UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA A importância da cutia Dasyprocta azarae como hospedeiro intermediário do carrapato-estrela Amblyomma spp. no campus da USP Ribeirão Preto, SP Vinicius Alberici Roberto Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas RIBEIRÃO PRETO SP 2013

2 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA A importância da cutia Dasyprocta azarae como hospedeiro intermediário do carrapato-estrela Amblyomma spp. no campus da USP Ribeirão Preto, SP Vinicius Alberici Roberto Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas Orientador: Dr. Carlos Alberto Perez RIBEIRÃO PRETO SP 2013

3 C'est même des hypothèses simples qu'il faut le plus se défier, parce que ce sont celles qui ont le plus de chances de passer inaperçues Jules Henri Poincaré Thermodynamique, 1892

4 Agradecimentos Ao Dr. Carlos Alberto Perez, por contribuir inigualavelmente para minha formação acadêmica, profissional e pessoal; pelos saberes comigo compartilhados, pelo respeito, reconhecimento e companheirismo, sou grato. À Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo pela bolsa de Iniciação Científica concedida. À Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, que me acolheu nos últimos cinco anos e me ofereceu incontáveis oportunidades de desenvolvimento e lembranças das mais importantes. À Prefeitura do Campus USP de Ribeirão Preto, pelo suporte dado à equipe durante a realização dos trabalhos, especialmente ao Prof. Dr. José Moacir Marin, prefeito quando os trabalhos se iniciaram; Prof. Dr. Wagner Eustáquio Paiva Avelar, vice-prefeito; Prof. Dr. Osvaldo Luiz Bezzon, atual prefeito; bem como à Alexandra Lacerda dos Santos Soares, Selma Lúcia de Carvalho, Luci Aparecida Ferreira Castrechini e Alessandra Bagatim Alves. À Seção de Transportes, pela disposição e pelo comprometimento em nos atender da melhor forma possível durante os trabalhos, em especial: Fátima Aparecida Lúcio Júlio, Maria Antônia Contart Campinas, Ahmad Sarkis Kanaan, Carlos Roberto Simão, Christovão Inácio dos Santos, José Joaquim de Araújo, José Luiz Paul Júnior, José Márcio Zanetti, Nelson Luiz de Assis, Thiago Luiz David Pereira e Zélio Carlos da Silva. À Seção de Parques e Jardins, pela colaboração, em especial: Paulo Roberto Barbosa, Dalton Aparecido Mataruco, Sérgio Donizete Rodrigues, Geraldo Avelar, José Rodrigues, Sebastião de Oliveira, Pedro da Silva, Flávio Carvalho, Paulo Ozório, José Festucci, Maurício Balatori, Geraldo Precinotto, Luiz Flávio Barucci e Helen Rosangela Forni. À Seção de Oficinas, pela confecção dos materiais utilizados nesta pesquisa. Ao Médico Veterinário Helder Tambellini, pelo apoio imprescindível na obtenção de dados e por disponibilizar o Biotério Central da USP-RP para manutenção dos animais em cativeiro.

5 Ao Dr. Hertz Figueiredo dos Santos pelo empréstimo de materiais utilizados para captura dos animais e por nos atender prontamente sempre que solicitado. Ao Me. Gilberto Sabino-Santos Jr., pelo apoio na implementação dos métodos de coleta, processamento e armazenamento de material biológico coletado em campo para posterior análise laboratorial. Aos colegas do NEC Núcleo de Estudos do Carrapato-estrela de Ribeirão Preto André Bordinassi Medina, Daiane Arruda de Almeida Dupim e Felipe Trevisan Ortiz, afinal, somos uma equipe. Aos meus pais, Edvaldo Targa Roberto e Lizete Carmem Alberici Roberto, por terem me dado toda a estrutura física e psíquica necessárias à minha caminhada; por terem sido o alicerce sobre o qual eu me construí e por serem o reflexo no qual me espelho; pela educação que me deram e pelo amor com que me criaram, sou e serei sempre grato. Ao meu irmão, Thiago Alberici Roberto, por nunca ter deixado de discutir comigo sobre a vida, o universo e tudo mais. À minha namorada, Marina Almeida Martinelli, pelo carinho, paciência e amizade; por ter preenchido a minha vida com alegria e por ter acreditado em mim quando eu mesmo não acreditava; por me amar e me deixar amá-la como eu amo. À XXT e a seus ilustres moradores, residentes ou não, que tantas vezes me receberam e fizeram desta a minha segunda casa. À 45ª turma da Biologia USP-RP, a gente tem tudo pra dar certo!

6 Lista de Abreviaturas CA: comprimento da cauda CC: comprimento cabeça-corpo DP: desvio-padrão ED: Educação Física EEFERP: Escola de Educação Física e Esporte de Ribeirão Preto ESALQ: Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz E.U.A.: Estados Unidos da América FFCLRP: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto FMB: Febre Maculosa Brasileira IC: intervalo de confiança m.a.: milhões de anos MC: massa corporal MT: Mata do Museu MUS: Música n: número de animais NEC: Núcleo de Estudos do Carrapato-estrela de Ribeirão Preto O: comprimento da orelha interna PCARP: Prefeitura do campus de Ribeirão Preto PÉ: comprimento da pata posterior com unha USP-RP: Universidade de São Paulo Ribeirão Preto UTM: Universal Transversa de Mercator

7 Lista de Figuras Figura 1. Distribuição conhecida de Amblyomma cajennense nas regiões Neártica e Neotropical, baseada em revisão literária e de coleções da Argentina e do Brasil. Os registros na América do Norte incluem E.U.A. (Texas e Flórida) e México; na América Central incluem Belize, Nicarágua, Guatemala, Costa Rica, Panamá, El Salvador, Honduras, Cuba, Jamaica, Trinidad e Tobago e outras Pequenas Antilhas; na América do Sul incluem Colômbia, Venezuela, Guiana, Suriname, Guiana Francesa, Peru, Bolívia, Brasil, Paraguai e Argentina. Os registros com pontos mais claros no mapa (Uruguai e sul do Brasil) são apontados como identificações errôneas. Adaptado de Estrada-Peña et al. (2004) Figura 2. Distribuição conhecida de Amblyomma dubitatum na América do Sul (pontos escuros). Os números representam províncias biogeográficas definidas por Morrone (2006): (15) Amapa; (21) Pantanal; (24) Cerrado; (25) Chaco; (26) Pampa; (28) Brazilian Atlantic Forest; (29) Parana Forest; (30) Araucaria angustifolia Forest. Adaptado de Nava et al. (2010) Figura 3. Dinâmica sazonal de Amblyomma cajennense de vida livre no sudeste brasileiro. Notar o maior número de formas imaturas (larvas e ninfas) na estação seca (abril a setembro) e o maior número de adultos na estação chuvosa (outubro a março). Fonte: Labruna (2000) Figura 4. Imagem de satélite do campus da USP de Ribeirão Preto. Fonte: Google Earth (2012) Figura 5. Armadilha do tipo Tomahawk, iscada com atrativo alimentar e armada em local de captura, no campus da USP - Ribeirão Preto Figura 6. Localização das armadilhas do tipo Tomahawk utilizadas na captura de indivíduos da espécie D. azarae no campus da USP Ribeirão Preto. ED = Educação Física, MUS = Música, MT = Mata do Museu. Fonte: Google Earth (2012) Figura 7. Procedimentos realizados em Biotério com os animais capturados da espécie Dasyprocta azarae no campus da USP-RP. A) Contenção manual do animal realizada dentro da gaiola metálica com o auxílio de uma tábua de madeira; B) Manipulação do animal após aplicação do anestésico, com a utilização de luvas de raspa de couro; C) Marcação do animal com brinco de identificação numerado na orelha direita, com o auxílio de um alicate apropriado; D) Retirada de 1ml de sangue do animal, por punção cardíaca. Data das fotografias: A) 04/06/2012; B) 01/06/2012; C) 11/12/2012; D) 04/06/ Figura 8. Manutenção dos animais no Biotério Central. A) Gaiola metálica coberta com pano preto para evitar o estresse do animal; B) Bandeja removível contendo maravalha para acomodar os carrapatos que se desprendem naturalmente após o ingurgitamento e fita adesiva nas laterais para impedir sua fuga; C) Cutia dentro de gaiola contendo frutos e vasilhames com água; D) Cutia sendo liberada no mesmo local de captura, após uma semana em biotério. Data das fotografias: A) 01/06/2012; B) 05/12/2012; C) 04/06/2012; D) 06/06/

8 Figura 9. A) Carrapatos acondicionados em Eppendorf com chumaço de algodão umedecido com água; B) Estufa com temperatura e umidades medidas por higrômetro digital. Laboratório do Núcleo de Estudos do Carrapato-estrela de Ribeirão Preto... 39

9 Lista de Tabelas Tabela 1. Classificação dos hospedeiros e sua relação com os parasitas. Adaptado de Croll (1968) Tabela 2. Especificidade carrapato-hospedeiro. Adaptado de Hoogstraal e Aeschlimann (1982) Tabela 3. Parasitismo por Amblyomma cajennense em espécies de animais domésticos e silvestres (nomes populares). Adaptado de Rohr (1909), Robinson (1926) e Aragão (1936) Tabela 4. Coordenadas geográficas (UTM) dos pontos de instalação das armadilhas do tipo Tomahawk utilizadas na captura de indivíduos da espécie Dasyprocta azarae (cutia) no campus da USP Ribeirão Preto. ED = Educação Física, MUS = Música, MT = Mata do Museu, EEFERP = Escola de Educação Física e Esportes de Ribeirão Preto, FFCLRP = Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto Tabela 5. Data e local de captura de cada indivíduo da espécie Dasyprocta azarae no campus da USP-RP, de janeiro de 2012 a janeiro de Grupo A = coletas realizadas no período de larvas do carrapato-estrela; Grupo B = coletas realizadas no término do período de ninfas do carrapato-estrela, Grupo C = coletas realizadas o período de adultos do carrapato-estrela Tabela 6. Dados biométricos dos animais capturados da espécie D. azarae. CC - Comprimento cabeça-corpo, CA comprimento da cauda. PÉ - comprimento da pata posterior com unha, O - comprimento da orelha interna, MC Massa corporal, DP desvio-padrão; n número de animais amostrados; IC intervalo de confiança Tabela 7. Número de carrapatos (larvas, ninfas e adultos) por cutia capturada no campus da USP-RP Tabela 8. Índices de infestação por larvas de carrapatos-estrela (Amblyomma spp.) em cutias (D. azarae) capturadas no campus da USP-RP, segundo Margolis et al., 1982 e Bush et al., n número de indivíduos Tabela 9. Índices de infestação por ninfas de carrapatos-estrela (Amblyomma spp.) em cutias (D. a azarae) capturadas no campus da USP-RP, segundo Margolis et al., 1982 e Bush et al., n número de indivíduos Tabela 10. Índices de infestação por estádios imaturos (larvas e ninfas) de carrapatosestrela (Amblyomma spp.) em cutias (D. azarae) capturadas no campus da USP-RP, segundo Margolis et al., 1982 e Bush et al., n número de indivíduos Tabela 11. Larvas e ninfas identificadas, após ecdise, para cada animal capturado

10 Tabela 12. Dados biométricos dos animais capturados da espécie D. azarae e comparação com os obtidos por Iack-Ximenes (1999). CC - Comprimento cabeçacorpo, CA comprimento da cauda. PÉ - comprimento da pata posterior com unha, O - comprimento da orelha interna, MC Massa corporal, n = número de animais amostrados

11 Sumário Resumo Introdução Revisão Bibliográfica Caracterização geral dos carrapatos Biologia do carrapato-estrela Amblyomma spp Distribuição geográfica de A. cajennense e A. dubitatum Dinâmica sazonal de A. cajennense e A. dubitatum Especificidade parasitária Amblyomma cajennense e seus hospedeiros Amblyomma dubitatum e seus hospedeiros Biologia do gênero Dasyprocta Illiger, Parasitismo em Dasyprocta Illiger, Hospedeiros reservatórios e amplificadores de R. rickettsii Objetivos Objetivo geral Objetivos específicos Material e Métodos Caracterização da área de estudo Delineamento amostral Captura dos animais Contenção química e biometria Manutenção em biotério e soltura dos animais Identificação dos ectoparasitos Análise dos dados Resultados Captura e biometria Prevalência, intensidade e abundância de parasitismo por Amblyomma spp Identificação das espécies de Amblyomma spp Discussão Conclusões Referências Bibliográficas... 58

12 Resumo Este estudo teve como objetivo identificar o potencial de parasitismo de Amblyomma spp. (carrapatos-estrela) em indivíduos da espécie Dasyprocta azarae (cutia) no campus da Universidade de São Paulo de Ribeirão Preto. Entre os meses de janeiro de 2012 e janeiro de 2013 foram realizadas coletas acompanhando a sazonalidade do carrapatoestrela. Os animais capturados foram mantidos em biotério e os seus carrapatos contados e identificados. Foram avaliadas a prevalência, intensidade média, intensidade máxima e abundância média de infestação por Amblyomma spp. Todos os indivíduos capturados (n=12) apresentaram-se parasitados por estádios imaturos de Amblyomma spp, totalizando 1690 larvas e 665 ninfas de carrapatos-estrela. A prevalência de infestação de 100% sugere forte relação entre o ambiente ocupado pelas cutias e pelos carrapatos. A intensidade e abundância médias de infestação foram 234,80 ± 256,01, com intensidade máxima de 707 carrapatos em um único animal. Foram encontradas apenas formas imaturas (larvas e ninfas) de carrapatos, o que corrobora a hipótese da espécie de cutia estudada ser hospedeira secundária de Ambylomma cajennense, espécie que representou a maior porcentagem de parasitismo (99,14%), quando comparada a Amblyomma dubitatum (0,86%). A relação de parasitismo entre o carrapato-estrela e as cutias pode ser um indicativo de desequilíbrio ambiental no campus da USP-RP. Palavras-chave: parasitologia, carrapato-estrela, Amblyomma, cutia, Dasyprocta azarae, hospedeiro secundário. 1

13 1. Introdução Parasitas estão presentes em quaisquer populações naturais e são essenciais ao equilíbrio de suas comunidades (CROLL, 1968). Carrapatos são ectoparasitas que dependem da presença de uma ou mais espécies de vertebrados para se estabelecer em um ecossistema, mas apenas a presença dos hospedeiros não é suficiente, pois fatores abióticos determinam sua sobrevivência e desenvolvimento no ambiente (ESTRADA- PEÑA et al., 2004). Mudanças ambientais podem afetar populações de hospedeiros e parasitas, criando novas relações de parasitismo ou alterando e até extinguindo relações já existentes; desta forma, o estudo da fauna de ectoparasitos de uma região pode indicar modificações no ambiente em uma escala temporal (LABRUNA et al., 2002b). Um dos efeitos mais significativos da fragmentação e degradação de ambientes naturais é a alteração na composição da fauna ao longo do tempo; enquanto algumas espécies são extintas localmente, outras colonizam o fragmento e passam a fazer parte de sua biota (JORDANO et al., 2006), pois as espécies afetadas podem responder de diferentes maneiras à fragmentação (ROBINSON et al., 1992). Fatores como a homogeneização da oferta de alimentos e de habitat são geralmente negativos para a fauna, causando declínio de suas populações; contrariamente, algumas alterações podem levar ao favorecimento de determinadas espécies: a substituição de ambientes naturais por paisagens agropastoris pode favorecer o aumento populacional de espécies sinantrópicas com alta capacidade reprodutiva, pouca exigência quanto ao habitat e de dieta generalista como as capivaras e os gambás (PINTO, 2003; FERRAZ et al., 2006). A capivara, Hydrochoerus hydrochaeris (Linnaeus, 1766), por exemplo, expandiu sua presença em muitas áreas naturais antropizadas, provavelmente devido a algumas de suas características, como o curto período de gestação, fácil adaptação em habitats alterados e dieta generalista, além da ausência de predadores naturais e da proibição de caça (QUEIROGAS, 2010). O mesmo autor afirma que as modificações ambientais de origem antrópica beneficiaram não apenas os animais capazes de se adaptar a áreas modificadas, mas também seus parasitos. No interior do estado de São Paulo, capivaras são abundantes em áreas endêmicas para a Febre Maculosa Brasileira (FMB), uma doença transmitida ao homem pela picada de carrapatos do gênero Amblyomma (Acari: Ixodidae), notadamente Amblyomma cajennense Fabricius, 1787, 2

14 espécie conhecida popularmente por carrapato-estrela e vetor da Rickettsia rickettsii (Wolbach, 1919), a bactéria causadora da FMB. É crescente a preocupação com doenças emergentes que surgem a partir do contato entre a vida selvagem, os animais domésticos e o homem (LAFFERTY, 1997). Carrapatos são reconhecidamente transmissores de agentes biológicos (e.g. vírus, bactérias e protozoários) e para entender a ecologia das zoonoses por eles transmitidas é necessário investigar a interação entre patógenos, vetores e hospedeiros (PAULASKAS et al., 2009). Entretanto, segundo Bossi et al. (2002), a maioria dos estudos sobre ectoparasitas incluem inventários, descrições taxonômicas e relatos de associações entre parasitas e seus hospedeiros, mas poucos avaliam as interações sob uma abordagem ecológica. As infestações de carrapatos-estrela em dois campi da Universidade de São Paulo, na ESALQ em Piracicaba e, mais recentemente, em Ribeirão Preto, são exemplos de desequilíbrios ambientais resultantes dos processos supracitados, decorrentes da atividade humana. O município de Ribeirão Preto, particularmente, sofreu grande alteração em sua paisagem natural, marcada pela degradação e fragmentação das áreas florestais, notadamente devido aos ciclos econômicos do café e da cana-de-açúcar no século passado e, mais recentemente, à expansão urbana (KOTCHETKOFF- HENRIQUES, 2003). Como relata Perez (2007), a partir da realização do diagnóstico ambiental do campus Luiz de Queiroz foi possível identificar um conjunto de indicadores que classificam determinadas áreas como de alto risco para infestação pelo carrapato-estrela, tais como: histórico de reclamações de picadas de carrapatos pelos frequentadores do campus; proximidade de locais de pesquisa e trabalho a matas ciliares; corpos d água e alimento em abundância para os hospedeiros e relatos de observação de capivaras e gambás. Dessa forma, verifica-se que o campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo encontra-se em uma área propícia para a proliferação do carrapato-estrela, pois atende às características acima citadas, conforme corroborado por Ortiz (2012). Visando prevenir problemas de saúde pública, faz-se necessário identificar os hospedeiros primários e secundários do carrapato-estrela em áreas endêmicas para FMB, visto que eles podem ser utilizados como indicadores biológicos dos níveis de infestação no ambiente (PEREZ, 2008). Este estudo foi realizado com o objetivo de 3

15 identificar a importância da espécie Dasyprocta azarae Lichtenstein, 1823 (cutia) na manutenção do ciclo de vida do carrapato-estrela e na dispersão de seus estádios imaturos no ambiente. As informações obtidas poderão elucidar o papel das cutias na epidemiologia da FMB e os impactos das modificações ambientais nas relações estabelecidas entre a comunidade de mamíferos hospedeiros e o carrapato-estrela no campus da USP-RP. 4

16 2. Revisão Bibliográfica 2.1. Caracterização geral dos carrapatos Carrapatos são artrópodes ectoparasitas que se alimentam, em todas as fases pósembrionárias, de sangue, linfa e/ou restos tissulares presentes na pele de animais vertebrados (VIEIRA et al., 2004). Apresentam características morfológicas distintas, como a presença de hipostômio e quelíceras denticulados, órgão de Haller e placas espiraculares (BARROS-BATTESTI et al., 2006). São de grande importância médicoveterinária, por serem vetores de arbovírus, bactérias e protozoários (BAKER, 1999), além de causarem injúrias aos hospedeiros pela introdução de toxinas, e por poderem provocar irritação e infecção nos locais em que se fixam (FLECHTMANN, 1975). São ácaros incapazes de locomoção a grandes distâncias, mas podem ser transportados por seus hospedeiros, o que, aliado a elevadas taxas reprodutivas, os torna organismos com alta capacidade de dispersão nos mais variados ambientes (RHOR, 1909). A revisão mais recente da sistemática dos carrapatos foi realizada por Guglielmone et al. (2010). Segundo estes autores, são reconhecidas atualmente 896 espécies de carrapatos, divididas em três famílias: Argasidae (193 spp.), Ixodidae (702 spp.) e Nuttalliellidae (1 spp.). No Brasil, existem 61 espécies de carrapatos, sobretudo da família Ixodidae, representada na região Neotropical pelos gêneros Amblyomma, Dermacentor, Haemaphysalis, Ixodes e Rhipicephalus (BARROS-BATTESTI et al., 2006). Segundo Nava et al. (2009), a origem dos carrapatos é incerta, devido à escassez de registros fósseis, os mais antigos datando do retáceo m dio m a. As hipóteses correntes na literatura baseiam-se em evidências (morfológicas, ecológicas e biogeográficas) obtidas a partir das espécies atuais, variando entre os períodos Paleozóico superior e Mesozóico inferior 3 a 2 m a, embora alguns autores sugiram origens mais remotas, no Devoniano (OLIVER, 1989), ou mais recentes, no Cretáceo (KLOMPEN et al., 1996). Mans et al. (2011) encontraram indivíduos da espécie Nuttalliella namaqua Bedford, 1931, única representante da família Nuttalliellidae, na África do Sul; dada à posição basal desta família em relação às demais, eles sugerem que as linhagens ancestrais de carrapatos originaram-se na região, antiga Gondwana, no Permiano médio ( m.a.), como parasitas de terapsídeos (ancestrais de mamíferos). De acordo com os autores, a diversificação de vertebrados e 5

17 diápsidos após o evento de extinção em massa do Permo-Triássico (251 m.a.) ocorreu paralelamente aos eventos de especiação que originaram a maioria das espécies de carrapatos. A caracterização dos carrapatos ixodídeos aqui apresentada baseia-se em Barros-Battesti et al. (2006): os indivíduos da família Ixodidae apresentam um ciclo de vida constituído por um estádio inativo (ovo) e três estádios móveis e hematófagos (larva, ninfa e adulto). As larvas são hexápodes e as ninfas e os adultos são octópodes, sendo facilmente distinguíveis pelo tamanho. Os machos possuem um escudo esclerotizado que cobre toda a região dorsal, razão pela qual os ixodídeos são chamados de carrapatos duros, diferentemente dos argasídeos, que por não possuírem escudo são chamados de carrapatos moles Os ixodídeos alimentam-se durante vários dias sobre o hospedeiro, período denominado de repasto sanguíneo, após o qual descem ao solo e sofrem a ecdise. A maioria das espécies de carrapatos ixodídeos é trioxena, pois completa o ciclo de vida em três hospedeiros, não necessariamente da mesma espécie. Após a cópula e repasto, a fêmea desce do hospedeiro e põe milhares de ovos no solo, morrendo em seguida, enquanto o macho permanece no hospedeiro e copula com várias fêmeas. 6

18 2.2. Biologia do carrapato-estrela Amblyomma spp. O gênero Amblyomma Koch, 1844 possui 130 espécies válidas (GUGLIELMONE et al., 2010), sendo que 45 espécies são endêmicas da região Neotropical (VOLTZIT, 2007) e 33 ocorrem no Brasil (BARROS-BATTESTI et al., 2006), constituindo assim o gênero com maior número de espécies de carrapato no país. Pela ornamentação característica dos machos, as espécies do gênero Amblyomma são comumente chamadas de carrapatos-estrela, sendo que os mais frequentemente encontrados no interior do estado de São Paulo são Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) e Amblyomma dubitatum Neumann, Segundo Guglielmone et al. (2010), Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) é a espécie tipo do gênero Amblyomma Koch, 1844, embora os autores comentem sobre a hipótese de que ela comporte um complexo de espécies crípticas 1. A espécie A. dubitatum Neumann, 1899 é frequentemente citada como seu sinônimo-júnior, Amblyomma cooperi Nuttall and Warburton, A. cajennense é considerada de grande relevância para a saúde pública no Brasil, por ser importante vetor da bactéria R. rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa Brasileira (FMB) (HORTA et al., 2009), enquanto A. dubitatum parece desempenhar um papel secundário na epidemiologia da FMB, tendo sido isolada, a partir de um exemplar desta espécie parasitando capivaras, uma riquétsia do grupo da febre maculosa numa área endêmica para FMB em Pedreira, SP (LEMOS et al., 1996). Além disso, A. dubitatum é um potencial vetor de Rickettsia parkeri e Rickettsia bellii em áreas endêmicas para FMB (LABRUNA et al., 2004) e recentemente foi relatado o parasitismo de imaturos e adultos dessa espécie no homem (LABRUNA et al., 2007). A espécie A. cajennense é notadamente mais abordada na literatura e será tratada aqui com maiores detalhes. Seu ciclo de vida pode ser resumido da seguinte maneira, de acordo com os trabalhos de Rohr (1909) e Guglielmone et al. (2006): Em geral, são necessários 30 a 40 dias de incubação dos ovos em temperatura ambiente para o início da eclosão das larvas, que se estende por cerca de 20 dias; temperaturas extremas (0ºC e 30ºC) estão fora da faixa ideal de incubação dos ovos. As larvas apresentam uma cor pardo-amarelada e formam aglomerados em pontas de capim 1 Espécies crípticas podem ser definidas como populações naturais reprodutivamente isoladas, mas morfologicamente semelhantes ou idênticas (MAYR, 1977) 7

19 e gravetos à espera de hospedeiros; quando um animal toca o local a maioria sobe e, após 3 a 7 dias de repasto sanguíneo, as larvas se desprendem e abrigam-se no solo dos ambientes visitados pelo hospedeiro, onde ocorre a ecdise, que pode levar de 4 a 8 semanas. Após a mesma as ninfas sobem em um novo hospedeiro, no qual se alimentam por 5 a 7 dias, retornando ao solo após o repasto e sofrendo nova ecdise, podendo demorar de 4 a 8 semanas até que se tornem adultos. Os adultos sobem em um novo hospedeiro após o endurecimento da cutícula e a cópula ocorre sobre o hospedeiro. As fêmeas alimentam-se por 7 a 10 dias, em um processo denominado ingurgitamento, e ao desprenderem-se do hospedeiro elas descem ao solo e põem mais de ovos, durante aproximadamente 25 dias. Alguns dias após o término da oviposição a fêmea morre, enquanto os machos podem permanecer no hospedeiro por várias semanas, podendo copular com outras fêmeas. Rechav et al. (1997) relatam que os machos de A. cajennense produzem um feromônio de agregação enquanto se alimentam, capaz de atrair ninfas e adultos de ambos os sexos, o que torna o hospedeiro mais atrativo para outros carrapatos da mesma espécie, podendo assim favorecer o sucesso reprodutivo dos machos. 8

20 Distribuição geográfica de A. cajennense e A. dubitatum Estrada-Peña et al. (2004) revisaram 1277 registros de ocorrência de A. cajennense nas regiões Neártica e Neotropical, a partir de dados publicados na literatura e de coleções da Argentina e do Brasil, com base nos quais propuseram um novo mapa de distribuição geográfica para a espécie (Figura 1). Segundo os autores, a distribuição de A. cajennense nas Américas parece limitar-se ao norte (27ºN) e ao sul (29ºS), sobretudo devido a baixas temperaturas e diferentes padrões sazonais de precipitação. No Brasil, a maioria dos registros do carrapato-estrela provém de zonas com temperaturas médias anuais de 20ºC (18-26ºC); as baixas temperaturas restringem o estabelecimento de populações no sul do país. Semelhante distribuição foi encontrada por Labruna et al. (2005); os autores revisaram o parasitismo por Amblyomma spp. em Carnivora e elaboraram um mapa de distribuição geográfica, de acordo com os biomas brasileiros, para cinco espécies do gênero Amblyomma ovale, Amblyomma tigrinum, Amblyomma aureolatum, Amblyomma parvum e Amblyomma cajennense. A espécie A. cajennense teve a maioria dos registros nos biomas da região central do país, Cerrado e Pantanal, mas também em alguns trechos degradados de Floresta Atlântica. Nava et al. (2010) revisaram os registros de ocorrência de A. dubitatum com base em dados publicados na literatura e coleções na Argentina, Brasil e Uruguai, resultando em um mapa de distribuição da espécie nas províncias biogeográficas da América do Sul, definidas por Morrone (2006) (Figura 2). A espécie apresenta a maioria dos registros no nordeste da Argentina, sudeste do Brasil, leste do Paraguai e parte do norte do Uruguai, notadamente nas províncias Pampa, Chaco, Cerrado, Floresta Atlântica e Floresta de Araucárias. Os autores apontam ainda que a distribuição de A. dubitatum é mais restrita do que a de seu principal hospedeiro, a capivara (H. hydrochaeris), o que sugere que fatores ambientais (e.g. clima e vegetação), além da presença de hospedeiros, influenciam na distribuição geográfica desse ácaro, tal como verificado para três outras espécies do gênero, entre elas A. cajennense (ESTRADA- PEÑA et al., 2004). 9

21 Figura 1. Distribuição conhecida de Amblyomma cajennense nas regiões Neártica e Neotropical, baseada em revisão literária e de coleções da Argentina e do Brasil. Os registros na América do Norte incluem E.U.A. (Texas e Flórida) e México; na América Central incluem Belize, Nicarágua, Guatemala, Costa Rica, Panamá, El Salvador, Honduras, Cuba, Jamaica, Trinidad e Tobago e outras Pequenas Antilhas; na América do Sul incluem Colômbia, Venezuela, Guiana, Suriname, Guiana Francesa, Peru, Bolívia, Brasil, Paraguai e Argentina. Os registros com pontos mais claros no mapa (Uruguai e sul do Brasil) são apontados como identificações errôneas. Adaptado de Estrada-Peña et al. (2004). 10

22 Figura 2. Distribuição conhecida de Amblyomma dubitatum na América do Sul (pontos escuros). Os números representam províncias biogeográficas definidas por Morrone (2006): (15) Amapa; (21) Pantanal; (24) Cerrado; (25) Chaco; (26) Pampa; (28) Brazilian Atlantic Forest; (29) Parana Forest; (30) Araucaria angustifolia Forest. Adaptado de Nava et al. (2010). 11

23 Dinâmica sazonal de A. cajennense e A. dubitatum A hipótese de que certas estações do ano sejam especialmente favoráveis a determinados estádios do carrapato-estrela vem sendo discutida na literatura há décadas. Aragão (1936) notou que nas estações secas e frias o carrapato-estrela A. cajennense tornava-se praga no Brasil, sobretudo suas formas imaturas (larvas e ninfas). Recentemente, diversos estudos sobre a dinâmica sazonal desta espécie foram realizados no Rio de Janeiro (SERRA-FREIRE, 1982 apud OLIVEIRA et al., 2000), em Minas Gerais (OLIVEIRA et al., 2000) e em São Paulo (LABRUNA, 2000; LABRUNA et al., 2002a) e demonstraram que os estádios de vida-livre de A. cajennense apresentam uma geração por ano, com predominância de imaturos (larvas e ninfas) nas estações secas e frias (outono/inverno) e de adultos nas estações quentes e chuvosas (primavera/verão) (Figura 3). Figura 3. Dinâmica sazonal de Amblyomma cajennense de vida livre no sudeste brasileiro. Notar o maior número de formas imaturas (larvas e ninfas) na estação seca (abril a setembro) e o maior número de adultos na estação chuvosa (outubro a março). Fonte: Labruna (2000). Labruna et al., 2003 atribuíram este padrão sazonal à diapausa comportamental 2 das larvas no período que antecede o início da estação seca, garantindo assim que os adultos entrem em atividade durante o período quente e chuvoso, com condições climáticas favoráveis à postura e incubação dos ovos e ao desenvolvimento da cobertura 2 Diapausa comportamental pode ser definida como ausência de comportamento de busca por hospedeiros (BELOZEROV, 1982 apud LABRUNA et al., 2003). 12

24 vegetal, que protege ovos e larvas da dessecação. Segundo os autores, é provável que o início e o término da diapausa sejam controlados, respectivamente, pela maior ou menor incidência solar diária, como já demonstrado para insetos (NETO et al., 1976). Os estudos realizados por Souza et al. (2006) em São Paulo e Guedes e Leite (2008) em Minas Gerais sugerem diferenças entre a dinâmica sazonal de A. cajennense e de A. dubitatum. Adultos desta espécie tiveram aumento populacional a partir de agosto, antes do relatado na literatura para A. cajennense, com declínio a partir de março-abril. Quanto aos estádios imaturos, observou-se a presença de larvas e ninfas entre outubro e março, período em que as larvas de A. cajennense encontram-se, em princípio, em diapausa comportamental, o que levou os autores a considerarem tais imaturos como pertencentes à espécie A. dubitatum. Embora estes estudos tenham mostrado resultados que indicam um padrão sazonal diferenciado para as duas espécies, com prolongamento da disponibilidade de estádios de A. dubitatum em relação à população de A. cajennense, não foram encontradas formas imaturas em alguns períodos do ano, o que poderia sugerir a ocorrência de diapausa comportamental em larvas não alimentadas para as duas espécies de carrapatos estudadas. 13

25 Especificidade parasitária Rohr (1909) classificou os hospedeiros de ixodídeos como habituais e acidentais, justificando essa divisão como uma maneira de mostrar que os nomes comumente dados aos carrapatos (e.g. carrapato de boi, carrapato de cão, carrapato de coelho) constituem designações impróprias; para o autor, hospedeiro habitual é a espécie frequentemente parasitada pelo carrapato, enquanto o acidental é o hospedeiro parasitado quando o carrapato não encontra seu hospedeiro habitual, devido às condições ambientais. Croll (1968) classificou os hospedeiros em quatro categorias: definitivos (primários), intermediários (secundários), paratênicos e vetores (Tabela 1). Hospedeiros paratênicos, embora sejam parasitados por formas infestantes (imaturas), tornando-as disponíveis para hospedeiros definitivos (primários), não devem ser confundidos com hospedeiros intermediários (secundários), pois nestes há desenvolvimento do parasita, sendo, portanto, essenciais ao seu ciclo de vida. Tabela 1. Classificação dos hospedeiros e sua relação com os parasitas. Adaptado de Croll (1968). Hospedeiro Estádio do parasita Necessidade Papel no ciclo de vida Definitivo (primário) Adulto Essencial Desenvolvimento e maturação sexual Intermediário (secundário) Imaturo Essencial Desenvolvimento e transmissão Paratênico Imaturo Ecológica Ecológico Vetor Imaturo Essencial Transmissão Para que ocorra o estabelecimento de uma população de carrapatos trioxenos em um determinado ambiente é necessária tanto a presença dos hospedeiros primários, que satisfazem as condições necessárias para a reprodução dos indivíduos adultos, quanto a dos hospedeiros secundários, preferencialmente parasitados por formas imaturas (BARROS-BATTESTI et al., 2006). Aragão (1936) notou que algumas espécies do gênero Amblyomma apresentavam um parasitismo muito disseminado ou um ecletismo no parasitismo das fases imaturas, enquanto outras espécies parasitavam, especialmente durante a fase adulta, grupos restritos de animais. O autor apontou também que nos animais parasitados por 14

26 carrapatos existe predominância de determinada fase do desenvolvimento (larva, ninfa ou adulto) sobre as demais, denominando este fenômeno como predileção parasitária e atribuindo-a à época do ano e à biologia do carrapato. Hoogstraal e Aeschlimann (1982) definem especificidade parasita-hospedeiro como uma associação entre uma espécie de carrapato e outra de vertebrado (ou grupo de espécies de vertebrados), que seja essencial para a reprodução e sobrevivência das populações do carrapato. Segundo os autores, vertebrados que apresentam comportamentos gregários e associados a locais de descanso e reprodução são geralmente parasitados por carrapatos com maior grau de especificidade, enquanto vertebrados errantes, com grandes áreas de vida e baixas densidades populacionais são em geral parasitados por carrapatos com médio a baixo grau de especificidade. Foram definidas seis categorias de especificidade parasitária, variando de estritamente específica a generalista (Tabela 2). Segundo Croll (1968), o grau de especificidade de um parasita é diretamente proporcional às suas demandas fisiológicas, de tal maneira que estas devem ser supridas pelo hospedeiro. Baer (1951), entretanto, afirma que a ausência de parasitismo por determinada espécie pode ter causas ecológicas, pelo simples fato do hospedeiro não ter entrado em contato com estádios infestantes; o autor defende o uso criterioso da expressão imunidade natural, já que um hospedeiro não infestado não necessariamente possui anticorpos que o protejam de determinado parasita, podendo ser parasitado ao entrar em contato com este. Gaafar et al. (1985) vê a baixa especificidade de parasitismo das formas imaturas como uma vantagem evolutiva, que confere às formas infestantes a capacidade de completarem seu desenvolvimento em mais de um hospedeiro. 15

27 Tabela 2. Especificidade carrapato-hospedeiro. Adaptado de Hoogstraal e Aeschlimann (1982). CATEGORIAS DE ESPECIFICIDADE Total-Estrita (Strict-Total) Adultos e imaturos (larvas e ninfas) são estritamente específicos para um grupo limitado de hospedeiros. Total-Moderada (Moderate-Total) Adultos e imaturos (larvas e ninfas) são estritamente específicos para um grupo não tão limitado de hospedeiros (dados disponíveis são frequentemente imprecisos). Estágio-Estágio-Estrita (Strict-Stage-Stage) Adultos e imaturos são isoladamente específicos para diferentes grupos limitados de hospedeiros. TAXA ARGASIDAE Todos os gêneros IXODIDAE Aponomma e Boophilus 3, Margaropus ARGASIDAE Ornithodoros IXODIDAE Ixodes, Amblyomma, Rhipicephalus IXODIDAE Ixodes, Amblyomma, Hyalomma, Dermacentor, Nosomma, Rhipicephalus Estágio-Estágio-Estrita/Moderada (Strict-Moderate-Stage-Stage) a) Adultos são estritamente específicos para determinado grupo de hospedeiros; imaturos são moderadamente específicos para um grupo diferente de hospedeiros. b) Imaturos são estritamente específicos para determinado grupo de hospedeiros; adultos são moderadamente específicos para um grupo diferente de hospedeiros. IXODIDAE Estágio-Estágio-Moderada (Moderate-Stage-Stage) Adultos e imaturos são moderadamente específicos para diferentes grupos limitados de hospedeiros. IXODIDAE Indeterminada (Nonparticular) Adultos e imaturos são generalistas quanto aos hospedeiros. IXODIDAE 3 Trabalhos taxonômicos recentes não consideram estes gêneros válidos. Algumas espécies do gênero Aponomma foram posicionadas em Bothriocroton e as demais no gênero Amblyomma. Já o gênero Boophilus foi classificado como sinônimo de Rhipicephalus (Guglielmone et al., 2010). 16

28 Ainda de acordo com Hoogstraal e Aeschlimann (1982), a maioria dos carrapatos ixodídeos apresenta certo grau de especificidade; embora o gênero Amblyomma seja classificado como de especificidade total-moderada e estágio-estágioestrita, A. cajennense pertence à categoria indeterminada, ou seja, é pouco específico. Lopes et al. (1998) analisou a especificidade de A. cajennense em seis diferentes espécies de animais domésticos coelho (Oryctolagus cuniculus), rato (Rattus norvegicus), galinha (Gallus gallus domesticus), pato (Anas platyrhynchus), codorna (Coturnix coturnix) e pomba (Streptopelia decorata). Cada potencial hospedeiro foi infestado com uma carga de larvas (n=500), ninfas (n=150) ou adultos (cinco machos, cinco fêmeas), de modo que para cada espécie doméstica houvesse animais infestados com apenas uma das fases de desenvolvimento dos carrapatos. Os coelhos apresentaram as maiores intensidades de parasitismo por larvas e ninfas, mas apenas cinco fêmeas parcialmente ingurgitadas foram obtidas de dois desses animais; destas, apenas duas produziram ovos, não viáveis. O estudo demonstrou que A. cajennense apresenta menor especificidade nos estádios imaturos, sobretudo nas larvas, e que nenhuma das espécies domésticas analisadas é capaz de sustentar o ciclo de vida do carrapato-estrela, embora possam ser importantes na dispersão de larvas e ninfas em áreas infestadas. A baixa especificidade dos estádios imaturos de A. cajennense, embora necessite ser confirmada em mais estudos, pode ser uma explicação do alto potencial de sobrevivência e da vasta distribuição geográfica da espécie, condizendo com resultados de diversos estudos que apontam o carrapato-estrela como a espécie mais encontrada sob a forma de vida-livre no ambiente (CANÇADO, 2008; PEREZ, 2007; OGRZEWALSKA, 2009), oferecendo os maiores riscos de disseminação de patógenos, tanto para animais domésticos quanto para o homem. 17

29 Amblyomma cajennense e seus hospedeiros O primeiro registro sistematizado na literatura sobre os hospedeiros dos carrapatos ixodídeos no Brasil foi realizado por Rohr (1909). Segundo o autor, os mamíferos são os vertebrados mais frequentemente parasitados pelos ixodídeos, seguidos pelas aves, os r pteis e raramente os anfíbios Dentre as ordens de mamíferos conhecidas, apenas cetáceos e pinípedes não apresentam registro de parasitismo por carrapatos. Os hospedeiros registrados por Rohr (1909) para A. cajennense incluem tanto animais domésticos como silvestres, além do homem. Robinson (1926) e Aragão (1936) confirmam o amplo parasitismo de A. cajennense, acrescentando outros registros (Tabela 3). Tabela 3. Parasitismo por Amblyomma cajennense em espécies de animais domésticos e silvestres (nomes populares). Adaptado de Rohr (1909), Robinson (1926) e Aragão (1936). Domésticos Hospedeiros de Amblyomma cajennense Silvestres Rohr (1909) cavalo, boi, cão, porco, carneiro, cabra, coelho veado, porco-do-mato, cachorro do mato, anta, capivara, cutia, tamanduá-bandeira, quati, tatu Robinson (1926) cavalo, boi, cão, porco, carneiro, coelho veado, cateto, cachorro do mato, anta, capivara, tamanduá-bandeira, tamanduá-mirim, quati, tatu, sapo Aragão (1936) cavalo, boi, cão, porco, carneiro, cabra, coelho, gato, codorna, peru, galinha veado mateiro, veado catingueiro, cervo, porco-domato, cachorro do mato, cutia, tamanduá-bandeira, tamanduá-mirim, quati, tatu, coelho do mato, sagui, onça-pintada, onça-parda, gato do mato, paca, morcego, guariba, macaco, porco-espinho, mocó, seriema, cobra, lagarto Estrada-Peña et al. (2004), após uma revisão da literatura sobre os hospedeiros de A. cajennense, concluiram que a espécie é generalista com relatos de parasitismo por adultos e imaturos em diversas ordens de mamíferos silvestres, dentre elas: Didelphimorphia (Didelphidae), Cingulata (Dasypodidae), Pilosa (Myrmecophagidae), Carnivora (Canidae e Procyonidae), Perissodactyla (Tapiridae), Artiodacytla (Tayassuidae e Cervidae), além de animais domésticos (cavalo, gado e cachorro). Os autores citam a presença de estádios imaturos em diversas famílias de roedores (Caviidae, Muridae, Dasyproctidae, Chinchillidae, Capromyidae e Echimyidae), além de aves passeriformes, que parecem ser hospedeiros secundários, contribuindo para 18

30 dispersar formas imaturas, mas não adultos. Alguns dos principais trabalhos revisados por Estrada-Peña et al (2004) serão detalhados a seguir: Labruna et al. (2002b) relatam parasitismo por A. cajennense em nove espécies de mamíferos de diferentes ordens (Pilosa, Primates, Carnivora, Artiodactyla e Rodentia); com exceção de Myrmecophaga tridactyla (Pilosa) e Pecari tajacu (Artiodactyla), espécies em que foram encontrados adultos, todos os demais hospedeiros abrigavam apenas estádios imaturos (larvas e ninfas) do carrapato estrela. Os autores acreditam que a abundância de infestação por A. cajennense em uma variedade de animais silvestres pode estar relacionada à disponibilidade de hospedeiros primários (cavalos, gado, anta, capivara, porco-do-mato) no ambiente, bem como às condições ambientais favoráveis aos estádios de vida-livre do carrapato. Labruna et al. (2005) realizaram uma revisão dos carrapatos parasitas de carnívoros silvestres no Brasil e encontraram A. cajennense em dez espécies, distribuídas nas famílias Felidae (4 spp.), Canidae (4 spp.) e Procyonidade (2 spp.). A. cajennense foi a segunda espécie mais comum entre hospedeiros da ordem Carnivora, sendo a maioria dos registros de fases imaturas (larvas e ninfas), o que, segundo os autores, confirma a baixa especificidade dos estádios imaturos deste carrapato. Vários trabalhos relatam parasitismo por formas adultas de A. cajennense em M. tridactyla (tamanduá-bandeira), na Serra da Canastra (MG) (BOTELHO et al., 1989), no Parque Nacional das Emas (GO) (BECHARA et al., 2002) e no Pantanal sul-matogrossense (MARTINS et al., 2004). Em geral a infestação é baixa e associada com outras espécies do gênero, como A. calcaratum e A. nodosum espécies encontradas em sua fase adulta quase que exclusivamente em tamanduás ou A. parvum, carrapato encontrado em várias espécies de hospedeiros, inclusive humanos. Nos estudos realizados no Pantanal sul-mato-grossense por Bechara et al. (2000) e Pereira et al. (2000) A. cajennense foi a espécie de carrapato mais encontrada em animais silvestres Blastocerus dichotomus (cervo-do-pantanal), Mazama gouazoubira (veado-catingueiro), Nasua nasua (quati), M. tridactyla (tamanduá-bandeira), Tamandua tetradactyla (tamanduá-mirim), H. hydrochaeris (capivara), além de animais domésticos como o cavalo, gado e cão. Ito et al. (1998) relatam a presença de ninfas e adultos de A. cajennense em P. tajacu (cateto) e Tayassu pecari (queixada), atribuindo a 19

31 disseminação desta espécie de carrapato no Pantanal sul-mato-grossense ao contato de animais domésticos infestados com animais silvestres. Semelhante conclusão é tomada por Szabó et al. (2003), pois o autor considera os cavalos e outros hospedeiros primários como fonte de infestação de A. cajennense para a espécie B. dichotomus (cervo-do-pantanal). Entre os mais amplos trabalhos realizados no Pantanal sul-mato-grossense figura o de Cançado (2008), que encontrou adultos de A. cajennense parasitando Sus scrofa (porco-monteiro). Segundo o autor, os valores de prevalência e intensidades encontrados, associados à alta taxa de sobrevivência de larvas eclodidas a partir de ovos das fêmeas ingurgitadas coletadas sugerem que o porco-monteiro é um importante hospedeiro e amplificador para o carrapato-estrela na região estudada. Nesse mesmo trabalho foram encontrados adultos e imaturos de A. cajennense nas seguintes espécies: Canis familiaris (cão doméstico), Cerdocyon thous (cachorro-do-mato), Procyon cancrivorus (mão-pelada), Leopardus pardalis (jaguatirica), N. nasua (quati), Ozotoceros bezoarticus (veado-campeiro), D. azarae (cutia), Trichomys sp. (rabudo), T. pecari (queixada), P. tajacu (cateto), M. tridactyla (tamanduá-bandeira), T. tetradactyla (tamanduá-mirim), tatu (Dasypodidae), além de animais domésticos como bovinos e cavalos, e também o homem. O autor indica também outras espécies registradas no Pantanal com parasitismo por A. cajennense, tais como Panthera onca (onça-pintada), Puma concolor (suçuarana), M. gouazoubira (veado-catingueiro), B. dichotomus (cervo-do-pantanal), H. hydrochaeris (capivara), Tapirus terrestres (anta) e ouriço. Relatos de parasitismo por carrapatos em pequenos roedores são vastos na literatura (LINARDI et al., 1991a; LINARDI et al., 1991b; LINARDI et al., 1991c; BARROS-BATTESTI et al., 1998; BITTENCOURT; ROCHA, 2003), mas a dificuldade na identificação de estádios imaturos leva os autores a classificarem os carrapatos coletados apenas como pertencentes ao gênero Amblyomma. Salvo estes casos, a ocorrência de formas imaturas de A. cajennense tem sido reportada em algumas espécies de roedores das famílias Cricetidae Akodon arviculoides e Zygodontomys lasiurus (=Necromys lasiurus), Oryzomys utiaritensis (=Olygoryzomys nigripes) e Oxymycterus roberti (LINARDI et al., 1987); Oryzomys russatus (=Euryoryzomys russatus) e Nectomys squamipes (BOSSI et al., 2002); Oryzomys megacephalus (=Hylaeamys megacephalus) (REIS et al., 2008) Echimyidae Proechimys iheringi 20

32 (=Trinomys iheringi) (BOSSI et al., 2002) e Caviidae Galea musteloides (GUGLIELMONE; NAVA, 2010), este último relato na Bolívia. Perez et al. (2008) reportaram parasitismo por adultos de A. cajennense em H. hydrochaeris (capivara) e por imaturos (larvas e ninfas) em Didelphis albiventris (gambá-de-orelha-branca), além de 13 espécies de aves parasitadas por larvas e ninfas de Amblyomma spp., com destaque para Coragyps atratus (urubu), que apresentou maior prevalência e intensidade de infestação por carrapatos deste gênero dentre as aves. Rojas et al. (1999) reportou pela primeira vez o parasitismo de formas imaturas de A. cajennense em 28 espécies de pássaros da ordem Passeriformes. Entretanto, Ogrzewalska (2009) considera os resultados obtidos neste trabalho duvidosos, pois a identificação dos carrapatos foi realizada apenas por comparação morfológica. A autora encontrou estádios imaturos de A. cajennense em apenas seis espécies de aves, com maior prevalência em Não-Passeriformes do que em Passeriformes, em um ambiente com grande abundância deste carrapato, o que a levou a concluir que A. cajennense exibe certa restrição quanto ao parasitismo em aves. 21

33 Amblyomma dubitatum e seus hospedeiros São poucos os relatos de parasitismo por esta espécie, muitos dos quais se referem ao seu sinônimo-júnior A. cooperi. É reconhecida por vários autores quanto à preferência de estádios imaturos e adultos pela capivara H. hydrochaeris (ARAGÃO, 1936; ROBINSON, 1926; EVANS et al., 2000; LABRUNA et al., 2002; PEREZ et al., 2008; NAVA et al., 2010), considerada como o seu principal hospedeiro primário. Nava et al. (2010) realizaram uma revisão de literatura do parasitismo por A. dubitatum e encontraram relatos de estádios imaturos e adultos nas seguintes espécies: T. terrestris (anta), M. gouazoubira (veado-catingueiro), T. pecari (queixada), S. scrofa (javali), C. thous (cachorro-do-mato), Myocastor coypus (ratão-do-banhado), Allouata caraya (bugio-preto), Glossophaga soricina (morcego-beija-flor), além de gado, cavalos e homem. Larvas e ninfas também foram coletadas nas espécies: D. albiventris (gambá-de-orelha-branca), Didelphis aurita (gambá-de-orelha-preta), Lagostomus maximus (viscacha) e em Lundomys molitor e Scapteromys tumidus (roedores cricetídeos); também há registro de uma ninfa em Rhea americana (ema). Estudos devem ser feitos com objetivo de avaliar se tais espécies são relevantes para o ciclo de vida de A. dubitatum ou se são apenas hospedeiros acidentais ou paratênicos para o carrapato. 22

34 2.3. Biologia do gênero Dasyprocta Illiger, 1811 Rodentia Bowdich, 1821 é a ordem mais ampla dentre os mamíferos viventes, com 33 famílias, 481 gêneros e espécies válidas reconhecidas até 2005, que representam cerca de 42% da biodiversidade de espécies de mamíferos do mundo (CARLETON; MUSSER, 2005). No Brasil são descritos 74 gêneros e 238 espécies (REIS et al., 2010). Os roedores diferenciam-se dos demais mamíferos pela capacidade de roer os alimentos, conferida por uma dentição específica composta de um único par de incisivos (superiores e inferiores) com crescimento contínuo, mas caninos ausentes, formando-se um grande espaço vazio (diastema) entre os incisivos e os pré-molares (EISENBERG; REDFORD, 1999; NOWAK, 1999). As cutias são roedores da família Dasyproctidae Bonaparte, 1838, pertencentes ao gênero Dasyprocta Illiger, Embora a família forme um grupo monofilético, com dois únicos gêneros, Dasyprocta Illiger, 1811 e Myoprocta Thomas, 1903, claramente distinguíveis entre si pela morfologia e utilização de habitat, as relações filogenéticas inter-específicas e supra-específicas não estão bem estabelecidas, sobretudo devido à grande variabilidade cromática das pelagens (OJASTI, 1972). Os registros fósseis de Dasyproctidae remontam ao Eoceno (55 m.a.), sendo considerados os registros mais antigos de roedores histricognatos na América do Sul (WYSS et al, 1993). Atualmente são reconhecidas 11 espécies válidas dentro do gênero Dasyprocta, cinco das quais ocorrem no Brasil: D. azarae, D. fuliginosa, D. leporina, D. prymnolopha e D. punctata (WOODS; KILPATRICK, 2005). Entretanto, a taxonomia do gênero é controversa. Iack-Ximenes (1999) realizou a mais recente revisão taxonômica da família Dasyproctidade e, a partir da análise de 1214 espécimens (peles e crânios), reconheceu dozes espécies do gênero Dasyprocta no Brasil, distribuídas em três grupos azarae, cristata e leporina com base no tipo e na saturação dos pêlos da garupa 4. 4 Nos Dasyproctidae, a garupa é tanto um campo tricogenético (hipertricose ou aumento significativo no comprimento dos pêlos), quanto cromogenético (área pigmentada), por isso denominada por Iack- Ximenes (1999) como campo tricocromogenético, 23

35 O grupo azarae é caracterizado por uma garupa com pêlo aguti padrão homogêneo de faixas intercaladas de eumelanina (pigmento marrom escuro) e feomelanina (pigmento avermelhado). É representado apenas por uma espécie, D. azarae, cuja distribuição está associada a regiões de matas decíduas e semidecíduas, ocorrendo da região Centro-Oeste ao sul do Brasil (Mato Grosso, Goiás, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul). O grupo cristata é caracterizado por uma garupa negra, cujos pêlos são eumelânicos com faixa subterminal ou terminal de feomelanina. É representado por quatro espécies, D. cristata, D. nigriclunis e duas não descritas Dasyprocta sp.1 e Dasyprocta sp.2. Ocorre no oeste do país (Amazonas, Acre, Rondônia, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul), e ao leste, no interior da Bahia e Goiás, em floresta ombrófila, zona de contato com savana e savana estépica florestada. O grupo leporina é caracterizado por uma garupa alaranjada, composta por pêlos aguti modificados saturados de feomelanina. É representado pelas espécies D. aguti, D. aurea, D. catrinae, D. croconota, D. leporina, D. prymnolopha e a não descrita Dasyprocta sp.3. Distribui-se por toda a costa do país até o norte de São Paulo, restrito na região amazônica à margem direita do rio Madeira e à margem esquerda do rio Negro, e associada à floresta ombrófila. Os animais do gênero Dasyprocta são descritos como de tamanho muito grande entre os roedores, com dorso posterior longo e fortemente curvado, membros anteriores menores que os posteriores, patas anteriores com quatro dígitos e posteriores com três e cauda vestigial nua; possuem incisivos com coloração alaranjada, olhos relativamente pequenos, orelhas curtas, quatro pares de mamas e coloração da pelagem do dorso posterior (garupa) variando nas diferentes espécies, podendo ser oliváceo-agrisalhada, amarelo-alaranjada, laranja-avermelhada, castanho-escura ou até preta (BONVICINO et al. 2008; ROSSANEIS et al., 2010). As cutias são animais cursoriais de habitat terrestre, que pode variar entre florestas pluviais, florestas semidecíduas, cerrados e até caatingas, geralmente com distribuição associada a cursos de água (EMMONS; FEER, 1997; BONVICINO et al., 2008). São diurnas, com maior atividade associada ao início da manhã e final da tarde, porém, em ambientes perturbados (e.g. caça) podem apresentar atividade noturna (DEUTSCH; PUGLIA, 1988). Vivem em pares monogâmicos, atingindo a maturidade sexual aos seis meses; a gestação dura de 105 a 120 dias, podendo ocorrer até duas 24

36 gestações por ano, com o número de filhotes variando de um a três (ROSSANEIS et al., 2010). As cutias possuem uma dieta baseada em frutos e sementes e apresentam um comportamento escavador (scatter-hoarding) de enterrar sementes e outros itens alimentares em pequenas quantidades em diversos locais e procurá-los no futuro, principalmente durante períodos de escassez de alimentos (SMYTHE, 1978). Tal comportamento evita a competição intra e interespecífica por recursos alimentares, além de propiciar a dispersão de sementes de grande porte de árvores neotropicais, já que nem todas as sementes enterradas são recuperadas (SANTOS, 2005; JORGE, 2007). As cutias podem ser consideradas espécies cinegéticas, pois são facilmente caçadas e possuem carne muito apreciada (SMYTHE, 1978). Embora nenhuma das espécies que ocorrem no Brasil esteja ameaçada 5, a espécie D. aguti é considerada Quase ameaçada no Estado de São Paulo 6, o que é questionável já que a distribuição desta espécie está associada à região amazônica. A espécie D. azarae é colocada na categoria Dados deficientes na Lista Vermelha da IUCN, devido à incerteza taxonômica, porém suspeita-se que ela seja uma espécie ameaçada (CATZEFLIS et al., 2012). 5 Instrução Normativa MMA nº 03, de 27 de maio de Decreto Estadual nº de 20 de Julho de

37 2.4. Parasitismo em Dasyprocta Illiger, 1811 De forma geral, há pouca informação na literatura sobre o parasitismo em Dasyprocta. Macedo (2008) informa que a fauna parasitológica de Dasyprocta tem sido investigada na região amazônica, mas que para outras regiões do país ainda há poucos estudos, a maioria consistindo em análises coproparasitológicas. Segundo Durette-Desset et al. (2006), doze espécies de nematódeos gastrointestinais já foram registrados parasitando cutias das espécies D. leporina, D. fuliginosa e D. azarae, mas recentemente tais helmintos foram observados também em D. prymnolopha (MACEDO, 2008), e novas espécies têm sido descritas (GONÇALVES et al., 2007). Baas et al. (1976) apud Brown-Uddenberg et al. (2004) citam o parasitismo por cestódeos gastrointestinais em D. punctata e D. azarae. Já a maior parte dos relatos de parasitismo por protozoários provém de D. leporina (MENDONÇA et al., 2006, LAINSON et al., 2007, REGINATTO et al., 2008). Sabe-se que algumas espécies do gênero participam como reservatórios e hospedeiros intermediários de endoparasitas, como Trypanosoma cruzi (RIBEIRO; BARRETO, 1977), Leishmania (Leishmania) amazonenses (BASANO et al., 2004), Babesia sp. e filarídeos (THOISY et al., 2000). Quanto aos ectoparasitos, existe relato de parasitismo em Dasyprocta sp. por pulgas (Siphonaptera) dos gêneros Rhopalopsyllus e Polygenis (LINARDI; GUIMARÃES, 2000) e piolhos (Phthiraptera) do gênero Gyropus (KELLOGG, 1914). Cucchi-Stefanoni et al. (2008) registraram a morte de duas cutias (D. mexicana) mantidas em cativeiro, provocada por anemia decorrente de severas infestações por pulgas do gênero Echidnophaga, causadoras de lesões cutâneas e dermatite em roedores. Rohr (1909) cita a espécie D. aguti como hospedeira para as seguintes espécies de carrapatos: Ixodes fuscipes, Haemaphysalis proxima 7, A. brasiliense e A. cajennense. Aragão (1936) cita a espécie D. aguti como hospedeira para Ixodes fuscipes e relata um fato curioso: a confusão entre as fases imaturas ou micuins do carrapato-estrela A. cajennense e do ácaro, Trombicula brasiliensis (=Tetranychus molestissimus), chamado 7 Segundo Guglielmone et al. (2010), esta espécie é um sinônimo-júnior de Haemaphysalis leporipalustris (Packard, 1869). 26

38 pelos franceses de pou d Agouti piolho de cutia, justamente por parasitar abundantemente as cutias. Robinson (1926), por sua vez, lista as espécies D. aguti e D. croconata como hospedeiras de A. brasiliense e A. scutatum, respectivamente. Estrada-Peña et al., 2004 indicam a família Dasyproctidae como possíveis hospedeiros do carrapato-estrela A. cajennense; em estudo recente realizado no Pantanal sul-mato-grossense, Cançado (2008) encontrou ninfas e adultos das espécies A. cajennense e A. parvum em D. azarae. 27

39 2.5. Hospedeiros reservatórios e amplificadores de R. rickettsii Diversos animais silvestres, além de animais domesticados, são apontados como hospedeiros do carrapato-estrela. Alguns destes hospedeiros também são identificados como reservatórios e amplificadores da R. rickettsii, como as capivaras (TRAVASSOS; VALLEJO-FREIRE, 1942a, b; SOUZA et al., 2009) e os gambás (MOREIRA; MAGALHÃES, 1935; HORTA et al., 2009),. Isto porque, embora a bactéria seja transmitida hereditariamente entre gerações sucessivas de uma população de carrapatos, apenas este mecanismo não é suficiente para mantê-la ativa ao longo do tempo, uma vez que também é patogênica para o carrapato vetor (NIEBYLSKI et al., 1999; LABRUNA et al., 2008; LABRUNA et al., 2011). O hospedeiro amplificador mantém a bactéria em níveis altos em sua corrente sanguínea por alguns dias ou semanas, garantindo que novos carrapatos se infectem e amplificando a infecção pela bactéria na população. Labruna (2006) define cinco principais pré-requisitos para uma espécie tornar-se um importante reservatório e amplificador de R. rickettsii. São eles: ser abundante na área endêmica, ser um bom hospedeiro do carrapato vetor, ser suscetível à infecção por R. rickettsii, manter a bactéria circulante e ter alta taxa de renovação populacional. Segundo Schmidt e Ostfeld (2004), hospedeiros podem variar significativamente quanto à competência como reservatórios de patógenos. Para explicar o papel ecológico da comunidade de hospedeiros na transmissão de doenças transmitidas por vetores, estes autores cunharam o termo efeito de diluição : a presença de hospedeiros com baixa competência de infectar vetores dilui o efeito dos reservatórios altamente competentes. Como resultado, a probabilidade do vetor parasitar um hospedeiro reservatório e infectar-se com o patógeno aumenta, bem como o risco de transmissão da doença naquele local. 28

40 3. Objetivos 3.1. Objetivo geral Identificar a fauna de carrapatos associada aos indivíduos da espécie Dasyprocta azarae (cutia) capturados no campus da USP-RP; 3.2. Objetivos específicos Avaliar prevalência, intensidade (média e máxima) e abundância média de infestação por Amblyomma spp. (carrapato-estrela) nos indivíduos da espécie Dasyprocta azarae (cutia) capturados; Testar a seguinte hipótese: a espécie Dasyprocta azarae (cutia) é um hospedeiro secundário de Amblyomma spp. (carrapato-estrela). 29

41 4. Material e Métodos 4.1. Caracterização da área de estudo O estudo foi realizado no campus da Universidade de São Paulo de Ribeirão Preto (Figura 4). O município é situado no nordeste do Estado de São Paulo, inserido em sua maioria na Bacia Hidrográfica do rio Pardo e, em menor extensão, do Mogi- Guaçu. As informações a seguir foram extraídas de Kotchetkoff-Henriques (2003): Ribeirão Preto apresenta altitude que varia de 500 a 800 metros, com verão chuvoso e inverno seco, enquadrando-se na categoria Aw, segundo a classificação climática de Köppen-Geiger; no período de 1981 a 2002 a temperatura média anual foi de 22,6ºC, enquanto que no período de 1937 a 2002 as médias anuais da precipitação pluviométrica e da umidade relativa do ar foram, respectivamente, 1467,9 mm e 71,82%. Figura 4. Imagem de satélite do campus da USP de Ribeirão Preto. Fonte: Google Earth (2012). O campus da USP-RP está localizado no terreno da antiga Fazenda Monte Alegre, propriedade de Francisco Schimidt, o Rei do af, e ocupa uma área de aproximadamente 585 hectares dentro do perímetro urbano do município de Ribeirão Preto (ZAIDAN, 2006). O campus recebe água dos córregos Laureano e Monte Alegre, que nascem no próprio município, abrigando ainda um lago artificial e quatro nascentes (Plano ambiental do campus da USP-RP, 2007). 30

42 Devido aos plantios de café e cana-de-açúcar, a vegetação existente no campus não é remanescente de mata primária (MARQUES, 2007); de acordo com o que consta no Plano ambiental do campus da USP-RP (2007), ocorrem no campus pequenas extensões de matas secundárias em estágio de sucessão inicial ou avançado, com espécies nativas e exóticas, além de bosques de composições variadas. Merece destaque a Floresta da USP, área de 75 ha que resultou de um projeto de reflorestamento com base em 80 espécies florestais nativas, iniciado em 1998 por uma parceria entre a PCARP Prefeitura do Campus de Ribeirão Preto e a FFCLRP Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto com o apoio de entidades governamentais e não governamentais. Há ainda no campus um fragmento de mata secundária (Mata do Museu) em que ocorreu regeneração natural da vegetação, além de plantio de espécies nativas e exóticas para pomar, viveiro de mudas e ornamentação (ESTEVES, 2006; MARQUES, 2007). 31

43 4.2. Delineamento amostral O estudo foi realizado entre os meses de janeiro de 2012 e janeiro de Como um dos objetivos foi testar a hipótese da espécie D. azarae (cutia) ser parasitada apenas por estádios imaturos de Amblyomma spp., as coletas acompanharam a sazonalidade da espécie de carrapato-estrela com maior representatividade no campus da USP-RP A. cajennense (ORTIZ, 2012). A fim de garantir um número significativo de animais capturados (prováveis hospedeiros) para cada período correspondente ao pico de atividade dos estádios de desenvolvimento do ácaro, foram definidos três períodos de coleta: I. Março a junho de 2012 (maior atividade de larvas) II. Julho a outubro de 2012 (maior atividade de ninfas) III. Novembro de 2012 a janeiro de 2013 (maior atividade de adultos) O período de janeiro a fevereiro de 2012 foi reservado para o preparo do material necessário à execução das coletas. 32

44 4.3. Captura dos animais Os animais foram capturados utilizando-se armadilhas do tipo Tomahawk gaiolas de arame galvanizado com um sistema de desarme automático e suporte para iscas suspensas (frutas), de dimensões iguais a 77cm de comprimento x 32cm de largura x 35cm de altura (Figura 5). As capturas foram realizadas mediante Licença Sisbio/ICMBio nº Figura 5. Armadilha do tipo Tomahawk, iscada com atrativo alimentar e armada em local de captura, no campus da USP - Ribeirão Preto. Os pontos de instalação das armadilhas foram georreferenciados utilizando-se aparelho de sistema de posicionamento global portátil (GPSMAP 60CSx, Garmin, E.U.A.) e podem ser observados na Figura 6. As coordenadas geográficas destes pontos são apresentadas na Tabela 4. O presente trabalho não teve como objetivo comparar diferentes áreas de amostragem quanto ao sucesso de captura ou quanto aos índices de infestação por carrapatos-estrela. Desta forma, o esforço de coleta entre as áreas não foi igualado. 33

45 Figura 6. Localização das armadilhas do tipo Tomahawk utilizadas na captura de indivíduos da espécie D. azarae no campus da USP Ribeirão Preto. ED = Educação Física, MUS = Música, MT = Mata do Museu. Fonte: Google Earth (2012). As armadilhas foram distribuídas em áreas que atendessem obrigatoriamente a três critérios: (a) provável ocorrência dos hospedeiros, (b) provável infestação por carrapatos-estrela e (c) ausência atividades de controle para carrapatos-estrela. Para satisfazer o primeiro critério foram considerados relatos de visualização de cutias por funcionários ou moradores do campus, além da fitofisionomia da área, proximidade de corpo d água e presença de recursos alimentares e.g. árvores frutíferas). Tais informações foram obtidas a partir de visitas a campo, previamente à instalação das armadilhas, por meio de entrevistas com funcionários e moradores, além de busca por vestígios (frutos e sementes consumidos, pegadas e fezes) dos animais. As visitas foram realizadas preferencialmente no horário de forrageio da espécie, a fim de facilitar a observação de indivíduos. Para atender ao segundo critério foram priorizadas as áreas próximas às matas ciliares dos córregos Laureano e Monte Alegre, visto que nessas áreas foram encontrados altos níveis de infestação pelo carrapato-estrela (ORTIZ, 2012). A Área 3 Mata do Museu (Figura 6) foi escolhida mesmo sendo relativamente distante de corpos d água e, portanto, menos sujeita a infestação por carrapato-estrela, por apresentar outras condições favoráveis a presença de cutias. 34

46 Contudo, ao decorrer da primeira campanha verificou-se um elevado número de furtos de armadilhas nas margens do lago, fato que, somado ao início do tratamento de matas ciliares com carrapaticida em meados de agosto de 2012, resultou na exclusão desta área dos locais de amostragem de hospedeiros. A área Floresta da USP tamb m foi excluída da amostragem, pois embora satisfizesse plenamente o terceiro critério, apresentava restrições quanto aos demais (poucos relatos de visualização de animais e baixa infestação por carrapatos-estrela). Além disso, a presença constante de seres humanos no local não só aumentava a probabilidade de furto de armadilhas, o que ocorreu na área mais de uma vez, mas também representava uma ameaça aos animais por ventura capturados. Após o roubo de uma das armadilhas instaladas na Área 1 (EEFERP), em junho de 2012, as coletas foram interrompidas e a área foi excluída da amostragem nos meses seguintes. Tabela 4. Coordenadas geográficas (UTM) dos pontos de instalação das armadilhas do tipo Tomahawk utilizadas na captura de indivíduos da espécie Dasyprocta azarae (cutia) no campus da USP Ribeirão Preto. ED = Educação Física, MUS = Música, MT = Mata do Museu, EEFERP = Escola de Educação Física e Esportes de Ribeirão Preto, FFCLRP = Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto. Armadilha Local Coordenadas geográficas (UTM 23K) ED m E m S Área 1 (EEFERP) ED m E m S MUS m E m S MUS 2 Área 2 (Música - FFCLRP) m E m S MUS m E m S MT m E m S MT 2 Área 3 (Mata do Museu) m E m S MT m E m S As armadilhas foram cevadas com atrativo alimentar, mas desarmadas por uma semana antes da coleta e, após esse período, foram armadas e vistoriadas duas vezes ao dia, às 7h30 e às 13h. Este horário coincide com o período de forrageio das cutias, que é diurno (SMYTHE, 1978; EMMONS; FEER, 1997). Como atrativos alimentares foram utilizados diferentes frutos (abacate, banana, manga e mamão). Para minimizar o estresse e possível óbito do animal durante as manipulações, após a captura as armadilhas foram cobertas com panos de tecido preto a fim de impedir que os animais observassem o ambiente externo, conferindo condições de penumbra ideais para o transporte dos mesmos até o Biotério Central da USP-RP. 35

47 4.4. Contenção química e biometria A contenção química teve como objetivo facilitar a manipulação dos animais e inibir a dor durante a realização dos procedimentos. Para tal, aplicou-se via intramuscular uma associação de cloridrato de cetamina (10-21mg/kg) e cloridrato de xilazina (1mg/kg) com seringas descartáveis de 3ml (0,70x25mm), cujo efeito sedativo anestésico é eficaz, sendo comumente utilizada em roedores, particularmente em cutias (SANTOS, 2005; MACEDO, 2008; CID, 2011). Para garantir uma aplicação segura dos anestésicos, os animais foram contidos manualmente dentro de gaiola metálica utilizando-se um aparador de madeira a fim de permitir a ação do médico veterinário (Figura 7, A). Após o animal ser sedado, este era posicionado em decúbito lateral em uma mesa metálica previamente higienizada para a realização dos demais procedimentos. Luvas de raspa de couro foram utilizadas para garantir a segurança durante a manipulação dos animais (Figura 7, B). A biometria foi feita de acordo com as medidas adotadas por Bonvicino et al. (2008) (comprimento cabeça-corpo, comprimento da cauda, comprimento da pata posterior com unha, comprimento da orelha interna e massa corporal). Os animais tiveram o sexo identificado e foram marcados com brincos de identificação numerados, para o reconhecimento em caso de recaptura (Figura 7, C), de acordo com Mangini e Nicola (2006). Amostras de tecido sanguíneo foram retiradas por punção cardíaca (Figura 7, D), com seringas descartáveis de 1ml (0,38x13mm), para posterior análise sorológica visando detectar a presença de R. rickettsii. Por fim, os animais foram examinados quanto à fixação dos carrapatos no corpo. Após o término dos procedimentos os animais foram devolvidos às gaiolas (cobertas com panos pretos para reduzir a incidência de luz e, consequentemente, o estresse dos animais) e monitorados até que se observasse a plena recuperação das funções fisiológicas normais (alimentação/excreção). O tempo total dos procedimentos (da aplicação do anestésico até a recuperação total do animal) foi de, aproximadamente, 30 minutos. 36

48 Figura 7. Procedimentos realizados em Biotério com os animais capturados da espécie Dasyprocta azarae no campus da USP-RP. A) Contenção manual do animal realizada dentro da gaiola metálica com o auxílio de uma tábua de madeira; B) Manipulação do animal após aplicação do anestésico, com a utilização de luvas de raspa de couro; C) Marcação do animal com brinco de identificação numerado na orelha direita, com o auxílio de um alicate apropriado; D) Retirada de 1ml de sangue do animal, por punção cardíaca. Data das fotografias: A) 04/06/2012; B) 01/06/2012; C) 11/12/2012; D) 04/06/

49 4.5. Manutenção em biotério e soltura dos animais Os animais com ectoparasitos fixados foram mantidos por sete dias em gaiolas metálicas de 100cm de comprimento, 60cm de largura e 60cm de altura, providas de bandeja removível na parte inferior contendo maravalha (Figura 8, A e B) para acomodar os carrapatos ingurgitados que naturalmente se desprendessem dos hospedeiros. Os parâmetros luminosidade, temperatura, ventilação e umidade do ar não foram controlados, permanecendo os naturais; a alimentação foi à vontade, com pelo menos três variedades de frutos da época e, quando possível, de ocorrência no campus da USP-RP (e.g. jatobá, abacate, manga, mamão, banana, goiaba); também foi oferecida água, não filtrada, à vontade. Diariamente as gaiolas foram higienizadas e o alimento e a água repostos (Figura 8, C). Após uma semana de permanência no biotério, os animais foram soltos no mesmo ponto em que foram capturados (Figura 8, D). Figura 8. Manutenção dos animais no Biotério Central. A) Gaiola metálica coberta com pano preto para evitar o estresse do animal; B) Bandeja removível contendo maravalha para acomodar os carrapatos que se desprendem naturalmente após o ingurgitamento e fita adesiva nas laterais para impedir sua fuga; C) Cutia dentro de gaiola contendo frutos e vasilhames com água; D) Cutia sendo liberada no mesmo local de captura, após uma semana em biotério. Data das fotografias: A) 01/06/2012; B) 05/12/2012; C) 04/06/2012; D) 06/06/

50 4.6. Identificação dos ectoparasitos Os carrapatos que se desprenderam foram contados e acondicionados adequadamente em microtubos plásticos tipo Eppendorf tampados com chumaço de algodão ligeiramente umedecido com água (Figura 9, A) e mantidos em estufa equipada de termo-higrômetro digital (Figura 9, B) com o objetivo de monitorar as condições ideais de temperatura (27 ± 2ºC) e umidade relativa (75 ± 5%) para favorecer a ecdise dos carrapatos. Figura 9. A) Carrapatos acondicionados em Eppendorf com chumaço de algodão umedecido com água; B) Estufa com temperatura e umidades medidas por higrômetro digital. Laboratório do Núcleo de Estudos do Carrapato-estrela de Ribeirão Preto. Posteriormente, procedeu-se à identificação dos ectoparasitas em lupa estereoscópica; os adultos foram identificados a partir da chave dicotômica proposta por Onofrio et al. (2006), enquanto que a identificação das ninfas seguiu a chave dicotômica proposta por Martins (2009). 39