O papel do laboratório no controlo da tuberculose

Transcrição

1 O Controlo da Tuberculose Diagnóstico e Tratamento O papel do laboratório no controlo da tuberculose Anabela Santos Silva Laboratório Nacional de Referência para Micobactérias Departamento de Doenças Infecciosas Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge Porto, 22 e 23 de Novembro 2011

2 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL (tuberculose doença) Exame directo Exame cultural Identificação TAAN Detecção molecular de resistências Teste sensibilidade aos fármacos

3 Exame directo

4 Exame directo Global tuberculosis control: WHO report 2011 (WHO/HTM/TB/ ) Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis 2011 update (WHO/HTM/TB/2011.6)

5 Exame directo Priorities for Tuberculosis Bacteriology Services in Low-Income Countries, second edition 2007, IUATLD

6 Exame directo fácil execução rápido resposta em 24h técnica pouco dispendiosa detecta casos infecciosos quantificado detecção de novos casos monitorização tratamento Limitações: baixa sensibilidade são necessários ~ 10 4 bacilos por ml de amostra para que sejam detectados não é específico para M. tuberculosis detecta bacilos álcool-ácido resistentes

7 Testes de Amplificação de Ácidos Núcleicos

8 Testes de Amplificação de Ácidos Nucleicos

9 Testes de Amplificação de Ácidos Núcleicos... the panel recommended that NAA testing become a standard practice in the United States to aid in the initial diagnosis of patients suspected to have TB, rather than just being a reasonable approach, as suggested in previously published guidelines...

10 Testes de Amplificação de Ácidos Núcleicos

11 Testes de Amplificação de Ácidos Núcleicos

12 Testes de Amplificação de Ácidos Núcleicos Sensibilidade:

13 Testes de Amplificação de Ácidos Nucleicos (TAAN) M. tuberculosis complex rápido execução em 48h específico identifica o Mycobacterium tuberculosis complex Limitações: sensibilidade variável não está aprovado para amostras extrapulmonares apenas diagnóstico exige equipamento específico e técnicos experientes teste mais caro Não substitui o exame cultural: execução das provas de sensibilidade identificação de micobactérias oportunistas

14 Detecção molecular de resistências

15 Detecção molecular de resistências TB MR

16 Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing: WHO report 2009 (WHO/HTM/TB/ )

17

18 Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis 2011 update (WHO/HTM/TB/2011.6)

19 Detecção molecular de resistências TB MR Rifampicina: mecanismo de acção: - inibição da síntese proteica - ligação à subunidade β da RNA polimerase inibe a transcrição resistência: mutações no gene rpob (codão 531, 526, 516) Isoniazida: pró-droga: activada pela enzima catalase-peroxidase KatG mecanismo de acção: - inibição da síntese dos ácidos micólicos - ligação à enzima inha resistência: mutação no gene KatG (codão 315) mutação no gene inha (região reguladora) mutação no gene ahpc, oxyr, kasa

20 Detecção molecular de multirresistência GenoType MTBDRplus amplificação + hibridização reversa Sondas wild type Sondas mutação Sonda wild type Sondas mutação Sondas wild type Sondas mutação rpob katg inha identifica as mutações mais frequentes nos genes que conferem resistência à INH e RAMP pode ser utilizado directamente em amostras biológicas com ex. directo positivo execução 2 dias

21 Detecção molecular de resistência Sistema GeneXpert MTB/RIF Global tuberculosis control: WHO report 2011 (WHO/HTM/TB/ ) Apenas identifica as mutações mais frequentes nos genes que conferem resistência à RAMP pode ser utilizado directamente em amostras biológicas com ex. directo positivo ou negativo execução 1 dia

22 Detecção molecular de resistências rápido execução em 24 48h permite resultados em culturas contaminadas específico identifica o Mycobacterium tuberculosis complex Limitações: Falsas resistências: proporção de mutantes resistentes mutações silenciosas Falsas sensibilidades: mutações não pesquisadas mutações ainda não descritas Não substitui o exame cultural: confirmação fenotípica das resistências execução das provas de sensibilidade para os outros fármacos

23 Exame cultural

24 International Union Against Tuberculosis and Lung Diseases Priorities for Tuberculosis Bacteriology Services in Low-income Countries 2nd edition, Paris, 2007

25 Exame cultural Meios sólidos sensibilidade superior ao exame directo 10 a 100 bacilos permitem obter uma cultura positiva permitem quantificar cultura positiva 15 a 20 dias cultura negativa 30 dias monitorização tratamento Meios líquidos com indicadores de crescimento sensibilidade superior aos meios sólidos 12% detecção não permite quantificar cultura positiva 5 a 15 dias cultura negativa 42 dias casos novos

26 Exame cultural maior sensibilidade 10 a 100 bacilos para cultura positiva permite identificação da espécie permite avaliação da sensibilidade aos fármacos confirmação resultados moleculares outros fármacos micobactérias não tuberculosas Limitações: método mais lento

27 Cultura positiva Meios sólidos e/ou meios líquidos Confirmar a presença de BAAR Morfologia das colónias nos meios sólidos Exame microscópico das culturas (ampliação 1000 x) Identificação métodos moleculares ensaio de hibridização protegida - hibridização com sondas de DNA (Sistema AccuProbe) amplificação + hibridização reversa (Sistema Genotype )

28 Testes de sensibilidade aos antibióticos - Método das proporções - Meios líquidos BACTEC/MGIT 960 Meio sólido (Lowenstein Jensen) Resultado 4 a 12 dias Rifampicina Isoniazida Estreptomicina Etambutol Pirazinamida Amicacina Capreomicina Etionamida Ofloxacina Linezolide 1ª- leitura ao 28º dia 2ª- leitura ao 42º dia Canamicina Ácido para-amino salicílico Cicloserina

29 Diagnóstico EXAME DIRECTO Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis 2011 update (WHO/HTM/TB/2011.6) TAAN DETECÇÃO MOLECULAR DE RESISTÊNCIAS Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis 2011 update (WHO/HTM/TB/2011.6) EXAME CULTURAL

30 Monitorização EXAME DIRECTO EXAME CULTURAL Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis 2011 update (WHO/HTM/TB/2011.6)

31 FLUXO INFORMAÇÃO - DIAGNÓSTICO LABORATÓRIO Boletins de resultados MÉDICOS Correio; Telefone FLUXO INFORMAÇÃO - VIGILÂNCIA LABORATÓRIO Notificação dos perfis de susceptibilidade Notificação dos casos de multiresistência REDES DE VIGILÂNCIA ARS- NORTE DGS Laboratório Médicos PLATAFORMA ELECTRÓNICA Médicos Redes de vigilância Laboratório

32 Global tuberculosis control: WHO report 2011 (WHO/HTM/TB/ )

33 1993 OMS considerou TB Emergência global milhões casos 1,3 1,6 milhões mortes 8,5 9,2 milhões casos 1,2 1,5 milhões mortes

34 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL (tuberculose latente)

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36 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL (tuberculose latente) Interferon-γ Release Assays (IGRAs) QuantiFERON-TB gold: Quantifica a produção de IFN- γ pelos linfócitos T circulantes Técnica de ELISA T-SPOT.TB: Quantifica o número de células mononuclerares produtoras de IFN- γ Técnica Elispot

37 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL TUBERCULOSE LATENTE Menzies D, Pai M, Comstock G Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty recommendations for research Ann Intern Med. 2007;146:

38 T SPOT.TB

39 Tipagem Molecular

40 Tipagem Molecular Aplicações estudo de surtos: investigação de contactos cadeias de transmissão noção de transmissão recente estudo das estirpes circulantes: noção de transmissão recente cadeias de transmissão distinção entre reinfecção e reactivação avaliação dos falsos positivos (laboratório) por contaminação cruzada

41 Caso I Sexo F, 26A Informação: meningite linfocitária com 3 semanas de evolução Amostra: LCR Exame directo: negativo TAAN: positivo Cultura positiva em meio líquido ao 40º dia

42 Caso II Sexo F, 26 A s/ informação clínica Amostra: Pús de joelho esquerdo Exame directo: positivo TAAN: positivo Cultura positiva em meio líquido e em LJ ao 20º dia

43 Caso III Sexo F, 11 A s/ informação clínica Amostra: Expectoração Exame directo: positivo TAAN: negativo Cultura positiva em meio líquido ao 7º dia Identificação: Mycobacterium abscessus

44 Caso IV Sexo M, 30 A s/ informação clínica Amostra (27/05/2011) : cultura positiva de expectoração Detecção molecular de resistências (07/06/2011) : positiva para INH + RAMP TSA 1ª + 2ª linha (06/07/2011): Resistente SM + INH + RAMP + EMB + PZA Sensível todos fármacos de 2ª linha

45 Caso V Sexo M, 46A Diagnóstico TBMR em 05/2009 (resistente INH+RAMP+SM) 3 amostras expectoração (22/06/09) : directo 3+ ; cultura positiva (tapete) 3 amostras expectoração (06/07/09) : directo 2+ ; cultura positiva (100 colónias) 2 amostras expectoração (27/07/09) : directo 1-9 baar/campo ; cultura positiva (6 colónias) 3 amostras expectoração (08/10/09) : directo 1-9 baar/campo ; cultura negativa amostras expectoração (10,11 e 12/09 e 01/10) : directo negativo; cultura negativa 3 amostras expectoração (06/04/10) : directo 1+; cultura negativa 3 amostras expectoração (04/06/10) : directo 1-9 baar/campo ; cultura negativa amostras expectoração (7,8,9,11/10) : directo negativo; cultura negativa

46 MUITO OBRIGADA