Mecanismos de Formação de Heterocromatina

Transcrição

1 Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas LGN SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS Mecanismos de Formação de Heterocromatina Mestranda Larissa M. de Andrade Orientador Prof. Dr. Mateus Mondin Departamento de Genética Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: Piracicaba - São Paulo - Brasil Telefone: (0xx19) / 4125 / Fax: (0xx19)

2 O que é Heterocromatina Emil Heitz (1928) descreveu a heterocromatina como o material nuclear que se mantém condensado em todo o ciclo celular, ao contrário do resto do cromossomo, que apresenta um ciclo de condensação-descondensação (Grewal e Jia, 2007)

3 Introdução Classificação da heterocromatina: Heterocromatina facultativa: ocorre em apenas um dos cromossomos do par, e é ativo em apenas um curto período de tempo do ciclo de vida; mantendo-se epigeneticamente reprimidos e heterocromáticos no restante da vida do indivíduo Heterocromatina constitutiva: ocorre no par de cromossomos homólogos, e não é transcrito devido à sua composição do DNA (Sumner, 2003)

4 Introdução Humanos Localização: Centromérica: Praticamente todos os cromossomos têm blocos de heterocromatina na região centromérica e estes blocos podem variar em tamanho entre grande e muito pequeno Exemplo: Arabidopsis (Sumner, 2003)

5 Introdução Intersticial e Terminal: são menos comuns; comuns em plantas com cromossomos grandes e insetos Milho Aguiar-Perecin, M. L. R. et al., 2000

6 Introdução Características da Heterocromatina: Aparência na intérfase Densidade de gene Replicação Recombinação meiótica Acessibilidade a nuclease Altamente condensada Baixa Final da fase S Baixa frequência Baixa (Sumner, 2003)

7 Introdução Características da Heterocromatina: é composta por seqüências de DNA repetitivo que tem pouca ou nenhuma atividade silenciadas por modificações covalentes no DNA ou nas histonas; Auxilia na recombinação entre elementos repetitivos; Auxilia no controle da segregação dos centrômeros; Promove interações entre regiões de cromatina;

8 Introdução Formação e manutenção integram 2 tipos de informações: localização cromossômica e nuclear presença e densidade de elementos de DNA repetitivo seqüências de DNA satélite e elementos transponíveis encontrados em centrômeros, telômeros e knobs' são os principais alvos de formação da heterocromatina (Grewal e Jia, 2007)

9 Mecanismos de Formação da Heterocromatina Metilação do DNA Modificações nas Histonas Interferência por RNA

10 Metilação do DNA

11 Metilação do DNA A metilação é uma modificação comum no DNA dos eucariotos Carbono 5 da citosina (5- methylcytosine, 5mC)

12 Metilação do DNA Em Plantas ocorre predominantemente nos sítios GC, mas também em sítios CHG e CHH (onde H é A, T, or C) (Teixeira et al., 2009) O nível de 5-MC é variável em Plantas: 6% das citosinas em Arabidopsis (Kakutani et al. 1999) 25% das citosinas em Milho (Papa et al. 2001)

13 Metilação do DNA Está ausente ou quase ausente na levedura, moscas e nematóides A interação entre a metilação do DNA e a metilação de histonas é bem estabelecida em animais e plantas (Lippman & Martienssen, 2004) Em Plantas, os transposons são metilados, os quais resultam na regulação dos genes vizinhos (Lippman e Martienssen, 2004; Vaughn et.al, 2007)

14 Os blocos de heterocromatina estão metilados e hipometilados

15 O repeat de 178 pb associado a CEN na cromatina são hipometilados em comparação com o mesmo repeat localizado na heterocromatina pericentromérica em milho e Arabidopsis

16 Epigenetic Modification of Centromeric Chromatin: Hypomethylation of DNA Sequences in the CENH3-Associated Chromatin in Arabidopsis thaliana and Maize 5-MC em Arabidopsis Marca cromocentros Sinais com centros ocos em alguns núcleos Os centros ocos são ocupados por cromatina associada a CENH3 As seqüências de DNA na cromatina CENH3 são hipometiladas comparada as seqüências de DNA da cromatina pericentromérica

17 Epigenetic Modification of Centromeric Chromatin: Hypomethylation of DNA Sequences in the CENH3-Associated Chromatin in Arabidopsis thaliana and Maize 5-MC em Milho Redução significativa do sinal de metilação foi observada nos domínios ocupado por CENH3 As seqüências de DNA na cromatina CENH3 são hipometiladas comparada as seqüências de DNA da cromatina pericentromérica

18 Epigenetic Modification of Centromeric Chromatin: Hypomethylation of DNA Sequences in the CENH3-Associated Chromatin in Arabidopsis thaliana and Maize Conclusões: Em Arabidopsis e no Milho os repeats associados com a cromatina CENH3 são hipometiladas em comparação com o mesmo repeat localizado nas regiões pericentromérica Os resultados sugerem que a metilação do DNA desempenham um papel importante na demarcação epigenética da cromatina CENH3

19 Modificações nas Histonas

20 Modificações nas Histonas As modificações nas histonas ocorrem, normalmente, nas caudas N-terminais Muitas destas alterações são específicas para: o Heterocromatina: metilação de histonas H3 na lisina 9 o Eucromatina: metilação de histonas H3 na lisina 4 (Lippman e Martienssen, 2004)

21 Modificações nas Histonas As modificações estão implicadas na regulação dos genes, formação e manutenção das heterocromatinas

22 Modificações nas Histonas Histonas são modificadas em muitos sítios: Há mais de 60 resíduos diferentes de modificações em histonas que foram detectados por meio de anticorpos específicos (Kouzarides, 2007) (Fuchs et al., 2008)

23 Modificações nas Histonas Há 3 tipos de metilação: (Sumner, 2003)

24 Modificações nas Histonas A heterocromatina é, normalmente, transcricionalmente inativa hipoacetilada nas histonas H3 e H4; hipometilada na lisina 4 da H3; altamente metilada na lisina 9 da histona H3 em levedura, Drosophila, mamíferos e Arabidopsis (Jasencakova et. al, 2003)

25 Modificações nas Histonas Proteínas que auxiliam na formação da heterocromatina Essas proteínas não foram descritas em Plantas, mas estudos mostram que existem proteínas análogas (Sumner, 2003)

26 Modificações nas Histonas Essas proteínas (Swi6p, HP1) quando ligada a H3K9 me2, serve como uma plataforma de montagem de fatores modificadores da cromatina que são envolvidos na estabilização (manutenção) e disseminação de heterocromatina (Grewal e Jia, 2007)

27 Modificações nas Histonas Bandeiras vermelhas indicam H3 metilada na lisina 9 HMT - Histona metiltransferase HDAC Histona deacetilase Esta estratégia geral da metilação da histona, funcionando como uma âncora para recrutar efetores, não se restringe a heterocromatina, sendo utilizados em loci eucromático, onde H3K4me e H3K36me recrutam HDAC para a remodelação da cromatina (Grewal e Jia, 2007; Jasencakova et. al, 2003)

28 Modificações nas Histonas Código de Histonas A alta diversidade de modificações de histonas, bem como o elevado número de resíduos que podem ser modificados dentro de caudas das histonas, e a correlação das alterações individuais com vários processos nucleares, levam à hipótese de que combinações específicas de modificações de histonas fornecem um código de histonas, que determina funções específicas (Jasencakova et. al, 2003)

29 Comparar a distribuição das modificações de histonas ao longo dos cromossomos durante o ciclo celular em espécies de plantas que diferem no tamanho do genoma e na filogenia

30 Chromosomal histone modification patterns from conservation to diversity Padrões de distribuição das modificações nas histonas não são conservados entre as plantas

31 Chromosomal histone modification patterns from conservation to diversity Arabidopsis Mbp/1C Eucromatina: marca específica da eucromatina, enquanto que o nucléolo e o cromocentros permanecem não marcados Heterocromatina: anticorpos contra as marcas de metilação mostra sinais específicos preferencialmente no cromocentros

32 Chromosomal histone modification patterns from conservation to diversity H. vulgare 5100 Mbp/1C (Orientação de Rabl): Eucromatina: marcas de metilação específicas mostram uma redução gradual da marcação dos telômeros em direção ao pólo centromérico Heterocromatina: marcas de metilação mostram uma redução de intensidades de sinal detectável nas regiões eucromáticas FISH com sondas para centrômeros (BAC7 - cyan) e os telômeros (HvT01 - verde) (Fuchs et al., 2006)

33 Chromosomal histone modification patterns from conservation to diversity Vicia faba Mb/1C Eucromatina: marcas específicas de eucromatina são ausentes nos conjuntos de heterocromatina Heterocromatina: marcas específicas apresentam uma distribuição dispersa (Fuchs et al., 2006)

34 Chromosomal histone modification patterns from conservation to diversity Dinâmica do ciclo celular e a intensidade de acetilação em vários resíduos de lisina da H3 e H4 em domínios distintos da cromatina: A intensidade de acetilação em eucromatina e heterocromatina aumenta durante a replicação

35 Chromosomal histone modification patterns from conservation to diversity A distribuição cromossômica das modificações (acetilação e metilação) podem variar ao longo do ciclo celular, bem como dentro e entre grupos de eucariontes possibilidade de divergência evolutiva na leitura do "código das histonas Conclusões: a metilação da H3K4 me2 são restritas a eucromatina H3K9me1, 2, e H3K27me1 H4K20me1 são marcas conservadas da heterocromatina e exibem padrões de distribuição diferentes dependendo do tamanho do genoma

36 Silenciamento de RNA

37 RNA de interferência Conceito: É um mecanismo encontrado em uma grande variedade de eucariontes, e sua principal característica é a utilização de pequenas moléculas de RNA (21-28 nucleotídeos) que conferem alta especificidade a seqüência homóloga (Lippman e Martienssen, 2004)

38 Histórico: Silenciamento RNA de interferência de RNA Plantas: descrito em Petunia Animais: Fire e colaboradores (1998) descreveram o mecanismo em Caenorhabditis elegans como "interferência por RNA (RNAi) (Almeida e Allshire, 2005; Novina e Sharp, 2004) RNAi foi originalmente definido como um mecanismo de silenciamento pós-transcricional A maquinaria de RNAi é composta por: RNA-dependente de RNA polimerase (RdRP), Dicer (Dcr) e Argonauta (Ago) (Grewal e Jia, 2007)

39 RNA de interferência Atuação do RNAi está envolvida na manutenção da heterocromatina em sítios de: o o elementos transponíveis ( jumping genes ) DNAs repetitivos (incluindo transgenes) altera a estrutura da cromatina Garantem a estabilidade do genoma (Lippman e Martienssen, 2004; Novina e Sharp, 2004)

40 Mecanismo Recrutamento de: Histona Metiltransferase De novo DNA metiltransferase Proteínas que modificam cromatina

41 RNA de interferência Heterochromatin sirna: hc-sirna (Vaucheret, 2006)

42 Heterocromatina em Plantas A heterocromatina em plantas envolve RNAi, mas a metilação no DNA e modificações são fatores importante na sua formação; 90%-95% dos sirnas (pequenos RNAi) em Arabidopsis correspondem a transposons e sequências repetitivas, nas quais as histonas e o DNA são facilmente metilados; RNAi e metiltransferases das histonas DNA metiltransferases e histonas deacetilases participam da formação e manutenção da heterocromatina (Lippman e Martienssen, 2004)

43 Conclusão As modificações nas histonas e a metilação do DNA são mecanismos interdependentes na formação e manutenção da heterocromatina (Fuchs et al., 2008) O papel da metilação do DNA na formação da heterocromatina foi reconhecido antes das modificações das histonas (Lippman & Martienssen, 2004) Diferenças na indexação heterocromatina correspondem a diferenças na composição de seqüência ao longo dos cromossomos e, conseqüentemente, diferenças na organização do cromossomo (Fuchs et al., 2008)

44 Conclusão Nas plantas, transposons são inativos e altamente metilados, enquanto genes raramente têm qualquer metilação do DNA (Rabinowicz et al., 2005) A heterocromatização dos elementos móveis serve como um mecanismo de defesa, silenciando sua atividade potencialmente deletéria Tem papel na regulação da expressão gênica durante o desenvolvimento e diferenciação celular

45 Conclusão Estes 3 mecanismos grande importância no processo evolutivo das plantas

46 Referencial Bibliográfico ALMEIDA, R. E ALLSHIRE, R.C RNA silencing and genome regulation. TRENDS in Cell Biology 15: FUCHS, J et al Chromosomal histone modification patterns from conservation to diversity. TRENDS in Plants Science 11: GREWAL, S. I. S. e JIA, S Heterochromatin revisited. Nature Reviews 8: GRAFI G, ZEMACH, A e PITTO, L 2007 Methyl-CpG-binding domain (MBD) proteins in plants. Biochimica and Biophysica Acta 1769: JASENCAKOVA, Z. et al Histone H4 Acetylation of Euchromatin and Heterochromatin Is Cell Cycle Dependent and Correlated with Replication Rather Than with Transcription. The Plant Cell 12: JASENCAKOVA, Z.; MEISTER, A. E SCHUBERT, I Chromatin organization and its relation to replication and histone acetylation during the cell cycle in barley. Chromosoma 110:

47 Referencial Bibliográfico LIPPMAN, Z. and MARTIENSSEN, R The role of RNA interference in heterochromatic silencing. Nature 431: NOVINA,C.D. e SHARP, P.A The RNAi revolution. Nature 430: RABINOWICZ, P.D. et al Differential methylation of genes and repeats in land plants. Genome Research 15: RICHARDS, E.J Inherited epigenetic variation -revisiting soft inheritance Nature Reviews 7: SUMNER, A Chromosomes Organization and Functions. Blackwell Science Ltd. Cap 7- pag.: VAUCHERET, H Post-transcriptional small RNA pathways in plants: mechanisms and regulations. Genes Dev. 20:

48 OBRIGADA!!!