Sementes da Demência

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1 Uma reação em cadeia de proteínas tóxicas pode ajudar a explicar Azheimer, Parkinson e outras doenças mortais que levariam a novas e promissoras opções de tratamento! AO ANALISAR NO MICROSCÓPIO CÉLULAS NERVOSAS doentes em amostras de tecido cerebral de um paciente que morreu vítima de Alzheimer, um patologista pode identificar grânulos anormais de material. Eles são formados por proteínas ausentes em células sadias. De onde viriam, e por que existem tantos deles? E, mais importante, qual a relação entre essas proteínas e a doença devastadora e incurável? Durante a busca por respostas ocorreu uma descoberta surpreendente: as proteínas que se acumulam nos neurônios de pacientes com Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas têm comportamento muito parecido com o de príons, proteínas tóxicas que destroem o cérebro na doença da vaca louca.! Os príons são proteínas deformadas, mas persistentes, e provocam alteração e posterior aglutinação de proteínas semelhantes, iniciando uma reação em cadeia que leva à destruição de regiões inteiras do cérebro. Ao longo dos últimos dez anos cientistas descobriram que processo semelhante pode estar envolvido em doenças não tão raras como a da vaca louca e outras enfermidades exóticas. Processos dessa natureza podem também ocorrer nas principais doenças neurodegenerativas, incluindo Alzheimer, Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (também conhecida como ELA ou doença de Lou Gehrig) e demência relacionada a concussão, comum em jogadores de futebol [americano] e pugilistas. De acordo com as evidências, Alzheimer e Parkinson não são contagiosas como a doença da vaca louca ou a gripe. Essas descobertas recentes indicam o principal suspeito de uma série de doenças devastadoras do cérebro - e apontam caminhos para tratamentos. Medicamentos desenvolvidos para tratar a doença de Alzheimer poderiam ser usados diretamente - ou estimular uma nova farmacologia - para Parkinson, lesão cerebral traumática e outras enfermidades terríveis que alienam os pacientes da sua condição de ser. Boa notícia para milhões de pessoas que sofrem de doenças neurodegenerativas em todo o mundo.! As novas concepções devem muito aos pesquisadores que descobriram os príons, Tudo começou no início do século 18, com relatos de uma doença curiosa e fatal de ovelhas - a scrapie -, assim chamada porque os animais afetados raspavam a lã de sua pele ao se esfregarem compulsivamente [scrape, raspar em inglês]. Posteriormente, quando os cientistas começaram a investigar a doença, notaram que o sistema nervoso dos animais apresentava diversos orifícios quando observado ao microscópio. Na década de 30 do século passado pesquisadores franceses e britânicos descobriram que scrapie pode ser transmitida de uma ovelha a outra, mas o agente infeccioso era elusivo e se comportava de modo incomum: o intervalo de tempo entre exposição e sintomas era muito mais longo que nas doenças provocadas por agentes convencionais, como bactérias e vírus. Além disso, a resposta imune normalmente acionada para eliminar esses invasores parecia ausente.! Essas particularidades indicavam que a doença não era provocada pelos suspeitos de costume, mas por mais de 20 anos os resultados sobre scrapie permaneceram como uma obscura doença veterinária. Na década de 50, porém, William Hadlow, então na British Agricultural Research Council Field Station em Compton, notou a grande semelhança da patologia cerebral entre scrapie e uma misteriosa doença humana chamada kuru. Kuru é uma doença neurodegenerativa progressiva, praticamente restrita ao povo fore da Nova Guiné. O declínio constante na coordenação e função mental de pessoas afetadas leva invariavelmente à morte. Algum tempo depois, verificou-se que kuru entre os fore estava associado à prática de canibalismo ritual de parentes que tinham

2 Sementes da Demência morrido da doença. O fato sugeria um agente infeccioso que de alguma forma chegava ao cérebro vindo de algum outro ponto do organismo.! Na década de 60, D. Carleton Gajdusek, do National Institutes of Health dos Estados Unidos, e colaboradores confirmaram que a doença era transmissível ao demonstrar que ela poderia ser induzida pela injeção direta de extrato cerebral de vítimas de kuru no cérebro de primatas não humanos. A equipe de Gajdusek também reconheceu semelhanças importantes na patologia cerebral entre kuru e uma enfermidade cerebral neurodegenerativa mais comum: a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD, na sigla em inglês). A CJD é um tipo de demência de progressão rápida e afeta aproximadamente uma em 1 milhão de pessoas em todo o mundo. Gajdusek demonstrou que a doença de

3 Creutzfeldt-Jakob pode ser transmitida a primatas como a kuru. Na maioria das vezes, no entanto, a doença se manifesta espontaneamente.! Na década de 80, Stanley Prusiner, da University of California em São Francisco, identificou o agente responsável pelo scrapie e distúrbios relacionados à doença As enfermidades ficaram conhecidas coletivamente como encefalopatias espongiformes porque, nestes casos, o cérebro dos afetados assume a aparência de queijo suíço, repleta de orifícios. Em uma série de experimentos, ele e seus colegas acumular~ evidências convincentes de que o agente infeccioso consiste unicamente em uma versão alterada de uma proteína chamada PrP, inócua em sua forma íntegra Prusiner naquele momento também cunhou o termo "príon - nome que designa ''partículas proteicas infecciosas" - para distinguir os agentes transmissíveis proteicos de agentes patogênicos conhecidos, como vírus, bactérias, fungos e outros. (Atualmente o termo inclui proteínas que impõem sua própria forma a proteínas semelhantes sem, necessariamente, implicar infecção.) Prusiner provocou enorme polêmica quando propôs a ideia da proteína como agente capaz de transmitir a doença, mas em 1997 ganhou o Prêmio Nobel por esse trabalho.! Recentemente, pesquisas detalhadas sobre o mal de Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas indicam que esses distúrbios, apesar de carentes da infectividade, ou infecciosidade, das doenças priônicas clássicas, podem surgir e se propagar de maneira semelhante no cérebro, ou seja, através de um processo que chamamos de semeadura de proteína patogênica. Assim como os príons responsáveis pela vaca louca e doenças correlatas, as sementes proteicas podem ser liberadas, absorvidas e transportadas pelas células. Essas características comuns podem explicar como a doença se alastra As semelhanças sugerem, assim, que o paradigma do príon pode, em breve, unificar nossa compreensão sobre a manifestação e danos provocados por doenças aparentemente diversas. PROTEíNAS RETORCIDAS NO ALZHEIMER?! O primeiro indício da associação de príons com Alzheimer foi detectado nos anos 60. Nessa época, pesquisadores envolvidos no esforço de compreender os mistérios de doenças produzidas por príons notaram semelhanças sugestivas com as alterações cerebrais que ocorrem em outras moléstias neurodegenerativas, especialmente Alzheimer. Causa mais comum de demência durante o envelhecimento de humanos, a doença aparece furtivamente e avança de modo implacável ao longo de anos, subtraindo a memória, a personalidade e, por fim, a própria vida da vítima. A incidência da doença de Alzheimer duplica a cada cinco anos depois dos 65 anos de idade, até que, por volta dos 85 anos, quase um em cada três adultos está afetado.! Na mesma época, os pesquisadores notaram o envolvimento da aglutinação da proteína na progressão da doença Em 1906, Alais Alzheimer, que dá o nome à doença, pela primeira vez associou a demência a duas alterações microscópicas peculiares no cérebro: placas senis (atualmente identificadas como aglomerados de fragmentos de proteínas retorcidas chamadas beta-amiloide, ou Aß), localizados fora das células, e emaranhados neurofibrilares (filamentos compostos de agregados de uma proteína chamada tau), localizados no interior da célula. Quando esses agregados são ampliados por microscopia eletrônica as proteínas podem ser vistas formando longas fibras constituídas de Aß) ou tau. Além disso, as proteínas formam agrupamentos menores, conhecidos como oligômeros ou protofibrilas, que também interferem no funcionamento normal dos neurônios.! No final dos anos 60, a equipe de Gajdusek testou a hipótese de que a doença de Alzheimer, como scrapie, kuru e a doença de Creutzfeldt-Jakob, pudesse ser

4 transmissível, Para isso injetaram extrato de cérebro de pacientes com Alzheimer no cérebro de primatas não humanos. De modo independente o grupo de pesquisadores liderado por Rosalind RidIey e Harry Baker, naquele momento no Clinical Research Center, in Harrow, na Inglaterra, fizeram experimentos semelhantes. Os resultados dos estudos de Gajdusek foram inconclusivos e nenhum dos grupos reportou o desenvolvimento completo de Alzheimer. Os pesquisadores britânicos encontraram, no entanto, a indicação de um efeito: depois de um período de incubação de pelo menos cinco anos, placas de Aß eram mais abundantes em saguís que receberam a injeção do extra to que no grupo de controle.! Nesse ponto, nossa equipe iniciou estudos para verificar se pequenos agregados de Aß retorcidas atuam como sementes que promovem a reação em cadeia de adulteração e aglomeração de proteínas e provocam depósitos de proteínas que sobrecarregam o cérebro na doença de Alzheimer. O longo período de incubação para a formação das placas nos macacos, porém, nos desencorajava.! Nossa perspectiva mudou consideravelmente em meados da década de 90, com o advento de camundongos transgênicos geneticamente modificados para produzir a proteína precursora do fragmento Aß humano, a APP (proteína precursora de amiloide). Iniciamos uma série de experimentos para explorar a hipótese da Aß-semente nesses camundongos com um grupo de talentosos colaboradores e estudantes. Os animais transgênicos não incorporam todas as características do mal de Alzheimer (que parece uma exclusividade dos humanos), mas oferecem vantagens consideráveis para nossos experimentos. São pequenos, fáceis de manter, têm vida curta e desenvolvem depósitos Aß no cérebro espontaneamente em uma idade relativamente consistente.! Nós nos concentramos no estudo de Aß em vez de tau porque, apesar de placas e emaranhados de ambas contribuírem para a neurodegeneração que provoca demência na doença de Alzheimer, a maior parte das evidências indicava que Aß retorcida é catalisador essencial para o desenvolvimento da doença. Na verdade, muitos dos fatores de risco genético conhecidos para a doença de Alzheimer influenciam processos celulares envolvidos com a produção, dobramento, agregação ou remoção de Aß. As mutações genéticas que levam ao aparecimento da doença em idades muito precoces alteram APP ou as enzimas que separam Aß desse precursor.! Os cientistas atualmente sabem que o cérebro começa a mostrar sinais de Alzheimer pelo menos uma década antes de os sintomas aparecerem e que o acúmulo anormal de proteínas ocorre muito cedo no processo da doença. Ciente de que o acúmulo de Aß retorcida é um importante catalisador para o desenvolvimento do mal de Alzheimer, queríamos saber o que iniciava a agregação das proteínas.! Em nossos primeiros experimentos nos propusemos a determinar se extratos de tecido cerebral de pacientes que morreram de Alzheimer deflagrariam a agregação de Aß no cérebro de camundongos transgênicos APP. Em outras palavras, poderíamos induzir e propagar a agregação de Aß imitando a ação dos príons nas encefalopatias espongiformes? Usando metodologias desenvolvidas para o estudo desses príons, tomamos pequenas amostras de cérebro de pessoas que morreram tanto com Alzheimer quanto outras causas. Fragmentamos o tecido e removemos os componentes maiores por breve centrifugação. Injetamos uma pequena quantidade do extrato resultante diluído no cérebro de jovens camundongos transgênicos.! Os resultados foram positivos. Três a cinco meses depois, antes que os camundongos gerassem suas próprias placas Aß, observamos uma quantidade substancial de agregados Aß no cérebro dos animais que receberam extra tos de cérebros com Alzheimer. O grau de formação de placas de Aß era proporcional à quantidade de Aß no extra to injetado e ao tempo de incubação - resultados compatíveis com a hipótese de os extra tos terem provocado o acúmulo de placas. E o que foi crucial:

5 extratos que não continham agregados de Aß não provocaram a formação de placas nos camundongos transgênicos. DEFININDO A Aß-SEMENTE Sementes da Demência! Apesar de as experiências mostrarem que a deposição de Aß pode ser iniciada por extratos de cérebro com Alzheimer, elas não certificam que Aß dos extratos são responsáveis pela formação das placas.! Essa incerteza nos obrigou a abordar várias questões adicionais. Primeiro, perguntamos se os depósitos de Aß que vimos nos ratos foram apenas do material injetado. A resposta foi não: uma semana após a injeção, não havia qualquer evidência de agregado Aß no cérebro. Ao contrário, as placas só se tornaram evidentes apenas após um intervalo de um mês ou mais.! Em segundo lugar, consideramos a possibilidade de que a formação de placa tenha sido estimulada por algum componente do extrato de cérebro humano que não Aß, talvez um vírus humano. Descartamos essa possibilidade confirmando que os extratos provenientes de cérebro idoso, mas livre de patógenos, de camundongos transgênicas APP possa promover o acúmulo de placas de forma tão eficaz quanto extratos de cérebro humano, desde que as amostras contenham agregados de Aß. Além disso, como extratos de cérebro sem Alzheimer não produziram agregação de Aß, podemos eliminar a possibilidade de que as placas fossem apenas uma resposta à lesão cerebral decorrente da injeção do extrato.! Os resultados apontavam fortemente Aß como o agente, mas queríamos uma prova mais direta, Nosso terceiro passo foi remover seletivamente Aß dos extratos cerebrais usando anticorpos específicos. Esse procedimento simples suprimiu a capacidade de amostras de cérebro com Alzheimer induzirem a formação de placas. Finalmente, quando usamos um ácido forte para desdobrar as proteínas deformadas o extra to não induziu a formação de placa. Confirmamos, assim, que a forma da proteína regula a sua capacidade de induzir a deformação e a agregação de outras moléculas.! Estávamos então razoavelmente convencidos do papel de semente ativa da Aß retorcida nas amostras de cérebro, mas uma parte do problema permanecia elusiva, Se o agregado de Aß sozinho atua como semente, deveria ser possível induzir a formação de placas com Aß sintetizada e colocada para se aglutinar em um tubo de ensaio, sem todas as outras substâncias presentes no cérebro. Sabíamos que a semeadura com proteínas sintéticas poderia ser desafiadora, pois estudos com príons haviam mostrado que material de laboratório pode diferir de forma sutil, mas aparentemente importante, do que é isolado diretamente do cérebro.! Com essa restrição em mente injetamos várias formas de agregados sintéticos Aß em camundongos transgênicos APP e aguardamos o período de incubação habitual de três a cinco meses. Os resultados foram desapontadores. Não havia evidências de início de formação durante o período. Recentemente, entretanto, Prusiner, Jan Stõhr, Kurt Giles e seus colaboradores na University of California em São Francisco injetaram fibras sintéticas Aß no cérebro de camundongos transgênicos APP. Após um prolongado período de incubação de mais de seis meses os animais mostraram evidência clara de deposição de Aß semeada na cérebro. Apesar de as sementes sintéticas terem se revelada menos patentes que as naturalmente produzidas, os resultadas são uma demonstração convincente da capacidade de agregadas de Aß isolados, sem qualquer outro fator, estimular a formação de depositadas de Aß na cérebro.! Mais recentemente passamos a investigar as propriedades das semente Aß que promovem a aglomeração de proteínas na cérebro. Esperávamos que fibras longas e insolúveis nas quais aaß está contida fossem as sementes mais eficazes. Os resultadas

6 nas surpreenderam. Ao fracionar extratos cerebrais ricos em Aß por ultracentrifugação, obtivemos duas fases: um pellet insolúvel contendo a maior parte das fibras Aß na parte inferior da tuba e um sobrenadante líquida clara contendo formas muito pequenas e solúveis da proteína Aß. A maior parte de Aß se depositou no fundo e, conforme antecipamos, essa porção foi capaz de induzir agregação de Aß na cérebro de camundongos transgênicos de forma tão eficiente quanta os extratos cerebrais. Inesperadamente, no entanto, a porção solúvel também induziu forte agregação e formação de placas, apesar de conter menos de 1 milésimo da quantidade de Aß da pellet. E mais: as sementes solúveis foram prontamente degradadas por uma enzima, a proteinase K, o que não ocorreu com as sementes insolúveis,! A variabilidade da tamanha e da fragilidade de sementes Aß é, ao mesmo tempo, uma notícia boa e má. A má é que pequenas agregados solúveis, capazes de se movimentar pela cérebro com mais facilidade que as fibras maiores, são sementes particularmente potentes. Em contraposição, sua sensibilidade à ação da enzima proteinase K indica que sementes solúveis podem ser especialmente vulneráveis a tratamentos programadas para eliminá-las da cérebro. A solubilidade das pequenas sementes ainda pode torná-las rapidamente detectáveis nas fluidos corporais e, assim, funcionar cama sentinelas moleculares para a diagnóstico precoce de Alzheimer, possivelmente bem antes da manifestação da demência.! Como a semeadura por proteína está aparentemente relacionada aos primeiros estágios da doença, descobrir formas para detectar e neutralizar as sementes poderia evitar danos cerebrais e demência. ALÉM DO ALZHEIMER Sementes da Demência! A Natureza raramente perde oportunidade de explorar um mecanismo para múltiplas finalidades e a agregação de proteína por semeadura não é exceção. Ocorre não só em doenças mas também em processos benéficos. Na década de 90, por exemplo, Reed Wickner, do Natíonal Institutes of Health, propôs que algumas proteínas fúngicas utilizam a estratégia para ajudar na sobrevivência celular, postulado que tem sido confirmado em várias laboratórios, Além disso, Susan Lindquist.do Massachusetts Institute of Technolagy, e Eric R. Kandel, da Columbia University, têm defendido a hipótese intrigante de que a propagação de proteínas específicas semelhante à provocada par príons ajuda a estabilizar os circuitos cerebrais, atuando para preservar memórias de longo praza.! Até agora, no entanto, a maior parte da pesquisa descreve a papel da agregação semeada de proteínas em doenças. Proteínas cuja agregação par semente tem sido implicada em doenças cerebrais incluem -sinucleína (em Parkinson), superóxido dismutase-l (na esclerose lateral amiotrófica ou ALS, na sigla em inglês), proteinopatia TDP-43 (em ALS e demência frontotemporal), huntingtina (na doença de Huntington), e tau (em doenças neurodegenerativas). Diversas outras doenças neurodegenerativas envolvem agregação de proteínas e será importante verificar se o princípio da semeadura também se aplica a elas.! Novos estudos mostram que algumas proteínas envolvidas na regulação dos genes incluem um mecanismo semelhante ao desencadeado por príon, isto é, uma sequência de aminoácidos que confere a uma proteína a capacidade de induzir outra molécula a assumir forma semelhante à sua. Pela sua natureza essas proteínas tendem a se agregar, propensão que pode ser potencializada por certas mutações. E, uma equipe de pesquisa liderada por J. Paul Taylor, do St. Jude Children's Research Hospital, e James Shorter, da University of Pennsylvania, relatou que mutações nos domínios semelhantes a príons das proteínas que se ligam a ácidos nucleicos, chamadas

7 hnrnpa2bl e hnrnpal, provocam proteinopatia mutissistêmica, doença complexa que afeta o sistema nervoso, músculos e ossos. A agregação por semeadura também vem sendo demonstrada experimentalmente em proteínas que levam a distúrbios fora do sistema nervoso, como amiloidose - e o espectro de patologias que envolvem a propagação de proteínas de modo semelhante ao príon pode continuar a crescer.! Se pretendemos fazer com que a nossa crescente compreensão do conceito de semeadura resulte em terapias precisamos estabelecer como as proteínas retorcidas provocam danos às células e aos tecidos. Essas informações podem ajudar a bloquear os prejuízos mesmo que seja difícil impedir a própria agregação da proteína. As pesquisas mostram que os agregados de proteínas podem debilitar as células de diversos modos - de interações tóxicas entre os agre. gados e os componentes celulares a bloqueio de proteínas normais -, impedindo que cheguem aos lugares onde são funcionais. Ao mesmo tempo, temos de compreender mais detalhadamente como as proteínas patogênicas surgem, se degradam e em que condições elas se contorcem e formam sementes.! O esclarecimento dos mecanismos pelos quais as células adquirem, transportam e secretam proteínas-semente certamente possibilitará novas interpretações sobre o desenvolvimento da doença. Finalmente, uma questão crítica ainda sem resposta é por que o envelhecimento aumenta tão significativamente o risco de doença neurodegenerativa. As respostas a essas perguntas podem sugerir novas formas de desvendar proteínas patogênicas,! O peso da evidência favorece a noção considerada heterodoxa tempos atrás: uma simples mudança de forma pode transformar uma proteína de amiga em inimiga. Enquanto descrevia a descoberta do príon durante sua conferência como premiado com o Nobel, Prusiner previu que o processo básico pelo qual os príons envolvidos na vaca louca e doenças relacionadas impõem suas características tóxicas a proteínas normais seria encontrado em outras doenças degenerativas. A última década testemunhou a confirmação experimental dessa previsão. De fato, a agregação da proteína de modo semelhante ao príon pode explicar a origem de algumas das doenças mais temidas da velhice e dar um quadro conceitual convincente que um dia pode se traduzir em tratamentos que alterem a progressão inexorável de doenças neurodegenerativas.