PRINCÍPIOS DA CICATRIZAÇÃO ÓSSEA (Revisão de literatura)

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS PRINCÍPIOS DA CICATRIZAÇÃO ÓSSEA (Revisão de literatura) Késia Sousa Santos Orientador (a): Neusa Margarida Paulo Goiânia 2011

2 II KÉSIA SOUSA SANTOS PRINCÍPIOS DA CICATRIZAÇÃO ÓSSEA (Revisão de literatura) Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós- Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás. Nível: Mestrado Área de Concentração: Patologia, Clínica e Cirurgia Animal Linha de Pesquisa: Técnicas Cirúrgicas e Anestésicas, Patologia Clínica Cirúrgica e Cirurgia Experimental Orientador (a): Profª. Drª. Neusa Margarida Paulo EVZ/UFG Comitê de Orientação: Profª. Drª. Liliana Borges de Menezes IPTSP/UFG Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno EVZ/UFG Goiânia 2011

3 III SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA O tecido ósseo Composição química do osso Anatomia óssea Vascularização óssea Histologia óssea Células do tecido ósseo Cicatrização óssea Consolidação indireta da fratura A resposta inflamatória aguda O papel da superfamília do fator de crescimento transformador beta (TGF-β) na cicatrização da fratura Recrutamento de células tronco mesenquimais (MSCs) A formação de um calo ósseo cartilaginoso e periosteal Revascularização e neoangiogênese no local a fratura Mineralização e reabsorção do calo cartilaginoso Remodelação óssea Consolidação direta da fratura Cicatrização por contato Cicatrização por lacunas Distração osteogênica CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS... 29

4 IV LISTAS DE FIGURAS Figura 1 Estrutura anatômica de um osso longo evidenciando a diáfise ao longo do eixo médio do osso; enquanto a epífise, uma área mais larga em cada uma das extremidades ósseas; a metáfise, ponto de encontro entre a epífise e a diáfise, e periósteo uma camada fibrosa que recobre a superfície externa do osso que não é recoberto por cartilagem articular e o endósteo uma camada fibrosa que reveste as cavidades internas dos ossos...5 Figura 2 Suprimento sanguíneo para: A - osso normal. B - osso imaturo. C - osso fraturado (suprimento sanguíneo extra ósseo) e D - osso em cicatrização...7 Figura 3 Fotomicrografia demonstrando os componentes do Sistema Haversiano...8 Figura 4 Tipos de células ósseas...9 Figura 5 As etapas de reparo da fratura...11 Figura 6 Esquema simplificado do processo de remodelação óssea...23

5 V LISTA DE ABREVIATURAS BMPs GDFs IL MCSF MSCs OPG PDGF RANKL SDF-1 TGF-β TNF-α VEGF Proteínas ósseas morfogenéticas Fator de crescimento e diferenciação Interleucinas Fator estimulante de colônias de macrófagos Células tronco mesenquimais Osteoprotegerina Fator de crescimento derivado de plaquetas Receptor ativador do núcleo do fator Kappa B ligante Fator 1 de células derivadas do estroma Fator de crescimento transformador beta Fator de necrose tumoral alfa Fator de crescimento vascular endotelial

6 1 INTRODUÇÃO A cicatrização óssea é um processo biológico complexo que segue padrões específicos de regeneração e envolve alterações na expressão de milhares de genes. Embora haja muitos estudos para se compreender totalmente o processo de regeneração óssea, sobretudo os eventos anatômicos e bioquímicos ainda vêm sendo estudados de forma mais detalhada. Estes estudos têm proporcionado uma compreensão geral de como ocorre a consolidação da fratura (MARSELL & EINHORN, 2011). O osso tem capacidade para reparação e regeneração em reposta a uma lesão ou tratamento cirúrgico. Ambos os processos envolvem uma complexa integração de células, fatores de crescimento e matriz extracelular. O processo de reparação consiste em restaurar a continuidade dos tecidos lesados, sem necessariamente aumentar o volume ósseo. Já a regeneração é um processo que envolve a diferenciação de novas células e a formação de um novo tecido ósseo que resulta em um aumento do volume total de novos tecidos esqueléticos (AL-AQL et al., 2008). O processo de regeneração óssea pode ocorrer também por meio do uso de procedimentos cirúrgicos como a distração osteogênica (TAY et al., 1998). A consolidação de uma fratura é um processo que envolve uma sequência de etapas que são iniciadas em reposta a uma lesão, resultando eventualmente no reparo e restauração da função (AL-AQL et al., 2008). Os processos biológicos são controlados por mecanismos moleculares complexos que envolvem fatores locais e sistêmicos, que interagem com muitos tipos de células, recrutados para a lesão acidental ou cirúrgica dos tecidos adjacentes e para a circulação (AL-AQL et al., 2008). A consolidação do osso pode ocorrer de uma forma direta ou indireta, que consiste tanto na formação óssea intramembranosa ou endocondral. O processo de cicatrização indireta é mais comum, uma vez que a cicatrização direta requer redução anatômica e uma estabilização do foco de fratura, que na maioria das vezes é obtida por redução aberta e fixação interna. No entanto, quando tais condições são alcançadas, a cicatrização direta

7 2 permite uma regeneração anatômica do osso lamelar e dos sistemas de Havers, sem a necessidade da etapa de remodelação (MARSELL & EINHORN, 2011). A formação óssea endocondral ocorre geralmente na parte externa ao periósteo, em regiões que são imediatamente adjacentes ao local da fratura e, mecanicamente menos estáveis. Já a ossificação intramembranosa ocorre na parte interna ao periósteo nas bordas proximal e distal do calo, onde formam um calo duro (DIMITRIOU et al., 2005). Essa transição de calo rígido ao redor do foco de fratura é que fornece uma estabilização inicial e recuperação da função biomecânica (GERSTENFELD et al., 2006). Durante cada uma dessas fases os processos biológicos são regulados por moléculas de sinalização que podem ser categorizados em três grupos: (1) citocinas pro-inflamatórias, (2) membros da super família do fator de crescimento transformador-beta (TGF-β), e (3) fatores angiogênicos. Cada um desses grupos de citocinas e outras proteínas têm atividades biológicas que promovem sobreposição dos processos biológicos e interações entre os diferentes tipos de células. Como por exemplo, as células-tronco mesenquimais se diferenciam em células mais especializadas que promovem efeito em cada uma das outras atividades (PENG et al., 2005). Durante as últimas décadas, os estudos sobre a cicatrização da fratura evoluíram rapidamente. É sabido que o osso é um dos poucos tecidos que podem cicatrizar sem que haja a formação de uma cicatriz fibrosa. Assim, o processo de desenvolvimento e reorganização da fratura pode ser considerado uma forma de regeneração óssea. No entanto, apesar da capacidade regenerativa do tecido ósseo, esse processo às vezes falha e as fraturas podem cicatrizar em posições anatômicas desfavoráveis, ter um atraso no tempo de cicatrização, ou até mesmo desenvolver uma pseudoartrose ou não união óssea (MARSHELL & EINHORN, 2010). A fim de evitar falhas no processo de cicatrização das fraturas, vários estudos em humanos e modelos animais têm fornecido informações sobre as etapas que regulam o processo biológico da cicatrização das fraturas, além de promoverem orientação para novas pesquisas (EINHORN, 2005). O uso de modelos animais tornou possível investigar a cicatrização das fraturas sobre várias perspectivas como a histológica, bioquímica e

8 3 biomecânica e tem sido, portanto, uma ferramenta importante na compreensão do processo de cicatrização óssea (BONNARENS & EINHORN, 1984). O objetivo desta revisão é caracterizar os eventos celulares que contribuem para o processo de cicatrização e descrever as complexas vias de sinalização das moléculas envolvidas.

9 4 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 O tecido ósseo Composição química do osso O osso é constituído basicamente por dois componentes: orgânicos e inorgânicos. A porção orgânica é formada por células (osteoblastos, osteócitos e osteoclastos), fibras colágenas e substância base (proteoglicanos e glicoproteínas). A parcela orgânica da matriz óssea é secretada principalmente pelos osteoblastos. O principal componente inorgânico é o fosfato de cálcio, responsável por dois terços do peso ósseo. O fosfato de cálcio interage com o hidróxido de cálcio transformando-se em hidroxiapatita. Conforme ocorre a formação dos cristais de hidroxiapatita, outros materiais inorgânicos como o carbonato de cálcio, sódio, magnésio e fluoreto vão se incorporando a ele (CONSTANTINESCU, 2002) Anatomia óssea No desenvolvimento dos ossos longos, chamamos o corpo do osso de diáfise e a extremidade de epífise. A diáfise é formada por medula óssea circundada por osso compacto, que constitui uma densa barreira protetora. Geralmente mais larga que a diáfise, a epífise é formada principalmente de osso esponjoso, o qual é constituído por uma trama de ossos trabeculares e medula óssea amarela ou vermelha, bem como uma fina e externa camada de osso compacto (Figura 1). Nos ossos em crescimento, o ponto de união da diáfise com a epífise é denominado metáfise. Nesta junção, existe uma placa de crescimento formada por cartilagem hialina, chamada de placa epifiseal ou fise de crescimento. Quando o processo de desenvolvimento é finalizado, a placa epifiseal é substituída pela linha epifiseal (MARIEB, 2003).

10 5 Figura 1 Estrutura anatômica de um osso longo evidenciando a diáfise ao longo do eixo médio do osso; enquanto a epífise, uma área mais larga em cada uma das extremidades ósseas; a metáfise, ponto de encontro entre a epífise e a diáfise, e periósteo uma camada fibrosa que recobre a superfície externa do osso que não é recoberto por cartilagem articular e o endósteo uma camada fibrosa que reveste as cavidades internas dos ossos. Fonte: adaptado de AKERS e DENBOW (2008). A superfície articular é constituída por uma fina camada de cartilagem hialina, a qual recobre a epífise dos dois ossos que mantém contato. A superfície externa do osso não coberta por cartilagem articular será envolta por periósteo, que é constituído por membrana conjuntiva densa irregular e unido à base óssea pelas fibras de Sharpey, oriundas das fibras presentes na matriz óssea. O periósteo contém fibras nervosas, vasos linfáticos e

11 6 sanguíneos responsáveis pelo suprimento ósseo. A superfície interna do osso é recoberta pelo endósteo, o qual envolve a cavidade medular dos ossos longos e as trabéculas dos ossos esponjosos (MARIEB, 2003) Vascularização óssea A fisiologia óssea interna, bem como os processos de cicatrização da fratura, dependem de um suporte sanguíneo adequado. Em ossos longos íntegros, a circulação consiste de suprimento aferente da artéria nutriente principal, artérias metafiseais proximal e distal e artérias periosteais que penetram no osso em áreas de forte ligação fascial (Figura 2). O fluxo sanguíneo segue do canal medular para o periósteo, ou seja, em direção centrífuga e a pressão medular, possivelmente, restringirá o fluxo sanguíneo periosteal para o terço externo do córtex. Em animais imaturos, encontramos inúmeras artérias em sentido longitudinal, que penetram no osso de formação recente, sobre a superfície periosteal. A metáfise e a epífise recebem suporte sanguíneo separadamente e não se comunicam através da fise cartilaginosa. A porção da circulação responsável pela nutrição da zona celular da reserva cartilaginosa e células fiseais em crescimento é o suprimento sanguíneo da epífise. A interrupção do aporte sanguíneo dessa porção resulta na morte das células em crescimento e suspensão da função fiseal. Entretanto, as células que participam da ossificação endocondral são supridas a partir das artérias metafiseais (FOSSUM, 2005).

12 7 Figura 2 Suprimento sanguíneo para: A - osso normal. B - osso imaturo. C - osso fraturado (suprimento sanguíneo extra ósseo) e D - osso em cicatrização. Fonte: FOSSUM (2005) Histologia óssea A unidade estrutural do osso compacto é denominada ósteon ou Sistema Haversiano. (Figura 3). Cada ósteon aparece como uma unidade cilíndrica lamelar de matriz óssea que envolve os canais de Havers. O sistema Haversiano corre paralelo ao eixo longo do osso e carrega pequenas artérias e veias. O canal de Volkmann se dispõe perpendicularmente ao eixo longo do osso, e está ligado à circulação sanguínea e aos nervos do periósteo através do canal de Havers. Os canais de Havers e de Volkmann conectam a cavidade

13 8 medular óssea à circulação por intermédio dos vasos sanguíneos, formando caminhos para que as células sanguíneas possam atingir a circulação (AKERS e DENBOW, 2008). Figura 3 Fotomicrografia demonstrando os componentes do Sistema Haversiano. Fonte: TIMOTHY, Células do tecido ósseo Encontramos no osso quatro principais tipos celulares (Figura 4): os osteoblastos, osteócitos, osteoclastos e as células osteoprogenitoras (ANDIA et al., 2006; AKERS e DENBOW, 2008).

14 9 Figura 4 Tipos de células ósseas. Fonte: TORMENA (2009). Osteoblastos são células secretoras de matriz óssea extracelular, além de colágeno e substâncias que constituem o osso não mineralizado. Durante a formação óssea, os osteoblastos secretam a matriz óssea. Porém, os osteoblastos mantém contato com outra via de conexões que contém junção comunicante. Conforme a matriz endurece, os osteoblastos amadurecem e tornam-se osteócitos ((ANDIA et al., 2006; AKERS e DENBOW, 2008). Os osteócitos são células ósseas maduras de maior população, com formato de aranha, encontradas em pequenas cavidades das junções lamelares chamadas de lacunas. Somente um osteócito é encontrado por lacuna e essas células não podem se dividir. Numerosos processos alongamse de cada osteócito para dentro dos canalículos, passando rapidamente pela matriz de mineralização e se conectando a uma lacuna adjacente. Então, há uma rede de comunicação entre o canalículo e a lacuna, fazendo com que o processo ocorra em todo o osso mineralizado. O canalículo é importante porque é dele que provem a rota pela qual o processo de um osteócito pode se contactar aos outros adjacentes. Portanto, todos os osteócitos são capazes de se comunicar entre si, carregando informações e nutrientes. Os osteócitos podem sintetizar ou absorver a matriz óssea e, caso sejam destruídos, a reabsorção da matriz óssea ocorre devido à atividade do osteoclasto, que é sucedida pela reparação ou remodelação através da atividade osteoblástica ((ANDIA et al., 2006; AKERS e DENBOW, 2008). Os osteoclastos são células multinucleadas gigantes envolvidas na reabsorção do osso e, portanto, estão presentes em áreas onde o osso está sendo removido. O osso também contém um pequeno número de células

15 10 mesenquimais conhecidas como células osteoprogenitoras, que estão localizadas na camada celular do periósteo, no endósteo e na linha vascular de passagem da matriz medular. São dessas células que se originam os osteoblastos e, portanto, são importantes para a reparação das fraturas ((ANDIA et al., 2006; AKERS e DENBOW, 2008). 2.2 Cicatrização óssea Consolidação indireta da fratura A consolidação indireta ou secundária é a forma mais comum de cicatrização das faturas, e consiste de uma cicatrização óssea endocondral e intramembranosa (GERSTENFELD et al., 2006). É caracterizada pela formação de um calo intermediário antes da formação do calo ósseo. Não exige redução anatômica e estabilização do foco de fratura. Pelo contrário, o foco de fratura é reforçado por micro movimentos. No entanto, muito movimento e/ou carga pode resultar em um atraso na cicatrização, ou até mesmo uma não união óssea (GREEN et al., 2005). A cicatrização óssea indireta ocorre normalmente no tratamento não cirúrgico de fraturas, e em determinados tratamentos cirúrgicos em que ocorrem alguns movimentos no local da fratura, como a fixação intramedular, fixação externa ou fixação interna de fraturas cominutivas complicadas (PAPE et al., 2002; PERREN, 2002). O processo de reparo em si é composto por quatro fases (Figura 5) que se sobrepõem. Inicialmente há uma fase de resposta inflamatória imediata que leva ao recrutamento de células-tronco mesenquimais e subsequente diferenciação em condrócitos que produzem cartilagens e osteoblastos, que formam o osso. Depois é produzida uma matriz cartilaginosa, que mineraliza, e ocorre uma transição para osso, com iniciativa da reabsorção da cartilagem mineralizada. A formação do osso primário é seguida por remodelação, em que o calo ósseo inicial é modificado por formação e reabsorção óssea secundária para restaurar a estrutura anatômica que suporta cargas mecânicas (GERSTENFELD et al., 2003a).

16 11 O reparo da fratura relembra o desenvolvimento embrionário normal com a participação coordenada de vários tipos de células provenientes do córtex, periósteo, tecidos moles circundantes e medula óssea (FERGUNSON et al., 1999; GERSTENFELD et al., 2003a). Figura 5 - As etapas de reparo da fratura. Fonte: adaptado de CARANO &FILVAROFF (2003) A resposta inflamatória aguda Imediatamente após o trauma, ocorre a formação de um hematoma que é constituído por células do sangue periférico e intramedulares, bem como células da medula óssea. A lesão inicia uma resposta inflamatória que é necessária para o processo de cicatrização. A resposta inflamatória faz com que o hematoma coagule entre e ao redor das extremidades da fratura, e dentro da medula formando um modelo para a formação do calo ósseo (GERSTENFELD et al., 2003b). Embora se tenha conhecimento de que uma expressão prolongada e crônica de citocinas inflamatórias tem um efeito negativo no osso, nas articulações e em presença de materiais implantados, uma secreção rápida e bem regulada de moléculas pró-inflamatórias após uma lesão aguda é fundamental para a regeneração do tecido (GERSTENFELD et al., 2003b). A resposta inflamatória aguda atinge seu pico nas primeiras 24 horas e se completa após sete dias, embora as moléculas pró-inflamatórias mais tarde

17 12 continuem desempenhando um papel importante no final da regeneração (CHO et al., 2002). A resposta pró-inflamatória inicial envolve a secreção do fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina (IL), IL-1, IL-6, IL-11 e IL-18, por macrófagos, células inflamatórias e células de origem mesenquimais (GERSTENFELD et al., 2003b). Esses fatores recrutam células inflamatórias, aumentam a síntese da matriz extracelular e estimulam a angiogênese (SFEIR et al. 2005). O pico de concentração dessas citocinas pode ser observado com 24 horas e retornam aos valores normais dentro de 72 horas após o trauma (CHO et al., 2002; GERSTENFELD et al., 2003b). Durante este período de tempo o TNF-α é expresso por macrófagos e outras células inflamatórias, e acredita-se que esse efeito seja mediado pela indução de sinais inflamatórios secundários e atua como um agente quimiotático para recrutar células necessárias (KON et al., 2001). Além de estimular a função dos osteoclastos, o TNF-α promove o recrutamento de células-tronco mesenquimais e induz a apoptose de condrócitos hipertróficos durante a formação óssea endocondral. Atrasos ou ausência da reabsorção da cartilagem mineralizada, consequentemente, impede a formação óssea. Em situações em que o TNF-α se expressa de forma mais abundante, como na cicatrização de diabéticos, ocorre uma remoção prematura da cartilagem que está associado a uma deficiência na cicatrização e formação óssea (KAYAL et al., 2007). O TNF-α também tem sido expresso in vitro para induzir diferenciação osteogênica de células tronco mesenquimais (MSCs) (CHO et al., 2006). Estes efeitos são mediados pela ativação de dois receptores TNFR1 e TNFR2 que são ambos expressos pelos osteoblastos e osteoclastos. No entanto, o TNFR1 sempre é expresso no osso enquanto que o TNFR2 é expresso somente após uma lesão, sugerindo um papel mais específico na regeneração óssea (KON et al., 2001; BALGA, 2006). A expressão de IL-1 e IL-6 aumentam novamente em associação com a remodelação durante a formação óssea secundária, enquanto que a expressão de TNF-α aumenta em associação com a reabsorção da cartilagem mineralizada no final da fase endocondral de reparo da fratura (GERSTENFELD et al., 2003c).

18 13 Entre as diferentes interleucinas, acredita-se que a IL-1 e IL-6 sejam as mais importantes na cicatrização óssea. A expressão da IL-1 se sobrepõe a do TNF-α no modo bifásico. É produzida por macrófagos na fase aguda da inflamação e induz a produção de IL-6 nos osteoblastos, promove a produção do calo cartilaginoso primário, e também promove angiogênese no local da injúria pela ativação de um dos seus dois receptores, IL-1RI ou IL-1RII (KON et al., 2001; SFEIR et al., 2005; LEE & LORENZO, 2006). A IL-6 por outro lado, é produzida somente durante a fase aguda, estimulando a angiogênese, a produção do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e a diferenciação de osteoblastos e osteoclastos (YANG et al., 2007). A expressão do receptor ativador do núcleo do fator Kappa B ligante (RANKL) e osteoprogesterina (OPG), dois membros da superfamília TNF-α, bem como o macrófago fator estimulante de colônias (MCSF), são fatores reguladores essenciais na osteoclastogênese, aumentando logo após a fase inicial da lesão, bem como durante o período de reabsorção da cartilagem mineralizada. Durante a fase de formação óssea secundária e remodelação óssea, RANK, OPG e MCSF apresentam níveis de expressão diminuídos em comparação aos observados durante a reabsorção da cartilagem (GERSTENFELD et al., 2003c) O papel da superfamília do fator de crescimento transformador beta (TGF-β) na cicatrização da fratura A superfamília do fator de crescimento transformador beta (TGF-β) consiste em um grande número de diferentes fatores de crescimento e diferenciação que incluem as proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs), fator de crescimento transformador beta (TGF-β), fator de crescimento e diferenciação (GDFs), ativinas, inibinas e a substância inibidora Mulleriana (CHO et al., 2002). Membros específicos desta família, como as BMPs (2-8), GDF (1, 5, 8 e 10) e TGF-β1-3 promovem vários estágios de ossificação endocondral e intramembranosa durante a cicatrização da fratura (CHO et al., 2002).

19 14 a) Proteínas ósseas morfogenéticas Durante o reparo da fratura, são produzidas BMPs por células mesenquimais, osteoblastos e condrócitos. As diversas BMPs funcionam independentemente ou em colaboração umas com as outras, bem como com outros membros da superfamília TGF-β, para desencadear uma cascata de eventos que promovem a formação de cartilagem e osso. Os processos celulares estimulados incluem quimiotaxia, proliferação e diferenciação de células mesenquimais, angiogênese e síntese da matriz extracelular (SAKOU, 1998; REDDI, 2001). Apesar das diversas BMPs estarem estruturalmente e funcionalmente relacionadas, elas exibem diferentes padrões de expressão nos diferentes estágios da consolidação da fratura, com base nos experimentos realizados em animais. Em estudos com murinos a consolidação da fratura, mostrou níveis máximos da expressão de RNAm de BMP-2 dentro de 24 horas após a lesão, sugerindo que este desempenha seu papel no início do reparo. Em coesão com estes achados, estudos recentes mostram que a BMP-2 é necessária para a reparação óssea pós-natal e está geneticamente associada com a manutenção da massa óssea normal. Ao contrário, a BMP-2 aparentemente não é necessária para a formação embriológica dos ossos (TSUJI et al., 2006; XIONG et al., 2006). Outros estudos in vitro examinam a diferenciação do estroma das células-tronco da médula e mostram que a BMP- 2 controla a expressão de vários outras BMPs e quando sua atividade é bloqueada, os estromas de células troncos da medula não conseguem se diferenciar em osteoblastos (EDGAR et al., 2007). AS BMP -3, BMP -4, BMP -7 e BMP -8 se expressam por um limitado período durante a cicatrização da fratura (14 a 21 dias), quando a reabsorção da cartilagem calcificada e o recrutamento osteoblástico são ativados, e ocorre a formação óssea. BMP-5 e BMP -6 e outros membros da superfamília do TGF-β são expressos de três a 21 dias durante a fratura em camundongos, sugerindo que eles têm um efeito regulador em ambas as ossificações intramembranosa e endocondral (CHO et al., 2002).

20 15 Tem sido proposto que a BMP-2, BMP -6 e BMP -9 podem ser os indutores mais potentes da diferenciação de células mesenquimais para osteoblastos, enquanto as BMPs restantes promovem a maturação dos osteoblastos comprometidos (CHENG et al., 2003). Os antagonistas de BMPs também desempenham um papel importante na reparação da fratura. YOSHIMURA et al. (2001) afirmaram que a expressão de noggin bloqueia BMP-2, BMP-4 e BMP -7, e é modulada durante a consolidação da fratura. O padrão da expressão de noggin é semelhante a de BMP-4, sugerindo que o equilíbrio noggin/bmp-4 poderia ser um fator importante na regulação da formação de calos durante a cicatrização da fratura. Isto é apoiado por descobertas que, na ausência de noggin, há excesso de osso e formação de cartilagem durante o desenvolvimento, indicando que o noggin desempenha um papel importante na limitação da formação destes tecidos (BRUNET et al., 1998). b) Fator de crescimento transformador beta Todas as três isoformas (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3), deste grupo de proteínas estão envolvidas no reparo da fratura. Elas são produzidas por degranulação plaquetária após a lesão inicial, o que sugere o seu envolvimento com o início da formação de calos (BOLANDER, 1992; BOSTROM, 1998). Certas proteínas também são produzidas pelos osteoblastos e condrócitos em fases posteriores, o que aumenta a proliferação destas células, bem como a de células mesenquimais e pré-osteoblastos (LIEBERMAN et al., 2002). Acredita-se que o TGF-β exerça uma papel importante na condrogênese e formação endocondral (BARNES et al, 1999). Ele também induz a expressão de proteínas da matriz extracelular (SANDBERG et al., 1993). Em ratos, expressão de TGF-β2 e TGF-β3 atinge seu pico sete dias após a fratura, quando a expressão de colágeno tipo II se eleva, e parece estar associada a formação de cartilagem. A expressão de TGF-β1 permanece constante durante todo o processo de cicatrização da fratura. Isto sugere que o TGF-β2 e TGF-β3 pode desempenhar o papel mais importante durante o

21 16 processo de cicatrização da fratura, uma vez que o pico de expressão ocorre durante a fase crítica da condrogênese (CHO et al., 2002) Recrutamento de células tronco mesenquimais (MSCs) Para o osso se regenerar, células-tronco mesenquimais específicas devem ser recrutadas, proliferar, e se diferenciar em células osteogênicas. O local exato de onde essas células vêm não é totalmente esclarecido. A maioria dos dados indica que estas MSCs são derivadas da medula óssea e de tecidos moles adjacentes, pesquisas recentes demostram que o processo de recrutamento e circulação das MSCs para o local da injúria possa ser de grande importância para uma cicatrização ideal (GRANERO-MOLTO et al., 2009; KITAORI et al., 2009). Inicialmente sugeriu-se que a proteína óssea morfogenética-2 (BMP-2) tem um importante papel neste recrutamento, mas outros dados demonstram que este não é o caso (BAIS et al. 2009). De fato, a BMP-2 é essencial para a reparação óssea (TSUJI et al., 2006), mas outras BMPs, tais como a BMP-7 podem desempenhar um papel mais importante no recrutamento de células progenitoras (BAIS et al. 2009) Sugere-se que o fator-1 de células derivadas do estroma (SDF-1) e proteína-g acoplado ao receptor CXCR-4 formam um eixo (SDF-1/CXCR-4) que é um regulador chave de recrutamento específico das MSCs para o local do trauma (MA et al., 2005; GRANERO-MOLTO et al. 2009; KITAORI et al., 2009). Estes estudos mostram que a expressão de SDF-1 está aumentada no local da fratura, especialmente no periósteo presente nas bordas da fratura. Os mesmos autores também demonstram que a SDF-1 tem um papel específico no recrutamento de CXCR-4 expressando MSCs para o local da fratura durante a fase de cicatrização endocondral (KITAORI et al., 2009). A importância deste eixo foi verificada durante um tratamento utilizando um antagonista anti-sdf-1 ou uma manipulação genética de SDF-1-4 e CXCR que demonstrou ser prejudicial para a consolidação da fratura (GRANERO-MOLTO et al., 2009; KITAORI et al., 2009).

22 A formação do calo ósseo cartilaginoso e periosteal Embora a consolidação da fratura consista de uma ossificação intramembranosa e endocondral, ocorre a formação de um calo cartilaginoso, que posteriormente sofre mineralização, reabsorção e é então substituído por osso que é a característica principal deste processo. Após a formação do hematoma primário, é formado um tecido de granulação rico em fibrina (RAHN, 2002). Dentro desses tecidos, ocorre a formação endocondral entre as extremidades da fratura e o periósteo. Essas regiões são mecanicamente menos estáveis e o tecido cartilaginoso forma um calo que promove maior estabilidade na região local da fratura (DIMITRIOU et al., 2005). Em modelos animais (ratos, coelhos e camundongos) o pico de formação de calos moles ocorre em 7-9 dias após o trauma, com um aumento de procolágeno tipo II e de marcadores nucleares de proteoglicanos de proteínas extracelulares (EINHORN, 1998). Ao mesmo tempo, ocorre uma resposta subperiosteal de ossificação intramembranosa diretamente adjacente às extremidades distais da fratura, formando um calo duro. A transição do calo duro para o centro da fratura, fornece uma estrutura semi-rígida que permite a sustentação do peso (GERSTENFELD et al., 2006). A formação dos calos é dependente do recrutamento de MSCs dos tecidos moles adjacentes, córtex, periósteo e medula óssea, bem como da mobilização sistêmica de células-tronco hematopoiéticas. Uma vez recrutadas, uma cascata molecular produz matriz de colágeno tipo I e de colágeno tipo II e sinaliza a participação de várias moléculas de peptídeos. Neste processo os integrantes da família do TGF-β têm se mostrado de grande importância. O TGF-β2, TGF-β3 e GDF-5 estão envolvidos na condrogênese e na ossificação endocondral, enquanto que sugere-se que a BMP-5 e BMP-6 pode induzir proliferação celular na ossificação intramembranosa do periósteo local (CHO et al., 2002; MARSELL & EINHORN, 2009). Além disso, como mencionado acima, a BMP-2 tem se mostrado crucial no início do processo de cicatrização, como observado em camundongos com mutações inativadoras de BMP-2 que não são capazes de formar calos, impedindo a cicatrização das fraturas com sucesso (TSUJI et al., 2006).

23 Revascularização e neoangiogênese no foco da fratura A consolidação das fraturas requer um suprimento sanguíneo e a revascularização é essencial para o sucesso da reparação óssea (KERAMARIS et al., 2008). Na cicatrização da fratura endocondral, isso não envolve apenas as vias angiogênicas, mas também a apoptose de condrócitos e a degradação cartilaginosa, bem como a remoção de células e matrizes extracelulares que são necessárias para permitir que ocorra o crescimento de vasos sanguíneos no local do reparo (AI- AQL et al., 2008). Uma vez que este padrão estrutural é alcançado, o processo de vascularização é regulado principalmente por duas vias moleculares, uma via angiopoietina-dependente e uma via de fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)-dependente (TSIRIDIS et al., 2007). As angiopoietinas, principalmente a angiopoietina-1 e angiopoietina- 2 são proteínas vasculares morfogenéticas. O papel da angiopoietina no reparo da fratura não é tão bem compreendido como na via VEGF. Sua expressão é induzida no início do processo de cicatrização, sugerindo que promova um crescimento vascular inicial dos vasos existentes no periósteo e estão associadas à formação de vasos de maior calibre e ao desenvolvimento de ramos colaterais a partir dos vasos existentes (LEHMANN et al., 2005). No entanto, a via VEGF é considerada a chave reguladora da regeneração vascular. Tem sido mostrado que tanto os osteoblastos quanto os condrócitos hipertróficos expressam altos níveis de VEGF, promovendo a invasão de vasos sanguíneos e a transformação de uma matriz cartilaginosa avascular em um tecido ósseo vascular (KERAMARIS et al., 2008). O VEGF promove a vasculogênese, agregação e proliferação de células endoteliais e células tronco mesenquimais em um plexo vascular, e a angiogênese, que é o crescimento de novos vasos a partir de outros já existentes (KANCZLER & OREFFO, 2008). Assim, o VEGF desempenha um papel crucial na neoangiogênese e revascularização do local da fratura. Sua importância nestes processos é ainda sustentada por observações, em que a adição de VEGF em excesso promove uma excelente cicatrização da fratura, enquanto que os bloqueios dos receptores do VEGF inibem o crescimento

24 19 vascular e promovem atrasos ou impedem o processo regenerativo (AI- AQL et al., 2008; KERAMARIS et al., 2008). Vários outros fatores como as interações sinérgicas das BMPs com VEGF e o estímulo mecânico também podem ter efeitos pró-angiogênicos contribuindo para melhorar as atividades angiogênicas de forma VEGFR2-dependente (AI- AQL et al., 2008; KANCZLER & OREFFO, 2008). Pesquisas comparando o perfil da expressão dos reguladores de angiogênese demostraram que os fatores expressos mais prevalentes ao longo do processo de cicatrização óssea foram angiopoietina-2, fator derivado do pigmento endotelial, pleiotrofina, Tie1, e o inibidor de crescimento vascular endotelial (GERSTENFELD et al., 2003c). Os membros da família VEGF detectáveis durante a consolidação da fratura são o VEGF-D, VEGF-A e VEGF-C. Eles são expressos ao longo da fase condrogênica da cicatrização, atingindo níveis máximos de expressão durante as fases finais de calcificação dos tecidos cartilaginosos, no momento em que se inicia a reabsorção. A relação entre a expressão de alguns fatores angiogênicos e citocinas pró-inflamatórias tem sido mostrado em camundongos sem receptores de TNF. A ausência de receptores de sinalização TNF diminui a expressão de angiopoietinas, metaloproteinases e do inibidor de crescimento vascular endotelial durante a cicatrização da fratura. No entanto, a expressão de membros da família VEGF que promovem diretamente a formação de novos vasos não é inibida. Os resultados deste estudo sugerem que, depois da injuria, os vasos existentes são primeiramente dissociados em um pool de células endoteliais não divisíveis através da ação da angiopoietina-2 e do inibidor de crescimento vascular endotelial, este último limitando a proliferação (AL-AQL et al., 2008). No momento em que a reabsorção da cartilagem e a remodelação óssea são iniciadas, há um aumento dos níveis de VEGF, que estimulam células deste grupo de progenitores e promovem a participação destas células endoteliais na neoangiogênese. Estes resultados sugerem que a sinalização do TNF-α por condrócitos controla a vascularização da cartilagem através da regulação da angiopoietina e do fator inibidor de crescimento vascular endotelial, que desempenham as funções de contrabalancear a supressão da

25 20 indução do crescimento e a apoptose de células endoteliais (AL-AQL et al., 2008). Apesar da menor relação, o terceiro membro da família do sistema de sinalização angiogênico é o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). O PDGF um grupo de fatores que pertencem estruturalmente a uma maior família, que incluem o VEGF e o fator de crescimento plaquetário (HELDIN & WESTERMARK, 1999). Os PDGFs são secretados a partir de grânulos alfa de plaquetas, bem como de células endoteliais, de células vasculares do musculo liso e de macrófagos (MEYER-INGOLD & EICHNER, 1995). Existem diversas formas de PDGF (PDGF-A-B-C- e D), que formam hetero e homodímeros que são biologicamente ativos. As formas de PDGF encontrados em plaquetas humanas PDFG-AA, PDFG-AB e PDGF-BB se ligam a receptores PDGF alfa e beta. As células-alvo do PDGF são células mesenquimais que incluem principalmente fibroblastos dérmicos e células musculares lisas. Estes tipos de células expressam maior nível de receptores PDGF-β (HELDIN & WESTERMARK, 1999). A ação do PDGF depende de células-alvo, do estímulo de células em proliferação, quimiotaxia, sobrevivência e mobilização de cálcio das reservas intracelulares (DILIBERTO et al., 1992). Os PDGFs também têm um papel na remodelação do tecido conjuntivo através da estimulação da colagenase (BAUER et al., 1985). De acordo com esses achados, o PDGF-BB tem sido efetivamente utilizado com um agente terapêutico para melhorar a cicatrização cutânea (PIERCE et al., 1988; PIERCE et al., 1989). Sugere-se que o PDGF seja um fator essencial na remodelação óssea por mostrar uma melhor migração e proliferação de osteoblastos e uma melhor secreção de osteoclastos (KUBOTA et al., 2002). Os resultados da administração sistêmica de PDGF em ratas ovariectomizadas demonstrou um aumento da força e da densidade óssea (MITLAK et al., 1996). O PDGF aumenta a formação de uma matriz mineralizante in vitro (HSIEH e GRAVES, 1998) e aumenta a formação óssea na regeneração periodontal in vivo (SARMENT et al., 1994). O PDGF exógeno aumenta a densidade do calo e a formação óssea associada com a consolidação de osteotomias (NASH et al., 1994). O PDGF pode ser detectado no calo tecidual obtido a partir da cicatrização de fraturas durante a formação óssea (ANDREW et al., 1995).

26 21 Para FUJII et al. (1999) o PDGF é um componente essencial na consolidação normal de fraturas em modelos animais. Ao contrário, o PDGF em associação com a expressão de TGF-β, fator-β de crescimento fibroblástico, BMP-2 e BMP-14 está ausente em fraturas que não cicatrizam corretamente (BROWNLOW et al., 2001) Mineralização e reabsorção do calo cartilaginoso Para que a regeneração óssea progrida, o calo mole principal precisa ser reabsorvido e substituído por um calo ósseo. Esta etapa da consolidação da fratura, em certo ponto, lembra o desenvolvimento ósseo embriológico com uma combinação de proliferação e diferenciação celular, com aumento do volume celular e aumento da deposição de matriz (BREUR et al., 1991). A ligação entre a regeneração óssea e o desenvolvimento ósseo foi reforçada por um recente entendimento do papel da família de moléculas Wnt, que é de grande importância na embriologia e também mostrou ter um importante papel na cicatrização óssea. Acredita-se que família Wnt regula a diferenciação de MSCs pluripotentes em linhagem osteoblástica, e em estágios mais avançados de desenvolvimento regula de forma positiva a formação óssea osteoblástica (CHEN & ALMAN, 2009). O calo de fratura prolifera condrócitos, e os mesmos se tornam hipertróficos e a matriz extracelular torna-se calcificada. O processo de cicatrização ativado principalmente pelo macrófago fator estimulante de colônias (M-CSF), receptor ativador do núcleo do fator kappa B ligante (RANKL), osteoprotegerina (OPG), e TNF-α inicia a reabsorção desta cartilagem mineralizada (BARNES et al., 1999; GERSTENFELD et al., 2003b). Durante este processo M-CSF, RANKL e OPG também ajudam a recrutar células ósseas e osteoclastos para formar o osso esponjoso. O TNF-α ainda promove o recrutamento de MSCs com potencial osteogênico, mas seu papel mais importante é iniciar a apoptose de condrócitos (GERSTENFELD et al., 2003b).

27 22 O mecanismo de calcificação envolve o papel da mitocôndria, que contém grânulos de cálcio, criando hipóxia no local da fratura. Depois de preparar o citoplasma, os condrócitos do calo da fratura e os grânulos de cálcio são transportados para a matriz extracelular onde se precipitam com o fosfato e iniciam a formação de depósitos minerais. Esses depósitos de cálcio e fosfato se agrupam e formam cristais de apatita (KETENJIAN & ARSENIS, 1975). O pico de formação do calo rígido é atingido geralmente em 14 dias em modelos animais, conforme definido pela histomorfometria de tecido mineralizado, mas também pela mensuração de marcadores de matriz extracelular, como o colágeno tipo I, osteocalcina, fosfatase alcalina e osteonectina (EINHORN, 1998). Com o tempo o calo rígido e a cartilagem calcificada são substituídos por osso esponjoso e se torna mais sólido e mecanicamente rígido (GERSTENFELD et al., 2006) Remodelação óssea Embora o calo rígido seja uma estrutura que proporcione uma estabilidade biomecânica, ele não restaura completamente as propriedades biomecânicas do osso normal. Para alcançar isso, o processo de cicatrização da fratura inicia uma segunda fase de reabsorção, desta vez para remodelar o calo rígido em uma estrutura de osso lamelar com uma cavidade central medular (GERSTENFELD et al., 2003b). Esta fase é bioquimicamente ativada por IL-1 e TNF- α, que mostram altos níveis de expressão durante esta fase, em oposição à maioria dos integrantes da família TGF-β, que diminuem sua expressão neste momento (AI- AQL et al., 2008; MOUNTZIARIS & MIKOS, 2008). Contudo, algumas BMPs como BMP-2 também estão aparentemente envolvidas nesta fase com níveis de expressão razoavelmente altos (MARSELL & EINHORN, 2009). O processo de remodelação é realizado por um difícil equilíbrio de reabsorção do calo pelos osteoclastos, e deposição de osso lamelar pelos osteoblastos (Figura 6). Embora o processo tenha início em torno de três a quatro semanas em modelos animais e humanos, a remodelação pode levar anos para ser completada e alcançar uma estrutura óssea totalmente

28 23 regenerada. O processo pode ocorrer mais rapidamente em animais e pacientes jovens (WENDEBERG, 1961). A remodelação óssea tem demostrado ser o resultado da produção de polaridade elétrica criada quando a pressão é aplicada em um ambiente cristalino (BASSETT, 1971). Isto é alcançado quando o carregamento axial de ossos longos ocorre, gerando uma superfície convexa eletropositiva, e uma superfície côncava eletronegativa, ativando a superfície osteoclástica e osteoblástica, respectivamente. O calo externo é então gradualmente substituído por uma estrutura de osso lamelar, enquanto que a remodelação do calo interno restabelece a característica de cavidade medular de um osso diafisário (BASSETT, 1971). Figura 6 Esquema simplificado do processo de remodelação óssea. Fonte: TORMENA (2009). Para que a remodelação óssea seja bem sucedida, um adequado suprimento sanguíneo e um aumento da estabilidade mecânica são decisivos (CARANO & FILVAROFF, 2003). Isto é claramente demonstrado nos casos em que esses fatores decisivos não são atingidos, resultando no desenvolvimento de uma fibrose atrófica, ou não união óssea. No entanto, nos casos em que se tem uma boa vascularização, mas há uma fixação instável, o processo de cicatrização evolui para a formação de um calo cartilaginoso, que resulta em uma não união hipertrófica ou uma pseudoartrose (GREEN et al., 2005).

29 Consolidação direta da fratura A consolidação direta não ocorre comumente no processo natural de cicatrização óssea. É caracterizada pela cicatrização do local da fratura sem a formação de um calo periosteal ou endosteal. Isto ocorre quando uma restauração anatômica dos fragmentos da fratura é alcançada e a fixação rígida é fornecida resultando em uma diminuição substancial da tensão interfragmentária. Portanto, este tipo de consolidação é frequentemente o objetivo principal alcançado após uma redução aberta e uma cirurgia de fixação interna. Quando esses requisitos são alcançados, a cicatrização óssea direta pode ocorrer por remodelação direta do osso lamelar, canais de Havers e vasos sanguíneos (RAHN, 2002). A redução precisa e rígida fixação parece eliminar os sinais biológicos que são conhecidos por atrair células osteoprogenitoras de tecidos moles adjacentes que contribuem para a formação do calo na cicatrização indireta (O SULLIVAN et al., 1989; RAHN, 2002). A cicatrização direta pode ocorrer por meio da cicatrização por contato ou cicatrização por lacunas, dependendo da proximidade das extremidades da fratura. Na cicatrização por contato, a união óssea e a remodelação ocorrem simultaneamente, enquanto que na cicatrização por lacunas essas etapas são sequenciais. De acordo com a espécie, normalmente leva de meses a alguns anos, antes que a cicatrização completa seja alcançada (RAHN, 2002) Cicatrização por contato A cicatrização por contato ocorre em todas as áreas onde o defeito entre as extremidades do osso é menor que 0,01mm e a tensão interfragmentar é menos do que 2% (SHAPIRO, 1988). Sob essas condições, cortes em cone são formados nas extremidades dos osteons o mais próximo do local da fratura (HULSE & HYMAN, 1993). As pontas dos cortes em cone consistem em osteoclastos que cruzam a linha de fratura, gerando cavidades longitudinais a uma velocidade de µm/dia. Estas cavidades são

30 25 posteriormente preenchidas por ossos produzidos pelos osteoblastos que residem na parte posterior dos cortes de cone. Isto resulta, simultaneamente, em união óssea e restauração do sistema de Havers formados na direção axial (KADERLY, 1991; RAHN, 2002). O restabelecimento do sistema de Havers permite a penetração de vasos sanguíneos que transportam precursores osteoblásticos (GREENBAUM & KANAT, 1993; EINHORN, 1998). A transição dos osteons maduros para uma remodelação direta em osso lamelar resulta em uma cicatrização de fratura sem a formação de um calo periosteal. O novo osso lamelar é alinhado paralelamente ao eixo longo do osso, e é menos denso do que o córtex intacto, durante os primeiros meses (RAHN, 2002) Cicatrização por lacunas A cicatrização por lacuna difere da cicatrização por contato, pelo fato de que a união óssea e a remodelação de Havers não ocorrem simultaneamente. Esse processo de cicatrização ocorre quando a redução anatômica e as condições estáveis das extremidades da fratura são alcançadas, e desde que a distância entre as extremidades seja menor que 800µm e 1mm, e a tensão interfragmentar menor que 2% (KADERLY, 1991). Neste processo o local da fratura é preenchido principalmente por osso lamelar orientado perpendicularmente ao longo do eixo do osso, exigindo uma reconstrução osteonal secundária, ao contrário do processo de cicatrização por contato (SCHENK & HUNZIKER, 1994). A estrutura óssea primária é, então, gradualmente substituída por osteons longitudinais revascularizados carreando células osteoprogenitoras que se diferenciam em osteoblastos e produzem osso lamelar em cada superfície do osso. Este osso lamelar, no entanto, se estabelece perpendicularmente abaixo do eixo longitudinal e é mecanicamente fraco (SHAPIRO, 1988). A remodelação de Harvers ocorre aproximadamente entre três a oito semanas, após o qual uma remodelação secundária se inicia, lembrando a que ocorre com o processo de cicatrização por contato com cortes de cones.

31 26 Embora não seja tão extenso como a remodelação endocondral, essa fase é necessária para restaurar as propriedades anatômicas e biomecânicas do osso (SHAPIRO, 1988) Distração osteogênica A distração osteogênica é um procedimento cirúrgico controlado que inicia um processo de regeneração e utiliza esforço mecânico para melhorar a resposta biológica dos tecidos lesados e formar um novo osso. Este modelo cirúrgico é utilizado para unir defeitos como fraturas que não cicatrizam, para tratar doenças como a osteomielite, em que o ocorre uma destruição do tecido ósseo, para aumentar o osso alveolar ao redor dos dentes perdidos e para corrigir deformidades esqueléticas congênitas onde há uma deficiência na estrutura do esqueleto original (TAY et al., 1998). A distração osteogênica (DO), no entanto, é um processo de regeneração óssea no qual a osteotomia seguida por distração gradual produz duas superfícies de osso vascularizadas, a partir do qual um novo osso é formado. Primeiramente descrita por CODIVILLA (1905) para o tratamento de membros com diferenças de comprimento. A partir do trabalho de ILIZAROV (1989) tornou-se um método utilizado para melhorar a regeneração óssea na clinica ortopédica e cirurgia oral/maxillofacial (ARONSON, 1994). Três modos de ossificação ocorrem durante a DO. Embora a ossificação endocondral ocorra durante o estágio inicial da DO, a formação óssea intramembranosa é o mecanismo de ossificação predominante, principalmente nos estágios posteriores. Têm-se sugerido ocorrer uma terceira forma de ossificação chamada de formação óssea transcondroíde. Durante a ossificação transcondroíde, o osso condroíde é formado diretamente por células como os condrócitos, com transição gradual de tecido fibroso para osso. A cartilagem que se forma durante a DO é geralmente observada no periósteo, mas não entre as extremidades do córtex dentro das lacunas de distrações (YASUI et al., 1997; CHOI et al., 2002). A distração osteogênica pode ser dividida em três tempos e fases dinâmicas: latência, distração e consolidação. A fase de latência permite que

32 27 ocorra uma resposta inicial no local do trauma. Ela começa imediatamente após a criação da osteotomia e se estende até o início ativo da distração. Os eventos realizados no local do trauma durante esta fase são basicamente os mesmos das fases iniciais de reparo da fratura. No entanto, até que a fase de distração seja iniciada, o processo de resposta inflamatória primária já foi concluído. Durante a fase de distração, forças de tensão são aplicadas aos calos com um ritmo e frequência específica. À medida que o calo é estendido, uma zona fibrosa central, chamada de interzona fibrosa (FIZ), se forma. Esta é rica em células como os condrócitos, fibroblastos e células ovais, que são morfologicamente intermediárias entre fibroblastos e condrócitos (VAUHKONEN et al., 1990; ARONSON, 1994; SATO et al., 1998). A diferenciação dos osteoblastos na interzona fibrosa deposita osteoíde ao longo dos feixes de colágenos. Eles subsequentemente sofrem cristalização mineral paralela aos feixes de colágeno, formando uma zona chamada de zona de formação de microcoluna (MCF). Entre a interzona fibrosa e a microcoluna de formação, é observada uma zona de alta proliferação de células, chamada de matriz principal ou frente de mineralização. Uma vez que o comprimento do osso desejado é alcançado, a distração cessa, marcando o início da fase de consolidação, onde osso e uma extensa quantidade de osteoíde sofrem mineralização e eventual remodelação (ARONSON et al., 1990). Acredita-se que a regeneração óssea durante a distração osteogênica ocorra em resposta a uma tensão mecânica aplicada ao calo durante a cicatrização. O mecanismo exato pelo qual a tensão estimula a formação óssea permanece incerto. Tem sido sugerido que os tecidos vivos tornam-se metabolicamente ativados por tração lenta e constante, um fenômeno chamado mecano-transdução, caracterizado pela estimulação proliferativa e de funções celulares biossintéticas (ILIZAROV, 1989). Apesar de a distração regenerar os tecidos do osso por um processo muito diferente do de reparo da fratura, os sinais moleculares que conduzem o processo regenerativo são similares e incluem citocinas pró-inflamatórias, o fator de crescimento transformador da superfamília beta e os fatores angiogênicos (AL-AQL et al., 2008).