relacionadas ao sistema regulatório de três componentes: HPK (histidina quinase); IF (fator de indução) e RR (regulador de resposta). O IF é requerido como um sinal para a indução da transcrição dos genes alvo, é sintetizado na forma de um pré-peptídeo, mas transportado e processado na 7

24 forma ativa. Em alguns casos, o fator de indução pode ser a própria bacteriocina (McAULIFFE et al., 2001). As moléculas indutoras se ligam a HPK, que ativa RR por fosforilação. Esse regulador ativa os genes responsáveis pela síntese da bacteriocina. A prébacteriocina, juntamente com a proteína de imunidade são sintetizadas, a bacteriocina é processada e exportada para o exterior da célula (ENNAHAR et al., 2000). A maioria das bacteriocinas das classes I e II é transportada para o meio extracelular por um sistema de transporte ABC (ATP binding cassete), que possui uma seqüência N-terminal com cerca de 150 aminoácidos, responsável pela clivagem proteolítica da bacteriocina durante o processo de secreção. Os transportadores ABC que secretam lantibióticos com diferentes seqüências líder não possuem atividade proteolítica N-terminal e a remoção da seqüência líder para a ativação da bacteriocina é feita por proteases codificadas juntamente com a bacteriocina, como a enzima NisP no sistema de secreção da nisina (CLEVELAND et al., 2001). Algumas bacteriocinas da classe II (cerca de 4 ou 5) podem ser secretadas por um sistema sec dependente (ENNAHAR et al., 2000) Imunidade A imunidade da célula que sintetiza a bacteriocina é uma das características que distingue as bacteriocinas dos antibióticos, embora o mecanismo de ação das proteínas de imunidade ainda não tenha sido completamente elucidado (CLEVELAND et al., 2001). Os genes que codificam as proteínas de imunidade são expressos juntamente com o gene estrutural da bacteriocina e protegem a célula produtora da ação antimicrobiana do seu próprio peptídeo (HÉCHARD e SAHL, 2002). Geralmente, a imunidade é conferida por uma única proteína com seqüência pouco conservada entre diferentes tipos de bactérias. As proteínas de imunidade parecem estar associadas à membrana citoplasmática de bactérias produtoras de bacteriocina (YARMUS, 2000). Em alguns lantibióticos, vários genes estão envolvidos na imunidade: um transportador ABC composto de duas proteínas (para as bacteriocinas subtilina, epidermina e lacticina) e uma lipoproteína adicional (no sistema da nisina e subtilina) (YARMUS, 2000). No caso de Lactococcus lactis subsp. lactis produtor de nisina, a 8

25 imunidade é conferida pelas proteínas NisI, E, F e G; NisI é uma lipoproteína que se liga à nisina na superfície externa da membrana celular, prevenindo sua inserção. As funções das demais proteínas não estão bem esclarecidas, mas parecem ser transportadores ABC que expulsam a nisina da célula ou promovem sua degradação (ENGELKE et al., 1994). No que se refere às bacteriocinas da classe II, as proteínas de imunidade, além de conferirem imunidade aos produtores da bacteriocina, parecem proteger parcialmente as células contra outras bacteriocinas da classe II. Tal fenômeno sugere, a princípio, uma conexão entre duas noções distintas de resistência e imunidade de bacteriocinas (ENNAHAR et al., 2000) Mecanismos de ação Como as bacteriocinas são moléculas positivamente carregadas e apresentam aminoácidos hidrofóbicos, interações eletrostáticas com grupamentos fosfato de carga negativa nas membranas das células alvo contribuem para a ligação inicial. Evidências sugerem que a porção hidrofóbica de algumas bacteriocinas se insere de maneira inespecífica na membrana da célula alvo, formando poros (CHEN et al., 1997); outras bacteriocinas interagem com receptores específicos nas membranas das células alvo (LINS et al., 1999) ou ainda são capazes de inibir a síntese da parede celular e a atividade de enzimas como RNAse ou DNAse (CLEVELAND et al., 2001). No estágio de ligação específica ou inespecífica na membrana celular da célula alvo, as bacteriocinas são sensíveis a uma possível ação de enzimas proteolíticas. Em seguida, ocorre a inserção da bacteriocina na membrana causando a dissipação da força próton-motora e a agregação de monômeros resultando na formação de poros, por onde a célula perde material intracelular, podendo culminar com a perda de viabilidade da célula alvo (MONTVILLE e CHEN, 1998). No caso da nisina, o alvo primário envolve a interação específica com o lipídeo II (precursor do peptideoglicano) e formação de poros na membrana plasmática do microrganismo sensível, com conseqüente perda do potencial de membrana e extravasamento de material intracelular, como aminoácidos, potássio, fosfato inorgânico e ATP (MONTVILLE e CHEN, 1998; ENNAHAR et al., 2000; HELANDER e MATTILA-SANDHOLM, 2000). O lipídeo II facilita a inserção da 9

26 nisina na membrana celular por agir como uma espécie de âncora (BREUKINK et al., 1999). Um mecanismo alternativo para a atividade bactericida de membros da família dos lantibióticos, como a mutacina 1140, não requer proteínas receptoras; essas moléculas são capazes de seqüestrar a molécula lipídeo II dos sítios onde a biossíntese da parede celular ocorre, ao se ligarem ao pirofosfato N-terminal do lipídeo II (HASPER et al., 2006). Bacteriocinas pertencentes à classe II, especificamente à subclasse IIa, tendem a dissipar a força próton motora (PMF) via colapso do potencial de membrana ( Ψ) e, ou de ph ( ph), promovendo a morte da célula por impedir a ocorrência de reações de síntese de energia (MCAULIFFE et al., 2001). Provavelmente, bacteriocinas da subclasse IIa necessitam de uma molécula alvo na superfície das células sensíveis para serem ativadas (ENNAHAR et al., 2000; HÉCHARD e SAHL, 2002). Algumas características podem influenciar significativamente a atividade da bacteriocina sobre a célula alvo: fatores intrínsecos dos alimentos, tais como composição química, ph, concentração de sal, atividade de água, presença de nitrito e nitrato; estrutura e quantidade de bacteriocina disponível; potencial de membrana; estrutura e nível de expressão das proteínas de imunidade; distância entre a molécula de bacteriocina e a célula alvo; quantidade de células alvo e, ou células capazes de adsorver à bacteriocina (LIU e HANSEN, 1990; BLOM et al., 1997) Aplicação industrial de bacteriocinas As bacteriocinas têm sido frequentemente estudadas como ferramentas biológicas potencialmente úteis na indústria de alimentos, assegurando a qualidade microbiológica dos produtos e reduzindo a prevalência de toxiinfecções alimentares. As bacteriocinas podem ser utilizadas como um obstáculo extra na tecnologia de barreiras por apresentar sinergismo com outros tratamentos de conservação de alimentos, de modo a prevenir o crescimento de bactérias patogênicas e deterioradoras de alimentos, especialmente quando a contaminação pode ocorrer após o processo de produção (DEEGAN et al., 2005). Para garantir a aprovação do uso da bacteriocina como conservante de alimentos, a mesma deve ser identificada e caracterizada quimicamente e seu uso e 10

27 eficácia devem ser demonstrados; o processo de obtenção deve ser descrito, bem como os ensaios usados para quantificação e padronização do peptídeo. Além disso, dados toxicológicos e o destino da molécula após ingestão devem ser reportados (FDA, 1993). Após um novo conservante de alimentos ser considerado seguro e eficiente, é importante ainda assegurar a longevidade de seu uso, prevenindo a proliferação de células resistentes (CLEVELAND et al., 2001). A aplicação de bacteriocinas no biocontrole de alimentos pode ocorrer por uso de culturas starter produtoras de bacteriocinas de espectro inibitório desejado, para produção de bacteriocinas in situ, ou adição direta de bacteriocinas, sintéticas ou purificadas a partir do sobrenadante da cultura das estirpes produtoras (MARTÍNEZ et al., 1999). Como as purificações geralmente são extensas e custosas, o uso de culturas starter em alimentos pode ser mais vantajoso (GEORGALAKI et al., 2002). Nos Estados Unidos, o uso de culturas starter produtoras de bacteriocinas pode não requerer regulamentação especial se a cultura de microrganismos é considerada Generally Recognized as Safe (GRAS), devido ao seu histórico de uso seguro pelas indústrias alimentícias (U.S. Government Printing Office, 1990). Se uma bacteriocina purificada é utilizada como conservante de alimentos, a substância pode ser confirmada como GRAS de acordo com o Code of Federal Regulations, mas o Food and Drug Administration (FDA) pode ainda requerer justificação de sua afirmação como GRAS para que seu uso seja permitido (CLEVELAND et al., 2001). Nisina é a única bacteriocina reconhecida como GRAS pelo FDA (FDA, 1988) e aprovada pela Organização Mundial de Saúde para uso como conservante de alimentos em mais de 50 países (DELVES-BROUGHTON, 1990). Atualmente, a nisina é utilizada em vários setores da indústria alimentícia. Nos Estados Unidos, a nisina é utilizada em queijos pasteurizados, como um agente anti-botulínico, e em ingredientes líquidos de ovo pasteurizado. Em diversos outros países a nisina é utilizada em produtos processados como leite e derivados pasteurizados, carnes, enlatados e bebidas, produtos de panificação e alimentos infantis, para melhorar a qualidade e a vida de prateleira dos produtos (TURTELL e DELVES- BROUGHTON, 1998). No Brasil, a nisina é aprovada para uso em todos os tipos de queijo, obedecendo o limite máximo de 12,5 mg/kg de alimento (SIRAGUSA et al., 1999). A dose diária aceita como segura para o consumo humano é de 2,9 mg por pessoa, com o limite máximo de ingestão de Unidades Internacionais/kg de peso (FDA, 1988; CLEVELAND et al., 2001). 11

28 O uso desta bacteriocina em alimentos se deve ao fato da nisina não ser tóxica, além de ser destruída por enzimas pancreáticas. São duas as variantes naturais de nisina já identificadas: nisina A e nisina Z, que variam em atividade e solubilidade (MULDERS et al., 1991). Uma vez que a atividade de nisina é dificultada em alguns alimentos, em virtude do ph elevado, inabilidade de distribuição uniforme, interferência de componentes nutricionais dos alimentos e também devido ao surgimento de células resistentes entre populações sensíveis, o uso e o efeito citotóxico de outras bacteriocinas com aplicações potenciais em alimentos também têm sido examinado (CLEVELAND et al., 2001). As bacteriocinas podem ser utilizadas ainda como uma alternativa ao uso indiscriminado de antibióticos de largo espectro de ação, tanto na medicina (humana e veterinária) como na agropecuária, em função de seu espectro de ação mais específico. Por serem frequentemente utilizados para fins terapêuticos, profiláticos e como promotores de crescimento, os antibióticos resultam em forte pressão seletiva para a seleção de bactérias multiresistentes às drogas disponíveis no mercado (STEWART et al., 1998). Dada a diversidade de bacteriocinas produzidas na natureza é provável que se encontrem peptídeos ativos contra diferentes microrganismos patogênicos. O desenvolvimento e uso de tais antimicrobianos de espectro de ação mais específico, pode reduzir o uso de antibióticos e, consequentemente, a intensidade de seleção para resistência e os efeitos colaterais sobre bactérias não patogênicas da microbiota normal (RILEY e WERTZ, 2002) Bovicina HC5 Streptococcus bovis, isolado do rúmen bovino, é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbia facultativa, altamente amilolítica, ácido-tolerante, com tempo de geração curto e requerimentos nutricionais simples, que fermenta amido primariamente a ácido láctico. É de interesse particular em virtude de seu papel no desenvolvimento de acidose láctica em bovinos alimentados com dietas ricas em alimentos concentrados (STEWART et al., 1997). Pertence à classe de estreptococos do grupo D de Lancefield (WHITEHEAD e COTTA, 2000) e estirpes isoladas de humanos 12

29 têm sido associadas ao câncer de cólon, endocardite e meningite (ELLMERICH et al., 2000; SONGY et al., 2002). Dentre o gênero Streptococcus, a bactéria Streptococcus bovis HC5 é capaz de inibir uma variedade de bactérias Gram-positivas do rúmen e de outros habitats, o que possibilita sua aplicação como agente para a modificação de populações microbianas nestes ambientes. A atividade antibacteriana de S. bovis HC5 é devida a uma bacteriocina, denominada bovicina HC5 (MANTOVANI et al., 2002). A bovicina HC5 apresenta massa molecular de aproximadamente 2440 Da e uma seqüência amino-terminal peculiar (VGXRYASXPGXSWKYVXF). Quatro resíduos de aminoácidos da região N-terminal ainda não foram identificados, o que sugere que a bovicina HC5 possua aminoácidos modificados pós-traducionalmente, uma característica que lhe confere similaridade aos lantibióticos (MANTOVANI et al., 2002). A bacteriocina permanece associada às células durante o crescimento bacteriano, podendo ser liberada por solução ácida de NaCl (100 mm, ph 2,0), sem que ocorra lise significante das células. O extrato bruto da bacteriocina é resistente à α-quimiotripsina, proteinase K e ao aquecimento (121 ºC por 20 min), propriedades que podem ser vantajosas para sua aplicação comercial (MANTOVANI et al., 2002). Seu provável mecanismo de ação consiste na formação de poros na membrana da célula-alvo, causando a perda de potássio intracelular (MANTOVANI et al., 2002; HOULIHAN et al., 2004). A bovicina HC5 apresenta amplo espectro antimicrobiano e é capaz de inibir uma variedade de linhagens bacterianas, sem que ocorra adaptação. A atividade da bovicina HC5 já foi demonstrada contra Clostridium aminophilum (MANTOVANI e RUSSELL, 2002), Clostridium sporogenes (MANTOVANI et al., 2002; FLYTHE e RUSSELL, 2004), Listeria monocytogenes (MANTOVANI e RUSSELL, 2003), Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis e Clostridium ssp. (de CARVALHO et al., 2007), sendo que a adaptação destes microrganismos à bacteriocina não foi observada. Estudos testando a efetividade da bovicina HC5 em alimentos ainda não foram realizados e, de acordo com MANTOVANI e RUSSELL (2003), a bovicina HC5 pode ser mais potente e apresentar espectro de ação mais amplo do que a nisina. 13

30 2.2 Detecção de bacteriocinas Bioensaios que avaliam o efeito inibitório de preparações de bacteriocinas sobre um microrganismo indicador são comumente utilizados para detecção e quantificação da atividade da bacteriocina. Os métodos mais comuns são os testes de atividade biológica, como a microtitulação (DABA et al., 1994) e o teste de difusão em ágar, que é a ferramenta analítica mais utilizada (TRAMER e FOWLER, 1964). A importância desses métodos biológicos no campo de estudos com bacteriocinas é inquestionável, entretanto os bioensaios são métodos indiretos, uma vez que mensuram a atividade inibitória contra um microrganismo alvo, além de apresentarem acurácia limitada, baixa especificidade e sensibilidade (BLOM et al., 1997). Outros métodos de detecção de bacteriocinas são baseados no uso de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) e de troca iônica, além de eletroforese de zona capilar (PFEIFFER e ORBEN, 1997). Resultados melhores para detecção e quantificação de bacteriocinas têm sido obtidos com a emergência de técnicas rápidas, diretas e sensíveis mediante utilização de métodos imunológicos (SUÁREZ et al., 1996; BOUKSAIM et al., 1999). Métodos altamente específicos, baseados em imunoquímica, têm sido desenvolvidos e utilizados rotineiramente como ferramentas analíticas em muitas áreas de pesquisa, desde Atualmente, os anticorpos são ferramentas importantes em muitos campos de pesquisa e indispensáveis no laboratório, sendo usados em imunoensaios (como ferramenta diagnóstica), cromatografia de afinidade, como imunomarcadores, em pesquisa visando a descoberta de novas proteínas e caracterização de estruturas antigênicas complexas, identificação de produtos gênicos, análise de domínios funcionais de enzimas, avaliação da eficácia potencial de vacinas peptídicas sintéticas e purificação de proteínas (JEAN et al., 1995; HENDRIKSEN e HAU, 2003). A produção de anticorpos específicos para bacteriocinas pode prover métodos alternativos, sensíveis e específicos, não só para o monitoramento da produção de bacteriocinas, mas também para o isolamento rápido e a imunolocalização destas em estirpes bacterianas e, ou alimentos nos quais tenham sido naturalmente produzidas ou adicionadas (BOUKSAIM et al., 1998). Os anticorpos podem também ser utilizados para detecção, quantificação e purificação de bacteriocinas em diferentes 14

31 substratos pelo uso de ensaios imunoquímicos e estratégias de cromatografia de imunoafinidade, além de serem úteis para a investigação de detalhes sobre a estrutura e função de bacteriocinas (MARTÍNEZ et al., 1997; NANDAKUMAR et al., 1999). A escassez de métodos imunológicos provavelmente deve se às dificuldades encontradas na aquisição de anticorpos policlonais e monoclonais específicos. Dentre os obstáculos presentes, os mais importantes são a necessidade de bacteriocinas purificadas e a massa molecular relativamente baixa (< 5000 Da) desses compostos, o que as torna fracamente imunogênicas ou, até mesmo, não imunogênicas. Adicionalmente, características peculiares das moléculas de bacteriocinas, como a ocorrência de motivos com seqüências hidrofílicas conservadas, sua hidrofobicidade, a formação de anéis dissulfurados intracadeias e, no caso dos lantibióticos, a presença de aminoácidos modificados, podem interferir na sensibilidade e especificidade dos anticorpos e no desenvolvimento de imunoensaios (SUÁREZ et al., 1996). Somente na década de 90 é que pesquisas com a utilização de anticorpos policlonais e monoclonais começaram a ser conduzidas com bacteriocinas. Desde então várias técnicas imunoenzimáticas têm sido padronizadas para utilização com diferentes bacteriocinas, como nisina, enterocina, pediocina e propionicina. Com anticorpos policlonais, por exemplo, já foram desenvolvidas técnicas de ELISA do tipo sanduíche (FALAHEE et al., 1990), ELISA competitiva direta (SUAREZ et al., 1996) e ELISA não competitiva direta (LEUNG et al., 2002), para detecção e quantificação de nisina pura, em meios de cultura ou adsorvida a superfícies. Técnicas de ELISA direta competitiva, ELISA indireta competitiva e não competitiva também foram utilizadas para detecção de pediocina PA-1 (MARTÍNEZ et al., 1998). Ensaios imunoenzimáticos baseados em anticorpos monoclonais também foram reportados para nisina (como flow-injection ELISA (NANDAKUMAR et al., 2000) e ELISA competitiva (DAOUDI et al., 2001)), para pediocina AcH (BHUNIA e JOHNSON, 1992) e pediocina RS2 (BHUNIA, 1994). A geração de anticorpos específicos para bacteriocinas tem sido baseada no uso da molécula completa como imunógeno, sozinha ou conjugada a proteínas carreadoras (bacteriocinas, assim como outros haptenos, muitas vezes necessitam ser conjugadas a proteínas carreadoras para tornarem-se imunogênicas). A molécula de bacteriocina completa como imunógeno, sem conjugação à proteína carreadora, foi 15

32 utilizada para geração de anticorpos policlonais anti-nisina (FALAHEE et al., 1990; STRÍNGER et al., 1995; SUÁREZ et al., 1996) e anti-pediocina AcH (BHUNIA et al., 1990; FALAHEE et al., 1990) e para geração de anticorpos monoclonais antipediocina RS2 (BHUNIA, 1994). Proteínas carreadoras foram utilizadas na geração de anticorpos policlonais anti-nisina Z (BOUKSAIM et al., 1999) e anti-nisina A (FALAHEE et al., 1990; SUÁREZ et al., 1996) e em procedimentos para geração de anticorpos monoclonais anti-nisina Z (DAOUDI et al., 2001). Entretanto, o uso da molécula de bacteriocina completa como imunógeno pode gerar anticorpos com reação cruzada com seqüências consenso de aminoácidos comuns, não sendo únicos e específicos para a bacteriocina contra as quais foram sintetizados (MARTÍNEZ et al., 1998). Tal fato foi observado por LEVERSEE e GLATZ (2001) com anticorpos policlonais anti-propionicina PLG-1, que apresentaram reação cruzada com o sobrenadante de outras 52 culturas bacterianas, inclusive não bacteriocinogênicas; SUÁREZ et al. (1996) também detectaram reações cruzadas de anticorpos policlonais anti-nisina A com o sobrenadante de uma estirpe produtora de nisina Z e com esse lantibiótico puro. A utilização de peptídeos sintéticos, em uma faixa de 10 a 15 aminoácidos, pode levar à produção de anticorpos mais específicos, com menor reatividade cruzada, capazes de reconhecer proteínas nativas e desnaturadas (HARLOW e LANE, 1988). Tais peptídeos devem ser conjugados a uma proteína carreadora (geralmente keyhole limpet hemocyanin (KLH), ovoalbumina ou albumina bovina sérica (BSA)) para se tornarem imunogênicos, como observado para a geração de anticorpos policlonais contra fragmentos C ou N-terminais, sintetizados quimicamente, das bacteriocinas enterocina A (MARTÍNEZ et al., 2000), enterocina P (GUTIÉRREZ et al., 2004), divercina V41 (RICHARD et al., 2004), pediocina PA-1 (MARTÍNEZ et al., 1997; MARTÍNEZ et al., 2000) e nisina A (SUÁREZ et al., 1996). Anticorpos monoclonais e policlonais têm sido utilizados também para o desenvolvimento de colunas de cromatografia de imunoafinidade para a purificação de bacteriocinas, como enterocina P (GUTIÉRREZ et al., 2004), divercina V41 (RICHARD et al., 2004) e nisina (BOUKSAIM et al., 1999; NANDAKUMAR et al., 2000); para detectar e quantificar a produção de bacteriocinas em meios de cultura sintéticos ou complexos, como já realizado para divercina V41 (RICHARD et al., 2004), nisina A (SUÁREZ et al., 1996), nisina Z (BOUKSAIM et al., 1999), 16

33 pediocina PA-1 (MARTÍNEZ et al., 1998) e pediocina RS2 (BHUNIA, 1994); para imunolocalização da bacteriocina em células produtoras e sensíveis, visando elucidar o mecanismo de ação do peptídeo, como realizado por BOUKSAIM et al. (1999) com anticorpos policlonais anti-nisina Z; para avaliar a co-produção heteróloga de bacteriocinas, como enterocina A e pediocina PA-1 por Lactococcus lactis (MARTÍNEZ et al., 2000). Muitas bacteriocinas têm sido caracterizadas bioquimicamente e geneticamente e, embora já exista um conhecimento básico sobre sua função estrutural, biossíntese e modo de ação, muitos aspectos desses compostos permanecem desconhecidos. A efetividade e a segurança da nisina como conservante de alimentos, por exemplo, já estão bem demonstradas, entretanto o uso potencial de outras bacteriocinas, como a bovicina HC5, permanece sob investigação. Desta forma, métodos para a determinação de bovicina HC5 são essenciais para o monitoramento de sua produção e para a purificação em larga escala, considerados fatores limitantes para o uso comercial e estudo dos mecanismos de ação das bacteriocinas em geral. 2.3 Imunidade e Resposta Imunológica O termo imunidade é derivado da palavra latina immunitas, que se refere à proteção contra processos legais que os senadores romanos tinham durante o seu mandato. Historicamente, imunidade significa proteção contra doenças, em particular contra doenças infecciosas. Entretanto, até mesmo substâncias estranhas não infecciosas são capazes de desencadear uma resposta imunológica. Desta forma, uma definição mais abrangente de imunidade seria uma reação a substâncias estranhas, incluindo microrganismos e macromoléculas, independentemente das conseqüências fisiológicas ou patológicas de tal reação (ABBAS e LICHTMAN, 2005). As células e moléculas responsáveis pela imunidade formam o sistema imunológico, e sua resposta coletiva e coordenada à introdução de substâncias estranhas é chamada de resposta imunológica ou resposta imune (LEVINSON e JAWETZ, 1998). 17

34 2.3.1 Tipos de imunidade A imunidade pode ser natural (inata ou nativa) ou adquirida (adaptativa ou específica). A imunidade natural consiste em mecanismos de defesa celulares e bioquímicos que já existiam antes do contato com um determinado agente estranho ao organismo; é inespecífica e inclui as defesas do hospedeiro, como as barreiras físicas e químicas (epitélios e substâncias antibacterianas nas superfícies epiteliais), as células fagocitárias (neutrófilos, macrófagos) e células NK (natural killers), proteínas do sangue (as proteínas da cascata do complemento e mediadores da inflamação) e citocinas. Esses mecanismos reagem apenas contra estruturas que são comuns a grupos de microrganismos, não apresentando respostas contra substâncias não-infecciosas, além de responderem rapidamente e essencialmente da mesma maneira a quaisquer infecções (FEARON e CARROLL, 2000). A imunidade adquirida apresenta especificidade extraordinária para distinguir as diferentes moléculas e uma habilidade de se lembrar e responder com mais intensidade a exposições subseqüentes do mesmo agente estranho, sendo capaz de reconhecer e reagir com substâncias microbianas ou não. Os componentes da imunidade adquirida incluem os linfócitos e seus produtos (PANCER e COOPER, 2006). A imunidade adquirida pode ser ativa ou passiva. A imunidade ativa é a resistência induzida após o contato com agentes estranhos ao organismo: o hospedeiro produz uma resposta imune ativa, consistindo de anticorpos e da ativação de linfócitos T. A imunidade passiva é a resistência com base em anticorpos préformados em outros organismos (LEVINSON e JAWETZ, 1998). Existem dois tipos de resposta imunológica ativa: a imunidade humoral e a imunidade celular, que são mediadas por diferentes componentes do sistema imunológico. A imunidade humoral é mediada pelos anticorpos, moléculas presentes no sangue e nas secreções das mucosas, que são produzidas pelos linfócitos B; é o principal mecanismo de defesa contra microrganismos extracelulares e suas toxinas. A resposta imune humoral é iniciada nos órgãos linfóides periféricos, como o baço (no caso de antígenos circulantes no sangue), linfonodos (para antígenos que penetram no organismo através da pele ou de outro epitélio) e tecidos linfóides da mucosa (para antígenos que são inalados ou ingeridos) (ABBAS e LICHTMAN, 2005). 18

35 A imunidade celular é mediada pelos linfócitos T; é responsável pela defesa contra fungos, parasitas e tumores, na rejeição de órgãos transplantados e nas infecções por microrganismos intracelulares (vírus e algumas bactérias), que são capazes de sobreviver e proliferar no interior de células fagocitárias e outras células do hospedeiro, onde estão protegidas dos anticorpos. Os constituintes do sistema imunológico responsáveis pela imunidade mediada por células incluem diversos tipos celulares (macrófagos, células T auxiliares, células NK, células T citotóxicas) (JANEWAY et al., 2005) Resposta imune primária e secundária Resposta imune primária é aquela que se estabelece quando um antígeno penetra, natural ou artificialmente, pela primeira vez em um organismo. No interior do organismo, o antígeno encontra uma célula imune antígeno-sensível, que inicia um processo de proliferação e diferenciação, culminando com a síntese de anticorpos específicos (FERRI et al., 1977). Desde a introdução do antígeno até o aparecimento de anticorpos circulantes existe uma fase de latência ou período de retardo de cerca de 7-10 dias, no qual há proliferação e diferenciação das células imunologicamente competentes. Após este período, que varia com as características individuais do hospedeiro, com a natureza, dose e via de administração do antígeno, há o aparecimento de anticorpos circulantes. A concentração sérica de anticorpo continua subindo por várias semanas e então declina, podendo chegar a níveis muito baixos (LEVINSON e JAWETZ, 1998). Após o estímulo primário, os anticorpos que aparecem precocemente (principalmente da classe IgM) possuem pequena afinidade pelo antígeno que o induziu, enquanto os anticorpos que aparecem mais tardiamente (da classe IgG) apresentam maior afinidade média (FERRI et al. 1977). Quando ocorre uma segunda exposição ao mesmo antígeno, meses ou anos após a primeira exposição, é estabelecida a resposta imune secundária, caracterizada pela necessidade de menor dose limiar de antígeno, período de latência menor (cerca de 3-4 dias) e síntese rápida de anticorpos, em nível mais alto e persistente. A mudança de classe do anticorpo sintetizado e a maturação da afinidade também aumentam com repetidas exposições aos antígenos. Durante a resposta secundária, a 19

36 quantidade de IgM produzida é similar àquela produzida na resposta primária, embora maiores quantidades de anticorpos IgG, com alta afinidade média, sejam produzidos (ABBAS e LICHTMAN, 2005). Os termos resposta primária e secundária estão primariamente associados à formação de anticorpos, mas o tempo de resposta das células T também segue o mesmo padrão. Após uma exposição inicial ao antígeno, a célula T específica prolifera formando um pequeno clone de células (resposta primária) e após uma exposição subseqüente ao mesmo antígeno, o pequeno clone de células expande formando muitas células T específicas (resposta secundária) (SPRENT e SURH, 2002) Antígenos Antígenos são moléculas que reagem com anticorpos ou receptores de antígenos nas células T, enquanto imunógenos são moléculas capazes de induzir uma resposta imune específica. Os antígenos podem ser classificados em antígenos T dependentes (ou dependentes do timo) e T independentes. A resposta imune a antígenos T dependentes, como as proteínas, requer que linfócitos T auxiliares reconheçam esses antígenos e ativem os linfócitos B. A resposta aos antígenos nãoprotéicos, como polissacarídios, lipídeos e ácidos nucléicos, não necessita da participação dos linfócitos T auxiliares específicos (ABBAS e LICHTMAN, 2005). Cada antígeno ou imunógeno apresenta um número variado de determinantes antigênicos ou epitopos, sítios estruturalmente definidos, de composição tridimensional, que se ligam aos anticorpos e receptores específicos dos linfócitos, para indução da resposta imune. Cada determinante possui um tamanho correspondente a 4-6 aminoácidos ou resíduos de açúcar. Estima-se que o sistema imunológico de uma pessoa possa discriminar de 10 7 a 10 9 determinantes antigênicos diferentes, pela existência de diversos clones linfocitários que diferem na estrutura de seus receptores de antígenos e em sua especificidade; todos os membros de cada clone expressam receptores antigênicos com a mesma especificidade e que são diferentes dos receptores de outros clones (CATTY, 1989a). 20

37 2.3.4 Resposta imune a antígenos protéicos extracelulares O início e o desenvolvimento de uma resposta imunológica induzida por um peptídeo requerem que o antígeno seja capturado e apresentado a linfócitos específicos, papel desempenhado pelas células apresentadoras de antígenos (APC). As APCs com maior grau de especialização são as células dendríticas, e outros tipos celulares, como os linfócitos B, desempenham a função de APCs em diferentes estágios da resposta imunológica (DOHERTY, 2007). Os antígenos, ao penetrarem no organismo, são reconhecidos e fagocitados pelas células mononucleares ou interagem diretamente com os anticorpos ligados à membrana das células B inativas (IgM ou IgD). Dentro do citoplasma de uma célula APC, o antígeno é processado (degradação proteolítica) e seus epitopos se associam às moléculas da Classe II do Complexo de Histocompatibilidade Principal (Major Histocompatibility Complex MHC). As moléculas do MHC da classe II são estabilizadas pela ligação aos peptídeos e o complexo é transportado à superfície da célula, onde o antígeno, em associação com a proteína de classe II, é apresentado ao receptor das células T auxiliares CD4 + (RCT) (SPRENT e SURH, 2002). O complexo antígeno-proteína MHC de classe II, apresentado pelas células APC, interage com RCT. A ativação e a proliferação clonal desses linfócitos T auxiliares ocorrem como resultado da produção de linfocinas, como a interleucina-1 (produzida por macrófagos), interleucina-2 (fator de crescimento de células T, produzida por linfócitos), interleucina-4 (fator de crescimento de células B) e interleucina-5 (fator de diferenciação de células B). Quando o RCT interage com o complexo antígeno-proteína MHC de classe II, a proteína CD4 presente na superfície da célula T auxiliar também interage com as proteínas da classe II do MHC. Além da ligação da molécula de CD4 com a proteína de classe II do MHC, outras proteínas interagem para ajudar a estabilizar o contato entre as células T e as APCs (SZABO et al., 2003). As citocinas secretadas pelas células T auxiliares estimulam a proliferação e diferenciação não só das próprias células T, mas também de células B, macrófagos e outros leucócitos. Após estimulação antigênica e ação de várias linfocinas, os linfócitos B maduros se diferenciam em células denominadas plasmócitos, que sintetizam e secretam anticorpos ativamente. Os plasmócitos se desenvolvem nos órgãos linfóides e nos locais em que ocorrem respostas imunológicas. A maioria 21

38 sobrevive por pouco tempo e não se renova, mas alguns podem migrar para a medula óssea e sobreviverem por um longo período após a eliminação do antígeno (KATHRYN et al., 2003). A mudança da cadeia pesada do isótipo e a maturação da afinidade são fenômenos característicos da resposta imune humoral a antígenos protéicos (EISEN, 2001). Inicialmente, todos os plasmócitos produzem anticorpos IgM em resposta à exposição àquele antígeno; mais tarde, rearranjos das regiões constantes das cadeias pesadas permitem a elaboração de anticorpos com a mesma especificidade antigênica, mas de diferentes classes de imunoglobulinas, de modo que os anticorpos sintetizados exerçam diferentes funções efetoras; esse processo é chamado mudança de isótipo de cadeia pesada e ocorre nos tecidos linfóides periféricos (McHEYZER- WILLIAMS e McHEYZER-WILLIAMS, 2005). O controle da mudança de isótipo é dependente da concentração de várias interleucinas (IL-4 aumenta a produção de IgE enquanto a IL-5 aumenta a IgA) e da interação da proteína CD40 da célula B (coestimuladora) com a proteína ligante CD40 na célula T auxiliar (SZABO et al., 2003). As células B ativadas também produzem anticorpos que se ligam ao antígeno com alta capacidade e afinidade crescente, combatendo antígenos persistentes ou recorrentes; esse processo é conhecido como maturação de afinidade (SPRENT e SURH, 2002). A ligação de anticorpos é melhorada, porque ocorrem mutações no DNA das células imunocompetentes, que codificam para os sítios de ligação ao antígeno. Algumas mutações resultam na inserção de diferentes aminoácidos na região hipervariável resultando em uma melhor interação, tornando a ligação antígeno-anticorpo muito mais forte. A subpopulação de células plasmáticas com essas regiões hipervariáveis melhoradas, são preferencialmente (e frequentemente) selecionadas pelo antígeno e, portanto, constituem a maioria da população de células produtoras de anticorpos (MAYNARD e GEORGIOU, 2000; NEMAZEE, 2000). Em função de estímulos ainda pouco conhecidos, alguns linfócitos B e T estimulados por antígenos são capazes de se diferenciarem em células de memória, que atuam como intermediárias das respostas secundárias. As células de memória podem sobreviver em um estado funcionalmente dormente ou de ciclo lento por longos períodos, mesmo após a eliminação do antígeno (ZINKERNAGEL et al., 1996). 22

39 As células de memória expressam proteínas em sua superfície que as diferenciam das células inativas e dos linfócitos efetores recém-ativados, além de apresentarem receptores de antígeno de alta afinidade (DUTTON et al., 1998). Os linfócitos B de memória expressam outros isótipos de imunoglobulinas na membrana (principalmente IgG), enquanto as células B inativas expressam somente IgM ou IgD (McHEYZER-WILLIAMS e McHEYZER-WILLIAMS, 2005). Comparadas às células T inativas, os linfócitos T de memória expressam altos níveis de moléculas de adesão, tais como as integrinas e CD44, que promovem a migração das células de memória para os locais de infecção ao longo do corpo (SPRENT e SURH, 2002). As células de memória são heterogêneas em muitos aspectos. Algumas migram de preferência para os linfonodos, onde representam uma reserva de linfócitos específicos, que são capazes de desencadear uma resposta imune caso o antígeno seja reintroduzido no organismo. Outras células de memória residem nas mucosas ou circulam no sangue, de onde podem ser recrutadas para qualquer local de infecção e desencadear respostas efetoras rapidamente para eliminar o antígeno (DUTTON et al., 1998) Anticorpos No início do século XX, Karl Landsteiner e outros investigadores demonstraram que, além das toxinas, substâncias bacterianas também podiam induzir respostas imunológicas humorais. Desses estudos surgiu o termo anticorpos, para designar as proteínas plasmáticas que mediavam a imunidade humoral e eram de fundamental importância para a identificação e eliminação de antígenos específicos, que penetravam no organismo (HENDRIKSEN e HAU, 2003). As glicoproteínas do plasma ou do soro são tradicionalmente separadas, por sua diferença de solubilidade, em albumina e globulina. A maioria dos anticorpos é encontrada no terceiro grupo de globulinas de migração mais rápida, chamadas de gamaglobulinas. Outro nome comum para os anticorpos é imunoglobulina (Ig), que se refere à imunidade conferida pela fração de gamaglobulina (ABBAS e LICHTMAN, 2005). Quando o plasma ou o sangue formam um coágulo, os anticorpos permanecem no líquido residual, que é chamado de soro. O soro que contém uma 23

40 quantidade detectável de moléculas de anticorpos específicos para determinado antígeno é normalmente chamado de antissoro (ABBAS e LICHTMAN, 2005). A eliminação do antígeno geralmente requer a interação do anticorpo com componentes do sistema imunológico natural, incluindo moléculas como as proteínas do complemento, células fagocitárias, células NK, mastócitos e eosinófilos, que apresentam receptores específicos para ligar moléculas de anticorpos. As funções efetoras mediadas pelos anticorpos incluem a neutralização dos microrganismos ou de toxinas microbianas, ativação do sistema do complemento, opsonização dos antígenos, hipersensibilidade imediata e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (LEVINSON e JAWETZ, 1998). As imunoglobulinas são glicoproteínas constituídas de cadeias polipeptídicas leves (L) e pesadas (H). Os termos leves e pesadas referem-se ao peso molecular: cadeias leves possuem peso molecular de cerca de 24 kd, e as cadeias pesadas, kd. A molécula de anticorpo mais simples possui estrutura básica simétrica, constituída por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas idênticas, ligadas por pontes dissulfídicas (LEVINSON e JAWETZ, 1998). Cadeias L e H são subdivididas em regiões variáveis e regiões constantes, compostas de dobras tridimensionais de segmentos repetidos chamados domínios, cada um constituído de aproximadamente 110 aminoácidos. As regiões variáveis são assim denominadas porque contêm regiões em que a sequência de aminoácidos é variável e distingue os anticorpos feitos por um clone de células B dos anticorpos feitos por outros clones (JANEWAY et al., 2005). Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas estão justapostos para formar os sítios de ligação ao antígeno; os domínios constantes da cadeia pesada formam os sítios que interagem com outras moléculas efetoras e células do sistema imunológico, participando, assim, como mediadora da maioria das funções biológicas dos anticorpos; as regiões constantes da cadeia leve não participam de funções efetoras e não se ligam a membranas celulares. A porção C-terminal das cadeias H é a responsável por ancorar os anticorpos na membrana plasmática dos linfócitos B (ABBAS e LICHTMAN, 2005). As regiões variáveis das cadeias L e H possuem três seqüências de aminoácidos extremamente variáveis (hipervariáveis) na porção N-terminal, a qual forma o sítio de ligação ao antígeno. Somente 5-10 aminoácidos, em cada região hipervariável, formam o sítio de ligação ao antígeno. A maior parte das diferenças 24

41 nas seqüências entre os diversos anticorpos está confinada a essas três pequenas extensões nas regiões V. Como essas seqüências formam uma superfície complementar à estrutura tridimensional do antígeno que é reconhecido, as regiões hipervariáveis também são chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs). A partir da porção N-terminal V L ou V H, essas regiões são chamadas de CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente. A região CDR3 dos segmentos V L e V H são as mais variáveis (MAYNARD e GEORGIOU, 2000). Todas as moléculas de anticorpos possuem as mesmas características estruturais básicas, mas apresentam grande variedade nas regiões que se ligam aos antígenos. Os sítios de ligação ao antígeno da maioria dos anticorpos são superfícies planas que podem acomodar epitopos conformativos ou lineares de macromoléculas, composto de cerca de 6 aminoácidos (ABBAS e LICHTMAN, 2005). Isótipos e subtipos de anticorpos possuem regiões constantes das cadeias pesadas diferentes e, consequentemente, desempenham funções efetoras diferentes. Em mamíferos, os anticorpos podem ser divididos em classes e subclasses distintas com base nas diferenças estruturais das regiões C das cadeias H. As classes, ou isótipos, são denominadas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, cada uma com características e atividades específicas (MAYNARD e GEORGIOU, 2000). As principais funções dos diferentes anticorpos estão sumarizadas na tabela 2. Tabela 2- Funções das imunoglobulinas (adaptado de JANEWAY et al., 2005). Imunoglobulina IgG IgA IgM IgD IgE Principais funções Principal anticorpo na resposta secundária; opsoniza bactérias; fixa o complemento; neutraliza toxinas bacterianas e vírus; atravessa a placenta. Previne a ligação de bactérias e vírus nas membranas mucosas; não fixa complemento. Fixa complemento; não atravessa a placenta; é o receptor de antígeno na superfície das células B. Encontrada na superfície de muitas células B; funções pouco conhecidas. Medeia a hipersensibilidade imediata, causando a liberação de mediadores por mastócitos e basófilos quando expostos a um antígeno (alérgeno); principal defesa do hospedeiro contra infecções por helmintos; não fixa complemento. 25

42 Reações antígeno-anticorpo O reconhecimento do antígeno pelo anticorpo envolve uma ligação nãocovalente reversível, altamente específica. Vários tipos de interações não covalentes podem contribuir para a ligação antígeno-anticorpo, incluindo forças eletrostáticas, ligações de hidrogênio, forças de van der Waals e interações hidrofóbicas (LEVINSON e JAWETZ, 1998). Segundo CATTY (1989a), as reações antígeno-anticorpo apresentam algumas características básicas: a) Especificidade Os anticorpos podem apresentar uma grande especificidade para um antígeno em particular, distinguindo pequenas diferenças em sua estrutura química. Entretanto, pode ocorrer a chamada reação cruzada, onde alguns anticorpos produzidos contra um antígeno são capazes de reconhecer e se ligar a outro antígeno, estruturalmente semelhante. b) Diversidade Característica que reflete a capacidade de ligação de um grande número de anticorpos a diferentes antígenos. c) Afinidade A exatidão do encaixe estereoquímico entre o sítio de ligação ao anticorpo e seu determinante antigênico complementar é chamada de afinidade do anticorpo. A afinidade é normalmente representada por uma constante de dissociação (K d ), que indica a concentração do antígeno necessária para ocupar os sítios de ligação de metade das moléculas de anticorpo presentes em uma solução de anticorpos (quanto menor a K d, maior a afinidade da interação). Pelo processo de maturação de afinidade, a K d de um anticorpo pode variar na resposta imunológica primária e na secundária (por exemplo, K d de 10-7 a 10-9 M passaria, na resposta secundária, para M ou menos). 26

43 Diversos testes imunodiagnósticos, baseados nas características físicas e biológicas das reações antígeno-anticorpo, podem ser realizados em laboratório, como os ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e Western blotting. a) Ensaio imunoenzimático (ELISA - Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) (CATTY, 1989b) No final do século XX (1970), a pesquisa por métodos simples e sensíveis para detecção e quantificação de antígenos ou anticorpos em amostras diversas levou ao desenvolvimento de ensaios com reagentes acoplados a enzimas em fase sólida. A técnica baseia-se na marcação, por conjugação química, de uma enzima a um antígeno ou a um anticorpo conhecido; o material marcado com a enzima reage com a amostra; a subseqüente interação com o substrato da enzima produz uma coloração, que pode ser visualizada e, ou medida por densidade óptica. Por causa de sua sensibilidade e simplicidade combinadas, imunoensaios com enzimas em fase sólida podem ser largamente utilizadas para screening de amostras teste de pequenos volumes. O avanço da técnica de ELISA possibilitou um grande impacto sobre a epidemiologia e o diagnóstico de doenças infecciosas, sendo também utilizada rotineiramente para screening de anticorpos monoclonais, para detecção e medida de hormônios e drogas, para determinação de isótipos de anticorpos específicos e complexos imunes. Problemas de especificidade não são diferentes, nem maiores, do que aqueles de outros imunoensaios e, da mesma forma que outros ensaios, esses problemas podem ser minimizados pelo uso de reagentes de boa qualidade e de procedimentos padronizados. A técnica de ELISA apresenta variações, como ELISA indireta, ELISA direta, ELSA sanduíche. A técnica de ELISA indireta é a mais popular no que se refere ao screnning de amostras de soro para avaliação da presença de anticorpos específicos e exerce papel importante em estudos epidemiológicos de muitas infecções. O anticorpo se liga ao antígeno em fase sólida e é detectado por antiglobulina conjugada. Pode ser utilizado antissoro policlonal e anti-globulina conjugada. É capaz de detectar concentrações tão baixas como 10 ng ml -1 de anticorpo, sendo útil para titulação de anticorpos, testes de especificidade, estudos de isotipos de anticorpos e screening de rotina de clones de hibridoma para produção de anticorpos monoclonais. 27

44 A técnica de ELISA sanduíche é favorecida por sua simplicidade, combinada a especificidade e sensibilidade, além da sua fácil conversão para dot-elisa ou formato dip-stick. O anticorpo na fase sólida é exposto à amostra teste, se liga ao antígeno e um segundo anticorpo detecta o antígeno ligado. Pode ser utilizado anticorpo policlonal ou monoclonal. Pode detectar concentrações de 10 ng ml -1 de antígeno. Potencialmente muito sensível, é capaz de, teoricamente, detectar uma única molécula de antígeno. b) Western blotting Usado para confirmar se um resultado positivo em ELISA é um verdadeiro positivo ou um falso positivo, para avaliar especificidade de anticorpos e também para identificar e purificar antígenos. As proteínas são separadas eletroforeticamente em um gel, resultando em bandas distintas, que são transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose, seguido pela adição de antissoro. Se os anticorpos estiverem presentes, se ligarão à proteína e será detectado pela adição de anticorpos contra IgG marcado com radioatividade ou com enzimas. Pode ser utilizado anticorpo policlonal ou monoclonal. Apresenta sensibilidade maior que 10 ng ml -1 de antígeno. O método revela a pureza, o peso molecular e a natureza do antígeno, podendo ser utilizado para definir e comparar especificidade de anticorpos (LEVINSON e JAWETZ, 1998) Anticorpos policlonais e monoclonais Anticorpos que surgem em um animal em resposta a antígenos típicos (ou a uma mistura de antígenos) são heterogêneos (formados por diferentes clones de linfócitos B), apresentam diferentes graus de afinidade e especificidade, sendo capazes de responder a vários epitopos de um antígeno; nesse caso, o antissoro é dito policlonal. Anticorpos que surgem em um único clone celular (por exemplo, no tumor de células plasmáticas, ou mieloma) são homogêneos, isto é, o antissoro é monoclonal. Anticorpos monoclonais podem também ser produzidos em laboratório pela fusão de células de mieloma com uma célula produtora de anticorpo (LEVINSON e JAWETZ, 1998). Quando se faz a escolha entre a geração de anticorpos policlonais (PAbs) ou monoclonais (MAbs) devem ser consideradas a aplicação desejada, o custo e o tempo 28

45 disponível para sua produção. Em pesquisa, enquanto muitas questões podem ser resolvidas utilizando-se PAbs, os MAbs são preferíveis para propostas diagnósticas e quando se deseja uma produção em larga escala (LEENAARS et al., 1996). De maneira experimental, o antissoro policlonal é o resultado convencional da imunização de um animal, geralmente coelho, carneiro ou cabra. A produção de anticorpos depende da estimulação de células sensíveis ao antígeno nos tecidos linfóides do animal imunizado e da presença contínua do imunógeno, de modo a possibilitar extensa proliferação policlonal de plasmócitos e uma competição entre células por quantidades limitadas de antígeno, para que somente células com alta afinidade pelos determinantes antigênicos sejam capazes de responder (JANEWAY et al., 2005). Como diferentes testes requerem diferentes propriedades do antissoro, não existe um procedimento padrão para imunização de animais que garanta uma produção ideal de anticorpos. Segundo HENDRIKSEN e HAU (2003), um procedimento de imunização inclui vários fatores críticos, que podem influenciar os resultados da imunização e o bem estar dos animais, incluindo o tamanho do antígeno a ser administrado, o uso de adjuvante, a escolha dos animais, a rota de imunização, o volume e a freqüência das imunizações, e as coleta periódicas de sangue. a) Tamanho do imunógeno A intensidade da resposta imune está diretamente relacionada ao tamanho do antígeno e à diferença filogenética entre o animal doador do antígeno e o receptor. Moléculas de peso molecular entre 5 10 kda geralmente necessitam de uma proteína carreadora, entretanto o método de conjugação pode levar ao desenvolvimento de anticorpos específicos para determinantes da própria proteína carreadora. Moléculas maiores, com alto grau de conformação e rigidez estrutural, tendem a ser mais fortemente imunogênicas, com múltiplos determinantes antigênicos (POULSEN et al., 1990). b) Uso de adjuvantes Os adjuvantes (do latim adjuvare, que significa auxiliar, ajudar) consistem de substâncias cujas propriedades físicas e, ou biológicas quando aplicados com imunógenos afetam, em diferentes graus, a resposta imune. São usados desde 1926, 29

46 sendo úteis para indução experimental de uma resposta de linfócitos T a um antígeno protéico (AGUILAR e RODRÍGUEZ, 2007). Antígenos protéicos administrados sob a forma aquosa, sem adjuvantes, deixam de induzir respostas dos linfócitos T ou induzem um estado de falta de responsividade, chamado tolerância (SPRENT e SURH, 2002). Os adjuvantes acentuam a resposta imune a um imunógeno por vários mecanismos: induzem inflamação local, estimulando o influxo de APCs a locais de exposição ao antígeno; possibilitam a liberação lenta do imunógeno a partir do local da imunização; ativam as APCs para aumentar a expressão de co-estimuladores e produzir citocinas; podem atuar sobre APCs para prolongar a persistência de complexos peptídeo-mhc na superfície celular (BALDRICK et al., 2002). Os adjuvantes mais comumente utilizados para procedimentos de imunização são o adjuvante completo de Freund (ACF) e o adjuvante incompleto de Freund (AIF) (CATTY, 1989b). O adjuvante completo de Freund (ACF) é composto por uma mistura de óleo mineral (Bayol F), uma suspensão de células de Mycobacterium butyricum, Mycobacterium smegmatis ou Mycobacterium tuberculosis mortas por calor e o emulsificante Arlacel A. É o adjuvante mais efetivo e mais utilizado para produção de rotina de antissoro em animais, para antígenos solúveis e emulsificados de células. O uso de adjuvante completo de Freund permite a persistência a longo prazo da resposta imune devido ao efeito de depósito do adjuvante no local da imunização, já que as vesículas de óleo ficam retidas no granuloma por longos períodos, enquanto o material imunogênico sofre uma degradação lenta, apresentando uma meia vida de cerca de 14 dias. ACF nunca deve ser injetado duas vezes em um animal e, normalmente, é administrado na primeira imunização. Injeções repetidas de ACF podem levar a severas reações teciduais e também ao choque anafilático. Com a formação de granuloma e a tendência do ACF em gerar reações auto-imunes, esse adjuvante não pode ser utilizado em humanos (HENDRIKSEN e HAU, 2003). O adjuvante incompleto de Freund (AIF) consiste de uma emulsão de óleo em água, composta por óleo mineral (Bayol F) a 85-90% e um detergente (Arlacel A; mannide monooleate) a 10-15%. Imunógenos em fase aquosa podem ser emulsificados com AIF para prover um depósito de imunização principal, visando uma resposta de produção de anticorpos intensa a longo prazo, havendo captação e perda gradual do imunógeno a partir do sítio de injeção. Contudo, a resposta com 30

47 AIF é comumente menos confiável e mais baixa, devido à ausência de granulomas ou da menor persistência do imunógeno nos sítios de depósito (KITTELL et al., 1991). c) Escolha dos animais O coelho é, tradicionalmente, a espécie mais utilizada para a produção de anticorpos, mas a escolha depende dos propósitos da imunização e de fatores como volume de antissoro necessário, facilidade para obtenção das amostras de sangue, relação filogenética entre a espécie doadora do antígeno e a receptora, características e finalidade do anticorpo a ser sintetizado (ABRAHAM et al., 1994). Deve ser dada preferência a animais adultos jovens, que respondem melhor a agentes imunoestimulatórios, já que a resposta imune é pequena em animais jovens e declina com o avanço da idade. As idades mínimas recomendadas para a produção de anticorpos policlonais são: 6 semanas para ratos e camundongos; 3 meses para coelhos e guinea pigs; 3-4 meses para galinhas; 6-7 meses para cabras; 6-9 meses para carneiros (HENDRIKSEN e HAU, 2003). Animais da mesma espécie apresentam respostas individuais a um antígeno, portanto, mais de um animal deve ser utilizado e seu soro testado separadamente. Embora não existam razões científicas para a não utilização de animais machos, as fêmeas são escolhidas, por serem geralmente mais dóceis (ABRAHAM et al., 1994). A produção de anticorpos poli e monoclonais requer o uso de um número considerável de animais e, em função da invasividade dos procedimentos experimentais, os animais são protegidos por legislação específica, que regula o uso de animais de laboratório. No caso dos anticorpos policlonais, os animais são imunizados para induzir uma resposta imune humoral otimizada, enquanto para anticorpos monoclonais, os animais são necessários para a obtenção de linfócitos B antígeno-específicos e para a produção de ascite (HENDRIKSEN e HAU, 2003). d) Rota, volume e freqüência das imunizações A rota de injeção do antígeno determina, em parte, os órgãos linfóides ativados e o tipo de resposta a ser induzida. Animais podem ser imunizados por via intradérmica (i.d.), subcutânea (s.c.), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.) ou 31

48 intravenosa (i.v.). A escolha da rota de injeção deve ser influenciada pela natureza física do imunógeno e pela rotina de imunização (LEVINSON e JAWETZ, 1998). Pequenas doses de antígeno devem ser usadas, já que altas doses ativam um grande número de clones de células B de baixa afinidade, enquanto pequenas doses de antígeno ativam somente clones de células B de alta afinidade (ABBAS e LICHTMAN, 2005). Geralmente, uma única imunização não é suficiente para a produção de anticorpos, sendo necessárias imunizações sucessivas, para o estabelecimento de células de memória. As imunizações nunca devem ser realizadas no mesmo sítio da injeção prévia, nem em granulomas ou regiões intumescidas. Como indicação geral, a próxima imunização deve ser realizada assim que o título de anticorpos atinja um platô ou comece a declinar (3-4 semanas após a primeira imunização, para antígenos aquosos; 4 semanas quando um adjuvante é utilizado). O número de imunizações sucessivas deve ser limitado a 2-3, mas no caso de antígenos de baixo peso molecular, um maior número de imunizações pode ser necessário (HENDRIKSEN e HAU, 2003). e) Coleta de sangue Uma coleta de sangue antes do início das imunizações deve sempre ser realizada, pelo fato de cada animal apresentar respostas individuais quando desafiado com um antígeno (CATTY, 1989a). Para uma produção otimizada de antissoro devem ser realizadas coletas periódicas de sangue após cada imunização, visando monitorar o título de anticorpos no soro, mudanças na especificidade e avidez. Os resultados dos testes influenciam as imunizações subseqüentes e podem ser um guia essencial para selecionar os melhores animais produtores de anticorpos (LEVINSON e JAWETZ, 1998). f) Estoque do antissoro obtido Embora o antissoro estéril permaneça viável quando estocado a 4 ºC por longos períodos, o congelamento é recomendável, sendo o mínimo de 20 ºC. Contudo, nessas condições, o componente aquoso sublima e congela na superfície, enquanto as proteínas podem agregar em precipitados insolúveis na parte inferior. Enzimas do soro continuam degradando as proteínas quando estocadas a 20 ºC, por isso, temperaturas de 60 ºC ou abaixo são ideais (CATTY, 1989a). 32

49 3. MATERIAIS E MÉTODOS O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Microbiologia de Anaeróbios do Departamento de Microbiologia, na Universidade Federal de Viçosa. 3.1 Microrganismos e condições de cultivo Streptococcus bovis HC5 foi cultivado em condições anaeróbias a 39 ºC, por 18 h, em meio basal, contendo (por litro): 16 g de glicose; 0,292 g de K 2 HPO 4 ; 0,292 g de KH 2 PO 4 ; 0,48 g (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0,48 g de NaCl; 0,1 g de MgSO 4.7H 2 O; 0,064 g de CaCl 2.2H 2 O; 0,5 g de hidrocloreto de cisteína; 4 g de Na 2 CO 3 ; 0,1 g de tripticase e 0,5 g de extrato de levedura. Foram utilizados Alicyclobacillus acidoterrestris DSMZ 2498 e Lactococcus lactis ATCC como microrganismos indicadores da atividade da bacteriocina, em testes de difusão em meio sólido. Lactococcus lactis ATCC foi cultivado em condições aeróbias, a 30 ºC, em meio MRS (DE MAN et al., 1960), contendo (por litro): 10 g de proteose peptona; 10 g de extrato de carne; 5 g de extrato de levedura; 1 g de Tween 80; 2 g de citrato de tri-amônio; 0,205 g de MgSO 4 ; 0,056 g de MnSO 4 ; 2,62 g de K 2 HPO 4 ; 20 g de sacarose e 5 g de acetato de sódio. Alicyclobacillus acidoterrestris DSMZ 2498 foi cultivado em condições aeróbias, a 40 ºC, em meio AAM meio para A. acidoterrestris (YAMAZAKI et al., 2000), contendo por litro: 1 g de extrato de levedura; 0,2 g de (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0,5 g de MgSO 4.7H 2 O; 0,25 g de CaCl 2.2H 2 O; 0,6 g de KH 2 PO 4 e 1 g de glicose. 33

50 3.2 Extração e determinação da atividade de bovicina HC5 A extração de bovicina HC5 foi realizada conforme descrito por MANTOVANI et al. (2002). Culturas de S. bovis em fase estacionária foram submetidas a tratamento térmico (70 o C, 30 min) para inativação das células e peptidases do envelope celular. As células foram separadas por centrifugação (1742 g, 15 min, 5 o C) (Sorvall RT 6000 D, GMI, Minnesota, EUA), lavadas com 50 ml de solução fosfato de sódio (5 mm, ph 6,4) e novamente centrifugadas; os pellets foram ressuspendidos em 50 ml de solução ácida de NaCl (100 mm, ph 2,0) e incubados por 2 h à temperatura ambiente, sob agitação constante; a suspensão de células foi novamente centrifugada (1742 g, 15 min, 5 o C) e o sobrenadante livre de células, liofilizado; o material liofilizado foi então ressuspendido em 10 ml de solução fosfato de sódio (5 mm, ph 2,0). A atividade da bacteriocina foi determinada pelo teste de difusão em meio sólido, conforme descrito por HOOVER (1993), utilizando A. acidoterrestris DSMZ 2498 ou L. lactis ATCC como microrganismo indicador (10 7 UFC/mL). As placas foram inoculadas com 100 μl de cultura de A. acidoterrestris DSMZ 2498 pelo método de spread plate ou com 100 μl de cultura de L. lactis ATCC pelo método de pour plate. A seguir, foram realizadas diluições seriadas da bovicina HC5 (incrementos de 2 vezes), em solução fosfato de sódio (5 mm, ph 2,0), e aplicados 25 μl de cada diluição em poços de 5 mm perfurados em meio sólido; as placas foram incubadas overnight a 4 ºC para difusão da bacteriocina. Em seguida, as placas com A. acidoterrestris DSMZ 2498 foram incubadas por até 36 h a 40 ºC e as placas com L. lactis ATCC foram incubadas por 24 h a 30 ºC; a atividade da bacteriocina foi determinada pelo recíproco da maior diluição onde foi possível visualizar halos de inibição 5 mm de diâmetro (a partir da borda do poço), sendo expressa em unidades arbitrárias por ml (UA/mL) (LEWUS e MONTVILLE, 1991). 3.3 Atividade inibitória de sobrenadantes de culturas lácticas bacteriocinogênicas A atividade antimicrobiana dos sobrenadantes das culturas lácticas PD 4.7, ID 3.1 e ID 8.5, foi determinada pelo método de difusão em ágar, já descrito para bovicina HC5, utilizando L. lactis ATCC como microrganismo indicador (

51 UFC/mL). O teste de difusão em ágar também foi realizado com o sobrenadante da cultura de Streptococcus bovis JB1, como controle negativo. 3.4 Purificação de bovicina HC5 A bacteriocina bovicina HC5 foi purificada por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC, Waters), utilizando coluna C-18 (6,0 x 150 mm, 5 μm Shimadzu), equilibrada com TFA 0,1 %. Foram aplicados 1,5 ml da bacteriocina após liofilização e ressuspensão em solução fosfato de sódio (5 mm, ph 2,0). Inicialmente, as proteínas foram eluídas a um fluxo de 1 ml min -1 na solução de equilíbrio, passando para uma concentração de 10 % do solvente B (acetonitrila 80 % e TFA 0,1 %), durante os primeiros 10 min, seguindo-se a eluição em um gradiente de 10 a 60 % do solvente B, durante 40 min; após 50 min de corrida, a concentração do solvente B atingiu 100 % e a coluna foi lavada por 25 min. A absorvância foi monitorada a 214 e a 280 nm. Todas as frações eluídas foram coletadas e avaliadas quanto à atividade antimicrobiana, por meio dos testes de atividade em meio sólido, descritos anteriormente. Definida a fração com atividade, o método de purificação foi alterado, com o objetivo de reduzir o tempo de cada corrida cromatográfica. As proteínas passaram a ser eluídas a um fluxo de 1 ml min -1 na solução de equilíbrio, na concentração de 35 % do solvente B, durante os primeiros 8 min, e um gradiente de 35 a 50 % do solvente B, durante 12 min; após 20 min de corrida, a concentração do solvente B atingiu 35 %, restaurando a condição inicial de equilíbrio; a coluna não foi lavada e as corridas foram sequenciais. A absorvância continuou sendo monitorada a 214 e a 280 nm. A purificação do peptídeo foi confirmada por SDS-Tricina-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Tricine Polyacrilamide Gel Electrophoresis) (16,5 % de acrilamida) (SHÄGGER e VON JAGOW, 1987). As proteínas foram separadas a 100 V, por 2 h, usando aparato de eletroforese mini-protean II da Bio-Rad. O gel foi lavado por 1 min em água Milli Q e fixado em três soluções: fixador 1, solução de ácido ortofosfórico 2 % e etanol 30 % (3vezes, por 30 min cada; 50 ml de solução para cada gel, em cada incubação); fixador 2, ácido ortofosfórico 2 % (3vezes, por 10 min cada; 50 ml de solução para cada gel, em cada incubação); fixador 3, ácido ortofosfórico 2 %, etanol 18 % e sulfato de amônio 12 % (p/v) (1 vez, por 30 min; 50 35

52 ml de solução para cada gel, em cada incubação). Ao gel imerso no fixador 3, foram adicionados 500 μl de solução de Coomassie blue G-250 (2,0 %) e a coloração procedeu até que as bandas fossem visualizadas (cerca de 5 h) (NEUHOFF et al., 1988). Foi utilizado padrão de baixa massa molecular (SIGMA-ALDRICH), com bandas de 31,0; 20,4; 19,7; 16,9; 14,4; 6,1; 3,5 kda. A atividade biológica da bacteriocina em SDS-Tricina-PAGE foi avaliada pelo teste de biorevelação. Uma camada de meio MRS semi-sólido (20 ml), contendo L. lactis ATCC como microrganismo indicador (10 7 UFC/mL), foi disposta sobre o gel de poliacrilamida em placa de Petri, que foi incubada a 30 ºC, por até 24 h (BHUNIA et al., 1987). 3.5 Produção de anticorpos policlonais Foram utilizados quatro coelhos brancos, fêmeas, da raça New Zealand, com mais de 60 dias de vida e cinco camundongos BALB/c com cerca de 7 a 8 semanas. Os animais receberam dieta comercial (SOCIL ) e água ad libitum ao longo do experimento, sendo monitorados quanto à aparência geral e reações nos locais de imunização. A fração ativa eluída em RP-HPLC foi submetida a tratamento térmico para evaporação da acetonitrila e do TFA (90º C, 1h e 30 min), e estocada a 20 ºC até o momento do preparo das amostras para imunização. Dois coelhos e os camundongos foram imunizados com uma mistura da bovicina HC5 e adjuvante de Freund. À bacteriocina foi adicionado igual volume de adjuvante completo de Freund (para a primeira imunização) ou adjuvante incompleto (para as imunizações subseqüentes) e a mistura foi homogeneizada com uma seringa (BHUNIA, 1994). Os outros dois coelhos foram imunizados com uma mistura de adjuvante incompleto de Freund e bacteriocina excisada do SDS-Tricina-PAGE. Foi preparado SDS-Tricina-PAGE (SHÄGGER e VON JAGOW, 1987), com canaleta contínua, para cada imunização e para cada coelho; a banda referente à bacteriocina foi excisada do gel, fragmentada e macerada em almofariz, com 2,0 ml de PBS (ph 7,2), até a formação de uma mistura homogênea. A essa mistura foi adicionado igual volume de adjuvante incompleto de Freund, para todas as imunizações, e homogeneizada com uma seringa. 36

53 Os coelhos e camundongos foram imunizados conforme descrito por AUSUBEL et al. (1997). Os coelhos foram imunizados por via subcutânea (dois pontos no dorso) e intramuscular (patas traseiras), com 2,0 ml de solução de antígeno e adjuvante (0,5 ml por sítio de imunização). Os camundongos foram imunizados por via subcutânea, em um único ponto na região abdominal, com 0,2 ml de solução de antígeno e adjuvante. As imunizações dos coelhos foram realizadas a cada 10 dias, totalizando 5 aplicações, enquanto os camundongos foram imunizados por 6 vezes, a cada 10 dias. Cerca de 15 ml de sangue de cada coelho foram coletados a partir da veia marginal da orelha esquerda, antes de iniciar as imunizações, para que fosse obtido o soro pré-imune dos animais. O local que seria sangrado foi raspado com lâmina de aço e aplicada pequena quantidade de xilol na extremidade da orelha, para possibilitar a dilatação da veia; o local onde foi realizado o corte foi esfregado, acima e abaixo, com vaselina; a extremidade da lâmina de aço foi utilizada para atravessar a veia marginal da orelha e a veia foi comprimida contra a cabeça, acima do corte; o sangue foi coletado em frasco de vidro com bastão de vidro. Após atingir o volume de sangue desejado, um algodão embebido em álcool 70 % foi comprimido firmemente contra o corte para retirada do xilol, até estancar o sangramento. Após o retorno às gaiolas, os coelhos foram examinados por alguns minutos para verificar se o corte na veia marginal da orelha estava em boas condições (CATTY, 1989a). A partir da segunda imunização, cerca de 10 ml de sangue dos coelhos foram coletados, também através da veia marginal da orelha, antes de cada imunização. O soro dos animais foi monitorado para acompanhamento da produção de anticorpos e 5 dias após a quinta imunização (45 dias de experimento), os animais foram submetidos à eutanásia e o sangue foi coletado a partir da veia jugular. No caso dos camundongos BALB/c, as amostras de sangue foram coletadas a cada 6 dias, a partir da 4ª imunização, totalizando-se 4 coletas. Os animais foram inicialmente sedados com éter etílico e o sangue foi coletado por punção na veia ocular direita, com pipeta Pasteur de vidro. Todas as amostras de sangue dos animais permaneceram à temperatura ambiente (37 ºC) por cerca de 1 hora ou até que o coágulo formado estivesse solto da parede do recipiente de vidro. O sangue foi armazenado sob refrigeração (4 ºC) overnight, para a retração do coágulo e separação do soro; o soro, com um mínimo de células vermelhas, foi coletado com uma pipeta automática, transferido para tubos 37

54 de microcentrífuga e centrifugados a rpm, por 15 min (Eppendorf, Centrifuge 5415C, Hamburg, Germany), à temperatura ambiente, para remoção de outras células sanguíneas. Para evitar repetidos descongelamentos, as amostras foram estocadas em alíquotas de 2,0 ml, a 20 ºC até o momento das análises (AUSUBEL et al., 1997). 3.6 Determinação do título de anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 O título de anticorpos foi determinado por testes do soro diluído em PBS (2,226 g de NaH 2 PO 4, 11,915 g de Na 2 HPO 4, 87,6 g de NaCl (ph 7,2)), contra bovicina HC5 purificada (10 μg ml -1 em PBS), usando a técnica de ELISA indireta, conforme descrito por LEVERSEE e GLATZ (2001), com modificações. As amostras de bovicina HC5 purificadas foram colocadas em microplacas de poliestireno, de fundo chato e 96 orifícios (Corning, Corning, EUA). As placas foram incubadas overnight a 4ºC, lavadas duas vezes com tampão salina fosfato (2,226 g de NaH 2 PO 4, 11,915 g de Na 2 HPO 4, 87,6 g de NaCl (ph 7,2)) e 0,05 % (v/v) de Tween 20 (PBST), bloqueadas com solução 1,0 % de albumina em PBST, por 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas três vezes com PBST. Anticorpo primário (200 μl de antissoro de coelho, em diluições seriadas em PBS, de 1:16 a 1:4096) foi adicionado aos orifícios e as placas foram incubadas à temperatura ambiente, por 3 h. A seguir, as placas foram lavadas cinco vezes com PBST e o anticorpo secundário (200 μl de anti-igg de coelho conjugado com peroxidase (SIGMA-ALDRICH), diluído 1:16000 em PBS) foi adicionado. As placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente, lavadas quatro vezes com PBST e uma vez com PBS, adicionada a solução de o-fenilenediamina, em concentração de 0,66 mg ml -1 com 0,012 % (v/v) de H 2 O 2. As placas foram incubadas à temperatura ambiente, no escuro, por 30 min, e os soros positivos foram evidenciados pelo desenvolvimento de coloração amarela resultante da ação da peroxidase sobre o substrato. A reação foi interrompida pela adição de ácido clorídrico 3 M e a absorvância foi analisada a um comprimento de onda de 492 nm, em leitor de ELISA (ThermoPlate, Modelo TP-Reader, tipo B). Foi considerado positivo todo soro em que a leitura de absorvância obtida foi maior do que a absorvância a 492 nm dos soros negativos, mais dois desvios-padrão 38

55 (DP). O título foi definido como o recíproco da maior diluição que apresentou absorvância, pelo menos, 50 % maior do que a absorvância média para todas as diluições do soro pré-imune (LEUNG et al., 2002). Todas as análises foram realizadas em triplicatas. 3.7 Análise da especificidade dos anticorpos A avaliação da especificidade dos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 foi avaliada por meio de ensaios de Western blotting e de ELISA indireta, em relação ao sobrenadante da cultura de S. bovis HC5, de três culturas lácticas bacteriocinogênicas (PD 4.7; ID 3.1; ID 85) e de uma cultura de S. bovis JB1, não bacteriocinogênica. Os ensaios de Western blotting foram realizados conforme descrito por AUSUBEL et al. (1997), com modificações. Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose com poros de 0,2 μm (SIGMA- ALDRICH), utilizando o equipamento de eletrotransferência Bio-Rad Trans-Blot, com amperagem constante de 0,35 A, por 40 min, a 4 ºC. As membranas foram bloqueadas com TBST 1X (20 mm Tris base, 0,5 M NaCl (ph 7,5), 0,1 % Tween 20) e 5 % de caseína, por 1h 30 min; lavadas rapidamente com TBST 1X e outras três vezes com 50 ml de TBST 1X (durante 15 min) e incubadas overnight com anticorpo policlonal anti-bovicina HC5, desenvolvido nesse trabalho (antissoro de coelho diluído 1:200 em TBST). As membranas foram lavadas três vezes com 50 ml de TBST 1X, durante 15 min/cada, incubadas, por 2 h, com anticorpo secundário (anti-igg de coelho conjugado com peroxidase (SIGMA-ALDRICH), diluído 1:16000, com a mesma solução tampão) e lavadas outras três vezes com 50 ml de TBST 1X, durante 15 min/cada. A ligação dos anticorpos à bovicina HC5 foi visualizada com o substrato cromogênico o-fenilenediamina: as membranas foram mergulhadas em solução de o-fenilenediamina e peróxido de hidrogênio, por 30 min, e lavadas com água destilada para interromper a reação. Todas as incubações e lavagens foram realizadas à temperatura ambiente, sob agitação constante (100 rpm). Foi utilizado padrão pré-corado de massa molecular muito baixa (SIGMA- ALDRICH), com bandas de 26,6; 17,0; 14,2; 6,5; 3,496; 1,06 kda. Os ensaios de ELISA indireta foram realizados conforme descrito anteriormente, em triplicatas. O sobrenadante das culturas avaliadas foi considerado 39

56 reativo com antissoro anti-bovicina HC5 se a absorvância a 492 nm foi, pelo menos, 10 vezes maior do que a média do valor de absorvância não específica (0,01) (LEVERSEE e GLATZ, 2001). 3.8 Neutralização da atividade inibitória de bovicina HC5 pelos anticorpos policlonais A habilidade do antissoro policlonal em neutralizar a atividade da bovicina HC5, foi verificada conforme descrito por LEVERSEE e GLATZ (2001). Diluições seriadas (1:2 a 1:1024) da bacteriocina em PBS (ph 7,2) foram misturadas com igual volume de antissoro não diluído (15 μl) e incubadas por 1 h e 30 min em banhomaria a 37 ºC. Em seguida, foi realizado o teste de atividade, conforme descrito anteriormente, utilizando L. lactis ATCC como microrganismo indicador. Soro pré-imune e água MilliQ estéril foram utilizados como controles negativos e todos os testes foram realizados em duplicatas. 3.9 Monitoramento da produção e quantificação de bovicina HC5 Após serem caracterizados, os anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 foram utilizados para determinar a produção de bovicina HC5 e para quantificar a bacteriocina durante o crescimento de S. bovis HC5, em condições anaeróbias, em meio basal, a 39 ºC, por 24 h (RICHARD et al., 2004). Para avaliar a produção de bovicina HC5 ao longo do período de incubação foram coletadas amostras da cultura a cada 15, 30 ou 60 min, de acordo com a fase de crescimento microbiano, sendo utilizada a técnica de ELISA indireta (LEVERSEE e GLATZ, 2001). Os dados de produção de bovicina HC5 foram correlacionados com os dados de D.O. 600nm (Electron Corporation, Spectronic 20D+) para determinação da fase de crescimento na qual o peptídeo foi produzido, e comparados aos testes de atividade baseados em difusão em meio sólido. Para a quantificação da bacteriocina produzida, amostras do sobrenadante da cultura de S. bovis HC5 foram processadas simultaneamente com amostras de concentrações conhecidas de bovicina HC5, para obtenção da curva padrão. Foram realizadas diluições seriadas das amostras do sobrenadante da cultura em PBS (ph 40

57 7,2) e avaliadas pela técnica de ELISA sanduíche, conforme descrito por AUSUBEL et al. (1999), com modificações. Microplacas de poliestireno, de fundo chato e 96 orifícios foram sensibilizadas com anticorpo policlonal anti-bovicina HC5 produzido em coelhos (200 μl/well, diluído 1:64 em PBS). As placas foram incubadas à 4º C overnight, lavadas duas vezes com PBST e bloqueadas com solução 1,0 % de albumina em PBST. As amostras da cultura de S. bovis HC5 foram diluídas 1:40 em PBS contendo 0,5% de albumina bovina e em cada placa foram testadas 43 amostras pareadas e dois controles positivos e negativos. As amostras foram incubadas por 2 h à temperatura ambiente, lavadas três vezes com PBST e adicionado anticorpo policlonal anti-bovicina HC5 produzido em camundongos (200 μl/well, diluído 1:64 em PBS); as placas foram incubadas por 2 h à temperatura ambiente, lavadas cinco vezes com PBST e, em seguida, adicionado anticorpo secundário conjugado com peroxidase (anticorpo de cabra anti-porção Fc de anticorpo de camundongo (SIGMA-ALDRICH), diluído 1:15000 em PBS). As placas foram incubadas à temperatura ambiente, lavadas quatro vezes com PBST e uma vez com PBS, e adicionado o substrato o-fenilenendiamina, que evidenciou os soros positivos pelo desenvolvimento de coloração amarela resultante da ação da peroxidase sobre o substrato. As placas foram incubadas à temperatura ambiente, no escuro, por 30 min e a reação foi interrompida pela adição de ácido clorídrico 3 M; a absorvância foi analisada a um comprimento de onda de 492 nm, em leitor de ELISA. Como controle negativo foi utilizado o microrganismo S. bovis JB1, não produtor de bacteriocina. Foi considerado positivo todo soro em que a leitura de absorvância obtida foi maior do que a absorvância a 492 nm dos soros negativos mais dois desvios-padrão (DP). Todos os testes foram realizados em duplicatas Efeito citotóxico Para avaliar o efeito citotóxico in vitro da bovicina HC5 foram utilizadas células Vero (linhagem celular derivada de rim do macaco verde Africano, Cercopithecus aethiops) mantidas em meio essencial mínimo (MEM) (SIGMA- ALDRICH), ph 7,2, e o método colorimétrico baseado na redução do 3-[4,5- dimetiltiazol-2-il]-2,-difeniltetrazolium brometo (MTT) (SIGMA-ALDRICH) por enzimas mitocondriais (MOSMANN, 1983). 41

58 Monocamadas de células Vero com tapetes celulares semiconfluentes em microplacas de 96 orifícios foram tratadas com concentrações de bovicina HC5, que variaram de 2,14 a 300 μg ml -1, e incubadas, por 48 h, em estufa (Shell Lab, IR2424) a 37 ºC e atmosfera de 5 % de CO 2. Após esse período, as células foram lavadas duas vezes com tampão fosfato (ph 7,2) e adicionada solução estoque de MTT (0,5 mg ml -1 ) a todos os orifícios da placa. As placas foram novamente incubadas em estufa umidificada a 37 C por 4 h; o sal formado foi solubilizado pela adição de isopropanol-hcl 0,04 N (100 μl de HCl 0,04 N em isopropanol) aos orifícios da placa e misturado rapidamente para dissolver os cristais de coloração azul escura; após 1 h à temperatura ambiente, a densidade óptica foi determinada em leitor de ELISA (Qiagen, Titertek Multiskan PLUS MK II, Hilden, Germany), utilizando comprimento de onda de 560 nm. As microplacas foram também monitoradas sob microscópio óptico invertido após 24, 36 e 48 h de incubação com a bovicina HC5, para determinar o efeito desta sobre a morfologia e a viabilidade celular (perda da monocamada, granulação e vacuolização no citoplasma), em relação ao aspecto das células controle, não tratadas. A percentagem de células tratadas viáveis foi calculada em relação ao controle não tratado (% de células tratadas viáveis = DO exp /DO célula controle x 100) e determinada a CT 50 (concentração de bovicina HC5 necessária para reduzir a densidade óptica em 50 %) (TODOROV et al., 2005). Para avaliar a interferência de outros fatores sobre o potencial citotóxico da bacteriocina, foram testados também os efeitos da solução fosfato de sódio (5 mm, ph 2,0) (utilizada para ressuspender a bacteriocina após liofilização), da acetonitrila na concentração de 40 % (gradiente de eluição da bacteriocina em RP-HPLC) e da bovicina HC5 ressuspendida em água MilliQ estéril, sobre culturas de células Vero, utilizando-se a mesma metodologia supracitada. Todos os testes foram realizados em triplicatas. 42

59 4. RESULTADOS 4.1 Purificação de bovicina HC5 Amostras de extratos liofilizados contendo bovicina HC5 obtida de células de S. bovis HC5 em fase estacionária e estocados sob refrigeração (4 o C) por 4 semanas foram inicialmente separadas por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) com gradiente crescente de acetonitrila. Vinte frações eluídas entre os tempos de retenção de 10 e 50 min foram coletadas para análise de atividade antimicrobiana. Duas frações (frações 13 e 19) inibiram o crescimento de L. lactis ATCC em bioensaio de difusão em meio sólido, sendo que a atividade antimicrobiana da fração 19 foi 70 % maior do que a observada com a fração 13. A fração 13, eluída com 42 % do tampão B, apresentou tempo de retenção de 35 min e 45 segundos, enquanto a fração 19 foi eluída aos 45 min e 40 segundos do início do perfil cromatográfico, quando a concentração de tampão B era de 54 % (Figura 1). Com base nesses resultados, o protocolo de purificação da bovicina HC5 foi otimizado, utilizando-se amostras armazenadas a 20 ºC, possibilitando a obtenção de uma única fração com atividade antimicrobiana, eluída com 50 % de tampão B e tempo de retenção de 18 min (Figura 2). Todas as corridas realizadas a partir de então apresentaram o mesmo padrão de espectro cromatográfico, podendo ser sobrepostas (Figura 3). 43

60 Figura 1. Perfil cromatográfico de fase reversa em HPLC, do extrato de bovicina HC5 estocado sob refrigeração por 4 semanas. São mostrados o gradiente de tampão B e as absorvâncias a 214 e a 280 nm. Figura 2. Perfil cromatográfico de fase reversa em HPLC otimizado para a purificação de extratos de bovicina HC5. São mostrados o gradiente de tampão B e as absorvâncias a 214 e a 280 nm. 44

61 Figura 3. Sobreposição dos perfis cromatográficos após otimização do processo de purificação de extratos de bovicina HC5 (seis repetições). São mostrados o gradiente de tampão B e a absorvância a 214 nm. Tipicamente, obteve-se atividade de UA/mL com os extratos liofilizados de bovicina HC5 (250 µg de proteína ml -1 ) e de UA/mL com a bacteriocina purificada (600 µg de proteína ml -1 ), utilizando-se A. acidoterrestris DSMZ 2498 como indicador. Quando L. lactis ATCC foi utilizado como célula-alvo, obteve-se atividade de UA/mL para os extratos liofilizados e de UA/mL para a bovicina HC5 purificada, indicando que L. lactis é menos sensível à bovicina HC5. Para avaliar a possível interferência dos solventes orgânicos acetonitrila e TFA na atividade das amostras de bovicina HC5 purificada, testou-se o efeito de cada solvente sobre o crescimento de L. lactis ATCC A acetonitrila inibiu o crescimento do microrganismo indicador quando a concentração foi igual ou maior do que 40 %. Neste último caso, observou-se a formação de halos de inibição de aproximadamente 7 mm de diâmetro. Amostras de TFA não apresentaram atividade antimicrobiana na concentração de 0,1 %. Ensaios anteriores de difusão em meio sólido indicaram que a atividade de bovicina HC5 não é afetada significativamente pelo tratamento térmico (MANTOVANI et al., 2002). Assim, sabendo-se da interferência da acetonitrila sobre a atividade de bovicina HC5 e considerando que os pontos de ebulição de acetonitrila e TFA são 82 ºC e 72 ºC, respectivamente, as amostras de bovicina HC5 45

62 purificadas foram submetidas a tratamento térmico a 90 ºC por 1h e 30 min para a evaporação dos solventes. A determinação da atividade de bovicina HC5 após o tratamento térmico indicou que a atividade biológica da bacteriocina não foi afetada pelo calor, embora tenha sido observada diminuição de até 10 % nos diâmetros dos halos de inibição. A purificação do peptídeo foi confirmada pela separação das amostras por SDS-Tricina-PAGE, onde foi possível visualizar uma única banda, de massa semelhante à esperada para a bovicina HC5. Observaram-se 2 bandas protéicas adicionais, de menor intensidade e massa molecular aproximada de 14,4 e 16,9 kda, nas amostras dos extratos liofilizados da bacteriocina, antes da etapa de purificação. É possível observar ainda pequena contaminação dos extratos obtidos de S. bovis HC5 com proteínas extracelulares e peptídeos derivados do meio de cultivo (Figura 4). Quando a banda correspondente à bovicina HC5 foi excisada do gel de poliacrilamida, transferida para uma placa de petri e coberta com uma camada de meio MRS semi-sólido contendo aproximadamente 10 7 UFC/mL de L. lactis ATCC 19435, observou-se a inibição do crescimento do microrganismo indicador, indicando que a atividade biológica da bovicina HC5 foi mantida no gel. Nenhum dos componentes do SDS-Tricina-PAGE ou das soluções de coloração pelo método de Coomassie Blue G-250 alteraram essa atividade antimicrobiana. Partes do gel de poliacrilamida que não apresentaram bandas, foram excisadas e tratadas de forma similar e não apresentaram halos de inibição sobre o microrganismo indicador (Figura 4). 46

63 Figura 4. Separação em SDS-Tricina-PAGE, 16,5 % de acrilamida, das amostras de bovicina HC5 purificada (linha A) e extrato bruto liofilizado (linha B). O gel foi corado com Coomassie blue G-250. As duas bandas que foram visualizadas na amostra do extrato de bovicina HC5 liofilizado estão indicadas por setas e apresentam massa molecular aproximada de 14,4 e 16,9 kda. Linha C - banda de bovicina HC5 purificada, excisada de SDS-Tricina-PAGE; linha D fragmento excisado de SDS-Tricina-PAGE que não apresentou banda; M - padrão de baixa massa molecular. Os bioensaios foram realizados com sobrecamada de meio MRS semi-sólido contendo o microrganismo indicador L. lactis ATCC 19435; as placas foram incubadas a 30 ºC, por até 24 h. 4.2 Titulação dos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 Somente um coelho e dois camundongos utilizados para a produção de anticorpos policlonais apresentaram reações imunes exacerbadas, com formação de granulomas após a primeira imunização por via subcutânea, na qual foi utilizada adjuvante completo de Freund. O granuloma persistiu até o final do experimento (cerca de 45 dias para o coelho e 60 dias para os camundongos). O soro pré-imune de cada um dos animais foi coletado antes da primeira imunização e titulado por ELISA indireta para avaliação de reações inespecíficas dos anticorpos pré-formados contra a bovicina HC5 e para a titulação do antissoro dos animais, coletado ao final das imunizações. Observou-se variação de reações 47

64 inespecíficas no soro pré-imune de cada animal, sendo as maiores leituras de absorvância detectadas no soro do coelho 2 e as menores, no soro do coelho 3 (Figura 5). Absorvância (492 nm) 0,4 0,3 0,2 0,1 Coelho 1 Coelho 2 Coelho 3 Coelho Fator de diluição Figura 5. Titulação do soro pré-imune dos coelhos utilizados para a produção de anticorpos policlonais anti-bovicina HC5. Os animais 1 e 2 foram imunizados com bovicina HC5 excisada do gel de poliacrilamida e homogeneizada com adjuvante incompleto de Freund, enquanto os animais 3 e 4 foram imunizados com bacteriocina e adjuvante de Freund (completo para a primeira imunização e incompleto para as demais). Os resultados representam a média das absorvâncias a 492 nm (n = 2) do soro pré-imune de cada animal diluído em tampão salina fosfato (ph 7,2) e detectados por ensaio de ELISA indireta. A titulação do antissoro coletado após as imunizações indicou que a produção de anticorpos policlonais foi ascendente, atingindo um platô após 30 dias da primeira imunização, como demonstrado pelo aumento do título de anticorpos nos soros dos coelhos (Figura 6). Tal informação foi utilizada para a determinação da data em que os animais sofreriam eutanásia e a coleta final de antissoro seria realizada. 48

65 Absorvância (492 nm) 0,4 0,3 0,2 0,1 Coleta 1 Coleta 2 Coleta Fator de Diluição Figura 6. Titulação dos antissoros coletados após 10, 20 e 30 dias (coletas 1, 2 e 3, respectivamente) da primeira imunização. As placas de ELISA foram sensibilizadas com amostras de bovicina HC5 purificada (10 μg ml -1 ) e o antissoro de cada animal foi diluído em tampão salina fosfato (ph 7,2), de 1:2 até 1:4096. A concentração de anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 foi determinada pela técnica de ELISA indireta. Os resultados representam a média das absorvâncias a 492 nm dos soros obtidos ao longo dos procedimentos de imunização dos quatro coelhos avaliados. O antissoro dos coelhos imunizados com bacteriocina purificada, excisada do gel de poliacrilamida e homogeneizada com adjuvante incompleto de Freund (coelhos 1 e 2) e dos coelhos imunizados com bacteriocina purificada e adjuvante completo (primeira imunização) ou incompleto de Freund (imunizações subseqüentes) (coelhos 3 e 4) apresentaram títulos de 1024 e 2048, respectivamente (Figura 7). Não foi possível titular o antissoro de camundongo, já que todas as diluições seriadas realizadas com o antissoro desses animais apresentaram a mesma leitura de absorvância a 492 nm (cerca de 0,63). 49

66 Absorvância (492 nm) 0,4 0,3 0,2 0,1 Coelho 1 Coelho 2 Coelho 3 Coelho Fator de diluição Figura 7. Titulação do antissoro anti-bovicina HC5 produzido em coelhos New Zealand e coletado ao final dos procedimentos de imunização. As placas de ELISA foram sensibilizadas com amostras de antissoro, diluídas em tampão salina fosfato (ph 7,2) de 1:16 a 1:4096. Os valores apresentados representam as médias das absorvâncias a 492 nm de amostras em duplicatas. 4.3 Especificidade dos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 A especificidade dos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 produzidos em coelhos foi avaliada pelas técnicas de Western blotting e ELISA indireta, utilizandose o antissoro que apresentou o maior título e a menor reatividade no soro pré-imune (coelho 3). Os sobrenadantes das culturas de S. bovis HC5, S. bovis JB1 e de outras três culturas de bactérias lácticas (PD 4.7; ID 3.1; ID 8.5), foram inicialmente testados quanto à atividade antimicrobiana contra L. lactis ATCC Os sobrenadantes das três culturas de bactérias lácticas apresentaram halos de inibição somente quando não diluídos; o sobrenadante de S. bovis JB1 não apresentou atividade antimicrobiana e o da cultura de S. bovis HC5 foi capaz de inibir o crescimento do microrganismo indicador quando avaliado puro e diluído 1:2. 50

67 No Western blotting, os anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 reconheceram somente as bandas referentes à bovicina HC5 na amostra purificada. Não foram observadas reações com o sobrenadante da cultura de S. bovis HC5 ou com o extrato de bovicina HC5. Também não foram observadas reações inespecíficas com os sobrenadantes das culturas lácticas bacteriocinogênicas ou com proteínas do sobrenadante da cultura de S. bovis JB1, uma estirpe de Streptococcus não bacteriocinogênica, mas filogeneticamente relacionada ao S. bovis HC5 (Figura 8). Quando avaliados pela técnica de ELISA indireta, o sobrenadante das culturas foi considerado reativo com antissoro anti-bovicina HC5 se a absorvância foi, pelo menos, 10 vezes maior do que a média do valor de absorvância não específica (0,01). Nessa técnica também não foram observadas reações inespecíficas com o sobrenadante das culturas lácticas testadas, sendo que, como ocorrido no Western blotting, somente as amostras de bovicina HC5 purificadas foram reconhecidas pelos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 (Figura 9). 51

68 Figura 8. Análise da especificidade dos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 por Western blotting (A). Amostras de extrato bruto de bovicina HC5 (canaleta 1, 160 μg ml -1 ), bovicina HC5 purificada e liofilizada (canaleta 2, 1200 μg ml -1 de proteína), bovicina HC5 purificada (canaleta 3, 300 μg ml -1 de proteína) e dos sobrenadantes das culturas de S. bovis HC5 (canaleta 4), S. bovis JB1 (canaleta 5), bactérias PD 4.7 (canaleta 6), ID 3.1 (canaleta 7) e ID 8.5 (canaleta 8), foram separados em gel de poliacrilamida, transferidos para membrana de nitrocelulose e sondados com o antissoro anti-bovicina HC5 diluído 200 vezes. O marcador précorado de massa molecular muito baixa é apresentado à esquerda. SDS-Tricina- PAGE com as proteínas separadas no gel antes da transferência para a membrana de nitrocelulose (B). 52

69 0,15 0,1 0,05 0 Bov HC5 (PL) Bov HC5 (P) Bov HC5 (S) JB1 (S) PD 4.7 (S) Absorvância (492 nm) ID 3.1 (S) ID 8.5 (S) Figura 9. Análise da especificidade dos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5, por ELISA indireta. Amostras de bovicina HC5 purificada e liofilizada (Bov HC5 PL), bovicina HC5 purificada (Bov HC5 P) e dos sobrenadantes das culturas de S. bovis HC5 (Bov HC5 S), S. bovis JB1 (JB1 S), bactérias PD 4.7 (PD 4.7 S), ID 3.1 (ID 3.1 S) e ID 8.5 (ID 8.5 S) foram avaliados. 53

70 4.4 Neutralização da atividade antimicrobiana de bovicina HC5 por anticorpo policlonal anti-bovicina HC5 Quando a bovicina HC5 purificada foi diluída com igual volume (15 μl) de água MilliQ estéril ou soro pré-imune, não foi observada diminuição da atividade antimicrobiana sobre o microrganismo indicador L. lactis ATCC 19435, sendo mantida a atividade em UA/mL (Figura 10A e B). Para o teste de neutralização foi utilizado o antissoro do coelho 3, que apresentou maior título de anticorpos policlonais e menor reatividade no soro préimune. O antissoro de coelho foi capaz de neutralizar aproximadamente 75 % da atividade da bovicina HC5, havendo formação de halos de inibição somente até a diluição 1:128 (5120 UA/mL) das amostras testadas (Figura 10C). 54

71 A B C Figura 10. Neutralização da atividade de bovicina HC5 pelos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 produzidos em coelho New Zealand. Diluições seriadas das amostras de bovicina HC5 foram misturadas com igual volume de água Milli Q estéril (A), soro pré-imune (B) e antissoro anti-bovicina HC5 (C). A atividade da bovicina HC5 foi determinada em meio MRS (30 μl de volume final de amostras em cada poço) inoculado com aproximadamente 10 7 UFC/mL de L. lactis ATCC As placas foram incubadas a 30 ºC, por até 24 h. 55

72 A neutralização da atividade de bovicina HC5 pelos anticorpos policlonais também foi avaliada com a diluição de 256 vezes individualmente, já que esta diluição apresentou atividade na amostra de bacteriocina purificada e misturada ao soro pré-imune, sendo completamente inibida quando em contato com o antissoro anti-bovicina HC5, não sendo possível a visualização dos halos de inibição do crescimento do microrganismo indicador L. lactis ATCC (Figura 11). Figura 11. Efeito da neutralização da atividade de bovicina HC5 diluída 1:256 pelos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 produzidos em coelho. A amostra de bacteriocina diluída foi misturada com igual volume de soro pré-imune (esquerda), água Milli Q estéril (centro) e antissoro anti-bovicina HC5 (direita). Foi utilizado o método de difusão em ágar e 30 μl de volume final em cada poço. Aproximadamente 10 7 UFC/mL do microrganismo indicador L. lactis ATCC foram inoculados em meio MRS e as placas foram incubadas a 30 ºC, por até 24 h. 4.5 Produção e quantificação de bovicina HC5 em meio basal S. bovis HC5 e S. bovis JB1 cresceram em meio basal com velocidade específica de crescimento de 1,51 h -1 e 2,27 h -1, respectivamente. S. bovis HC5 também apresentou fase lag de aproximadamente 2 h (Figura 12A), enquanto a linhagem JB1 iniciou o crescimento exponencial imediatamente após a inoculação (Figura 12B). Após 24 h de incubação, obteve-se densidade óptica de 2,49 para S. bovis HC5 e 3,56 para S. bovis JB1. 56

73 10 a A Densidade Óptica (600 nm) 1 0, Tempo (horas) 10 B Densidade Óptica (600 nm) 1 0, Tempo (horas) Figura 12. Crescimento de S. bovis HC5 (A) e S. bovis JB1 (B) em meio basal contendo glicose (16 g L -1 ) como fonte de carbono e energia. O crescimento foi monitorado pela leitura da densidade óptica a 600 nm. 57

74 A determinação de bovicina HC5 no extrato de células e no sobrenadante da cultura de S. bovis HC5 indicou que a bacteriocina começou a ser produzida durante o crescimento exponencial e aumentou quando a cultura atingiu a fase estacionária de crescimento. Pelo método de difusão em ágar, a maior atividade de bovicina HC5 foi detectada após 24 h de incubação, tanto no extrato (3200 UA/mL) como no sobrenadante da cultura (960 UA/mL) (Figura 13A). Entretanto, não foi observada tendência de estabilização da produção da bacteriocina, sendo possível haver aumento da atividade após o tempo final de amostragem utilizado nestes experimentos. Nenhuma atividade antimicrobiana contra L. lactis ATCC foi detectada nos extratos e no sobrenadante da cultura de S. bovis JB1, uma estirpe sabidamente não bacteriocinogênica utilizada como controle negativo neste experimento. Para a detecção de bovicina HC5 por método imunológico baseado em anticorpos policlonais, utilizou-se a técnica de ELISA indireta e o mesmo antissoro do coelho 3, empregado na análise de Western blotting e nos ensaios de neutralização. Como observado nos bioensaios em meio sólido, a atividade de bovicina HC5 detectada pelo ensaio de ELISA indireta no extrato de células foi maior do que aquela detectada no sobrenadante das culturas. Com o método de detecção utilizando anticorpos policlonais a presença de bovicina HC5 seguiu uma dinâmica um pouco diferente daquela da atividade de bacteriocina pelo método de difusão em ágar utilizando A. acidoterrestris DSMZ 2498 como microrganismo indicador. A bovicina HC5 começou a ser identificada no sobrenadante e no extrato da cultura de S. bovis HC5 com 2 h de crescimento (absorvância a 492 nm maior do que o dobro do valor encontrado para o tempo zero), correspondente ao início da fase exponencial de crescimento bacteriano. Os maiores valores de absorvância foram atingidos no tempo de 3 h e 15 min no extrato (região média da fase exponencial) e de 3 h no sobrenadante (início da fase exponencial de crescimento), sendo detectada diminuição das leituras de absorvância após 3,5 e 4 h de incubação, atingindo um platô a partir de 6 h de cultivo (Figura 13B). Não foi detectada reação positiva dos anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 contra proteínas do extrato e do sobrenadante de S. bovis JB1 (média de absorvância de 0,064 para o extrato de células e de 0,071 para o sobrenadante da cultura) cultivado nas mesmas condições de S. bovis HC5 (Figura 14). 58

75 Sobrenadante Extrato A Bovicina HC5 (AU/mL) (UA/mL) Tempo (horas) 0,5 0,4 Sobrenadante Extrato b a B Absorvância (492 nm) 0,3 0,2 0, ,5 3 3,2 3, Tempo (horas) Figura 13. Atividade de bovicina HC5 no extrato e no sobrenadante da cultura de S. bovis HC5 incubada por 24 h em meio basal a 39 ºC, expressa em UA/mL, medida pelo método de difusão em ágar (A) e por ELISA indireta (B). Barras abertas e fechadas representam a bovicina HC5 no sobrenadante da cultura e no extrato de células, respectivamente. 59

76 0,5 0,4 Sobrenadante Extrato Absorvância (492 nm) 0,3 0,2 0, Tempo (horas) Figura 14. Absorvância das amostras de sobrenadante da cultura e extrato de células de S. bovis JB1, incubada por 24 h em meio basal a 39 ºC, por ELISA indireta, utilizando anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 produzidos em coelho. Barras abertas e fechadas representam amostras de sobrenadante da cultura e do extrato de células, respectivamente. A detecção de bovicina HC5 pelo bioensaio e pela técnica de ELISA indireta, apresentou melhor correlação no sobrenadante da cultura de S. bovis HC5 (r 2 = 0,80533) do que no extrato de células (r 2 = 0,57755) (Figura 15A e 15B). 60

77 0,5 y = 0, , x A Absorvância (492 nm) 0,4 0,3 0,2 0,1 R 2 = 0, Bovicina HC5 (UA/mL) 0,5 y = 0, , x B Absorvância (492 nm) 0,4 0,3 0,2 0,1 R 2 = 0, Bovicina HC5 (UA/mL) Figura 15. Correlação entre os métodos de bioensaio e ELISA indireta para detecção de bovicina HC5 no sobrenadante das culturas de S. bovis HC5 (A) e no extrato de células (B). A detecção pelo bioensaio foi expressa em UA/mL e pela absorvância a 492 nm no caso de ELISA indireta. 61

78 Não foi possível a quantificação de bovicina HC5 pela técnica de ELISA sanduíche, utilizando anticorpos policlonais anti-bovicina HC5 produzidos em camundongos e coelhos, uma vez que as leituras de absorvância de todas as amostras do sobrenadante e do extrato da cultura de S. bovis HC5 em meio basal resultaram em valores muito próximos. 4.6 Efeito citotóxico de bovicina HC5 sobre células Vero A determinação da concentração máxima não tóxica de bovicina HC5 foi realizada utilizando-se método colorimétrico de redução do sal de tetrazolium (MTT). Pequena alteração da integridade celular foi observada quando células Vero foram incubadas com solução fosfato de sódio (5 mm, ph 2,0) ou acetonitrila 40 %, indicando baixo efeito citotóxico. Nestes ensaios, aproximadamente 85 % das células tratadas permaneceram viáveis quando comparadas ao tratamento controle. A adição de bovicina HC5 nas concentrações de 150 e 300 μg ml -1 (20480 UA/mL), causou redução maior que 50 % no percentual de células viáveis, sugerindo efeito citotóxico da bacteriocina em concentrações elevadas. Não foram observadas diferenças quanto ao efeito do solvente (água MilliQ estéril ou solução fosfato de sódio, 5 mm, ph 2,0) sobre o efeito tóxico da bovicina HC5 (Figura 16). Diante desses resultados, o efeito tóxico da bovicina HC5, ressuspendida em solução fosfato de sódio (5 mm, ph 2,0) e purificada em RP-HPLC, foi avaliado nas concentrações de 100 a 150 μg ml -1, com incremento de 10 μg ml -1, sendo observado efeito citotóxico nas concentrações abaixo de 120 μg ml -1. O efeito tóxico do peptídeo foi então avaliado nas concentrações de 75 a 120 μg ml -1, com incremento de 1 μg ml -1 (Figura 16). 62

79 Células Viáveis (%) Bovicina HC5 (µg/ml) Figura 16. Percentual de células Vero viáveis após tratamento com solução fosfato de sódio (5 mm, ph 2,0) ( ), acetonitrila 40 % (+), bovicina HC5 ressuspendida em água MilliQ estéril ( ) e bovicina HC5 ressuspendida em solução fosfato de sódio (5 mm, ph 2,0) ( ). As células controle (não tratadas) representam 100 % de células viáveis (x). As células foram inicialmente mantidas em câmara umidificada a 37 ºC por 48 h, sendo então adicionada bovicina HC5 em diferentes concentrações. Os resultados apresentados são médias das leituras de absorvância a 560 nm em leitor de ELISA (n = 3). Quando o efeito citotóxico da bovicina HC5 foi avaliado nas concentrações de 75 a 120 μg ml -1, observou-se que em concentrações iguais ou maiores que 90 μg de bovicina HC5 ml -1 as células Vero tratadas apresentavam modificações morfológicas, quando analisadas sob microscopia de luz (Figura 17B). Apesar disso, verificou-se que mais de 80% das células tratadas ainda permaneceram viáveis nas condições testadas. Abaixo da concentração de 90 μg ml -1, não foram observadas modificações morfológicas e cerca de 100 % das células Vero tratadas permaneceram viáveis. A concentração máxima não tóxica determinada para a bovicina HC5 foi de 100 μg ml -1, correspondente à CT 50, ou concentração necessária para reduzir a 63

80 densidade óptica em 50 %. Acima da concentração de 100 μg ml -1 foram observadas alterações na morfologia das células (como retração e vacuolização do citoplasma, condensação e lateralização do núcleo), morte e desprendimento do tapete celular (Figura 17C e D). O efeito tóxico observado com 24 h de incubação da bovicina HC5 com as células Vero se manteve quando as células foram analisadas com 36 e 48 de incubação. Após adição de MTT às células tratadas e não tratadas com bovicina HC5 foi observada redução do MTT por quase todas as células tratadas com 98 μg ml -1 de bovicina HC5, pela metade das células tratadas com 100 μg/ml e por praticamente nenhuma das células tratadas com 300 μg ml -1 de bacteriocina (Figura 18). 64

81 A B C D Figura 17. Efeito citotóxico de bovicina HC5 sobre células Vero. Células Vero controle, não tratadas com bovicina HC5 (A) e após 48 h de incubação com 98 μg ml -1 (B), 100 μg ml -1 (C) e 300 μg ml -1 de bovicina HC5 (D). Aumento de 10X. É possível a visualização de alterações morfológicas nas células (como retração e vacuolização do citoplasma, condensação e lateralização do núcleo), morte e desprendimento do tapete celular nos tratamentos com concentrações iguais ou superiores a 100 μg ml -1 de bovicina HC5. 65

82 A B C D Figura 18. Efeito citotóxico de bovicina HC5 sobre células Vero após adição de solução estoque de MTT. Células viáveis absorvem e reduzem o MTT, que adquire coloração roxa no interior das células. Células mortas não apresentam essa capacidade. Células Vero controle, não tratadas com bovicina HC5 (A), células Vero anteriormente incubadas por 48 h com 98 μg ml -1 (B), 100 μg ml -1 (C) e 300 μg ml -1 de bovicina HC5 (D), após adição de MTT às placas. Aumento de 10X. 66