TESTES SALIVARES E MICROBIOLÓGICOS NA AVALIAÇÃO DO RISCO DE CÁRIE EM ALUNOS DE ODONTOLOGIA. Almeida P C, Crosariol, S K, Canettieri A C V

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1 TESTES SALIVARES E MICROBIOLÓGICOS NA AVALIAÇÃO DO RISCO DE CÁRIE EM ALUNOS DE ODONTOLOGIA Almeida P C, Crosariol, S K, Canettieri A C V UNIVAP/FCS - Odontologia, Av. Shishima Hifumi, 2911 Urbanova São José dos Campos SP, paulacarolinasj@yahoo.com.br, soniak@univap.br, acanettieri@gmail.com Resumo- Testes salivares e microbiológicos são importantes na avaliação do risco de cárie em indivíduos. O trabalho pretendeu resgatar uma metodologia que não está sendo muito utilizada nos dias atuais, com a intenção de demonstrar a sua importância para a clínica odontológica, e consistiu em uma análise dos testes salivares e microbiológicos. Esses testes foram realizados em 32 alunos do 3 período do Curso de Odontologia da Faculdade de Ciências da Saúde da UNIVAP, no primeiro semestre de 2012, durante as aulas práticas da disciplina de Microbiologia bucal. Os resultados dos testes salivares demonstraram que o fluxo salivar médio foi de 1,89 ml/min, sendo considerado normal, e a capacidade tampão da saliva da maioria foi considerada normal. A contagem média de lactobacilos foi de UFC/ml de saliva, sendo interpretado como discreto risco de cárie, e a de estreptococos do grupo mutans foi de UFC/ml, com índice de baixa incidência de cárie. Buscou-se por meio deste trabalho esclarecer a importância dos testes para a determinação do risco de carie e a importância do uso destes em pacientes, para um diagnóstico preciso e acompanhamento da evolução do paciente após orientação adequada e controle da saúde oral. Palavras-chave: Risco de cárie, fluxo salivar, Streptococcus mutans, lactobacilos. Área do Conhecimento: Ciências da Saúde Introdução A cárie, doença infecciosa, crônica e transmissível, é causada pela ação de ácidos produzidos pela fermentação de carboidratos da dieta, principalmente a sacarose, pelo metabolismo sacarolítico de bactérias acidúricas e acidogênicas, e resulta na perda localizada e progressiva de tecido mineralizado dos dentes. Entre as bactérias carigênicas destacam-se os estreptococos do grupo mutans (EGM) e os Lactobacillus spp (GARCIA et al., 2009). Estes microorganismos além de acidogênicos, isto é, que produzem ácidos pela fermentação de carboidratos, são também considerados acidúricos porque sobrevivem na presença dos ácidos formados na placa bacteriana, ao contrário de outros microrganismos orais. Essas propriedades são importantes na etiologia da cárie dentária e explicam a sobrevivência destes microrganismos no biofilme dentário. Na cavidade oral humana as espécies mais freqüentemente encontradas do EGM são S. mutans e S. sobrinus. (DE LORENZO, 2004). Dentre os mecanismos de controle destes microorganismos está a manutenção da quantidade e da qualidade da saliva. A saliva desempenha várias funções no sistema estomatognático entre elas a limpeza mecânica das superfícies dentárias realizada pelo fluxo salivar e a remineralização do esmalte dos dentes. Indivíduos normais apresentam um fluxo salivar de 1 a 2 ml/min de saliva estimulada. A capacidade tampão da saliva é, por definição, a propriedade da saliva em manter o ph dos fluidos orais constante. É um importante mecanismo de defesa contra a cárie, pois neutraliza a produção de ácidos formados pela placa bacteriana evitando a desmineralização do esmalte e a formação da doença. A redução no fluxo salivar resulta em uma diminuição do efeito tamponante da saliva (GARCIA et al., 2009). O objetivo deste trabalho foi identificar, por meio de testes salivares e microbiológicos, o risco de cárie em alunos do curso de Odontologia, visando à divulgação do uso destes testes em indivíduos submetidos ao tratamento odontológico. Metodologia Na avaliação do risco de cárie, foram considerados dois fatores relacionados à quantidade e qualidade da saliva: o fluxo salivar e a capacidade tampão. Foram, também, realizados testes microbiológicos para isolar e contar espreptococos do grupo mutans e lactobacilos. Determinação do fluxo salivar: os alunos foram orientados a colocar o pedaço de parafina na boca, aguardar 2 min, em seguida deglutir a saliva e iniciar a mastigação da parafina marcando 5 min a partir desse momento. Durante este tempo foi solicitado para que coletassem a saliva, em intervalos, no cálice e, após os 5 min, devia-se 1

2 parar a mastigação e coletar a última porção de saliva estimulada (GARCIA et al., 2009). A quantidade de saliva coletada foi medida (em ml) e dividida pelo tempo (5 minutos) e comparada à tabela1: Tabela 1 Interpretação do teste de fluxo salivar. Velocidade de fluxo salivar normal (adulto) Velocidade acentuadamente diminuída Xerostomia 1-2ml/min Menor que 0,7ml/min Menor que 0,1ml/min Teste de capacidade tampão da saliva: Adicionouse 1 ml da saliva coletada no procedimento anterior, com o auxilio de uma pipeta, em um tubo contendo 3ml de HCl 0,005N e agitou-se a solução. Após uma espera de 10 min, com o tubo aberto, mediu-se o ph com a tira de papel indicador (GARCIA et al., 2009). Após a leitura foi realizada a comparação do resultado com a tabela 2: Tabela 2- Interpretação do teste de capacidade Tampão da Saliva Capacidade tampão normal ph final entre 5 e 7 Valores limite ph entre 4 e 5 Capacidade tampão baixa ph final menor a 4 Contagem de estreptococos do grupo mutans e lactobacilos da saliva: A partir da coleta de saliva estimulada, foram realizadas diluições seriadas. Os alunos foram orientados a realizar com o auxilio de uma pipeta esterilizada, a aspiração e rejeição da saliva, por 10 vezes, para dispersar os grumos de microrganismos. Com a mesma pipeta foi transferido 1 ml de saliva para o tubo com solução salina (tubo 1, com 9 ml) e novamente com a pipeta, fez-se movimentos de aspiração e sopro, por 5 vezes. Com outra pipeta esterilizada, foi transferido 1 ml do tubo 1 para o tubo 2, e novamente agitou-se como descrito acima. Desta forma foram obtidas diluições de 10 vezes (10-1 ) no tubo 1 e 100 vezes (10-2 ) no tubo 2. Foram utlizados dois tipos de meio de cultura seletivos, o Mitis Salivarius Bacitracina Sacarose (MSBS) para EGM e o meio Rogosa SL, para lactobacilos. (GARCIA et al., 2009). Três placas de cada meio receberam 0,1ml de saliva pura ou diluída. Nos meios MSBS, com o auxilio da alça Drigalski espalhou-se os inóculos pela superfície dos meios de cultura. A incubação foi feita a 37 0 C durante 48h em microaerofilia, pelo método da jarra com vela. Nos meios Rogosa SL, a semeadura foi feita em profundidade (pour-plate). Após dispensar 0,1 ml da saliva pura e de cada diluição em placas de Petri esterilizadas, verteu-se 15 ml do meio fundido e mantido em banho-maria à temperatura de 50 C. Foi realizado movimentos em 8 com a placa para homogeneização do meio com a saliva. A incubação foi feita a 37 C, durante 4 dias (GARCIA et al., 2009). Após, foi observado o crescimento de microrganismos e escolhidas as placas que continham de 30 a 300 colônias (UFC) para contagem. Observaram-se, nesse processo, as características peculiares das colônias sugestivas de cada tipo de microrganismo estudado. Após incubação, os EGM crescem como colônias convexas, opacas, com a aparência de vidro esmerilhado. As colônias sugestivas de lactobacilos crescidas na massa de ágar apresentam aspecto discóide. Foi realizado o cálculo do número de UFC por ml de saliva pela fórmula: N o de UFC/ml de saliva = número de colônias x 10 x fator de diluição Os resultados foram interpretados utilizando a tabelas 3 e 4: Tabela 3- Interpretação a partir da contagem de Estreptococos do grupo mutans (EGM) N de estreptococos do grupo mutans na saliva (UFC/ml) Inferior a Acima de Interpretação Baixa incidência de cárie Alta incidência de cárie Tabela 4- Interpretação a partir da contagem de Lactobacilos N de lactobacilos na saliva Risco de cárie (UFC/ml) Pequeno ou negativo Discreto Moderado Mais de Acentuado Resultados As tabelas 5 e 6 mostram os resultados relacionados à quantidade de saliva produzida por minuto e à capacidade tampão. Analisando os dados da tabela 5, percebeu-se que os valores variaram entre os alunos, oscilando entre 1 a 3 ml de saliva por minuto. A média do fluxo salivar produzido foi de 1,89 ml/min e, quando comparado à tabela 1, indicou que em média os alunos apresentaram a velocidade de fluxo salivar normal para um adulto. O valor que apresentou maior freqüência foi 2 ml/min o que determinou uma moda também dentro do que é considerado normal para a velocidade de fluxo salivar (Tabela 5). 2

3 Tabela 5- Velocidade do fluxo Salivar (ml/min) nos 32 alunos avaliados Fluxo Salivar ml/min N de alunos % de alunos com mesmo valor 1, ,6 1, ,5 1,50 1 3,1 1,80 1 3,1 2, ,8 2,20 2 6,3 2,40 1 3,1 3, ,5 Os valores do ph final, após a exposição da saliva de cada aluno a um ácido, variaram entre 3,0 e 7,0. Em média os alunos apresentaram ph 5,14 o que os colocou na faixa de normalidade para capacidade tampão da saliva, quando comparado com a tabela 2. O valor de ph que apresentou maior freqüência foi 5,0 o que determinou uma moda também dentro do normal para a capacidade tampão da saliva (Tabela 6). Dois alunos (6,2%) apresentaram valores relacionados à baixa capacidade tampão da saliva, 9 (28%) ficaram nos valores limite e a maioria (65,6%) exibiu capacidade tampão normal. Tabela 6- Valor do ph final no teste de capacidade tampão da saliva nos 32 alunos avaliados Indice ph N de alunos % de alunos com mesmo valor 3,0 1 3,1 3,5 1 3,1 4,0 6 18,8 4,5 3 9,4 5,0 9 28,1 5,5 1 3,1 6,0 6 18,8 6,5 2 6,2 7,0 3 9,4 As tabelas 7, 8 e 9 permitiram a análise dos valores das contagens de microorganismos associados ao risco e incidência de cárie. A média de contagem de lactobacilos foi de UFC/ml, o que classificou os alunos como um grupo de discreto risco de cárie. Nesta análise podemos considerar que os valores variaram de UFC/ml de saliva até valores nulos, sem crescimento de colônias nas placas de cultivo, o que revelou uma alta amplitude de variação. Se considerarmos a moda o valor mais freqüente foi o de crescimento nulo, ou seja, 34,6 % dos alunos não tiveram crescimento de colônia de lactobacilos em culturas da saliva. (Tabela 7) Tabela 7- Contagem de Lactobacilos (UFC/ml de saliva) nos 32 alunos avaliados UFC/ml N de alunos % de alunos com mesmo valor , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,1 Considerando a tabela 4 e dividindo os alunos em grupos por classificação do risco de cárie obteve-se a tabela 8: Tabela 8- Distribuição dos 32 alunos conforme a classificação de risco de cárie pela contagem de lactobacilos. UFC/ml N de alunos % de alunos na mesma classificação , , ,2 > ,4 Assim, 59,4% dos alunos apresentaram pequeno/negativo risco de cárie (intervalo de 0 a 1000 UFC/ml), 25 % com discreto risco de cárie (1000 a 5000 UFC/ml), 9,4% (contagem maior que UFC/ml de saliva) possuíram acentuado risco de cárie e, somente, 6,2% alunos se encaixaram no intervalo de 5000 a 10000, apresentando risco moderado. Em média, o crescimento EGM foi de UFC/ml o que classificou os alunos avaliados em um grupo de baixa incidência de cárie. A avaliação destes dados mostrou uma grande amplitude de variação entre os resultados, desde valores nulos até UFC/ml (dados não apresentados). Baseado na tabela 3 e considerando o valor inferior a UFC/ml de saliva, observou-se que 26 alunos (81,3%) se enquadraram na 3

4 classificação de baixa incidência de cárie (Tabela 10). Tabela 9- Distribuição dos 32 alunos conforme a classificação de incidência de cárie pela contagem de EGM. UFC/ml N de % de alunos na alunos mesma classificação , ,7 As tabelas 10, 11 e 12 correlacionam os valores: EGM acima de UFC/ml, lactobacilos acima de UFC/ml e ph menor que 5,0. Observou-se que 6 alunos com contagem de EGM acima de UFC/ ml de saliva não apresentaram capacidade tampão baixa (ph menor que 4) e somente um aluno apresentou crescimento de lactobacilos acima de UFC/ml (no caso UFC/ml) (Tabela 10). Cinco alunos com crescimento de lactobacilos acima de UFC/ml não apresentaram capacidade tampão baixa (ph menor que 4) e somente um aluno apresentou contagem de EGM acima de UFC/ ml de saliva (Tabela 11). Somente um aluno com valor limite de capacidade tampão (ph 4,5) apresentou crescimento de lactobacilos acima de UFC/ml. Um aluno com capacidade tampão baixa (ph=4) apresentou contagem de EGM acima de UFC/ ml ( UFC/ml) e um aluno com valor limite de capacidade tampão (ph=4,5) apresentou contagem de EGM acima de UFC/ ml ( UFC/ml) (Tabela 12). Tabela 10- Alunos com contagem de EGM acima de UFC/ ml de saliva e comparação com valores de UFC de Lactobacilos e índice de ph. EGM Nº Lactobacilos ph UFC/ ml Aluno UFC/ ml , Tabela 11- Alunos com contagem de Lactobacilos acima de UFC/ ml de saliva e comparação com valores de UFC de EGM e índice de ph. Lactobacilos Nº EGM ph UFC/ ml Alunos UFC/ ml , , Tabela 12- Alunos com valores de ph abaixo de 5,0 e comparação com valores de UFC de EGM e Lactobacilos. ph Nº Aluno Lactobacilos UFC/ml EGM UFC/ml 3, , , , , , , , , , , Discussão Os testes salivares e bacteriológicos geralmente são realizados com a saliva estimulada porque ela apresenta vantagens em relação à saliva não estimulada, como a padronização e facilidade da técnica de coleta, o menor tempo de coleta; a remoção dos microrganismos da placa dentária obtendo-se desta forma um espécime representativo da saliva contaminada (GARCIA et al., 2009). Do ponto de vista da doença cárie, a saliva desempenha importantes papéis na cavidade bucal, sobretudo pela participação na formação da película adquirida, na lavagem e neutralização de ácidos bacterianos, sendo o fluxo salivar o fator mais relevante na análise salivar (CARVALHO et al., 2011). O fluxo salivar é responsável pela limpeza das superfícies orais e pelo transporte de microrganismos e restos alimentares que serão deglutidos, e deveria ser avaliado no início e durante o tratamento das lesões de cárie (GARCIA et al., 2009). Segundo De Lorenzo, 2004, uma taxa de saliva estimulada de menos de 0,70 ml/min é indicativa de alto risco de cárie em indivíduos com mais de 50 anos. A medida do fluxo salivar estimulado recolhido após 5 minutos pode revelar hipossalivação ou pacientes xerostômicos, indicando a necessidade de cuidados maiores com os dentes, exames médicos e intensificação das medidas preventivas (MARINHO et al., 1998). No nosso trabalho, a média do fluxo salivar produzido foi de 1,89 ml/min o que indicou uma velocidade de fluxo salivar normal para adultos, sendo considerada uma característica importante para o grupo em relação à proteção contra a cárie. A capacidade tampão da saliva é um importante mecanismo de defesa contra a cárie, 4

5 porque neutraliza a produção de ácidos formados pela placa bacteriana, evitando assim a desmineralização do esmalte e a formação de cárie. Apresenta, ainda, uma relação direta com o fluxo salivar, isto é, uma redução no fluxo salivar resulta em uma diminuição do efeito tamponante da saliva (GARCIA et al., 2009). Há uma tendência de se observar uma relação inversa entre a capacidade tampão da saliva e a atividade de cárie (JORGE, 1988), porém para indivíduos com fluxo salivar normal o valor da capacidade tampão na predição do risco de cárie é limitado quando avaliado de maneira isolada (CARVALHO et al., 2011). No nosso trabalho, mais de 65% (n=21) apresentaram capacidade tampão salivar normal, 28% (n=9) capacidade limite e 6% (n=2) baixa capacidade. Esses dois alunos com baixa capacidade tampão apresentaram baixas contagens de EGM (< UFC/ml) e contagens nulas para lactobacilos e, portanto, o risco de cárie para eles não poderá ser avaliado baseado apenas nos testes de capacidade tampão, até porque apresentaram fluxo salivar normal. Quando a dieta do hospedeiro é especialmente rica em carboidrato, a placa bacteriana dentária pode se tornar dominada por bactérias como S. mutans e Lactobacillus. Nessas circunstâncias, o biofilme se acidifica ocorrendo a desmineralização do esmalte dentário, que pode exceder as fases de remineralização, iniciando ou piorando as lesões cariosas (LOESCHE, 1986; FEATHERSTONE, 2000). Os lactobacilos representam aproximadamente 1% da microbiota oral cultivável, sendo L. casei, L. acidophilus, L. fermentum, L. cellobiosus, L. brevis e L. buchneri as espécies mais freqüentemente encontradas na cavidade oral. São acidogênicos, e acidúricos sobrevivendo na presença dos ácidos formados na placa bacteriana. Essas propriedades são importantes na participação dos lactobacilos na cárie dentária e explicam a longa sobrevivência destes microrganismos na dentina cariada. Os lactobacilos raramente estão ausentes nas bocas de adultos portadores de dentes e aumentam em número nas superfícies do esmalte e nas placas, antes do aparecimento da cárie. O aumento do número de lactobacilos da saliva precede em 3-6 meses o aparecimento de lesões de cárie (JORGE, 1988). A determinação do número de lactobacilos da saliva estimulada foi o primeiro método usado em bacteriologia para avaliar o risco de cárie (GARCIA et al., 2009). No cultivo utiliza-se o meio Rogosa SL, que é ácido (ph 5,4) e seletivo para lactobacilos, entretanto, como sua seletividade não é absoluta, considera-se que esse método estima o número de microrganismos acidúricos da saliva. A contagem de lactobacilos tem dado boa correlação com a atividade de cárie na clínica, principalmente em comparações entre pacientes cárie-ativos e cárie-inativos (DE LORENZO, 2004). A alta contagem de lactobacilos na saliva revela, em muitos casos, uma alta freqüência na ingestão de açúcar ou mesmo um grande número de lesões cariosas abertas em plena evolução (MARINHO et al., 1998), e a alteração de hábitos dietéticos para melhor, em geral, levariam a uma redução na contagem desses microrganismos (DE LORENZO, 2004). No nosso trabalho a média de contagem de lactobacilos foi de UFC/ml de saliva o que classificou os alunos como um grupo de discreto risco de cárie. Ao considerar o intervalo de 0 a 1000 UFC/ml, 59,4% dos alunos apresentaram pequeno ou negativo risco de cárie e, no intervalo de 1000 a 5000 UFC/ml, 25% dos alunos apresentaram discreto risco de cárie. A presença de S. mutans na saliva é um poderoso indicador do risco de cárie. (MARINHO et al., 1998). Os EGM são cocos Gram-positivos, imóveis, catalase negativos, que formam cadeias curtas ou médias, e constituem um complexo de espécies bacterianas do gênero Streptococcus. Na cavidade oral humana as espécies mais freqüentemente encontradas são S. mutans e S. sobrinus. (GARCIA et al., 2009). A concentração na saliva humana tem uma variação desde a não detectável até 10 7 UFC/ml, com concentração média de 10 5 UFC/ml de saliva. A alta capacidade de transporte de sacarose pelo S. mutans é provavelmente a sua principal propriedade e contribui para a acidogênese e formação de cárie dentária (HAMADA & SLADE, 1980). O único habitat natural conhecido de S. mutans é a superfície dentária. Esses microrganismos não foram encontrados na cavidade bucal antes da erupção dos dentes e uma única cepa de S. mutans pode colonizar um hospedeiro por longo período de tempo (KARN et al., 1998; DE SOETT & GRAAFF, 1998; EMANUELSSON & THORNQVIST, 2000). Os níveis salivares de EGM relacionam-se com o número de superfícies dentais colonizadas pelo organismo. Pacientes que apresentam mais de um bilhão de UFC/ml de saliva apresentaram 7,5 novas lesões num período de três anos, enquanto aqueles com níveis entre 100 mil e um milhão exibiram 4,7 e os com níveis menores que 100 mil, 3,5 novas lesões, no mesmo período (DE LORENZO, 2004). No nosso trabalho a média de crescimento de EGM foi de UFC/ml o que classificou os alunos avaliados em um grupo de baixa incidência de cárie e, nos valores inferiores a UFC/ml de saliva, 81,3% dos alunos se 5

6 enquadraram na classificação de baixa incidência de cárie. Altas contagens de S. mutans e lactobacilos e baixo fluxo salivar são características de pacientes de alto risco. Quando testes com esta finalidade são aplicados em pacientes de baixo risco observou-se menor contagem de S. mutans e lactobacilos (MARINHO et al., 1998). Nesse trabalho não se obteve nenhum aluno com alto risco de cárie. O aluno com maior contagem de EGM ( UFC/ml) apresentou capacidade tampão normal e contagem nula de lactobacilos. Destacaram-se três alunos, onde foi possível relacionar os testes de capacidade tampão e contagem de microrganismos. O fluxo salivar apresentou-se normal para todos os alunos, o que era esperado para a faixa etária estudada. Dois alunos estavam fora do grupo de baixa incidência de cárie (EGM> UFC/ml; com e UFC, respectivamente). Um deles apresentou UFC de lactobacilos/ml de saliva (acentuado risco), mas com capacidade tampão salivar normal. Outro com capacidade tampão limite apresentou UFC de lactobacilos/ml (discreto risco). Um terceiro aluno com contagem de lactobacilos de UFC/ml (acentuado risco) obteve baixa contagem de EGM ( UFC/ml), mas capacidade tampão limite. Destacamos esses três alunos (9%), como os que necessitariam de uma avaliação clínica e radiográfica para pesquisa de lesões cariosas. Não se obteve uma relação direta entre os testes, o que seria compreensível pela população estudada (alunos de Odontologia), que receberam durante o curso orientações sobre os fatores relacionados com a etiologia da cárie. Esses dados poderão servir como referência para comparação com outros grupos, como os de pacientes que ingressam na clínica odontológica. Conclusão A média do fluxo salivar foi de 1,89 ml/min sendo considerado normal para um adulto. Em média os alunos apresentam capacidade tampão da saliva normal. A contagem de lactobacilos foi em média de UFC/ml de saliva, o que significou moderado risco de cárie, mas 59,4% dos alunos apresentaram pequeno/negativo risco de cárie. A média de crescimento de EGM foi de UFC/ml o que classifica os alunos avaliados em um grupo de baixa incidência de cárie, e 81,3% foram classificados com baixa incidência de cárie. Referências - CARVALHO, V. A.; ESPINDULA, M. G.; VALENTINO, T. A.; TURSSI, C. P. Abordagens utilizadas na avaliação do risco de cárie. RFO, Passo Fundo, v. 16, n. 1, p , jan./abr DE LORENZO, J. L. Microbiologia para o estudante de odontologia. São Paulo: Atheneu, DE SOET, J.J.; de GRAAFF,J. Microbiology of carious lesions. Dent Update. V.25, n.8, p , EMANUELSSON, I.R.; THORNQVIST, E. Genotypes of mutans streptococci tend to persist in their host for several years. Caries Res. V.34, n.2, p.133-9, FEATHERSTONE, J.D.B. The science and practice of caries prevention. JADA. V.131, n.7, p , GARCIA, L. B.; BULLA, J. R.; KOTAKA, C. R.; TOGNIM, M. C. B.; CARDOSO, C. L. Testes salivares e bacteriológicos para avaliação do risco de cárie. RBAC. V. 41, n.1, p , HAMADA, S.; SLADE, H.D. Biology, immunology, and cariogenicity of Streptococcus mutans. Microbiol Reviews. V.44, n.2, p , JORGE, A.O.C. Microbiologia bucal. 2.ed. São Paulo: Santos, p. - KARN, T.A. et al. Colonization of mutans streptococci in 8- to 15- month- old children. J. Public Health Dent. V.58, n.3, p.248-9, LIMA, D. C.; SALIBA, N. A.; GARBIN, A. J. I.; FERNANDES, L. A.; GARBIN, C. A. S. A importância da saúde bucal na ótica de pacientes hospitalizados. Ciênc. Saúde Colet. V.16, n.1, p , LOESCHE, W.J. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol. Rev. V.50, n.4, p , MARINHO, V. A.; PEREIRA, G. M. Cárie: diagnóstico e plano de tratamento - Revisão de literatura - R. Un. Alfenas, Alfenas, 4:27-37,