CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE VEADO-ROXO NA TENTATIVA DE RESOLUÇÃO DE INCERTEZAS TAXONÔMICAS

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1 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE VEADO-ROXO NA TENTATIVA DE RESOLUÇÃO DE INCERTEZAS TAXONÔMICAS GENETIC CHARACTERIZATION OF AN AMAZONIAN BROWN BROCKET DEER ATTEMPT TAXONOMIC RESOLUTION OF UNCERTAINTIES Jorge Alfonso Morales Donoso (1)(2) Cristiane Maria Fernandes de Melo (3) Jose Mauricio Barbanti Duarte (1) Resumo Trabalhos recentes têm indicado que a taxonomia do gênero Mazama necessita ser revista. A espécie Mazama nemorivaga foi considerada, por certo tempo, como sinonímia e mais adiante como subespécie de Mazama gouazoubira, sendo elevada recentemente ao nível de espécie. Com base em estudos citogenéticos e moleculares, pode-se inferir que a atual classificação de M. nemorivaga apresenta incertezas. O presente trabalho pretende contribuir para a taxonomia do gênero Mazama, com a definição do que seja realmente Mazama nemorivaga. No presente trabalho foi realizada uma caracterização citogenética (cariótipo convencional, biometria cromossômica, bandeamento C, coloração RON) e molecular (cyt b) de um exemplar coletado na localidade tipo da espécie (Caiena, Guiana Francesa). Como resultado das análises cariotípicas, o exemplar coletado apresentou um cariótipo padrão para machos desta espécie com 2n=69; NF=70, entretanto sem a fusão X autossômica que gera o sistema sexual múltiplo. O bandeamento C mostrou que todos os cromossomos autossômicos apresentam blocos pericentroméricos de heterocromatina constitutiva na região centromérica, assim como também o cromossomo X. Em quanto o cromossomo Y mostrou-se eucromático. A impregnação com nitrato de prata revelou regiões organizadoras nucleolares ativas nos telômeros do braço q dos pares 02 e 03. A árvore filogenética sob inferência bayesiana do gene do cyt b mostra uma clara diferenciação entre esta espécie e Mazama gouazoubira, agrupando-se em dois clados claramente separados. Os resultados obtidos até o presente ainda são preliminares, sendo necessária a ampliação do número de bandeamentos cromossômicos, bem como o número de genes mitocondriais. Palavras chaves: Bandeamento clássico, DNA mitocondrial, taxonomia, Mazama nemorivaga. Abstract Recent work indicates that it is necessary for the taxonomy of the genus Mazama to be revisited. The species Mazama nemorivaga was considered for some time a subspecies of Mazama gouazoubira and was only recently elevated to the species level. With a base in cytogenetic and molecular studies, it can be infered that the actual classification of M. 1 Coordenador do Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos (NUPECCE), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Jaboticabal SP. barbanti@fcav.unesp.com.br, Tel: (16) Mestrando no Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento Animal, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Jaboticabal SP. jorgemoralesdonoso@gmail.com, Tel: (11) Doutoranda no Programa de Pós-graduação em Clinica e Medicina veterinária, Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Jaboticabal - SP. crisalicemelo@gmail.com. Tel: (16)

2 nemorivaga presents uncertainties. Current work intends to contribute to the taxonomy of the genus Mazama, with the definition of what really is Mazama nemorivaga. This was realized after a cytogenetic (conventional karyotype, chromosomal biometry, C banding, RON coloration) and molecular characterization (cyt b) of a sample collected in the type locality of the species (Cayenne, French Guiana). Like the results of the karyotypic analysis, the sample presented a karyotypic pattern for males from this species with 2n=69; NF=70, however it did not have the X autosomal fusion that generates the multiple sexual system. Chromosome preparation subjected to C banding showed that all of the autosomes present pericentromeric blocks of heterochromatin constituting in the centromeric region, like the X chromosome. Whilst the Y chromosome showed to be euchromatic. Impregnation with silver nitrate reveled nucleolar organizer regions active in the telomeres of the q arm of the pairs 02 and 03. After DNA extraction was amplified mitochondrial DNA Cyt b region (1140 bp), the phylogenetic tree under bayesian inference shows a clear differentiation between this species and Mazama gouazoubira, grouping them in two clear separate clades. Obtained results until the present day are preliminaries, meaning that the application of the number of chromosomal bands is necessary, as well as the number of mitochondrial genes. Keywords: Classic banding, mitochondrial DNA, taxonomy, Amazonian brown brocket deer 1. Introdução Mazama nemorivaga foi descrita pela primeira vez como Cervus nemorivagus por Cuvier (1817, p 534), a partir de exemplares armazenados no museu Nacional de História Natural de Paris. Porém, a localidade tipo de M. nemorivaga foi descrita por Cuvier em 1821, a partir de animais coletados pelos Srs. Poiteau e Martin em Caiena, Guiana Francesa. Até o presente momento, já foram relatadas cerca de 21 sinonímias para M. nemorivaga e outras 13 que ainda apresentam identificações duvidosas (ROSSI, 2010). Além disso, existem sete descrições de subespécies de Mazama nemorivaga, que também têm sido referidas como subespécies de Mazama gouazoubira (Pinder & Leeuwenberg 1997). O nome Mazama nemorivaga é reconhecido como espécie válida por Rossi (2000). Além da confusão taxonômica entre espécies e subespécies, análises filogenéticas do gênero Mazama, utilizando marcadores de DNA mitocondrial e nuclear, sugerem que o gênero Mazama é polifilético (GILBERT et al., 2006; DUARTE et al., 2008; HASSANIN et al., 2012).Avaliando os padrões de diversificação filogeográfica de M. gouazoubira e M. nemorivaga, Figueiredo (2014) analisou amostras de M. nemorivaga provenientes de quatro localidades da Amazônia Brasileira, sugerindo a separação de M. nemorivaga em três clados diferentes. Somadas as diferenças filogenéticas, diferenças cariotípicas corroboram a classificação de M. nemorivaga como espécie verdadeira (RESENDE, 2012), Fiorillo et al. (2013) através

3 do bandeamento G, identificaram que os machos apresentavam uma fusão X-autossômica, o que provocou a diferenciação do sistema sexual (XX/XY 1 Y 2.). Com base em estudos morfológicos (ROSSI, 2000), moleculares (DUARTE et al., 2008, FIGUEIREDO, 2014) e citogenéticos (RESENDE 2012, FIORILLO et al., 2013), podese sugerir que a atual classificação de M. nemorivaga apresenta incertezas, o que impede a sua classificação como unidade específica (DUARTE et al., 2012). O objetivo deste trabalho foi contribuir para a taxonomia do gênero Mazama. Mediante uma caracterização molecular (cyt b) e citogenética (cariótipo convencional, biometria cromossômica, bandeamento C, coloração RON). Através da coleta de um exemplar em sua localidade tipo e comparar estes padrões com os já descritos na literatura para outros espécimes da mesma espécie. 3. Materiais e Métodos Após a coleta de um animal da espécie M. nemorivaga, macho, juvenil, a 70 km de Caiena, Guiana Francesa, foi realizada a tricotomia e antissepsia da região interna da coxa esquerda, permitindo a excisão de um fragmento de 5 x 2 cm de pele, o qual foi estocado em imersão com nitrogênio líquido (-196ºC). Nesta condição, estas células permaneceram vivas, e foram utilizadas em cultivos de fibroblastos para estudos citogenéticos. Para estudos moleculares, foram coletadas amostras de tecido (músculo, fígado) em fragmentos de 1 cm 2, que foram mergulhados em tubos com etanol absoluto, permanecendo à temperatura ambiente. 4. Resultados e Discussão Como resultado das análises cariotípicas, o exemplar coletado apresentou um cariótipo padrão para machos desta espécie com 2n=69; NF=70, entretanto sem a fusão X autossômica que gera o sistema sexual múltiplo, como descrito no trabalho de Rezende (2012) e Fiorillo (2013). O bandeamento C mostrou que todos os cromossomos autossômicos apresentaram blocos pericentroméricos de heterocromatina constitutiva na região centromérica, assim como também o cromossomo X. Enquanto o cromossomo Y mostrou-se eucromático. A impregnação com nitrato de prata revelou regiões organizadoras nucleolares ativas nos telômeros do braço q dos pares 02 e 03, resultado que diferiu do encontrado por Rezende (2012).

4 A árvore filogenética sob inferência bayesiana do gene do cyt b mostrou uma clara diferenciação entre esta espécie e Mazama gouazoubira, agrupando-se em dois clados claramente separados, assemelhando-se com o proposto por Duarte et al. (2008) e Figueiredo (2014). 5. Conclusão Os resultados obtidos até o presente momento, ainda são preliminares, sendo necessária a ampliação do número de bandeamentos cromossômicos, bem como o número de genes mitocôndrias, a fim de esclarecer o nível de diferença entre indivíduos já estudados, e também possibilitar uma revisão taxonômica da espécie, incluindo suas sinonímias e subespécies. 6 Apoio Financeiro: Agradeço a Fundação CAPES pelo apoio financeiro e ao laboratório de genética do Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos (NUPECCE) Referências CUVIER, G.L.C.F.D. Dictionnarie des Sciences Naturelles. Zoologie. Mammiferes. F.G. Levrault, Paris. v.7, n.1, p CUVIER, G.L.C.F.D. Recherches sur le ossemens fossiles de quadrupédes. Ou l on rétablit les caracteres des plusieurs espéces d animaux que les révolutions du Globe ont paroissent avoir détruites ect. 2nd ed. Edmond D Ocagne, Paris. v. 4. p DUARTE, J.M.B., Vogliotti, A., Zanetti, E.S., Oliveira, M.L., Tiepolo, L.M., Rodrigues, L.M., Almeida, L.B Avaliação do risco de Extinção do Veado-roxo Mazama nemorivaga Cuvier, 1817, no Brasil. Biodiversidade Brasileira. v. 2, n.3, p DUARTE, J.M.B., Gonzalés, S., Maldonado, J.E. The surprising evolutionary history of South American Deer. Molecular Phylogenetics and Evolution. v. 49, p FIORILLO, B.F., Sarria-Perea, J.A., Abril, V.V., Duarte, J.M.B. Cytogenetic description of the Amazonian brown brocket Mazama nemorivaga (Artiodactyla; Cervidae). Comparative cytogenetics. v. 7, n.1, p FIGUEIREDO, M.G. Filogenia e taxonomia dos veados cinzas (Mazama gouazoubira e M. nemorivaga) f. Trabalho de Ph.D dissertação, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, Brasil

5 GILBERT, C., ROPIQUET, A., HASSANIN, A. Mitocondrial and nuclear phylogenies of Cervidae (Mammalia; Ruminantia): Systematics, morfology, and biogeography. Molecular. Phylogenetics and Evolution. v. 40, n. 1, p HASSANIN, A., DELSUC, F., ROPIQUET, A., HAMMER, C., VAN VUUREN, B.J., MATTHEE, C., RUIZ-GARCIA, M., CATZEFLIS, F., ARESKOUG, V., NGUYEN, T.T., COULOX, A. Pattern and timing of diversification of Cetartiodactyla (Mammalia; Laurasiatheria), as revealed by a comprehensive analisys of mitocondrial genomes. Comptes Rendum Biology. V.335. n. 1, p HERSHKOVITZ, P. Mammals from British Honduras, Mexico, Jamaica and Haiti. Fieldiana Zoology. v.31, n. 1, p PINDER, L.; LEEUWENBERG, F. Veado-catingueiro. In: DUARTE, J.M.B. Biologia e conservação de Cervídeos sul-americanos: Blastocerus, Ozotoceros e Mazama. Jaboticabal. Funep (Ed.) RESENDE, J. P. A. Comparação cariotípica entre Mazama cinzas do Brasil (Mazama gouazoubira e Mazama nemorivaga, Artiodactyla; Cervidae) f. Trabalho de Dissertação Mestrado Melhoramento Genético Animal. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias. Jaboticabal, Brasil ROSSI, R. V. Taxonomia de Mazama Rafinesque, 1817 do Brasil (Artiodactyla, Cervidae) f. Trabalho de Dissertação de Mestrado em Ciências Biológicas. Instituto de Biociências. Universidade de São Paulo, São Paulo. Brasil