PURIFICAÇÃO DE BETANINA A PARTIR DE Beta vulgaris L UTILIZANDO SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS

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1 PURIFICAÇÃO DE BETANINA A PARTIR DE Beta vulgaris L UTILIZANDO SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS R. P. SANTOS 1, C. M. S. d ANZICOURT 1, C. M. F. SOARES 1,2, A. S. LIMA 1,2 e R.L.SOUZA 1,2 1 Universidade Tiradentes, Av. Murilo Dantas 300, Farolândia, Aracaju, SE, Brasil 2 Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Av. Murilo Dantas 300 Prédio ITP, Farolândia, Aracaju, SE, Brasil para contato: rporto87@yahoo.com.br RESUMO A utilização de corantes de origem natural tem adquirido maior relevo no cenário mundial. Os corantes extraídos da beterraba (Beta vulgaris L.) são um exemplo disso. Até o momento, a betanina é a única betalaina aprovada para alimento. Pode-se extrair em média 0,2% de betanina de 100 g de beterraba, sendo um desafio realizar grandes extrações devido à sua estabilidade, afetada por parâmetros físico-químicos. Portanto, a escolha de uma técnica adequada para a purificação de betalainas é um desafio. Para superar este desafio, a extração líquido-líquido por meio dos SABs pode ser uma alternativa eficiente para a separação e purificação destes biocompostos. Portanto, o objetivo deste foi a formação de novos SABs constituídos por um solvente orgânico (THF e etanol) e diferentes sais inorgânicos para a purificação de betanina a partir do extrato de beterraba. Resultados demonstram que a capacidade dos sistemas à base de THF em formar duas fases aumenta de acordo com a capacidade de hidratação dos aníons. Palavras-chave: Purificação, Betanina, Sistema Aquoso Bifásico 1. INTRODUÇÃO Atualmente existe um interesse considerável em produtos naturais com propriedades antioxidantes e dietéticas, como os componentes bioativos presentes em alimentos. Destacam-se os corantes naturais, carotenóides, antocianinas (flavonóides), e os curcuminóides (Aleksic & Knezevic, 2014; Cai et al., 2003; Delgado-Vargas et al., 2000). As betalaínas são pigmentos nitrogenados solúveis em água utilizadas como fonte de corantes naturais alimentares. Apesar da presença do átomo de nitrogênio, as betalaínas não são classificadas como alcalóides, pois são de natureza ácida devido à presença de vários grupos carboxila. O ácido betalâmico é o precursor comum deste composto fenólico que pode ser dividido em dois grupos estruturais: as betacianinas e as betaxantinas (Cai et al., 2005). Dentre suas propriedades funcionais, as

2 betalaínas caracterizam-se por apresentar propriedades antioxidantes, anti-flamatórias, anticancerígenas e antimicrobianas (Brewer, 2011; Harlev et al., 2013). A betanina (CI Natural Red 33, E-number E162, betanidin 5-Ob-glucoside) é a única betalaína aprovada para utilização em alimento. Entretanto, a purificação de grandes quantidades de qualquer betalaína é difícil devido à sua instabilidade (Gonçalves et al., 2012); em torno de mg de betanina são normalmente obtidos por 100 g de beterraba (Herbach et al., 2006). Aliado a isso, a estabilidade de betalaínas é fortemente influenciada por açúcares, luminosidade, oxigênio, atividade de água, ph e temperatura. Os açúcares livres presentes no extrato de beterraba podem provocar sua fermentação e também caramelização durante o processamento de alimentos a altas temperaturas (Delgado-Vargas et al., 2000). Dentre os processos de separação pode-se destacar a extração líquido-líquido utilizando sistemas aquosos bifásicos. A principal característica da utilização desta técnica é o elevado conteúdo de água nas fases (entre 85% e 95%), permitindo a partição de biomoléculas e partículas celulares de diversas origens em condições não-desnaturantes. Além disto, os SABs apresentam vantagens que incluem a elevada biocompatibilidade com os solutos, a rápida separação de fases, alta eficiência de extração, baixa viscosidade, alta polaridade e baixo custo (LI et al., 2011). Portanto, este trabalho visa a formação de novos SABs constituídos por um solvente orgânico (THF ou etanol) e diferentes sais inorgânicos para a purificação de betanina a partir do extrato de beterraba. 2. METODOLOGIA Para a preparação dos sistemas aquosos bifásicos foram utilizados diferentes solventes orgânicos (tetrahidrofurano [99%, pureza] e etanol [ 98%, pureza]), incluindo sais inorgânicos tais como fosfato de potássio dibásico - K2HPO4, fosfato de potássio tribásico - K3PO4, carbonato de sódio - NaCO3, tiossulfato de sódio - Na2S2O3 e citrato de sódio - Na3C6H5O7 obtidos pela Sigma-Aldrich. O padrão de betanina foi também adquirido da Sigma-Aldrich A beterraba foi obtida no mercado central de Aracaju, sanitizada e armazenada a -20ºC Sistema Aquoso Bifásico Diagrama de Fases: Soluções aquosas do solvente orgânico (tetrahidrofurano e etanol) à 60% (m/m) + sais inorgânicos à 40% (m/m) foram utilizadas para a preparação das curvas binodais. As soluções tampão de citrato (ph 4.5) e tampão fosfato de sódio e potássio (ph 6) foram preparadas em concentrações de 30% (m/m). Os diagramas de fases foram determinados pelo método da turvação (cloud point) a 25 ± 1ºC e à pressão atmosférica (Pereira et al., 2010). Para correlacionar os pontos experimentais que descrevem os sistemas foi utilizado um ajuste não linear (Merchuk et al., 1998), conforme equação 1. w 1 = A exp[(bw 2 0,5 ) (Cw 2 3 )] (1)

3 onde: w1 e w2 são as porcentagens em fração de massa do componente 1 e do componente 2, respectivamente. Os parâmetros de ajuste A, B e C são obtidos pela regressão dos mínimos quadrados. Formação do Sistema: Pontos de mistura foram escolhidos por meio da observação dos diagramas de fase e utilizados para extração das biomoléculas. Para estes sistemas os componentes foram dissolvidos na solução aquosa contendo solvente orgânico (THF ou etanol), sais e extrato de Beta vulgaris L (beterraba). Em seguida, os sistemas foram centrifugados para atingir o equilíbrio (12 horas, 25ºC). As fases foram cuidadosamente separadas e pesadas, o volume das fases foi determinado e a concentração dos bioativos quantificada em cada uma delas. Obtenção do extrato: O extrato de beterraba foi obtido a partir de 250 g de beterraba (Beta vulgaris L) fresca adquiridas em comércio local. Em seguida, foram trituradas no liquidificador com 500 ml de agua milli-q e 0,5006 mg de ácido ascórbico; após isso foram filtradas em lã de vidro com auxílio de uma bomba. Para a remoção das partículas maiores o filtrado foi centrifugado por 20 min a rpm, a 4 C. Parâmetros de extração: Os coeficientes de partição foram avaliados pela concentração dos bioativos (betanina e betaxantinas) na fase de topo e de fundo, determinada de acordo com a equação 2. A recuperação do bioativo foi avaliada pelas equações 3 e 4, para as fases de topo e fundo, respectivamente. O fator de purificação (FP) foi determinado pela equação 5. K = [C T] [C F ] R T = 100/(1 + ( 1 )) (3) R V K R B = 100/(1 + R V K) (4) FP = [BS] [BS] i (5) (2) onde: RV é a razão volumétrica entre as fases (VT é o volume da fase de topo ml e VF é o volume da fase de fundo ml); CT e CB são as concentrações de bioativo (betaninas, betaxantinas ou flavonoides totais) nas fases de topo e fundo (mg/l); a concentração específica de cada bioativo (betaninas ou betaxantinas) será dividida pelo teor de flavonoides totais depois [BS] e antes [BS]i do procedimento de purificação Determinações Analíticas Determinação do valor do ph: Foi determinado por phmetro. Flavonoides totais (FT): O teor de flavonoides totais foi determinado de acordo com Dewnto (2002), com modificações. Foi adicionado 0,25 ml da amostra ou padrão de catequina,

4 1,25 ml de água destilada e 75 μl de uma solução de NaNO2 à 5% (m/v), mantido em repouso durante 6 min. Em seguida, foi adicionado 150 μl de uma solução de AlCl3 (10 %, m/v) e mantido em repouso por 5 min. Após, foi adicionado 0,5 ml de solução de NaOH (1M) e realizada leitura em espectrofotômetro SHIMADZU UV-1700, Pharma-Spec Spectrometer UV Vis a 510 nm. A curva de calibração foi preparada a partir de uma solução de padrão de catequina (0,5 mg/ml). Quantificação de betalainas: A quantificação de betalainas foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Nilson (1970) utilizando um espectrofotômetro SHIMADZU UV-1700, Pharma-Spec Spectrometer UV Vis a 537 nm, 476 nm e 600 nm. A determinação em termos de porcentagem de betanina e betaxantinas (vulgaxantina-i) foi calculada a partir das seguintes equações: x = 1,094 (A A 600 ) y = 0,258 A A 476 0,742 A 600 ) (7) onde x é a absorção de betanina e y é a absorção de vulgaxantina-i. A concentração de betalainas foi calculada em mg/ml baseado em Beer-Lambert`s Law, usando valores de absorvidade A 1% 1120 para betanina e 750 para vulgaxantina-i. 3. RESULTADOS 3.1. Diagrama de fases A escolha de solventes orgânicos alternativos e de baixo custo como o tetrahidrofurano (THF) e o etanol foram usados para avaliar sua capacidade em formar SABs com diferentes sais. Soluções aquosas de cada um dos componentes foram inicialmente preparadas e utilizadas para a determinação das curvas binodais à 25 ± 1 C. Os resultados são mostrados na Figura 1 e 2 em unidades de frações mássica (m/m). Os parâmetros de regressão (A, B e C) foram estimados por regressão de mínimos quadrados usando a Eq. 1. Seus valores com os respectivos desvios padrões (std) e os fatores de correlação (R 2 ), juntamente com os dados experimentais de frações em peso (g) para o sistema estão apresentados na Tabela 1. (6) Figura 1: Curvas binodais para os sistemas ternários compostos de [THF] + sais + água à 25 ± 1 C e pressão atmosférica.

5 Figura 2: Curvas binodais para os sistemas ternários compostos de [THF] + sais + água à 25 ± 1 C e pressão atmosférica. Tabela 1: Os parâmetros obtidos através da Equação 1 com os respectivos desvios padrão (std) e os fatores de correlação (R 2 ) para os sistemas propostos. Solvente THF + Sal Parâmetros de ajustes A B C R² Carbonato de sódio 111,4±3,281-0,703±0,011 6,57E-06±3,19E-06 0,9982 Citrato de sódio 101,3±3,583-0,470±0,011 5,57E-16±1,38E-06 0,9969 Tiossufato de sódio 94,5±3,1475-0,363± 0,009 0,000±6,70E-07 0,9990 Fosfato de sódio 72,5±1,327-0,241±0,006 6,98E-06±8,35E-07 0,9979 Tampão fosfato 59,0±1,7-0,290±0,009 2,0E-06 ±1,2E-06 0,9971 Etanol + Tampão citrato 78,9±0,4-0,219±0,002 7,7E-06±4,4E-07 0,9997 Citrato sódio 68,6±3,2-0,212±0,016 2,3E-05 ±1,7E-06 0,9980 Os diagramas de fases proporcionam informações relevantes sobre (i) a concentração necessária dos componentes para formar sistemas de duas fases aquosas; (ii) a concentração de componentes nas fases superior e inferior; e (iii) a relação de volumes de fases. Assim, é possível observar que a capacidade dos sistemas à base de THF em formar duas fases aumenta de acordo com a capacidade de hidratação dos aníons, auxiliado pela série de Holfmeister, que classifica os íons (cátions e aníons) com a capacidade em induzir salting-in ou salting-out, ou seja, a posição de um íon na série Hofmeister é determinada essencialmente pelo seu grau de hidratação. Assim, a série de Hofmeister é geralmente utilizada para explicar a capacidade dos íons em formar duas fases aquosas (Hofmeister et al., 1988). Neste caso, seguindo esta ordem: [CO3-3 ] > [HPO4-2 ] > [Citrato - ] > [S2O3-2 ]. Considerando que estes sais possuem os mesmos cátions [Na + ] mas diferentes ânions, a capacidade de formação de fase destes sais deve ser determinada pela natureza dos ânions. Os ânions, com densidades de carga mais elevados têm uma forte capacidade de hidratação do que aqueles com uma densidade de carga inferior (Forciniti et al., 1991), que conduz para a exclusão dos compostos mais hidrofóbicos (THF, neste caso) a uma segunda fase líquida.

6 3.2. Partição e Purificação da Betanina Os experimentos iniciais de partição das biomoléculas presentes no extrato de beterraba foram conduzidos em SABs à base de etanol + tampão fosfato de sódio e potássio (ph 9) e etanol + tampão citrato de sódio (ph 5,5). Os dois sistemas foram preparados a partir da escolha de um ponto de mistura em comum na região bifásica do diagrama de fases dos sistemas propostos. O SABs baseado em etanol + tampão citrato de ph 5,5 apresentaram partição de flavonoides totais e betaninas para a fase de fundo (k < 1, rica em sal) como mostrado na Figura 3. Os sistemas baseados em etanol + tampão fosfato de ph 9,0 apresentaram partição diferenciada para os biocompostos, flavonoides totais migraram para a fase rica em etanol (fase de topo) e as betaninas para a fase rica em sal (fase de fundo). Estes resultados estão diretamente associados ao ph das fases, ou seja, ph mais ácido favorece estabilidade da molécula e consequentemente à uma maior migração da betanina para a fase de fundo. Figura 3: Resultados de coeficiente de partição (k) para os flavonoides totais e betaninas utilizando SABs à base de etanol. Para aperfeiçoar os parâmetros de extração da betanina nos sistemas propostos (Figura 2), o efeito da concentração do sal foi avaliado em concentrações que variam entre 20 e 27% (m/m). A concentração de etanol foi fixado em 30% (m/m). Um aumento gradual na concentração de sal favoreceu a purificação e a recuperação da betanina para a fase inferior (rica em sal), passando de 0,22 2,17 e 48,7 75,4%, respectivamente. Esta tendência é observada para concentrações até 27% (m/m) de sal no SAB. Acima desta concentração o os valores de PF e Rt tendem a diminuir como observado na Figura 4. De acordo com Babu et al. (2008), o aumento da concentração de sal diminui a solubilidade das moléculas na fase rica em sal (fase de fundo), o que resulta em aumento de particionamento de moléculas para a fase de topo devido ao feito de salting-out. Souza et al. 2010) observou esta mesma tendência, em que a eficácia de partição de lipase pancreática é afetada negativamente em SAB a base de polímeros e sais. Os resultados de recuperação e purificação da betanina é mostrado na Figura 4, assim como os fatores de purificação das fases de topo e fundo nas Tabelas 2 e 3. A recuperação das betaninas utilizando sistemas a base de tampão citrato foi de 77,86 % ±1,20 com um fator de purificação de 2,43 ±0,22 (vezes) para a fase de fundo do SAB. Estes sistemas são mais eficazes para a partição e purificação de betaninas (Tabela 2).

7 PF R T %, sal (m/m) Figura 4: Resultados de recuperação (barras) de betanina e purificação (linha) na fase de fundo dos SABs baseados em etanol. Tabela 2: Dados de separação e purificação dos biocompostos utilizando SAB composto de etanol + tampão citrato de sódio (ph 5,5) + água a 25 ºC. Biocomposto k R (topo) R (fundo) FP (topo) FP (fundo) Flavonoides totais 0,34 ± 0,14 Betaninas 0,19±0,02 22,14±1,20 77,86±1,20 1,11±1,27 2,43±0,22 Tabela 3: Dados de separação e purificação (com os respectivos desvios) dos biocompostos utilizando SAB composto de etanol + tampão fosfato (ph 9) + água a 25 ºC. Biocomposto k R (topo) R (fundo) FP (topo) FP (fundo) Flavonoides totais 1,47±0,37 4. CONCLUSÃO Betaninas 0,90±0,03 59,64±2,84 40,36±2,84 0,11±0,02 0,18±0,01 Os resultados demonstram que a capacidade dos sistemas à base de THF e etanol em formar duas fases aumenta de acordo com a capacidade de hidratação dos aníons, seguindo esta ordem: [CO3-3 ] > [HPO4-2 ] > [citrato -] > [S2O3-2 ]. Além disso, utilizando SABs à base de etanol + tampão citrato de ph 5,5, foi possível o isolamento das betaninas para a fase de fundo (k < 1, FP = 2.43 para a fase rica em sal). Os resultados demonstram que SABs estudados são promissores para a purificação de betanina a partir do extrato de beterraba (Beta vulgaris L), uma vez que estes apresentam um ambiente estável para as betaninas.

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