PROSPECÇÃO DE LIPASE E PROTEASE ADAPTADAS AO FRIO DE MICRO-ORGANISMOS DA ANTÁRTICA

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1 PROSPECÇÃO DE LIPASE E PROTEASE ADAPTADAS AO FRIO DE MICRO-ORGANISMOS DA ANTÁRTICA PROSPECTION OF LIPASE AND PROTEASE COLD-ADAPTED FROM ANTARCTIC MICROORGANISMS Resumo Fábio José Inforsato (1) Lara Durães Sette (2) Micro-organismos provenientes de ambientes extremos são de grande interesse industrial para vários processos. Os micro-organismos isolados e utilizados no presente trabalho foram isolados de amostras provenientes de sedimentos marinhos da Antártica e submetidos a estudos de produção de duas enzimas de aplicação industrial e ambiental que são as lipases e proteases, através do enriquecimento do meio com azeite de oliva (para lipase) e Skim Milk (para protease) com o objetivo de selecionar os melhores produtores dessas enzimas. Do ponto de vista ambiental, essas enzimas podem ser aplicadas para o tratamento de dejetos industriais, principalmente do ramo alimentício. O melhor resultado para atividade da lipase foi da levedura 6A-1C2II com o valor de 0,88 U.mL -1 e para protease o melhor resultado foi do fungo 4A-1C615III com atividade de 6,21 U.mL -1. Palavras-chave: Lipase. Protease. Psicrofilicos. Psicrotolerantes. Resíduos. Abstract Microorganisms from extreme conditions are very interesting for several industrial processes. The microorganisms isolated and used in this work were isolated Antarctic marine sediments samples and submitted to studies related to the production of two enzymes for industrial and environmental application that are lipases and protease,by enriching the medium with olive oil (for lipases) and Skim Milk (for proteases) in order to select the best producers to these enzymes. From environmental point of view, both enzymes can be used in industrial waste treatment, mainly in the food industry. The best result for lipase was from the yeast 6A-1C2II with the value of 0,88 U.mL -1 and to protease the best result was from the fungi 4A-1C615III with the activity of 6,21 U.mL -1. Keywords: Lipase. Protease.Psycrophilics.Psychrotolerant. Waste. 1 Introdução Micro-organismos que habitam ambientes extremos, com temperaturas muito elevadas ou baixas e outras condições adversas, estão sendo alvo de estudos crescentes, visto que podem apresentar produção de um determinado produto com grande eficiência e ao mesmo 1 Mestrando em Microbiologia Aplicada pela Universidade Paulista Campus de Rio Claro. Endereço eletrônico: fabio.2009.chemistry@outlook.com.br 2 Docente da Universidade Paulista Câmpus de Rio Claro. Ciências Biológicas Endereço: larasette@rc.unesp.br

2 & tempo diminuir a necessidade de reagentes e consumo energético em plantas industriais (GOMES et al., 2007). Lipases (EC ) são enzimas de ocorrência natural e produzidas por animais, vegetais e micro-organismos. As lipases apresentam uma grande gama de aplicações: na indústria de produtos de limpeza para potencializar a ação de sabões e detergentes com objetivo de auxiliar a remoção de manchas de gordura e óleo de tecidos e utensílios e também ambiental como no tratamento de resíduos industriais (MARTINS et al., 2008; DAMASO et al., 2008; FEITOSA et al., 2010). Proteases estão entre as enzimas mais utilizadas nas indústrias, sendo responsáveis por aproximadamente 60-65% do comércio mundial de enzimas. (MURI et al., 2014; CORTALET et al., 2011; SANTOS et al., 2013). As enzimas adaptadas ao frio também possuem alta atividade catalítica e boa atuação em temperaturas medianas (15-25ºC), o que é muito interessante para processos industriais e de tratamento de rejeitos a temperatura ambiente (GEORLETTE et al., 2004; SIDDIQUI e CAVICCHIOLI, 2006). O foco do presente estudo foi o isolamento de fungos filamentosos e leveduras das amostras de sedimentos marinhos da Antártica bem como a prospecção de duas classes importantes de enzimas: as lipases e as proteases. 2 Material e Métodos As amostras de sedimentos marinhos utilizadas foram coletadas durante a OPERANTAR XXXIII (Janeiro de 2015) pela Profa. Lara Sette no âmbito do projeto PROANTAR/CNPq intitulado "A vida microbiana na criosfera antártica: mudanças climáticas e bioprospecção - MICROSFERA"; Visando favorecimento do crescimento de fungos que são potencialmente produtores de lipases e proteases a estratégia de isolamento foi composta por uma etapa de enriquecimento. Para indução do isolamento de fungos produtores de lipases e proteases foram adicionados ao meio azeite de oliva e Tween 80 e para Skim Milk, respectivamente. As amostras enriquecidas foram incubadas a 5 ºC e a 15 ºC por um período de 10 dias. Após o enriquecimento alíquotas de 200 µl das amostras foram inoculadas em 4 meios diferentes: Potato Dextrose Agar (PDA), Potato Dextrose Agar diluído 10x, Meio seletivo para basidiomiceto (BSA) adaptado (ARENZ et al., 2006) e Marine Agar adpatado (MA). Para a seleção dos fungos lipolíticos foi utilizado o Meio Tubaki modificado (15 g.l -1 de Agar, 1,0 g.l -1 de peptona, 0,5 g.l -1 de extrato de levedura, azeite 31,25 ml.l -1 ). Os

3 - fungos foram cultivados por 5 dias a 20 C. A determinação da atividade lipolítica foi realizada pelo método proposto por Yang et al. (2002). Para a seleção dos fungos proteolíticos foi utilizado inicialmente, meio sólido contendo Skim Milk como única fonte de carbono. Os fungos foram cultivados por 5 dias a 15 C. Os isolados com resultado positivo (formação de halo de degradação) foram submetidos ao teste de quantificação enzimática utilizando o método reportado por Charney e Tomarelli (1947). 3 Resultados e Discussão A estratégia de enriquecimento resultou no isolamento de 146 leveduras e 19 fungos filamentosos. Os isolados positivos no teste qualitativo para lipase (19 fungos filamentosos e 60 leveduras) foram submetidos à quantificação da atividade enzimática. A levedura 6A-1C2II isolada do sedimento proveniente do Refúgio 2 (entre marés; superficial; 2,4 C) apresentou o melhor resultado de atividade enzimática para lipase (0,88 U.mL -1 ). Dentre os fungos filamentosos, o melhor resultado (0,27 U.mL -1 ) foi obtido com o fungo 3A-1C315IIII isolado do sedimento EACF (23 m de profundidade e 0,5 C). Nos estudos de Chen et al. (1992) com o isolado Trichosporon fermentans WU C12 a atividade lipolítica máxima foi de 128 U.mL -1, após 96h de incubação a,120 RPM e 30 ºC. Silva et al. (2005) obteve resultados variando entre 1,64 e 4,97 U.mL -1 de lipase utilizando o fungo Metarhizium anisopliae em diferentes substratos, tais como: gordura de porto, azeite de oliva, óleo de girassol, durante 50h a 150 RPM e 28 ºC. Cabe resaltar que nos estudos apresentados foram realizados planejamentos experimentais para maximizar a atividade das enzimas, o que ainda não foi realizado para os micro-organismos do presente estudo. Com relação à atividade proteolítica o maior valor obtido para as leveduras foi de 0,49 U.mL -1 (produzido pela levedura 6A-1C215I isolada do sedimento proveniente do Refúgio 2; entre marés; superficial; 2,4 C). Para os fungos filamentosos o maior valor de atividade enzimática foi de 6,21 U.mL -1 (produzida pelo fungo 4A-1C615III isolado do sedimento Punta Ullman; 20,3 m de profundidade e 0,5 C). Silva et al. (2012) utilizando diferentes indutores atingiu o valor de 40 U.mL -1 para peptidases de Aspergillus fumigatus. Vázquez et al. (2008) utilizou um isolado marinho da Antártica identificado como Pseudoalteromonas sp. P9647 e obteve valores entre 63,2 e 67,1 U.mL -1 de proteases, após ensaios para determinar as melhores condições de cultivo.

4 , Os resultados obtidos demonstram o potencial dos fungos filamentosos e leveduras da Antártica para produção de lipases e proteases. Cabe destacar, que esses resultados foram alcançados em triagem inicial sem a presença de indutores e estudos de influência de variáveis no processo e produção enzimática. Fickers et al. (2006) com planejamento e determinação dos melhores parâmetros para indução da lipase da levedura Yarrowia lipolytica atingiu a atividade de 1100 U.mL -1 (biorreator 2000L, 29 ºC, 120 RPM), sendo assim os melhores produtores serão submetidos a estudos adicionais utilizando o planejamento experimental visando à otimização da produção enzimática. 4 Conclusões A estratégia utilizada para o isolamento de fungos filamentosos e leveduras de sedimento marinho da Antártica foi aplicada com sucesso, visto que das 146 leveduras e 19 filamentosos, os isolados 6A-1C2II e 3A-1C315IIII e 6A-1C215I e 4A-1C615III foram capazes de produzir lipases e proteases a 20 e 15 ºC, respectivamente. A produção de enzimas a temperaturas baixas e moderadas podem representar benefícios industriais relevantes, como a diminuição dos custos com energia elétrica. 5 Agradecimentos/Apoio financeiro À FAPESP pelo apoio financeiro (Projeto Fapesp 2013/ ) e à CAPES pela bolsa de estudos. Referências ARENZ, B. E., HELD, B. W., JURGENS, J. A., FARRELL, R. L.; BLANCHETTE, R. A. Fungal diversity in soils and historic wood from the Ross Sea Region of Antarctica. Soil Biology and Biochemistry, New Zealand, v. 38, n. 10, p , CHARNEY, J. & TOMARELLI, R. M.. A colorimetric method for the determination of the proteolytic activity of duodenal juice. Journal of Biological Chemistry, Rockville, v.170, n. 23, p , CHEN, J.; SHIMURA, S.; KIRIMURA, K.; USAMI, S.. Lipase production by Trichosporon fermentans WU-C12, a newly isolated yeast. Journal of Fermentation and Bioengineering, Osaka, v. 73, n.5, p , COTARLET, M.; NEGOITA, T. G.; BAHRIM, G.; STOUGAARD, P.. Partial characterization of cold active amylases and proteases of Streptomyces sp. from Antarctica. Brazilian Journal Microbiology, São Paulo, v. 42, n. 3, p , 2011.

5 . DAMASO, M. C. T.; PASSIANOTO, M. A.; FREITAS, S. C.; FREIRE, D. M. G.; LAGO, R. C. A.; COURI, S.. Utilization of agroindustrial residues for lipase production by solid-state fermentation. Brazilian Journal Microbiology, São Paulo, v. 39, n. 4, p , FEITOSA, I. C.; BARBOSA, J. M. P.; ORELLANA, S. C.; LIMA, A. S.; SOARES, C. M. F. Produção de lipase por meio de microrganismos isolados de solos com histórico de contato com petróleo. Acta Scientiarum. Technology, Maringá, v. 32, n. 1, p , FICKERS, P.; ONGENA M.; DESTAIN, J.; WEEKERS, F.; THONART, P.. Production and down-stream processing of an extracellular lipase from the yeast Yarrowia lipolytica. Enzyme and Microbial Technology, New York, v. 38, n. 6, p , GOMES, E.; GUEZ, M. A. U.; MARTIN, N.; SILVA, R.. Enzimas termoestáveis: fontes, produção e aplicação industrial. Química Nova, São Paulo, v. 30, n. 1, p , MARTINS, V. G., KALIL, S. J., COSTA, J. A. V.. Co-produção de lipase e biossurfactante em estado sólido para utilização em biorremediação de óleos vegetais e hidrocarbonetos. Quimica Nova, São Paulo, v. 31, n.8, p , MURI, E. M. F.. Proteases virais: importantes alvos terapêuticos de compostos peptideomiméticos. Química Nova, São Paulo, v. 37, n. 2, p , SANTOS, A. F.; VALLE, R. S.; PACHECO, C. A.; ALVAREZ, V. M.; SELDIN, L.; SANTOS, A. L. S.. EXTRACELLULAR proteases of Halobacillus blutaparonensis strain M9, a new moderately halophilic bacterium. Brazilian Journal Microbiology, São Paulo, v. 44, n. 4, p , 2013 SIDDIQUI, K. S.; CAVICCHIOLI, R.. Cold-Adapted Enzymes. Annual Review of Biochemistry, v. 75, p , SILVA, R. R.; CABRAL, T. P. F.; RODRIGUES, A.; HAMILTON, C. Production and partial characterization of serine and metallo peptidases secreted by Aspergillus fumigatus Fresenius in submerged and solid state fermentation. Brazilian Journal Microbiology, São Paulo, vol. 44, n. 1, p , SILVA, Ronivaldo Rodrigues da et al. Production and partial characterization of serine and metallo peptidases secreted by Aspergillus fumigatus Fresenius in submerged and solid state fermentatio. Brazilian Journal Microbiology, São Paulo, v. 44, n. 1, p , SILVA, W. O. B.; MITIDIERI, S.; SCHRANK, A.; VAINSTEIN, M. H.. Production and extraction of an extracellular lipase from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Process Biochemistry, North America v. 40, n.1, p , VAKHLU, J.; KOUR, A.. Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning. Electronic Journal of Biotechnology, Valparaíso, v. 9, n.1, p , VAZQUEZ, S.C.; HERNANDEZ, E.; MAC CORMACK, W.P.. Extracellular proteases from the Antarctic marine Pseudoalteromonas sp. P96-47 strain. Revista Argentina de Microbiología. Buenos Aires, v. 40, n. 1, p , 2008.

6 ( YANG, J.; KOGA, Y.; NAKANO, H.; YAMANE, T. Modifying the chain-length selectivity of the lipase from Burkholderia cepacia KWI-56 through in vitro combinatorial mutagenesis in the substratebinding site. Protein Engineering, Oxford, v. 15, n. 2, p , ZHANG, C., KIM, S. Research and Application of Marine Microbial Enzymes: Status and Prospects. Marine drugs, Basel, v.8, n.6, p , 2011.