ANÁLISE NO PADRÃO DE METILAÇÃO DO DNA EM TECIDOS DIFERENCIAIS DE GOIABEIRA ANALYSIS IN THE METHYLATION PATTERN OF DNA IN DIFFERENT GUAVA TISSUES

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1 ANÁLISE NO PADRÃO DE METILAÇÃO DO DNA EM TECIDOS DIFERENCIAIS DE GOIABEIRA ANALYSIS IN THE METHYLATION PATTERN OF DNA IN DIFFERENT GUAVA TISSUES Luziane Brandão Alves (1) Aléxia Gonçalves Pereira (1) Luara Lopes Sousa (1) Ana Beatriz Rocha de Jesus Passos (2) Marcia Flores da Silva Ferreira (3) Adésio Ferreira (4) Resumo A expressão fenotípica pode ser regulada por mecanismos epigenéticos com mudanças na cromatina sem alterar as bases do DNA. Dentre os diversos mecanismos epigenéticos, a metilação do DNA consiste na adição de um grupo metil na citosina reprimindo ou ativando genes durante a transcrição. As alterações fenotípicas relacionadas ao controle da expressão gênica em diferentes tecidos vegetais, bem como em diferentes genótipos, ainda é pouco estudado em espécies frutíferas. Nesse intuito, objetivou-se estudar o nível de metilação global no DNA de diferentes tecidos galho, gema apical, folha nova e folha desenvolvida e em diferentes genótipos de goiabeira. Os níveis de metilação foram medidos por meio de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Os valores de citocina metilada variaram de 21 a 24%. Dentre os tecidos avaliados, a maior porcentagem de metilação foi observado no galho. Entre as cultivares, o maior percentual foi encontrado em Cortibel 6. Não houve interação significativa de metilação entre tecidos e cultivares, demonstrando que o nível de metilação acontece de forma independente entre tecidos vegetais e plantas. Palavras-chave: CLAE. Epigenética. Psidium guajava L. Abstract Phenotypic expression can also be regulated by epigenetic mechanisms, with changes in the chromatin without altering the DNA bases. Among the various epigenetic mechanisms, DNA methylation consists of the addition of a methyl group to the cytosine by repressing or activating genes during transcription. Phenotypic alterations related to the control of gene expression in different plant tissues, as well as in different genotypes, are still little studied in fruit species. The aim of this research the level of global methylation in the DNA of different tissues - twig, apical bud, new leaf and developed leaf - and guava cultivars. The methylation levels were measured by High Performance Liquid Chromatography. Methylated cytokine values ranged from 21 to 24%. Among the evaluated tissues, the highest percentage of methylation was observed in the branch and among the cultivars, the highest percentage was found in Cortibel 6. There was no significant interaction of methylation between tissues and cultivars suggesting that the level of methylation occurs independently between plant tissues and plants. Keywords: Epigenetic. HPLC. Psidium guajava L. 1. Mestranda em Genética e Melhoramento pela UFES/CCAE. luzianebalves@hotmail.com. 2. Pós-Doutoranda em Genética e Melhoramento pela UFES/CCAE. 3. Professora Doutora em Genética e Melhoramento. Departamento de Agronomia, UFES/CCAE. 4. Professor Doutor em Genética e Melhoramento. Departamento de Agronomia, UFES/CCAE.

2 1 Introdução A goiabeira (Psidium guajava L.) é uma planta originária da América Tropical presente dentro da família das Myrtaceae e se destaca por suas características edafoclimáticas e sua composição nutricional. O Brasil se destaca na produção de goiabas vermelhas, e juntamente com a Índia e o Paquistão são destaques na produção da cultura pelo mundo (Oliveira et al., 2012). A goiaba é utilizada tanto in natura quanto pela indústria na fabricação de doces, sucos, biscoitos além da sua alta capacidade de fibra e vitamina C (POMMER E MURAAMI, 2009). O estudo associado a goiabeira tem tido um crescimento nos últimos anos devido ao desenvolvimento de cultivares e a associação aos estudos de análises moleculares. Durante o desenvolvimento dos indivíduos, a manifestação de alterações genéticas e fenotípicas estão associadas em sua maioria a fatores bióticos e abióticos, e essa incidência pode levar a interferência na expressão gênica e se perpetuar ao longo de gerações. Variações fenotípicas que se enquadram em um padrão de hereditariedade não relacionadas unicamente à sequências de bases do DNA é atribuído a epigenética (EINTCHEN, 2014), que é caracterizada por mudanças que ocorrem na cromatina devido as modificações ambientais, ocasionando em sua remodelação e em sua atividade de expressão. Tais mudanças podem ser hereditárias e ocorrer em diferentes fases de desenvolvimento do indivíduo atrelado também a fatores ambientais e com isso, as modificações passam a ser associadas ao epigenoma. Existem diferentes mecanismos epigenéticos que atuam nos organismos, dentre eles uma das mais comuns é a metilação do DNA que consiste na adição de um grupo metil no quinto carbono da citosina. Durante o processo de divisão celular, o grupo metil que está presente de forma covalente na citosina que pode ser hereditária e com a ocorrência na replicação, o trecho do genoma pode ficar hemimetilado devido a presença de citosinas não metiladas que são adicionadas (EINTCHEN, 2014). A ocorrência de um evento de metilação tende a desencadear a uma inativação de elementos transponíveis no genoma e redução na expressão gênica em especial quando a metilação atuar sobre regiões cisregulatórias (KOOKE et al., 2015). Além disso, enzimas metiltransferases estão envolvidas nesse evento em três contextos: CG, CHG, CHH. O H corresponde as bases Adenina, Guanina ou Citosina. Mediante ao exposto, objetivou estudar o nível de metilação global no DNA de diferentes tecidos galho, gema apical, folha nova e folha desenvolvida em cultivares de goiabeiras.

3 2 Materiais e Métodos Foram selecionadas cinco cultivares de goiabeira Século XXI, Cortibel 11, Cortibel 14, Cortibel 6 e Paluma - provenientes de pomar da localidade de Palmeiras, em Mimoso do Sul ES, com 3 anos, instalado em delineamento em blocos casualizados, com três repetições e cada uma com duas plantas, no entanto como eram clones, utilizou-se apenas uma planta por repetição. Foram amostrados os tecidos diferenciais por planta sendo: gema apical, folha nova, folha desenvolvida, galho e botão floral. O DNA genômico foi obtido a partir do protocolo CTAB descrito por Doyle Doyle (1990) com modificações. A concentração e qualidade do DNA isolado foi mensurada em espectrofotômetro NanoDrop e padronizado em 30µg/100µl. Realizou-se uma hidrólise ácida com ácido perclórico e o ph foi aferido em uma faixa de 3 a 5. A identificação de metilação nos diferentes tecidos ocorreu por meio de uma análise cromatográfica utilizando a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) através de um arranjo em fotodiodo, coluna C18, utilizando como fase móvel uma solução de KH2PO4 50mmol L-1. A fim de saber a quantidade de citosina metilada disposto no genoma, foi obtida o percentual de 5 - metilcitosina por meio de: % (5 mc) = 5 mc C+5 mc x 100. A análise estatística foi realizada considerando as médias de metilação obtidas na CLAE, além da análise de fatorial no ambiente de programação R para observar efeito de interação entre cultivares e tecidos. 3 Resultados e Discussão A análise de metilação foi realizada a fim de identificar como ocorria a expressão de metilação em tecidos diferenciais em cultivares de goiabeira que se destacam em características morfoagronômicas e traçar um perfil epigenético na cultura. Considerando os dados gerais das cinco cultivares e suas repetições para cada tecido, foi possível perceber que entre os tecidos avaliados o galho apresentou o maior nível de metilação, com 23.2% de metilação (Figura 1). Com base nos dados conjuntos dos tecidos por cultivar verificou-se maior o nível de metilação na Cortibel 6 conforme apresentado na Figura 2. O percentual de metilação encontrado nos demais tecidos foi menor em relação ao galho, mas próximos nos tecidos gema apical, folha velha e folha nova (22.41, e 22.45% respectivamente). O galho permite entender diferentes questões de desenvolvimento sobre a planta como morfologia foliar, tamanho de frutos e sementes, como também responsável pela sustentação das folhas importante para o processo fotossintético e um meio condutor na passagem direta ou indireta de nutrientes para os tecidos foliares (Yang, 2010).

4 Figura 1. Percentual de metilação em tecidos vegetais de goiabeiras por CLAE % de metilação nos tecidos Gema apical Folha velha Folha nova Galho Figura 2. Percentual das medias de metilação dos tecidos nas cultivares analisadas % de metilação nas cultivares Séc XXI C14 C11 C6 Paluma Dentre os eventos epigenéticos, a metilação do DNA influencia no processo de transcrição gênica e tem apresentado uma maior caracterização nos estudos em eucariotos, constituindo de suma importância na manutenção do genoma e regulação da expressão gênica (LE et al., 2014). Dessa forma a importante função atrelada aos galhos para a manutenção e desenvolvimento na planta caracteriza o aumento de metilação nesse tecido. Considerando a expressão de metilação nas cultivares avaliadas, notou-se que os valores médios no nível de metilação nos tecidos foram maiores para as cultivares de Cortibel 11 e 14, em especial a Cortibel 6. Além disso, uma análise de fatorial utilizando o pacote ExpDes.pt no ambiente de programação R pra saber o comportamento dos tecidos estatisticamente, demonstrou que não há uma interação entre os tecidos e as cultivares avaliadas. A razão para esse resultado é que a atividade de cada tecido na planta é diferente e isso não está relacionada com o indivíduo em si. O mecanismo eigenético de metilação do DNA ocorre em tecidos específicos

5 considerando suas funções e estado de desenvolvimento da planta. Isso pode levar a expressão ou inativação de genes de formas diferentes. Neste estudo não foi verificado interação entre cultivares utilizadas e os tecidos avaliados, entretanto Widman (2014) verificou-se diferenças de metilação e expressão em tecidos de raízes de Arabidopsis thaliana, os quais não foram analisados. 4. Conclusão Não houve diferença significativa entre a metilação entre os tecidos avaliados, nem entre os genótipos avaliados, evidenciando um nível de metilação global constante, o que não significa dizer que estes mecanismo não esteja relacionado a manutenção destes tecidos e genótipos, uma vez que diferentes porções genômicas podem estar sendo acessadas. Referências DOYLE, J.J.; DOYLE J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v.12 p.13-15, EICHTEN, S. R.; SCHMITZ, R. J.; SPRINGER, N. M. Epigenetics: beyond chromatin modifications and complex genetic regulation. Plant Physiology, v. 165, p , 2014 KOOKE, R.; JOHANNES, F.; WARDENAAR, R.; BECKER, F.; ETCHEVERRY, M.; COLOT, V.; VREUGDENHIL, D.; KEURENTJES, J. J. B. Epigenetic basis of morphological variation and phenotypic plasticity in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell, v. 27, p , 2015 LE, T-N.; SCHUMANN, U.; SMITH, N. A.; TIWARI, S.; AU, P. C. K.; ZHU, Q-H.; TAYLOR, J. M.; KAZAN, K.; LLEWELLYN, D. J.; ZHANG, R.; DENNIS, E. S.; WANG, M-B. DNA demethylases target promoter transposable elements to positively regulate stress responsive genes in Arabidopsis. Genome Biology. V. 15, p. 1 18, OLIVEIRA, I. P.; OLIVEIRA, L. C.; MOURA, C. S. F. T.; LIMA JÚNIOR, A. F.; ROSA, S. R. A. Cultivo da goiabeira: do plantio ao manejo. Revista Faculdade Montes Belos, v. 5, n. 4, POMMER, C.V., MURAKAMI, K.R.N. Breeding Guava (Psidium guajava L.). In: Jain, S.M., Priyadarshan, P.M., Breeding Plantation Tree Crops: Tropical Species. Springer, v.1. p WIDMAN, N.; FENG, S.; JACOBSEN, S. E.; PELLEGRINI, M. Epigenetic differences between shoots and roots in Arabidopsis reveals tissue-specific regulation. Epigenetics, v. 2, n. 1, p , YANG, D.; NIKLAS, K. J.; XIANG, S.; SHUCUN SUN, S. Size-dependent leaf area ratio in plant twigs: implication for leaf size optimization. Annals of Botany, v. 105, p , 2010.