CARACTERIZAÇÃO DE FILMES E MATRIZES POROSAS DE ALGINATO DE SÓDIO E PECTINA DE FRUTAS CÍTRICAS RETICULADOS COM CaCl 2 E CARBODIIMIDA.
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- Stefany Braga Fialho
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1 CARACTERIZAÇÃO DE FILMES E MATRIZES POROSAS DE ALGINATO DE SÓDIO E PECTINA DE FRUTAS CÍTRICAS RETICULADOS COM CaCl 2 E CARBODIIMIDA. Aline M.F. Lima 1 *, Valdir Soldi 2 1* Departamento de Química da UFSC- Campus Universitário Trindade, Bairro Trindade CEP Florianópolis-SC-amflima@gmail.com; 2 Departamento de Química da UFSC- vsoldi@qmc.ufsc.br Characterization of films and porous scaffolds of sodium alginate and citric fruits pectin crosslinked with CaCl 2 and water-soluble carbodiimide. The preparation of crosslinked sodium alginate/pectin (AS/P) blend films and porous scaffolds were realized by solution casting and films and scaffolds immersion methods using calcium and EDC. Films and scaffolds were characterized using swelling measurements, scanning electron microscopy (SEM), Fourier Transform infrared (FT-IR) spectroscopy and by mechanical property measurements. The swelling test and FT-IR spectroscopy were carried out as a measure of the extent of crosslinking. FT-IR spectra showed the increase of the intensity of the absorbancies as amide bonds (band 1700 cm -1 ) in the case of the EDC and by the shifting to higher wavenumbers at 1420 cm -1 for CaCl 2. The properties of AS/P films and scaffolds were compared with the individual pectin and alginate structures. The results indicate the possibility of obtaining a wide range of properties depending on the mixture together with the presence of calcium or water-soluble carbodiimide as crosslinker agents. Introdução A pesquisa na área de polímeros intensificou-se nos últimos anos, tanto na aplicação destes na área alimentícia [1-3], nanotecnológica [4] ou farmacêutica [5-7]. Dentro desse contexto, os polímeros naturais, como os polissacarídeos, vêm ganhando espaço devido, em parte, pela biodegradabilidade e a não-toxicidade. Neste trabalho foram escolhidos os polissacarídeos alginato de sódio e pectina para preparação de bandagens para lesões. O alginato de sódio (AS) é um heteropolissacarídeo de ocorrência natural, pertencente à família dos polissacarídeos lineares não-ramificados composto por duas espécies de resíduos de ácidos urônicos, o ácido β-d-manurônico (M) e o seu epímero no C5 o α-l-gulurônico (G) unidos por ligações (1 4). Esses resíduos [8] estão dispostos em blocos alternados e podem variar largamente em composição e seqüência ao longo da cadeia determinando as propriedades do alginato de sódio. A pectina (P) é um polissacarídeo heterogêneo complexo e sua composição assim como no alginato de sódio, varia com a fonte e as condições aplicadas durante seu isolamento. O maior constituinte da seqüência linear é o ácido α-d-galacturônico unidos por ligações glicosídicas α(1 4) [9] A bandagem de alginato de sódio vem sendo utilizada para esse fim, mas seu custo é uma barreira para o tratamento. Esse problema pode ser contornado com substituição total ou parcial de pectina
2 na preparação destas bandagens, já que a pectina é um biopolímero de fácil obtenção, sendo extraída de cascas de frutas cítricas, o que não seria problema no caso do Brasil, o que adicionaria mais uma forma de aproveitamento deste subproduto que em muitos casos são descartados. Dentro deste contexto, este estudo tem como objetivo colaborar de forma a utilizar a pectina de frutas cítricas, devido suas propriedades inerentes, na preparação de bandagens e ao mesmo tempo como veículo de liberação de fármacos para o tratamento de lesões. Para determinadas aplicações dos filmes e matrizes porosas de pectina e suas blendas com alginato de sódio como bandagens e sistemas de liberação controlada de fármaco, torna-se necessário reticular estes sistemas devido sua solubilidade em meio aquoso. A reticulação (formação de ligações cruzadas) pode aumentar a resistência mecânica do material. Neste estudo, foi escolhido como agente reticulante o hidrocloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida também conhecido como EDC, que ao contrário dos agentes reticulantes convencionais, como o glutaraldeído ou poliepóxidos, não é encontrado no produto final da reticulação, e seus subprodutos de degradação são derivados de uréia, e, portanto de baixa toxicidade [10]. Outro agente reticulante para esse sistema é o cloreto de sódio, largamente utilizado como reticulante para alginato de sódio e pectina. Assim, o presente estudo tem como objetivo avaliar a viabilidade da substituição total ou parcial do alginato de sódio pela pectina de frutas cítricas na preparação de filmes e matrizes porosas com aplicação em sistema de liberação controlada de fármaco e ao mesmo tempo como bandagem para lesões e/ou queimaduras. Assim, atenção especial será dada às propriedades físico-químicas das soluções e dos filmes e matrizes porosas dos polissacarídeos puros e das blendas alginato de sódio /pectina. O estudo das propriedades físico-químicas dos filmes e matrizes porosas podem fornecer informações valiosas ao entendimento das características desses sistemas e suas possíveis aplicações. Experimental Preparação de filmes e matrizes porosas de alginato de sódio, pectina de frutas cítricas e suas blendas AS/P. Os filmes de AS, P e blendas AS/P foram preparadas na concentração de 20g/L em água deionizada e no caso das blendas, em diferentes proporções (v/v): AS/P 30/70, AS/P 50/50 e AS/P 70/30. Para obtenção de filme reticulados com cálcio, adicionou-se 0,1 g de CaCl 2. No caso do agente reticulante EDC, foi mantido ph ácido em todas as soluções com a adição de 0,1M NaOH ou 0,1M HCl e a adição de uma determinada quantidade de EDC. As soluções reticuladas com cálcio e EDC
3 foram espalhadas em placas de poliestireno e levadas a capela de exaustão para evaporação Esta reticulação foi denominada reticulação em solução. Os filmes formados foram submetidos a uma segunda reticulação, denominada reticulação por imersão. Nessa etapa, os filmes formados foram cortados no tamanho adequado para posteriores ensaios e foram colocados em uma solução etanólica 70% (v/v) contendo 0,4M de CaCl 2 por 30 minutos. No caso do EDC as melhores condições para reticulação foram obtidas de acordo com estudo prévios realizados de acordo com a literatura [11, 12]. As matrizes de alginato de sódio, pectina e as blendas AS/P reticuladas foram preparadas a partir das soluções obtidas da reticulação em solução, como descrito para preparação dos filmes. Estas foram vertidas em recipiente de acrílico ( mm) e submetidas ao congelamento gradativo e liofilizadas (Freeze Dryer, Edwards High Vacuum International/ Model Serial) equipado com uma bomba a vácuo modelo E2- M8 por um período de 24 horas. As matrizes reticuladas em solução foram submetidas ao segundo processo de reticulação (imersão), nas mesmas condições da reticulação dos filmes. Após a retirada do excesso de EDC e de CaCl 2 pela agitação em água deionizada por 5 minutos, as matrizes reticuladas foram novamente congeladas e liofilizadas por 24h e acondicionadas em um dessecador para as análises posteriores. Espectroscopia no Infravermelho As análises de infravermelho (FTIR) foram realizadas a partir de filmes finos obtido das soluções polimérica na concentração de 2g/L. O espectro de infravermelho foi obtido em um aparelho de FTIR marca ABB Bomem Inc, modelo FTLA 2000, com resolução de 4 cm -1 na faixa de cm -1. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Medidas de MEV (Philips XL 30), tanto na forma de filmes, quanto matrizes porosas foram realizadas para avaliar a influência da composição das misturas poliméricas e do agente reticulante na morfologia dos mesmos. As análises de MEV foram realizadas tanto na superfície como da secção transversal a partir da fratura em nitrogênio líquido. Previamente às análises de MEV, as amostras foram recobertas como uma fina camada de ouro.
4 Ensaio de tração dos filmes e ensaio de compressão das matrizes porosas Ensaios de tensão/deformação foram realizados em um aparelho de ensaio mecânico EMIC-DL- 500 para determinar a tensão máxima, deformação na ruptura e o módulo de elasticidade ou módulo de Young dos filmes de alginato de sódio, pectina e blendas AS/P. O método ASTM D882-95a foi adotado para o experimento. A separação inicial das garras foi de 50 mm e a velocidade de tração de 5 mm/min, com célula de carga de 50 Kgf. O teste de compressão foi realizado em um aparelho de ensaio mecânico EMIC-DL-500 usando dois pratos paralelos de 100 mm de diâmetro cada um e com velocidade de compressão de 5 mm/min até atingir 80% de compressão, com célula de carga de 500 Kgf. O experimento foi realizado após 21 dias da exposição das matrizes porosas e filmes a UR de 43%. Razão de intumescimento (RI) A razão de intumescimento (RI) dos filmes e das matrizes porosas, que foi também usada como parâmetro de medida da extensão da reticulação [13] (considerando a solubilidade total do filme não reticulado), foi analisada em termos do período de tempo de exposição em solução tamponada ph 7,4 em um banho termostatizado a 37ºC, sob agitação a 120 revoluções por minutos e por diferentes períodos de tempo. A razão de intumescimento foi expressa como a razão do ganho em massa em relação à massa inicial do filme. A RI foi medido usando três amostras escolhidas aleatoriamente de cada tipo de filme, secas a 105 C por 24h para determinar a massa inicial. As amostras dos filmes e das matrizes porosas reticulados foram imersos em um tubo de ensaio com uma determinada quantidade de solução tamponada. Após um período de tempo pré-determinado, os filmes e as matrizes foram removidos da solução e o excesso foi removido com papel de filtro para obtenção da massa final. Resultados e Discussão Os espectros de infravermelho dos filmes obtidos após os processos de reticulação são mostrados nas figuras abaixo. A Figura 1 (A) mostra o espectro de infravermelho dos filmes da blenda AS/P 30/70 reticulado com cálcio. O espectro mostra diferenças na forma e deslocamento dos picos. A banda de deformação simétrica do COO - em torno de 1420 cm -1 nos filmes antes da reticulação, exibe deslocamento para 1445 cm -1 e diminui de intensidade. Segundo Sartori e colaboradores [14] a banda em 1420 cm -1 é específica para ligação iônica e a substituição de íons sódio por cálcio pode alterar a densidade de carga, massa atômica e o raio ao redor dos grupos carbonila causando o
5 deslocamento. Para pectina e alginato de sódio puros (dados não mostrados), o mesmo deslocamento foi observado. AS/P 30/70 Reticulado com CaCl 2 AS/P 50/50 reticulado com EDC Transmitância AS/P 30/ cm -1 Trnasmitância (%) AS/P 50/ cm cm cm Número de Onda (cm -1 ) Número de Onda (cm -1 ) (A) (B) Figura 1 - Espectro de infravermelho dos filmes reticulados com cálcio (A) e EDC (B) das blendas AS/P em diferentes composições. Para os filmes reticulados com EDC, similarmente aos componentes puros e outras blendas, a blenda AS/P 30/70 apresentou a banda em 1700 cm -1 (Figura 1(B)) correspondente a grupos carbonila de ligação éster [12]. Os grupos hidroxila e carboxila presentes na estrutura da pectina e do alginato de sódio são responsáveis pela reticulação, e para que esta ocorra, é necessária à formação da ligação éster entre estes grupos. Como descrito na literatura [15], o EDC promove a formação de anidrido ácido entre dois grupos carboxila pertencentes a mesma ou diferentes moléculas do polissacarídeo. O anidrido ácido resultante pode reagir rapidamente com grupos hidroxilas do polissacarídeo, formando a ligação éster. Quanto aos resultados de MEV, a micrografia da superfície dos filmes reticulados com EDC e cálcio (dados não mostrados) apresentaram características de um material denso e sem porosidade. A secção transversal mostrou estruturas homogêneas, mas com aspecto rígido e características lamelares diferentes do observado para os filmes não reticulados que apresentaram uma estrutura lisa, compacta e densa para ambos os filmes. No entato, as matrizes porosas apresentaram morfologias dependentes de sua composição e do tipo de agente reticulante utilizado. A Figura 2 (A) mostra a superfície da matriz porosa de AS/P 30/70 com cálcio, e a Figura 2 (B) representa a matriz reticulada com EDC. O tamanho médio dos poros estimado por MEV é mostrado na Tabela 1.
6 (A) (B) Figura 2 Micrografia de MEV das matrizes porosas de AS/P 30/70 reticuladas com cálcio (A) e EDC (B). As matrizes reticuladas com cálcio apresentaram uma diminuição no tamanho médio dos poros em relação as matrizes não reticuladas, que pode estar relacionado com a rápida coordenação com íons cálcio durante a reticulação, reduzindo a mobilidade das cadeias dos polímeros. Para as matrizes reticuladas com cálcio, o tamanho médio dos poros obedece a seguinte ordem: P>AS/P 30/70>AS/P 50/50>AS/P 70/30> AS. Em geral, as matrizes apresentaram poros interconectados exceto a matriz de pectina que apresentou um grau de conectividade menor entre os poros e maior tamanho de poros. De acordo com Braccini e colaboradores [16], a pectina exibe associação cadeia-cadeia com cálcio diferente do alginato que é baseado no modelo egg-box. A cavidade formada através da associação entre as cadeias de pectina é muito grande para acomodar o cálcio. Os autores propõem um modelo da interação das cadeias da pectina com cálcio com sítios de coordenação consecutivos e não alternada como no alginato. Entretanto, a associação não é tão efetiva como no alginato que apresenta sítios alternados de coordenação com o cálcio. Diminuindo a quantidade de pectina para 70%, as matrizes apresentam melhor conectividade dos poros que a pectina pura. Tabela 1 Tamanho médio dos poros das matrizes porosas reticuladas. Matriz porosa Tamanho médio dos poros matrizes não reticuladas (μm) Tamanho médio dos poros matrizes reticuladas com CaCl 2 (μm) Tamanho médio dos poros matrizes reticuladas com EDC (μm) AS AS/P 70/ AS/P 50/ AS/P 30/ P As matrizes reticuladas com EDC apresentaram tamanho médio dos poros maior que as matrizes não reticuladas e as reticuladas com cálcio. Aparentemente, a formação de ligações covalentes com
7 a adição de EDC entre as cadeias dos polissacarídeos, apresentou certa mobilidade em relação à ligação iônica. Além disso, a reticulação com EDC não é rápida como no caso com os íons cálcio. A ordem para o tamanho dos poros das matrizes reticuladas com EDC é inversa a da reticulação com cálcio, ou seja: AS>AS/P 70/30>AS/P 50/50>AS/P 30/70 > P. Todas as matrizes apresentaram conectividade entre os poros, que é um fator essencial para aplicação biomédica, por exemplo, o crescimento de tecidos de maneira homogênea e uniforme, o que possibilita a utilização inclusive de matrizes de pectina. As Figuras 3 (A) e (B) respectivamente, apresentam o módulo de Young e a deformação na ruptura, dos filmes não reticulados e reticulados com cálcio e EDC. O ensaio de tração de filmes de alginato de sódio e pectina reticulados com cálcio [17, 18] já é descrito na literatura, ao contrário dos filmes reticulados com EDC. Os filmes de pectina e alginato de sódio apresentaram valores de módulo de Young maiores que os filmes não reticulados. Por exemplo, alginato de sódio e pectina nas mesmas condições experimentais, apresentaram antes da reticulação módulo de Young de 480 MPa e 392 MPa, respectivamente. Após a reticulação com cálcio, os módulos foram de 514 e 468 MPa. As blendas AS/P apresentaram a mesma tendência observada para os polímeros puros. O aumento no módulo de Young indica a formação de ligações cruzadas das cadeias do alginato de sódio e pectina com os íons cálcio. A ordem para os valores de módulo de Young é: AS >AS/P 70/30 > AS/P 50/50 >AS/P 30/70 >P. Os filmes reticulados com EDC também apresentaram valores de módulo de Young maiores que os filmes não reticulados (521 MPa para o alginato e 420MPa para pectina), conseqüência da formação da ligação covalente (ligação éster) entre as cadeias poliméricas. Quando se compara os valores do módulo de Young dos filmes reticulados com cálcio e EDC, os filmes reticulados com cálcio apresentaram uma pequena tendência para o aumento do módulo de Young em todas as composições dos filmes em relação aos filmes reticulados com EDC. Esse resultado pode estar relacionado com o caráter iônico da ligação com os íons Ca 2+, resultado da coordenação pelos grupos G do alginato e galacturônicos da pectina. Entretanto, com a reticulação houve uma diminuição do valor da deformação na ruptura, por exemplo, para a blenda AS/P 30/70 de 4 MPa para 3 MPa após reticulação. Os filmes de alginato reticulados com cálcio apresentaram valor de deformação na ruptura (6,3 MPa) muito próximo ao descritos na literatura na faixa de 4,5 a 8 MPa [17, 19]. O aumento do módulo de Young e diminuição da deformação na ruptura após reticulação foram observados em filmes de polissacarídeos e proteínas. [20, 21] Quanto aos reticulantes utilizados, não houve uma diferença significativa entre os valores nos resultados de deformação máxima na ruptura e tensão máxima dos filmes.
8 Módulo de Young (MPa) Não reticulados Reticulados com EDC Reticulados com CaCl 2 Deformação na Ruptura Não reticulado Reticulado com EDC Reticulado com CaCl Composição de Pectina (%) Composição pectina (%) (A) (B) Figura 3 Módulo de Young (A) e deformação na ruptura (B) em função da composição de pectina para os filmes reticulados com EDC e cálcio. Quanto ao módulo de compressão das matrizes porosas (dados não apresentados) as matrizes reticuladas com cálcio apresentaram maior módulo de compressão que em relação as matrizes reticuladas com EDC, como observado nos filmes. As blendas apresentaram valores de RI intermediários ao alginato e pectina e a ordem observada para a RI dos filmes reticulados com cálcio foi P>AS/P 30/70>AS/P 50/50>AS/P 70/30>AS. Essa diferença se deve o arranjo estrutural das cadeias do alginato e pectina com íons cálcio. A reticulação do alginato de sódio e pectina com o EDC leva a formação de ligações covalentes entre os grupos carboxílicos e hidroxilas dos polissacarídeos. Comparando-se o comportamento dos filmes reticulados com cálcio, os filmes reticulados com EDC apresentaram uma inversão na RI: AS>AS/P 70/30> AS/P 50/50> AS/P 30/70 >P. Além disso, a RI para os filmes reticulados com EDC (Figura 4A) é ligeiramente maior que os reticulados com cálcio. De acordo com Rhim [17], a reticulação iônica com íons cálcio reduz a mobilidade das cadeias do alginato, reduzindo a permeabilidade aos vapores de água. Esse resultado também pode ser relacionado com as propriedades mecânicas do filmes, que apresentaram maior valor de módulo de Young e tensão máxima que os filmes reticulados com EDC. As matrizes apresentaram a mesma ordem de intumescimento observada nos filmes, entretanto com maior RI como observado na Figura 4 (A) para os filmes e (B) para as matrizes reticulados com EDC. Por exemplo, o filme da blenda AS/P 30/70 apresentam um valor de RI em torno de 2,5 comparado com 13 na matriz na mesma composição. O aumento da RI em relação aos filmes é devido à presença dos poros que apresentaram tamanhos dependentes da composição alginato/pectina e do agente reticulante utilizado. Em geral, o intumescimento de um material diminui à medida que o grau de reticulação aumenta [22] e pode ser usado como uma medida da reticulação das estruturas.
9 RI (g/g) P AS/P 30/70 AS/P 50/50 AS/P 70/30 AS RI (g/g) AS AS/P 70/30 AS/P 50/50 AS/P 30/70 P Tempo (h) Tempo (h) (A) (B) Figura 4 Razão de intumescimento em função do tempo (h) dos filmes (A) e matrizes porosas (B) reticulados com EDC. Outra característica das matrizes reticuladas com EDC, é que essas apresentaram maior RI que as matrizes reticuladas com cálcio, por exemplo, a matriz AS/P 30/70 reticulada com cálcio apresentou RI de 5,7 enquanto a matriz reticulada com EDC, a RI foi de 13. Esse resultado foi devido ao tamanho dos poros e a maior mobilidade das cadeias unidas por ligações covalentes. As propriedades mecânicas das matrizes também apresentaram menor módulo de compressão e tensão máxima em relação as matrizes reticuladas com cálcio. Conclusões Todas as blendas de alginato de sódio/pectina, tanto na forma de filmes quanto na forma de matrizes porosas apresentaram propriedades intermediárias aos polissacarídeos puros, portanto nenhum efeito sinérgico foi observado. O uso de cálcio ou EDC como agente reticulante pode modular algumas propriedades como intumescimento, propriedades mecânicas, principalmente para as matrizes porosas devido a formação dos poros. Com base nos resultados é possível a utilização de blendas de alginato de sódio/pectina na preparação de filmes e matrizes porosas reticuladas, reduzindo o custo do produto final com a substituição parcial do alginato de sódio pela pectina. Estes filmes e matrizes podem ser utilizados como sistemas de liberação de fármacos e bandagens para lesões e/ou queimaduras, apresentando boas propriedades mecânicas, alta capacidades de intumescimento e no caso das matrizes, poros interconectados que são fundamentais para o crescimento do tecido lesionado. Agradecimentos A CAPES pela bolsa concedida.
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