UNIVERSIDADE DE FRANCA - UNIFRAN CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

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1 UNIVERSIDADE DE FRANCA - UNIFRAN CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Efeito dos fungos entomopatogênicos Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. e Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. sobre ovos e lagartas de primeiro ínstar de Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera, Crambidae) MICHELLE DOS SANTOS SILVEIRA Orientador: Prof. Dr. Alexandre de Sene Pinto Franca, SP 2006

2 1 1 INTRODUÇÃO As pragas contribuem para diminuir a produtividade da cultura do milho em torno de 20%, no campo, e 40%, no armazenamento. A broca-da-cana-deaçúcar, Diatraea saccharalis (Fabr., 1794) (Lepidoptera, Crambidae), é uma das pragas do milho e ocorre em todo o hemisfério oeste, atacando principalmente cana-de-açúcar, mas também o sorgo e o arroz, ambas de importância econômica, e plantas selvagens com caules mais grossos (ROE et al., 1981). No milho, os prejuízos diretos ocorrem devido à penetração das lagartas no colmo, abrindo galerias longitudinais, aparentemente não sendo importantes, pois a planta atacada produz normalmente. Os problemas estão nos prejuízos indiretos, quando as lagartas fazem galerias circulares que seccionam o colmo, tornando a planta bastante suscetível à queda por ação do vento. Isso porque o vento derrubando a planta, também colocará a espiga em contato com o solo, favorecendo a germinação dos grãos e ataque de microrganismos (CRUZ et al., 1995; GALLO et al., 2002; PINTO et al., 2004). No Brasil, a broca-da-cana não era importante para a cultura até o início da expansão das áreas cultivadas com cana-de-açúcar na década de 1990, aumentando o número de ocorrência de prejuízos para o milho desde então. Pinto et al. (2002a) e Pinto et al. (2002b) estudaram os danos causados pela broca-da-cana em milho em Ribeirão Preto, SP, e verificaram que são necessárias mais que quatro lagartas de primeiro ínstar por planta para causar algum prejuízo à produção e que as fases de cartucho e embonecamento

3 2 foram as mais suscetíveis ao ataque da lagarta. Em outros países, como no México, as perdas chegam a 39% na produção (PINTO et al., 2004). Na cultura da cana-de-açúcar, onde a broca-da-cana é a principal praga, esta é controlada principalmente pelo uso da vespinha de larvas Cotesia flavipes (Cam.) (Hymenoptera, Braconidae) (GALLO et al., 2002), que localiza seu hospedeiro dentro do colmo atacado, diminuindo a população da mariposa para as próximas safras (BOTELHO; MACEDO, 2002). Entretanto, para a cultura do milho, esse braconídeo não deverá ser eficaz, pois esse parasitóide controla lagartas já desenvolvidas. Existem outras opções biológicas, como o uso de Trichogramma galloi Zucchi (Hymenoptera, Trichogrammatidae), para o controle de ovos (PINTO; PARRA, 2002), e os fungos Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok., e Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., para o controle de ovos (ALMEIDA et al., 1984a) e lagartas (ALMEIDA et al., 1984b; ALMEIDA et al., 1984c; ESTRADA et al., 1997; LECUONA et al., 1996), sendo os fungos muito interessantes pois controlam várias fases da praga. Almeida et al. (1984b) avaliaram o efeito de dosagens de M. anisopliae, isolado SPL, sobre lagartas de últimos ínstares de D. saccharalis e observaram elevada patogenicidade de diferentes dosagens de conídios, inclusive estendendo-se para as pupas de lagartas infectadas. Entretanto, vários isolados existem atualmente e que ainda não foram testados quanto sua virulência para as fases iniciais de desenvolvimento, que são as mais expostas ao ambiente na cultura do milho. Dessa forma, esse trabalho terá por objetivo avaliar a mortalidade causada um isolado de M. anisopliae e um de B. bassiana sobre ovos de diferentes idades e sobre lagartas de primeiro ínstar de D. saccharalis em laboratório.

4 3 2 REVISÃO DE LITERATURA A broca-da-cana, D. saccharalis, ocorre em todo o hemisfério oeste onde ocorre a cana-de-açúcar. Entretanto, existem outras plantas hospedeiras, como o milho, o sorgo e o arroz, de importância econômica, e em plantas selvagens com caules mais grossos (ROE et al., 1981). Os prejuízos diretos ocorrem devido a penetração das lagartas no colmo, abrindo galerias longitudinais, aparentemente não sendo importantes, pois a planta atacada produz normalmente. Os problemas estão nos prejuízos indiretos, quando as lagartas fazem galerias circulares, que seccionam o colmo, tornando a planta bastante suscetível à queda por ação do vento. Isso porque o vento derrubando a planta, também colocará a espiga em contato com o solo, favorecendo a germinação dos grãos e ataque de microrganismos (PINTO et al., 2004). Esta praga se torna importante para o milho quando o mesmo foi plantado em áreas próximas à canaviais, sendo difícil a supressão da D. saccharalis (GALLO et al., 2002). Roe et al. (1981) prepararam uma revisão sobre D. saccharalis, listando os trabalhos publicados de 1887 até No Brasil, Rebelles Reis (1989) relataram a ocorrência de diversas pragas em arroz de sequeiro e, dentre elas, se encontrava D. saccharalis. Em São Paulo, a broca-da-cana é a principal praga da cana-de-açúcar e seus danos se caracterizam pelo complexo broca-podridão, este último causado por microrganismos que penetram os colmos juntamente com a praga

5 4 (GALLO et al., 2002). Vendramim et al. (1989) observaram que a maior extensão dos danos nos colmos foi causada pelos fungos Colletotrichum falcatum e Fusarium moniliforme, chegando a 70%, em média, em comprimento e 95% em volume, para vários cultivares. Os danos causados por D. saccharalis em milho foram verificados por Flynn et al. (1984), em Louisiana, EUA, onde as reduções na produção foram, em média, de 11,8, 9,9 e 14,1% por lagarta estabelecida por planta, quando as infestações foram iniciadas no início da fase de cartucho, no meio da mesma e no início do embonecamento, respectivamente. Embora as perdas na produção tenham sido atribuídas às reduções no peso médio da espiga, esta resposta parece ter sido causada pela combinação de diferentes tipos de danos, ou seja, pelo broqueamento dos caules no início da fase de cartucho, pela alimentação da lagarta no caule e espigas no meio da mesma fase anterior e pela alimentação na espiga no início do embonecamento. Na Argentina, próximo a Rojas, foi verificada por Miguez e Alonso (1984) uma correlação positiva entre o número de internódios danificados por caule, o número de orifícios por caule, o número de lagartas por planta e a porcentagem de plantas danificadas. Qualquer um destes parâmetros poderia ser usado para estimar o nível de infestação. Pode-se observar que as infestações foram maiores em plantas crescendo em solos mais ricos, que os ataque tardios da praga não reduziram a produção e que reduções marcantes na produção foram observadas quando as plantas foram atacadas nos estágios iniciais de crescimento (sendo pouco freqüentes). Em Tamaulipas, no México, Rodriguez del Bosque et al. (1988) estudaram os danos causados por D. saccharalis em milho, durante 1985 e Existiu uma correlação significativa entre o número de lagartas, a porcentagem de internódios danificados e a porcentagem de plantas danificadas. Os danos foram maiores no outono, quando as populações foram maiores. As perdas na produção foram de 1,3, 17,0 e 2,0%, em média, respectivamente durante a primavera de 1985, outono de 1985 e primavera de

6 Um máximo de 39,3% de perda na produção foi detectado em uma localidade no outono de López R. et al. (1989) relataram perdas na produção de milho de 1,32 a 11,73%, em plantações atacadas por Diatraea spp., no Vale do Cauca, Colômbia. Muñoz F. (1990) observou que os danos foram diminuídos quando a adubação foi feita. Os danos de D. saccharalis em milho em quatro diferentes estágios fenológicos foram avaliados por Maredia e Mihm (1991), no México, durante 1987/88. Os maiores danos causados devido à alimentação em folhas ocorreram quando as plantas foram infestadas no estágio de 4-5 folhas, declinando a partir daí. Os danos em caule e espigas foram maiores quando as plantas foram infestadas no estágio de 9-11 folhas e no florescimento, respectivamente. Nos EUA, essa praga ataca desde plantas com duas a quatro folhas, causando danos semelhantes aos da lagarta-rosca, plantas na fase de cartucho, raspando folhas e perfurando o caule, até plantas na fase do embonecamento, atacando espigas (FLYNN et al., 1984). Pinto et al. (2002a) e Pinto et al. (2002b) estudaram os danos causados pela broca-da-cana em milho em Ribeirão Preto, SP, e verificaram que são necessárias mais que quatro lagartas de primeiro ínstar por planta para causar algum prejuízo à produção, mas o número de colmos broqueados aumentou significativamente com o maior número de lagartas, e que as fases de cartucho e embonecamento foram as mais suscetíveis ao ataque da lagarta. O fungo M. anisopliae tem se mostrado eficiente no controle de D. saccharalis. Almeida et al. (1984b) avaliaram o efeito de dosagens desse fungo, isolado SPL, sobre lagartas de último ínstares de D. saccharalis e observaram elevada patogenicidade de diferentes dosagens de conídios, inclusive estendendo-se para as pupas de lagartas infectadas. Entretanto, vários isolados existem atualmente e que ainda não foram testados quanto sua virulência para as fases iniciais de desenvolvimento, que são as mais expostas ao ambiente na cultura do milho.

7 6 A influência de diferentes dietas na suscetibilidade de D. saccharalis aos fungos M. anisopliae e B. bassiana foi verificada por Alves et al. (1990), em laboratório. As lagartas coletadas no campo (plantação de cana-de-açúcar) mostraram uma mortalidade de 35% para M. anisopliae e de 60% para B. bassiana. Entretanto, as lagartas criadas em dieta a base de milho apresentaram mortalidade de 56 e 28% para M. anisopliae e B. bassiana, respectivamente, e as criadas em dieta de farelo, feijão e caseína mostraram mortalidade de 65, 65 e 76%, respectivamente, para M. anisopliae e de 71, 66 e 69%, respectivamente, para B. bassiana. Macedo et al. (1990) estudaram o efeito da planta hospedeira (sorgo, cana-de-açúcar, arroz e milho) para D. saccharalis na suscetibilidade aos fungos M. anisopliae e B. bassiana, em laboratório. As lagartas criadas em sorgo foram as mais suscetíveis a M. anisopliae, enquanto que aquelas criadas em arroz e milho foram as mais resistentes a B. bassiana. Lecuona et al. (1996) caracterizaram e avaliaram a patogenicidade de B. bassiana contra lagartas de D. saccharalis, em laboratório, e constataram taxas de mortalidade de 50 a 90%, com TL50 de 2,1 a 8,4 dias para os diferentes isolados testados.

8 7 3 MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram conduzidos no laboratório de Fitossanidade do Centro Universitário Moura Lacerda, localizado na cidade de Ribeirão Preto estado de São Paulo. Os ovos e as lagartas de Diatraea saccharalis utilizados nos experimentos foram fornecidos pela Biocontrol sistema de controle biológico Ltda., de Sertãozinho, SP, assim como os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana. 3.1 Efeito de fungos entomopatogênicos sobre ovos de D. saccharalis em laboratório Para este experimento foram testados os fungos M. anisopliae isolado CB425 e B. bassiana isolado BG sobre ovos de D. saccharalis de um, dois e três dias de idade. Os ovos foram oriundos de adultos criados em dieta artificial, a base de levedura e farelo de soja (HENSLEY; HAMMOND, 1968 modificada), em escala industrial (CANO et al., no prelo), nas dependências da Biocontrol. Já os fungos, foram oriundos de uma produção em escala industrial em arroz, segundo Leite et al. (2003), nas dependências da Biocontrol.

9 8 Para a obtenção dos conídios dos fungos os grãos de arroz que continham os mesmos foram lavados em um recipiente com água e a calda formada foi recolhida em outro recipiente, passando por uma peneira de 50 mesh. Os papéis que obtinham as posturas de D. saccharalis de diferentes idades foram recortados em pedaços menores, onde cada pedaço conteve em média cerca de 40 ovos. Os pedaços de papel contendo as posturas de D. saccharalis foram mergulhados individualmente com o auxílio de uma pinça no recipiente com a calda dos fungos, ficando submerso durante 3 segundos. Após esse tempo, os ovos foram colocados sobre um pedaço de papel filtro para a remoção do excesso do produto. Após este processo as posturas foram individualizadas em placas de Petri plásticas (10 cm de diâmetro x 2 cm de altura) identificadas, com papel filtro no fundo, e abaixo da tampa foi utilizado um filme plástico para a vedação, evitando para que as lagartas recém eclodidas escapassem das placas. Dentro de cada placa foi mantido um pequeno chumaço de algodão umidecido para manter a umidade no micro-ambiente. Todos esses procedimentos foram realizado em uma capela, próximo a um bico de Bunsen, em local e com materiais previamente desinfetados com álcool 96%. Cada fungo foi considerado um tratamento, além de uma testemunha onde os ovos de diferentes idades foram mergulhados em água destilada. Sendo assim, cada tratamento foi repetido 10 vezes, em um delineamento inteiramente casualizado. Dessa forma, foram testados 3 tratamentos, em 3 idades de ovos diferentes, com 10 repetições cada, totalizando 90 posturas. Todas as placas foram mantidas em uma câmara de germinação do tipo B.O.D., com temperatura regulada para 28±1ºC, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12 horas.

10 9 Diariamente as posturas foram observadas para quantificação do número de lagartas eclodidas e do número de ovos inviáveis. Os ovos que não originaram lagartas foram acondicionados em uma câmara úmida e mantidos na B.O.D. (28±1ºC, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12 horas) para possível esporulação dos fungos. Nas posturas onde ocorreram esporulação, uma pequena quantidade dos conídios foi removida para confirmação da espécie do fungo que se desenvolveu, observação essa que foi feita em lâmina sob microscópio binocular. Das placas onde a mortalidade não foi total, retirou-se em torno de 5 lagartas de cada, sendo estas confinadas individualmente em tubos de vidro de fundo chato esterilizados (2 cm de diâmetro x 15 cm de altura), fechados com algodão hidrófugo esterilizado, contendo dieta mencionada anteriormente ( a base de levedura e farelo de soja) e identificadas de acordo com o tratamento. Após este processo os tubos contendo as lagartas foram observados a cada dois dias e anotado a data de mortalidade, de pupação e de emergência do adulto. As lagartas ou pupas mortas foram colocadas em câmaras úmidas, como descrito anteriormente (em B.O.D.), para confirmação da infecção pelo fungo estudado. Dos dados obtidos calculou-se as médias, que foram comparadas entre si por um teste mais adequado. 3.2 Efeito de fungos entomopatogênicos sobre lagartas recémeclodidas de D. saccharalis em laboratório Neste experimento foram testados os fungos M. anisopliae isolado CB425 e B. bassiana isolado BG sobre lagartas recém-eclodidas de D. saccharalis (12 horas da eclosão), como descrito no item 3.1, mantendo também uma testemunha, como no item anterior.

11 10 Para a realização dos tratamentos as lagartas foram separadas em grupos de 10 e acondicionadas em saquinhos de voil, sendo mergulhadas por 3 segundos na calda dos fungos e colocadas sobre papel filtro para a retirada do excesso de produto, evitando assim a obstrução dos espiráculos. Após este procedimento as lagartas foram confinadas individualmente em tubos de vidro de fundo chato esterilizados (2 cm de diâmetro x 15 cm de altura), fechados com algodão hidrófugo esterilizado, contendo dieta a base de levedura e farelo de soja, com auxílio de uma pinça. Dessa forma, foram testados 3 tratamentos com 50 repetições (um tubo contendo uma lagarta), em delineamento inteiramente casulizado. Os tubos contendo as lagartas foram observados a cada dois dias e anotado a data de mortalidade, de pupação e de emergência do adulto. As lagartas ou pupas mortas foram colocadas em câmaras úmidas, como descrito anteriormente (em B.O.D.), para confirmação da infecção pelo fungo estudado. Dos dados obtidos calculou-se as médias, que foram comparadas entre si por um teste mais adequado.

12 11 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO A seguir, serão mostrados, os dados obtidos através das análises de programa estatístico das avaliações de mortalidade e da confirmação dos ovos e seus receptivos tratamentos. Tabela 1. Porcentagem média de mortalidade de ovos de D. saccharalis, de um dia de idade, tratados com os fungos B. bassiana ou M. anisopliae ou com água (testemunha). Tratamentos Testemunha (água) Beauveria bassiana Mortalidade média (%) (± erro padrão da média) 1,70 ± 0,5493 c 28,25 ± 3,6752 b Metarhizium anisopliae 98,06 ± 1,3127 a Médias seguidas pela mesma letra não diferiram entre si pelo teste de Tukey (α<0,01). A mortalidade média de ovos de D. saccharalis, de um dia de idade, atingiu 98,06% quando utilizou-se o fungo Metarhizium anisopliae, resultado este, maior quando comparado aos demais tratamentos, Beauveria bassiana (28,25%) e Testemunha (1,70%). Todavia o tratamento que utilizou-se o fungo Beauveria bassiana, apresentou resultado maior em relação á Testemunha. No entanto, a Testemunha obteve médias inferiores aos outros tratamentos (M. anisopliae e B. bassiana).

13 12 Tabela 2. Porcentagem média de mortalidade de ovos de D. saccharalis, de dois dias de idade, tratados com os fungos B. bassiana ou M. anisopliae ou com água (testemunha). Tratamentos Testemunha (água) Mortalidade média (%) (± erro padrão da média) 0,95 ± 0,4853 c Beauveria bassiana 25,50 ± 3,5013 b Metarhizium anisopliae 99,26 ± 0,4167 a Médias seguidas pela mesma letra não diferiram entre si pelo teste de Tukey (α<0,01). A tabela 2 mostra que a mortalidade média de ovos de D. saccharalis, de dois dias de idade, atingiu 99,26% quando utilizou-se o isolado do fungo Metarhizium anisopliae, sendo este maior em relação aos tratamentos que utilizou-se o isolado do fungo Beauveria bassiana e Testemunha. Quando utilizou-se o isolado do fungo Beauveria bassiana a mortalidade média foi de 25,5%, resultado superior em relação a Testemunha que obteve média de 0,95% de mortalidade. Sendo assim, a Testemunha foi inferior comparando-se aos outros tratamentos (M. anisopliae e B. bassiana). Tabela 3. Porcentagem média de mortalidade de ovos de D. saccharalis, de três dias de idade, tratados com os fungos B. bassiana ou M. anisopliae ou com água (testemunha). Tratamentos Testemunha (água) Beauveria bassiana Metarhizium anisopliae Mortalidade média (%) (± erro padrão da média) 1,96 ± 0,8664 b 11,51 ± 2,2834 ab 94,78 ± 1,9220 a Médias seguidas pela mesma letra não diferiram entre si pelo teste de Tukey (α<0,01).

14 13 A mortalidade média de ovos de D. saccharalis, de 3 dias de idade, quando utilizado o isolado do fungo Metarhizium anisopliae obteve 94,78%, não diferindo com o tratamento que utilizou o isolado do fungo Beauveria bassiana que atingiu 11,51% de mortalidade, sendo maior quando comparado com a Testemunha que obteve 1,96% de mortalidade. Porém, o tratamento que utilizou o isolado do fungo Beauveria bassiana, obteve médias semelhantes aos da Testemunha, não diferindo entre si ao nível de 1% de probabilidade. Mortalidade (%) ,79 b 98,02 a B. bassiana M. anisopliae Colunas seguidas pela mesma letra não diferiram entre si pelo teste de Tukey (α<0,01). Figura 1. Porcentagem média de mortalidade confirmada e corrigida de ovos de D. saccharalis de um dia de idade tratados com os fungos B. bassiana e M. anisopliae. A mortalidade confirmada de ovos de D. saccharalis de um dia de idade, tratados com o fungo M. anisopliae, foi de 98,02%, resultado este maior em relação ao tratamento com o fungo B. bassiana que atingiu apenas 23,79%, a nível de1% de probabilidade.

15 14 Mortalidade (%) ,13 b 99,25 a B. bassiana M. anisopliae Colunas seguidas pela mesma letra não diferiram entre si pelo teste de Tukey (α<0,01). Figura 2. Porcentagem média de mortalidade confirmada e corrigida de ovos de D. saccharalis de dois dias de idade tratados com os fungos B. bassiana e M. anisopliae. Na figura 2, mostra que o tratamento que utilizou o fungo M. anisopliae obteve 99,25% de mortalidade confirmada sobre ovos de D. saccharalis de dois dias de idade, sendo maior quando comparado ao tratamento com o fungo B. bassiana que obteve resultado de 17,13% de confirmação sobre a mortalidade, a nível de 1% de probabilidade.

16 Mortalidade (%) ,73 b 94,68 a 0 B. bassiana M. anisopliae Colunas seguidas pela mesma letra não diferiram entre si pelo teste de Tukey (α<0,01). Figura 3. Porcentagem média de mortalidade confirmada e corrigida de ovos de D. saccharalis de três dias de idade tratados com os fungos B. bassiana e M. anisopliae. De acordo com a Figura 3, constatou que o tratamento com o fungo M. anisopliae obteve 94,68% de mortalidade confirmada sobre os ovos de D. saccharalis de três dias de idade, sendo mais eficiente em relação ao tratamento que utilizou o fungo B. bassiana que atingiu 5,73%, a nível de 1% de probabilidade.

17 16 50 Mortalidade (%) ,99 a 17,13 ab 5,73 b Idade dos ovos (dias) Colunas seguidas pela mesma letra não diferiram entre si pelo teste de Tukey (α<0,01). Figura 4. Porcentagem média de mortalidade confirmada e corrigida de ovos de D. saccharalis de diferentes idades tratados com o fungo B. bassiana. Quando se utilizou o fungo B. bassiana sobre os ovos de D. saccharalis em diferentes idades, constatou-se que, nos tratamentos com os ovos de um e dois dias, respectivamente, não mostrou diferença significativa entre os tratamentos, porém o tratamento com os ovos de um dia apresentou mortalidade maior quando comparado ao tratamento com ovos de três dias. Todavia, o tratamento que utilizou ovos de dois dias não diferiu significativamente quando comparados ao tratamento com os ovos de três dias.

18 17 Mortalidade confirmada (%) B. bassiana M. anisopliae Dias após a eclosão Figura 5. Mortalidade média confirmada e acumulada durante o desenvolvimento larval de D. saccharalis após o tratamento dos ovos de um dia de idade com os fungos B. bassiana e M. anisopliae. Mortalidade confirmada (%) B. bassiana M. anisopliae Dias após a eclosão Figura 6. Mortalidade média confirmada e acumulada durante o desenvolvimento larval de D. saccharalis após o tratamento dos ovos de dois dias de idade com os fungos B. bassiana e M. anisopliae.

19 18 Mortalidade confirmada (%) B. bassiana M. anisopliae Dias após a eclosão Figura 7. Mortalidade média confirmada e acumulada durante o desenvolvimento larval de D. saccharalis após o tratamento dos ovos de três dias de idade com os fungos B. bassiana e M. anisopliae. A duração média do período embrionário e a duração média do período larval não foram afetadas pelos fungos aplicados. A duração média do período embrionário e a duração do período larval variaram de 5,0 a 6,5 dias e de 26,15 a 29,40 dias, respectivamente, entre os tratamentos e as idades dos ovos utilizados.

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