Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2011/2012. Unidade Curricular de BIOQUÍMICA I Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano

Transcrição

1 Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2011/2012 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA I Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO 2ª AULA PRÁTICA 1. Noções de equilíbrio ácido-base 2. Inspecção rápida da eficiência de um tampão de ph 3. Efeito acidificante do CO 2

2 1. IMPORTÂNCIA DO ph NO METABOLISMO CELULAR O ião de hidrogénio (H + ) é, de entre todos os iões inorgânicos, aquele que exerce maior influência na célula por unidade de concentração. Muitas das moléculas que fazem parte das estruturas celulares e dos vários sistemas de enzimas ionizam-se e existem nas células em equilíbrio com os iões livres de hidrogénio. A [H + ] é geralmente traduzida em unidades de ph, definido como o negativo do seu logaritmo (ver adiante). Muitas reacções que ocorrem nas células dependem da carga eléctrica das moléculas dos sistemas envolvidos. Por exemplo, a actividade das enzimas, a permeabilidade da membrana plasmática e o transporte activo de substâncias concentradas selectivamente na célula são dependentes da concentração de H +, porque este ião determina a carga eléctrica de moléculas e estruturas celulares. Geralmente, existe uma concentração óptima de H + para cada reacção ou actividade funcional da célula. Concentrações inferiores ou superiores a essa concentração são em geral inibidoras, como se indica no caso específico das actividades enzimáticas (Fig. 1). Actividade enzimática (% do máximo) 100 ph óptimo ph Fig. 1 - Relação entre o ph do meio e a actividade enzimática. O ph óptimo da enzima representada na figura é de aproximadamente 6,5. Apesar do ph óptimo de actuação de uma variedade de enzimas ser de aproximadamente 7, existem excepções significativas; por exemplo, a enzima pepsina, uma protease do suco gástrico, tem um ph óptimo de 1,5. O ph do estômago é bastante ácido (ph = 1), podendo a enzima funcionar neste meio. O efeito do ph (ph = - log [H + ]) na velocidade duma reacção enzimática pode ser devido ao efeito do H + na enzima, no substrato, ou no complexo formado pela enzima e o substrato. No entanto, variações na concentração de H + têm um efeito na enzima, uma vez que as enzimas são proteínas e estas, como substâncias anfotéricas (possuem grupos com cargas positivas e outros com cargas negativas) são muito sensíveis a alterações de ph do meio em que se encontram. 1

3 A variação da concentração de H + também altera a dissociação de várias substâncias. Assim, uma diminuição da [H + ] (aumento do ph) aumenta a dissociação, nomeadamente de proteínas, já que as proteínas com um pk relativamente baixo se dissociam primeiro. Ao ph das células (± 6,5-7,0), as proteínas possuem habitualmente uma carga predominantemente negativa e podem, portanto, captar iões H + produzidos pelo metabolismo celular. Esta reacção entre o ião H + e as proteínas, ou outras substâncias capazes de o captarem (p.e. HPO 2-4 e HCO - 3 ) é rápida e evita flutuações na concentração hidrogeniónica (ie do ph) na célula durante a sua actividade. 2. NOÇÕES DE -BASE Um ácido, segundo a definição de Bronsted, é uma substância dadora de H +, enquanto uma base é aceitadora de H +. Na descrição que se segue, faremos referência somente aos ácidos, especialmente ácidos fracos (representados na reacção 1 por HA), que se dissociam parcialmente e existem em equilíbrio, em solução com o H + e A - produzidos pela dissociação: K D HA H + + A - (Reacção 1) onde HA representa o ácido, A - a quantidade do ácido que se dissociou e K D representa a constante de dissociação, a qual se pode expressar pela equação 1: os ácidos. [ H + ] [A - ] K D = (Equação 1) [HA] Em relação às bases, as considerações são idênticas às que foram descritas para Os ácidos fortes, tais como o HCl, dissociam-se completamente e, portanto, em água, a concentração de H + ou Cl - é igual à concentração original do ácido. Assim, 0,1 M de HCl produz 0,1 M de H + e 0,1 M de Cl -. No caso dos ácidos fracos, tais como o ácido acético, a concentração de H + produzida pelo ácido em solução aquosa é inferior à concentração original do ácido, porque só uma parte do H + concentração de H + dissociado pode calcular-se pela equação 2: do ácido se dissocia. A 2

4 [HA] [H + ] = K D (Equação 2) [A - ] ou [HA] - log [H + ] = - log K D - log (Equação 3) [A - ] A [H + ] é geralmente indicada pelo valor do ph que é definido como o negativo do logaritmo da concentração de [H + ].Portanto: [HA] ph = - log K D - log (Equação 4) [A - ] Verifica-se que, quando as concentrações de HA e A - são iguais, o ph é igual a - log K D. O valor de - log K D é uma constante característica de cada ácido e é definida como o ph a que as concentrações de HA e A - são iguais. Esta constante (-log K D ) representa-se pelo símbolo pka. Portanto: [A - ] ph = pk a + log (Equação 5) [HA] Esta é a equação de Henderson-Hasselbalch, a partir da qual é possível calcular o ph de soluções de ácidos fracos. 3. REGULAÇÃO DA [H + ] NO ORGANISMO 3.1. Eficiência de um tampão Um tampão é geralmente uma mistura dum ácido fraco e do seu sal capaz de libertar ou captar H +, de modo a evitar alterações na concentração de H +. Um termo mais descritivo para este sistema seria amortecedor, pois o seu efeito é manter um meio constante no que diz respeito à concentração de H +, em face de produção ou gasto deste ião em qualquer reacção celular. A eficiência dum sistema tampão traduz-se na capacidade do sistema em manter constante a concentração de H +. Quantas moles de H + (ou OH - ) podem ser adicionados a 3

5 um meio contendo um sistema tampão para alterar significativamente a concentração de H +? O número de moles necessárias será tanto maior quanto mais eficiente for o sistema tampão. Pela equação de Henderson-Hasselbalch, ph = pka + log ([A - ]/[HA]), pode verificar-se que a alteração do valor de ph (e portanto da concentração de H + ) depende da razão [A - ]/[HA], isto é, das concentrações do ácido, [HA], e do sal do ácido, [A - ]. Uma análise cuidadosa da equação revela também que o sistema tampão (isto é, mistura do ácido e do seu sal) é mais eficiente na manutenção do ph quando [HA]=[A - ] e, portanto, quando ph=pka. Na prática, utiliza-se um tampão para evitar variações de ph. Este é mais eficiente na gama de valores de ph situados entre uma unidade abaixo e uma unidade acima do valor do pka do ácido fraco (ou base fraca) que serve de tampão. Fora desta gama, a eficiência do tampão é muito reduzida, como se pode verificar na Fig. 2, que representa a titulação do ácido acético e do ião amónia com NaOH. 1,0 CH 3 COOH CH 3 COO - + H + NH 4 + NH 3 + H + Formatada: Inglês (E.U.A.) Formatada: Inglês (E.U.A.) Formatada: Inglês (E.U.A.) 0,8 (a) (b) 0,6 Equivalentes de pka = 4,76 pka = 9,3 NaOH 0,4 0, ph Fig. 2 - Curvas de titulação para dois ácidos fracos: (a) ácido acético, com um pka = 4,7 e (b) amónia, com um pka = 9,3. Deve notar-se que a forma da curva é idêntica para todos os monoácidos, sendo a sua posição determinada pelo pka. 4

6 Analisando a curva de titulação do ácido acético representada na Fig. 2, pode verificar-se que no ínicio da curva a adição de 0,1 equivalentes de NaOH causa uma alteração no ph de aproximadamente uma unidade. Porém, para valores de ph entre 3,76 e 5,75 (ou seja, uma unidade de ph abaixo e uma unidade de ph acima do pka do ácido) a adição de quantidades maiores de NaOH aumenta mais lentamente o ph. Para valores superiores de ph, uma pequena adição de NaOH causa um aumento relativamente grande no valor de ph. O ácido acético pode, portanto, ser usado como tampão na gama de ph entre 3,76 e 5,76. Para se tamponar uma solução noutra gama de ph é necessário usar um ácido fraco (ou base fraca) cujo valor do pka corresponda ao valor de ph pretendido. Para se preparar o tampão, titula-se o ácido até se obter o ph desejado, ie próximo do valor do pka do tampão, de modo a que as concentrações das formas ionizada e não ionizada do tampão sejam próximas e máxima a eficiência do tampão à concentração usada. Os tampões mais comuns, eficientes ao ph fisiológico (possuem pka entre 6 e 8), são os fosfato (tampão intracelular), bicarbonato (tampão extracelular) e imidazol (estrutura semelhante à do aminoácido histidina). Para o caso do ácido fosfórico, com três equivalentes de H + por mole (H 3 PO 4 ), existem três valores de pka. Este ácido pode portanto, servir de tampão em três regiões de ph correspondentes aos valores de pka do ácido (pka 1 = 2,1; pka 2 = 7,2; pka 3 = 12,3). No entanto apenas o pka 2 (7,2) é importante ao nível fisiológico. Definiu-se o valor de ph ao qual uma molécula apresenta uma carga global nula ou neutra (ie, o número de cargas positivas é igual ao número de cargas negativas) como o ponto isoeléctrico (pi 1 ) Importância dos aminoácidos na regulação da concentração de H + No caso dos aminoácidos, moléculas com carga, os grupos carboxílicos dissociam-se a um ph mais baixo do que os grupos amínicos (Fig. 3). 5

7 Como exemplo, apresenta-se a dissociação da glicina (Reacção 2): pk 1 = 2,3 pk 2 = 9,6 H 2 C - COOH H 2 C - COO - + H + H 2 C - COO - + H + (Reacção 2) NH + 3 NH + 3 NH 2 Neste caso, em que o aminoácido tem apenas dois grupos acido-base ( a glicina é um aminoácido monoamino, monocarboxílico), o valor de ph correspondente ao pi é determinado pelo cálculo da média dos dois pk s entre os quais a carga global é nula. 1,0 0,8 pka 2 0,6 pi = 6,0 Equivalentes de NaOH 0,4 0,2 pka ph Fig. 3- Curva de titulação da glicina. Nesta curva estão representados os valores de pka 1 = 2,3 e pka 2 = 9,6. O pi é 6,0 (cálculo da média: (pk 1 + pk 2 /2). No caso de aminoácidos com mais de um grupo carboxílico, a curva (Fig. 4) que representa a titulação do aminoácido com uma base, apresenta uma região tampão para cada grupo carboxílico, além da região tampão correspondente ao grupo amínico. Como exemplo, apresenta-se a dissociação do ácido aspártico (Reacção 3): 6

8 COOH COO - COO - COO - pk 1 = 2,1 pk 2 = 3,9 pk 3 = 9,8 HC - NH + 3 HC - NH H + HC - NH H + HC-NH 2 +H + CH 2 -COOH CH 2 -COOH CH 2 -COO - CH 2 -COO - Carga eléctrica (+1) (0) (-1) (-2) 2,5 Formatada: Inglês (E.U.A.) Formatada: Português (Portugal) Formatada: Português (Portugal) Formatada: Português (Portugal) Formatada: Português (Portugal) Formatada: Português (Portugal) Equivalentes de NaOH 1,5 tampão pka 3 = 9,8 0,5 tampão pka 1 = 2,1 tampão pka 2 = 3,9 1,1 2,1 3 3,9 4,9 8,8 9,8 10,8 Fig. 4 - Curva de titulação do ácido aspártico. Estão representadas as três zonas de ph em que o ácido aspártico pode actuar como tampão, e que são correspondentes aos respectivos valores de pka, pka 1 de 2,1, pka 2 de 3,9 e pka 3 de 9,8. O pi é 3,0 (cálculo da média: (pka 1 + pka 2 /2). As proteínas possuem vários aminoácidos e, portanto, grupos carboxílicos e amínicos que se ionizam a diferentes valores de ph. Isto explica o facto de as proteínas serem bons tampões de ph, contribuindo para a manutenção da concentração hidrogeniónica nas células. 7

9 Alguns dos grupos das proteínas que se dissociam e os respectivos valores de pk estão representados na Tabela I (pk = valor do ph ao qual ocorre 50% de dissociação de uma substância). TABELA I- GRUPOS QUÍMICOS DAS PROTEÍNAS E O VALOR DE pk Grupo das proteínas Reacção de dissociação pk Carboxílico COOH COO - + H + 3-4,7 + Imidazólico HC NH HC N + H + 6,1 HC CH HC CH N H N H Amínico NH 3 + NH 2 + H + 6,5-10, Transporte de CO 2 no sangue e efeito acidificante do CO 2 O CO 2 é continuamente formado por todas as células do organismo como um dos produtos finais do catabolismo. É libertado das células por difusão e, ao penetrar nos capilares, é transportado pelo sangue sob três formas possíveis: a) Uma pequena quantidade é transportada na forma dissolvida (7%); b) Outra pequena percentagem é transportada na forma de carbaminohemoglobina (10%); c) A maior parte (60-90%) é transportada sob a forma de ião bicarbonato. O CO 2 que se difunde do plasma para os glóbulos vermelhos (GV) reage com a água para formar ácido carbónico (H 2 CO 3 ); esta reacção é catalizada pela enzima anidrase carbónica (AC). O ácido carbónico dissocia-se rapidamente em iões hidrogénio (H + ) e bicarbonato (HCO - 3 ). A maior parte dos iões H + formados reagem com a hemoglobina, que é um poderoso tampão de ph. Por outro lado, grande parte dos iões 8

10 bicarbonato difundem para o plasma através do trocador aniónico que permite a entrada simultânea de iões Cl - para o interior dos GV (Fig. 5). A respiração remove o CO 2 que é libertado nos pulmões (normalmente à mesma velocidade com que vai sendo formado), ocorrendo a Reacção 4 no sentido inverso. H 2 O + CO 2 H 2 CO 3 H + + HCO 3 - (Reacção 4) N Fluído intersticial Capilar GV Célula Hb Hb-CO 2 CO 2 CO 2 CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 AC Formatada: Inglês (E.U.A.) Formatada: Inglês (E.U.A.) CO 2 O 2 H HCO 3 Hb- O 2 Hb - Hb-H Plasma Cl - HCO 3 - Fig. 5 - Transporte de CO 2 no sangue. A forma desoxigenada da hemoglobina tem maior afinidade para H + do que a forma oxigenada. Assim, quando o sangue flui através dos tecidos metabolicamente activos, uma fracção da oxihemoglobina perde o oxigénio e transforma-se na forma desoxigenada, com maior afinidade para protões. Deste modo, a maior parte dos protões 9

11 derivados da reacção de CO 2 com água ao nível do sangue são captados pela hemoglobina (Fig. 6), razão pela qual o ph do sangue venoso é ligeiramente inferior ao do sangue arterial. Tecidos Plasma GV Hb-O 2 O 2 O 2 Hb - Hb-H CO 2 CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 H + + HCO 3 - Fig. 6 - Efeito tampão da hemoglobina (Hb) quando o sangue flui nos capilares que banham os tecidos. Quando o sangue venoso passa pelos pulmões, a hemoglobina fica saturada de O 2 e a sua capacidade de ligar H + diminui. Os protões libertados reagem então com o HCO - 3, deslocando-se o equilíbrio no sentido de formar CO2, que se difunde para os alvéolos e é expirado (A reacção 5 é a 4, no sentido inverso). HCO H + H 2 CO 3 CO 2 + H 2 O (pulmões; Reacção 5) O tampão bicarbonato é um tampão fisiológico importante. Um aumento extracelular da [H + ] desloca a Reacção 5 para a direita, ao passo que um decréscimo desloca a mesma reacção para a esquerda. 10

12 Conceitos importantes associados ao sistema tampão bicarbonato: a) A concentração de bicarbonato extracelular é normalmente alta (cerca de 25 mm) e regulada pelos rins. b) Existe uma relação estreita entre a [H + ] extracelular e a eliminação de CO 2 pelo organismo. Assim, quando a [H + ] extracelular aumenta, a Reacção 5 desloca-se no sentido da formação de CO 2, mas o restabelecimento da [H + ] depende da eliminação de CO 2, ie da eliminação pulmonar. Caso contrário, a acumulação de CO 2 desloca de novo o equilíbrio para a esquerda, com formação de H +. Um aumento da [H + ] extracelular estimula o centro respiratório, aumentando a ventilação alveolar e, consequentemente, a eliminação de CO 2. É este controlo da eliminação de CO 2 pela [H + ] extracelular que permite que o sistema HCO - 3/CO 2 funcione como um tampão eficiente. Quando a [H + ] extracelular diminui, a Reacção 5 desloca-se no sentido da formação de HCO - 3 e H +, restabelecendo a [H + ] extracelular normal, porque o decréscimo de [H + ] extracelular inibe o centro respiratório, diminuindo a ventilação alveolar e, portanto, a eliminação de CO 2. O aumento subsequente da [CO 2 ] extracelular favorece a reacção para a esquerda, permitindo a formação de H Efeito de um excesso de H + no CO 2 do plasma O efeito directo de um excesso de H +, pela lei de acção da massa, é aumentar a produção de CO 2, mas o resultado indirecto é baixar o CO 2, estimulando rapidamente a respiração. Uma vez que o último efeito predomina, o efeito final é a redução de CO 2 no plasma. H + + HCO 3 - H 2 CO 3 H 2 O + CO 2 resultado final VENTILAÇÃO CO 2 CO 2 plasma 11

13 Este exemplo ilustra o efeito do equilíbrio ácido-base na respiração. Vejamos agora o efeito da respiração no equilíbrio ácido-base: A) Paragem prolongada da respiração (asfixia): CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 - H + + HCO 3 - acidose: ph extracelular 7,4 ~7,1 Como consequência, o aumento de H + estimula o centro respiratório e leva à necessidade de respirar profundamente e com grande frequência, partindo do pressuposto de que a função ventilatória foi entretanto restaurada. B) Hiperventilação: CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 H + + HCO 3 - alcalose: ph extracelular 7,4 7,7 Em consequência, a diminuição de H + inibe o centro respiratório, levando à necessidade de respirar menos profundamente e com menor frequência. Efeito da acidose e da alcalose na respiração (volume de ar ao longo do tempo): Normal Acidose Normal Alcalose ph 7,4 ph 7,1 ph 7,4 ph 7,7 Formatada: Português (Portugal) 12

14 3.5. Aplicação da equação de Henderson-Hasselbalch ao tampão fisiológico CO 2 /HCO 3 - Tendo em conta a Reacção 4 e a aplicação da Equação 5: [HCO 3 - ] ph = pk a + log (Equação 5) [CO 2 ] Esta é a equação de Henderson-Hasselbalch, para o par ácido-base CO 2 /HCO - 3, a partir da qual é possível calcular variações no ph fisiológico resultantes das alterações, tanto na pressão de CO 2 ([CO 2 ]=pco 2 x 0,0301 mm), como na concentração plasmática do ião HCO - 3. O pka é cerca de 6,1. 13

15 APÊNDICE: I. DISSOCIAÇÃO DA ÁGUA E DEFINIÇÃO DE ph A água actua como um ácido e como uma base, uma vez que produz H + e OH -, ie cede e capta protões. K e H 2 O H + + OH - onde Ke é a constante do equilíbrio da reacção. A concentração de H + concentração de OH -. O valor de Ke é: produzido pela água é relativamente baixa e é igual à K e = [H + ] [OH - ] [H 2 O] Como a concentração da água [H 2 O] é relativamente alta e constante (é igual ao número de gramas de H 2 O num litro dividido pelo peso molecular da água, ou seja 1000/ 18 = 55,55 M), o produto Ke [H 2 O] pode expressar-se pela constante Kw (produto iónico da água). Portanto: Kw = [H + ] [OH] = Se expressarmos esta equação em termos dos logaritmos dos valores representados: pkw = ph + poh = 14 onde poh tem o valor do - log [OH] por analogia com o valor de ph definido anteriormente. Uma vez que consideraremos somente ácidos e bases fracos em solução aquosa, o produto das concentrações de [H + ] e [OH - ] será igual a (ou a soma ph + poh = 14). Portanto, se a concentração de H + dum ácido fraco em água for de 10-5 M, a concentração de OH - nessa mesma solução será de 10-9 M. Esta relação é válida para valores de ph entre 0 e 14. 1

16 A expressão da concentração de H + em termos de normalidade (N) ou molaridade (M) é pouco conveniente, uma vez que se tem de recorrer ou a potências (ex: 10-6 M) ou a muitas casas decimais (ex: 0, M). Afim de evitar esta dificuldade Sorensen propõs expressar a concentração de H + como o negativo do seu logaritmo e designou esta função de ph: ph = - log 10 [H + ] Na tabela seguinte indica-se a relação entre concentração de H +, de OH - e o ph. Relação entre concentração de H + expressa em normalidade e o ph: [H + ] [ OH - ] log [H + ] - log [H + ] = ph 1N 10 0 N N ,1 N 10-1 N N ,001 N 10-3 N N , N 10-5 N 10-9 N , N 10-7 N 10-7 N , N 10-9 N 10-5 N , N N 10-3 N , N N 10-0 N

17 II. MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DO ph Existem dois métodos para medir o valor do ph normalmente usados no laboratório:o método dos indicadores (corantes) e o que usa o aparelho de ph (método potenciométrico). II.a) Indicadores Indicadores de ph são ácidos (ou bases) fracos que apresentam cores diferentes na forma ionizada e não ionizada. Quando o ph da solução em que se encontram estes indicadores é igual ao pk dos indicadores, as concentrações das moléculas ionizadas e não ionizadas do indicador são iguais e observa-se uma cor de transição. O uso dos indicadores tem uma aplicação limitada. No entanto, ainda são correntemente usados em titulações de ácidos e bases. HIn H + + In - K = [H + ] [In - ] [HIn] [H + ] = K a (indicador) [HIn] [In - ] [HIn] quando [HIn] = [In - ] = 1 [H + ] = K a (indicador) ou ph = pk a [In - ] Quando o indicador possui grande capacidade de tingimento, basta usar quantidades pequenas, tão pequenas que não conseguem afectar a acidez ou a basicidade da solução. A relação entre as duas formas do indicador, HIn e In -, mede neste caso a [H + ] que existe na solução antes da adição do indicador. Em equilíbrio, teríamos, no caso da adição de HCl a uma solução com indicador: [HIn] = a-x [In - ] = x [H + ] = [HCl] adicionado + x (proveniente de HIn) [HCl] 3

18 Valores dos pk e as cores dos indicadores usados em titulações: Indicador pk Transição de cor Gama de ph em que pode ser usado Timol azul 1,7 Vermelho-amarelo 1,2-2,8 Laranja de Metilo 3,5 Vermelho-amarelo 3,1-4,4 Bromofenol azul 4,0 Amarelo-azul 3,1-4,7 Bromocresol verde 4,7 Amarelo-azul 3,8-5,4 Vermelho de Metilo 5,0 Vermelho-amarelo 4,2-6,3 Clorofenol vermelho 6,0 Amarelo-vermelho 5,1-6,7 Bromocresol púrpura 6,2 Amarelo-roxo 5,4-7,0 Bromotimol azul 7,0 Amarelo-azul 6,0-7,6 Fenol vermelho 7,8 Amarelo-vermelho 7,0-8,6 Cresol vermelho 8,3 Amarelo-vermelho 7,4-9,0 Timol azul 8,9 Amarelo-azul 8,0-9,6 Fenolftaleína 9,7 Descorado-vermelho 8,3-10,0 II.b) Medição do ph pelo potenciómetro Nos laboratórios é mais comum usar-se o aparelho de medir ph (potenciómetro) em estudos que requerem medições da concentração do ião H + em solução. O aparelho de ph (Fig. A.1) possui um elétrodo de vidro que é um tubo que contém dentro uma solução com uma determinada concentração de H +. Esta solução é separada das soluções exteriores (em que se deseja medir a concentração de H + ) por uma membrana de vidro no fundo do tubo, a qual é permeável somente a H +. Portanto, a tendência de difusão do H + através desta membrana causa um potencial eléctrico cuja grandeza depende do gradiente de concentração de H + dentro e fora do eléctrodo. O resto do instrumento consiste simplesmente num mecanismo electrónico que mede o potencial eléctrico quando o circuito é fechado por meio dum eléctrodo de referência. O ph é proporcional a este potencial. O eléctrodo de referência é preparado de modo a evitar potenciais de junção, usando para isso uma solução concentrada de KCl que faz a ligação com a solução cujo ph se deseja medir por intermédio dum pequeno orifício. A quantidade de KCl que se difunde para a solução é insignificante mas basta para fechar o circuito. O KCl é preferido a outros sais porque as mobilidades de K + e Cl - são aproximadamente iguais, o que evita que se gere um potencial de junção que interfiriria com o potencial criado pelo gradiente de H + através da membrana do eléctrodo de vidro: isto é, seria difícil distinguir entre os dois potenciais. 4

19 Calibração do aparelho de ph: 1. Seleccionar no respectivo botão do aparelho de ph a temperatura da solução cujo ph se pretende determinar. 2. Colocar o eléctrodo numa solução tampão padrão de ph = 7,0 e ligar o aparelho 3. Ajustar a agulha da escala para a leitura 7,0 com o botão "buffer adjustment". 4. Repetir 2. e 3. para uma solução tampão padrão de ph = 4,0 e certificar-se de que a agulha dá a leitura de 4,0. 5. Medir o ph da solução desejada. Eléctrodo de Referência (calomelanos) Eléctrodo de vidro potenciómetro amplificador solução de KCl KCl Hg 2 Cl 2 [H+] Hg 2 [H+] = 0,1 N [H+] desconhecida Fig. A.1- Esquema simplificado dos componentes principais de um aparelho para medir ph. A amostra cujo ph se pretende medir é colocada num recipiente no qual se coloca a extremidade do eléctrodo de vidro contendo H + 0,1 N e o eléctrodo de referência. Devido à diferença de concentração de H + dentro e fora do eléctrodo de vidro gera-se um potencial que é amplificado e medido por um potenciómetro. Normalmente o potenciómetro está calibrado em unidades de ph ou em volts (V). 5

20 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA I Mestrado Integrado em Medicina 1º Ano Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2011/2012 A) INSPECÇÃO RÁPIDA DA EFICIÊNCIA DE UM TAMPÃO DE ph Grupos 1 e 3 1. Coloque 96 ml de água da torneira num copo de precipitação. 2. Adicione algumas gotas de azul de bromotimol em quantidade suficiente para que a cor seja bem visível. 3. Ao primeiro copo, adicionar, gota a gota, HCl 1 M até a cor se tornar francamente amarela e anote o volume de ácido. Depois adicione, gota a gota, NaOH 1 M. Observe a mudança de cor para verde e finalmente azul escuro, anotando o volume da base. 4. Ao mesmo copo, adicione cerca de 2 ml de KH 2 PO 4 0,35 M e deixe dissolver completamente. Seguidamente, adicionar 2 ml de K 2 HPO 4 0,3 M e dissolver. Note as mudanças de cor que acompanham as adições. 5. Repetir a adição de HCl 1 M e NaOH 1 M e compare as diferenças de volume (dramáticas) entre a solução não tamponada e depois de tamponada. 6. Interprete as observações. Grupos 2 e 4 1. Coloque 60 ml de água da torneira num copo de precipitação. Adicione algumas gotas de azul de bromotimol em quantidade suficiente para que a cor seja bem visível. Adicionar 20 ml de KH 2 PO 4 0,35 M e K 2 HPO 4 0,3 M (anote as mudanças de cor que acompanham as adições). Anote os volumes de ácido (HCl 1 M) e base (NaOH 1 M) requeridos para alterar as cores do bromotimol. 2. Interprete as observações. 1

21 Ano Lectivo 2011/2012 BIOQUÍMICA I 1º Ano PROTOCOLO DE BANCADA - 2ª AULA PRÁTICA B) O princípio de Le Chatelier APLICADO AO Efeito acidificante do CO 2 Grupos 1 a 4: 1. Prepare um copo com água da torneira (25 ml) e 3 gotas de azul de bromotimol e adicione NaOH 0,01 M, o suficiente para a solução ultrapassar a neutralidade e estabelecer a cor azul. Retirar 5 ml para um tubo de ensaio para servir de controlo. 2. Fazer borbulhar CO 2 (de ar expirado). 3. Notar a mudança gradual da cor. 4. Aquecer a solução até à fervura e registar as transições de cor. 5. Voltar a adicionar CO 2 e notar as transições. 6. Comente as observações com base no equilíbrio. CO 2 + H 2 O (H 2 CO 3 ) H + + HCO 3-2 H + + CO Comente o equilíbrio em relação ao processo respiratório. Nota: o azul de bromotimol é um indicador de ph com um valor de pk~7,0. A forma protonada do indicador (HIn), prevalente a ph<7,0 tem uma coloração amarela, enquanto a forma desprotonada (In - ), prevalente a ph>7,0 tem uma coloração azul. 2