ALGUNS ASPECTOS DA INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO VÍRUS DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA (BLV) EM BÚFALOS ( Bubalus bubalis ) E OVINOS ( Ovis aries ).

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1 ARS VETERINARIA, 15(1):33-38, ALGUNS ASPECTOS DA INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO VÍRUS DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA (BLV) EM BÚFALOS ( Bubalus bubalis ) E OVINOS ( Ovis aries ). ( SOME ASPECTS OF EXPERIMENTAL INFECTION OF BOVINE ENZOOTIC LEUKOSIS VIRUS (BLV) IN BUFFALOES ( Bubalus bubalis ) AND SHEEP ( Ovis aries ) ). C. DEL FAVA 1, S. I. SAMARA 2, M. C. G. BOER 2, A. S. R. MEDEIROS 2, M. A. C. OLIVEIRA 3, M. A. OLIVEIRA 3, E. GARCIA LIMA 4 RESUMO Foram estudados alguns aspectos da infecção experimental por inoculação do Vírus da Leucose Enzoótica Bovina (BLV) em 2 búfalas e 2 ovinos. Utilizando o teste de Imunodifusão em Gel de Ágar, anticorpos contra a gp51 do BLV no soro sanguíneo foram evidenciados em apenas um búfalo, que soroconverteu na 24ª semana pós-inoculação, enquanto que os 2 ovinos soroconverteram na 4ª semana pós-inoculação. Não foram observados alterações hematológicas como linfocitose persistente e não foi constatado aumento dos gânglios linfáticos superficiais durante o período de observação de 52 semanas, em todos os animais. PALAVRAS-CHAVE: Vírus da Leucose Enzoótica Bovina, búfalos, ovinos, infecção experimental. SUMMARY Some aspects of experimental infection by the Bovine Enzootic Leukosis Virus (BLV) were studied in 2 buffaloes and 2 ovines. Antibodies against gp51 of BLV in the blood were evidenced by the Agar Gel Immunodifusion Agar test (AGID). One of the buffaloes seroconverted at the 24 th week following the inoculation, while the 2 ovines seroconverted at the 4 th week post inoculation. No haematological alterations like persistent lymphocytosis and no enlargement of the superficial lymphonodes were found during the observation period of 52 weeks, in all the animals. KEY-WORDS: Enzootic Bovine Leukosis Virus, buffaloes, sheep, experimental infection. 1 Instituto de Zootecnia CP.60, CEP , Nova Odessa, SP. Parte da Dissertação apresentada à FCAV-UNESP-Jaboticabal, para obtenção do título de MESTRE EM MEDICINA VETERINÁRIA, área de Concentração em Medicina Veterinária Preventiva. Projeto CNPq /91. 2 Depto. Medicina Veterinária Preventiva-FCAV UNESP Jaboticabal. 3 Alunos bolsistas do PET CAPES, curso de graduação em Medicina Veterinária da FCAV-UNESP Jaboticabal. 4 Faculdade Regional de Medicina de São José do Rio Preto, SP.

2 34 ARS VETERINARIA, 15(1):33-38, INTRODUÇÃO O vírus da Leucose Enzoótica Bovina (BLV), classificado na Família Retroviridae, gênero BLV-HTLV retrovírus (COFFIN et al., 1995), causa em bovinos, principal fonte de infecção, linfocitose persistente e linfossarcoma (OLSON & MILLER, 1987). Nesta espécie, a soroconversão pode levar de 3 até 24 meses para se manifestar (BIRGEL, 1982a). Após um variável período de tempo, aproximadamente 30% dos animais infectados podem apresentar linfocitose persistente durante anos ou por toda a vida do animal, sem causar distúrbios na vitalidade e até 5% dos indivíduos podem desenvolver o processo neoplásico (linfossarcoma), com desfecho fatal (FERRER et al., 1979). O linfossarcoma pode estar presente em indivíduos a partir de dois anos de idade, sendo maior a ocorrência entre 5 e 8 anos (BIRGEL, 1982a). As lesões do tipo linfossarcoma podem ser encontradas nos gânglios linfáticos, coração, abomaso, baço, fígado, útero e rins (PARODI, 1987). Apesar de estar constatada a ocorrência de infecção natural em búfalos (MARÍN et al., 1978, MARÍN et al., 1982, TSOUTSOUMANSKI & GENOV, 1985) e em ovinos (MARÍN et al., 1982), aspectos patogênicos da infecção do BLV nestas duas espécies têm sido pouco estudados. Existem relatos de casos de linfocitose e linfossarcoma em búfalos, porém não foram realizados testes sorológicos, isolamento viral ou microscopia eletrônica para determinar se os animais estavam infectados pelo BLV (GUPTA et al., 1977, SINGH et al., 1979, LÁU, 1987). Os poucos estudos dos efeitos da infecção do BLV para a espécie bubalina foram realizados em animais infectados experimentalmente. ROMERO et al. (1981) inocularam 7 búfalos com sangue de bovino sorologicamente positivo ao BLV, ocorrendo soroconversão de 1 búfalo 3 meses e outro aos 7 meses e de 2 búfalos aos 8 meses pós-inoculação, tendo sido possível observar partículas virais do tipo C pela microscopia eletrônica em todos os animais soropositivos no 8 º mês de observação. PERSECHINO et al. (1983) causaram infecção experimental em 2 búfalos, determinada por reação sorológica fracamente positiva na 12ª semana e fortemente positiva a partir da 14 ª semana, sem que houvesse alteração do número médio de linfócitos quando comparadas as contagens dos períodos pré e pós-infecção experimental até o 7º mês de observação. PERSECHINO & D AMORE (1984) verificaram que, em de 19 meses de observação pós-inoculação, os búfalos apresentaram anticorpos contra o BLV, não tendo ocorrido alteração do número de linfócitos e linfadenopatia. Porém, isolaram in vitro o BLV de um destes animais, cujo sangue foi inoculado em 2 ovinos, causando soropositividade na 4 ª e 5 ª semanas e demonstrando a transmissão interespécie do BLV do búfalo ao ovino. PERSECHINO et al. (1985), após 25 meses de observação, verificaram que os 2 búfalos inoculados em 1983 (PERSECHINO et al., 1983) ainda apresentavam anticorpos precipitantes contra o BLV e somente o animal positivo ao isolamento in vitro foi submetido à uma terapia imunossupressiva com corticóide. Este animal, ao final de um período de observação de 8 meses, não apresentou linfoadenopatia e alterações hematológicas, mas anticorpos contra o BLV. Comprovou-se a transmissão intraespécie ao inocular o sangue deste animal em 2 búfalos, sendo que um deles soroconverteu 5 meses após a inoculação. A espécie ovina tem sido utilizada como modelo de infecção experimental ao BLV, por ser tão susceptível quanto a espécie bovina à infecção, soroconvertendo e desenvolvendo linfocitose persistente e linfossarcoma. RESSANG et al. (1976) inocularam 12 ovinos com sangue de bovino com BLV, sendo que 7 animais, em período variável de 1 a 3 meses após a inoculação apresentaram anticorpos contra o vírus e 3 ovinos apresentaram linfocitose e aumento de linfonodos periféricos a partir do 23 º mês. GENTILE et al. (1977) inocularam ovinos com sangue de bovino com BLV, onde todos tornaram-se soropositivos ao vírus em 2 a 3 meses pós-inoculação e em período de 19 meses não apresentaram outras alterações clínicas. MAMMERICKX et al. (1980) inocularam sangue de bovino com BLV em 13 ovinos, ocasionando reação sorológica positiva 15 a 30 dias pós-inoculação e manifestações tumorais em alguns indivíduos 6 anos após a inoculação. O presente trabalho teve como objetivo observar alguns aspectos da resposta imune humoral e hematológica do BLV para as espécies bubalina e ovina, em animais experimentalmente inoculados, observando a susceptibilidade à infecção ao BLV em búfalos e ovinos. O conhecimento dessas variáveis é de suma importância para se poder atuar na cadeia epidemiológica da Leucose Enzoótica Bovina, principalmente com relação à prevenção da doença. MATERIAL E MÉTODOS Animais de experimentação: selecionou-se uma fêmea bovina adulta soropositiva ao BLV, com linfocitose persistente e linfoadenopatia, para ser a doadora do inóculo. Para receptores do inóculo, 2 bubalinos fêmeas, sem raça definida, com 13 e 15 meses de idade, soronegativas ao BLV e 2 ovinos machos, sem raça definida, jovens, também soronegativos ao BLV, foram utilizados para serem controle da infecciosidade do inóculo e reservados ao estudo da susceptibilidade. As observações foram efetuadas em 2 fases, pré-inoculação e pós-inoculação experimentais.

3 ARS VETERINARIA, 15(1):33-38, Fase Pré-inoculação Experimental: as búfalas e os ovinos foram submetidos a 8 colheitas de sangue efetuadas em intervalos semanais. Em cada colheita foi realizado exame sorológico para certificar que não estavam infectados pelo BLV e provas hematológicas, para obter a contagem padrão do número de linfócitos/mm 3 do sangue dos indivíduos. Foi realizado exame clínico para observar as características dos gânglios linfáticos superficiais. Após a 8 a colheita de sangue foi preparado o inóculo, constituído de sangue fresco, colhido sob vácuo em frasco esterilizado, contendo solução de Citrato de Sódio, obtendo linfócitos/mm 3 após a diluição com anticoagulante. Cada búfala recebeu, por via intravenosa, 100 ml, e cada ovino, por via subcutânea, 20 ml do inóculo. Fase Pós-inoculação Experimental: após a inoculação, foram colhidas amostras de sangue das búfalas e dos ovinos a cada 2 semanas, nos primeiros 9 meses, e mensalmente, após este período, até completarem 52 semanas de observação. As amostras sanguíneas foram submetidas a exames hematológicos, para determinar linfocitose persistente. Os gânglios linfáticos mandibulares, parotídeos, pré-escapulares e pré-femurais, foram examinados por palpação, para observar tamanho, consistência, forma e aderência aos tecidos circundantes, conforme ROSENBERGER (1983). Exames Laboratoriais: as amostras de sangue, colhidas em frascos com EDTA, foram submetidas à contagem global e diferencial de leucócitos, segundo BIRGEL (1982b). O soro sanguíneo foi submetido ao teste de Imunodifusão em Gel de Ágar (IDGA) para a pesquisa de anticorpos contra o BLV, utilizando antígeno gp51 (OIE, 1991). Em cada colheita de sangue com EDTA, nos períodos pré e pós-inoculação, uma única amostra era retirada de cada um dos animais e submetida 3 vezes à contagem do número total de linfócitos. A partir dos 3 valores obtidos, foi calculada a média aritmética do número absoluto de linfócitos para cada colheita do animal. Foram efetuadas 8 colheitas antes da inoculação experimental e, a partir dos valores médios do número absoluto de linfócitos destas, calculou-se a média e desvio padrão (DP) para cada animal, valor considerado como padrão normal. Após a inoculação experimental, a média do número absoluto de linfócitos de cada colheita das búfalas e ovinos situadas 3 desvios padrão acima da média normal de cada animal, foi considerada como linfocitose, segundo critério estabelecido pelo International Committee on Bovine Leukosis (1968). Diferenciou-se a linfocitose persistente da temporária, quando a elevação no número de linfócitos manteve-se pelo menos por 3 meses seguidos, segundo FERRER et al. (1979). RESULTADOS Durante a fase pré-inoculação, as búfalas e os ovinos foram sorologicamente negativos. Na fase pós-inoculação, somente uma búfala soroconverteu, demonstrando reação fracamente positiva à IDGA na 24ª semana, que se manteve até a 52ª semana, quando foram encerradas as observações. Os dois ovinos soroconverteram na 4ª semana pós-inoculação, mantendo-se positivos durante todas as colheitas realizadas. Os valores hematológicos médios obtidos nas 8 colheitas antes da inoculação e os valores situados 3DP acima da média de cada animal são apresentados na Tabela 1. A búfala A apresentou linfocitose na 10ª, 32ª, 40ª, 44ª e 48ª semanas e a búfala B na 8ª, 10ª e 40ª semanas pósinoculação (Gráfico 1) e apenas o ovino B apresentou linfocitose na 2ª e 52ª semanas pós-inoculação experimental (Gráfico 2), porém, nenhum animal apresentou linfocitose persistente. Não foram detectadas alterações de tamanho, consistência, forma e aderência aos tecidos circundantes dos gânglios linfáticos mandibulares, parotídeos, préescapulares e pré-femurais dos animais inoculados. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES Considerando que a primeira resposta do organismo à infecção pelo BLV seja a formação de anticorpos (BIRGEL, 1982a), observou-se que a búfala B apresentou reação sorológica fracamente positiva à IDGA, detectada na 24 ª semana e se manteve durante o período de 52 semanas. O período de soroconversão observado por PERSECHINO Tabela 1 - Média do número absoluto de linfócitos x 10 3 /mm 3 das 8 colheitas realizadas antes da inoculação e valores situados 3 DP acima do considerado normal. BÚFALA A BÚFALA B OVINO A OVINO B MÉDIA ± DP 5,17 ± 0,51 5,54 ± 0,54 3,70 ± 0,58 3,41 ± 0,54 MÉDIA + 3 DP 6,70 7,16 5,44 5,03

4 36 ARS VETERINARIA, 15(1):33-38, Gráfico 1 - Variação do número absoluto de linfócitos x 10 3 / mm 3 de sangue das búfalas A e B, pós-inoculação experimental do BLV, ao longo do tempo (Semanas), em função do valor normal médio + 3 desvios padrão DP) de cada indivíduo. Número absoluto de linfócitos x 10 3 /mm Búfala A Semanas Búfala B Média + 3 DP Búfala A Média + 3 DP Búfala B Gráfico 2 - Variação do número absoluto de linfócitos x 10 3 / mm 3 de sangue dos ovinos A e B, pós-inoculação experimental do BLV, ao longo do tempo (Semanas), em função do valor normal médio + 3 desvios padrão (DP) de cada indivíduo. Número absoluto de linfócitos x 10 3 /mm Ovino A Semanas Ovino B Média + 3 DP Ovino A Média + 3 DP Ovino B et al. (1983) foi de 12 semanas e ROMERO et al. (1981) obtiveram 4 em 6 búfalos soropositivos 3 a 8 meses após a inoculação do BLV. A resposta sorológica positiva dos ovinos foi detectada através da IDGA na 4ª semana pós-inoculação e mantevese persistente até o fim do experimento, tendo sido também precocemente observada por RESSANG et al. (1976), GENTILE et al. (1977) e MAMMERICKX et al. (1980). A ampla variação natural de valores hematológicos apresentada em populações poderia trazer dificuldades na interpretação dos resultados para as búfalas e ovinos, por isso cada animal foi seu próprio controle, utilizando como valor normal a média e desvio padrão das contagens obtidas no período pré-inoculação. Segundo o critério do International Committee on Bovine Leukosis (1968), que considera como linfocitose os valores situados 3 DP acima da média normal, as duas búfalas e um ovino apresentaram linfocitose em algumas colheitas de sangue no período pós-inoculação, sendo que em nenhum animal a linfocitose foi persistente (FERRER et al., 1979). Os achados hematológicos devem ser interpretados juntamente com os sorológicos, porque enquanto a IDGA é prova específica e sensível ao BLV, a hematologia pode sofrer interferência devido à diversas causas. Dessa forma, observa-se pelo Gráfico 1 que o comportamento linfocitário das duas búfalas foi semelhante, apesar de uma estar soropositiva e outra soronegativa, enquanto que no Gráfico 2, dos 2 ovinos soropositivos, apenas um apresentou linfocitose esporádica, levando a crer que outros fatores que não a infecção pelo BLV tenham causado as variações

5 ARS VETERINARIA, 15(1):33-38, hematológicas observadas nos animais. Com relação à espécie bovina, a patogenia do BLV é conhecida. Cerca de 30% dos indivíduos infectados podem desenvolver linfocitose persistente, alterações essas que se iniciam em períodos muito variáveis pós-infecção, enquanto que o surgimento de linfossarcoma raramente excede os 5% (FERRER et al., 1979). A manifestação tumoral, quando ocorre, é tardia e atinge frequentemente indivíduos situados na faixa etária de 5 a 8 anos (BIRGEL, 1982b). Para a espécie bubalina, não existem esses parâmetros de comparação e os poucos casos de linfocitose associados à linfoadenopatias e linfossarcoma em búfalos descritos na literatura científica (GUPTA et al., 1977; SINGH et al., 1979; LÁU, 1987) não determinaram se o quadro clínico dos indivíduos examinados estaria relacionado à infecção pelo BLV, porque os animais não foram submetidos ao isolamento e identificação viral ou sorologia, ou seja, há dúvidas se estes casos descritos referiam-se à forma enzoótica ou esporádica da infecção pelo BLV. Por outro lado, estudos sobre a ocorrência de búfalos naturalmente infectados pelo BLV não abordaram aspectos patogênicos da infecção (MARÍN et al., 1978, MARÍN et al., 1982, TSOUTSOUMANSKI & GENOV, 1985). Em ovinos, o desenvolvimento de linfocitose persistente e linfossarcoma já foram comprovados por outros autores (RESSANG et al., 1976, MAMMERICKX et al., 1980). Conclui-se que em 52 semanas de observação, a infecção experimental pelo BLV causou apenas soroconversão, não ocorrendo linfocitose persistente e linfossarcoma nos búfalos e ovinos avaliados. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIRGEL, E.H. Leucose linfática enzoótica dos bovinos adultos. Aspectos clínicos e diagnósticos. In: BIRGEL, EH., BENESI, F.J. Patologia clínica veterinária. São Paulo: Sociedade Paulista de Medicina Veterinária, 1982a, p BIRGEL, E.H. Técnicas hematológicas de uso corrente em Patologia Clínica Veterinária. In: BIRGEL, E.H., BENESI, F.J. Patologia clínica veterinária. São Paulo: Sociedade Paulista de Medicina Veterinária, 1982b, p COFFIN, J.M., ESSEX, M., GALLO, R., GRAF, T.M., HINUMA, Y., HUNTER, E., JAENISCH, R., NUSSE, R., OROSZLAN, S., SVOBODA, J., TEICH, N., TOYOSHIMA, K., VARMUS, H. Family Retroviridae. Arquives of Virology, supl.10, p , FERRER, J.F., MARSHAK, R.R, ABT, D.A. Relationship between lymphosarcoma and persistent lymphocitosis in cattle: a review. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.175, n.7, p.705-8, GENTILE, G., RUTILI, D., FERRARI, G. Sulla Leucosi Bovina: Rilievi d ordine virologico in ovini inoculati con materiale leucosico bovino. In: CONVEGNO NAZIONALE, 31ª, Camerino, 1977, p.503. GUPTA, PP., SINGH, B., GILL, B.S. Some uncommon neoplasms of indian water buffaloes (Bubalus bubalis). Zentralblatt für Veterinarmedizin A, v.24, p.511-9, INTERNATIONAL COMMITTEE ON BOVINE LEUKOSIS. Criteria for the determination of the normal and leukotic state in cattle. Journal of the National Cancer Institute, v.41, n.1, p , LÁU, H.D. Leucose cutânea em búfalo: relato de um caso. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.22, n.8, p.843-5, MAMMERICKX, M., PORTETELLE, D., BURNY, A., LEUNEN, J. Detection by Immunodiffusion and Radioimmunoassay - Tests of antibodies to Bovine Leukemia Virus antigens in sera of experimentally infected sheep and cattle. Zentralblatt für Veterinarmedizin B, v.27, n.4, p , MARÍN, C., LÓPEZ, N.M., ALVAREZ,L., LOZANO, O., ESPAÑA, W., CASTAÑOS, H., LEÓN, A. Epidemiology of Bovine Leukemia in Venezuela. Annales de Recherches Vétérinaires, v.9, n.4, p.743-6, MARÍN, C., LÓPEZ, N.M., ALVAREZ,L., CASTAÑOS, H., ESPAÑA, W., LEÓN, A., BELLO, A. Humoral spontaneous response to Bovine Leukemia Virus Infection in zebu, sheep, buffalo and capybara. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON BOVINE LEUKOSIS, 4, Bologna, 1980, p OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES. Manual of recommended diagnostic techniques and requirements for biologic products. Paris: OIE, v.3, p.1/9-9/9. OLSON, C., MILLER, J. History and terminology of Enzootic Bovine Leukosis. In: BURNY, A., MAMMERICKX, M.(Ed.). Enzootic bovine Leukosis and bovine Leukemia Virus. Boston: Martinus Nijhoff, p PARODI, A.L. Pathology of enzootic bovine Leukosis. Comparison with the sporadic form. In: BURNY, A., MABMERICKX, M. (Ed.). Enzootic bovine Leukosis and Bovine Leukemia Virus. Boston, Martinus Nijhoff, p PERSECHINO, A., MONTEMAGNO, F., D AMORE, L. Sulla recettività del bufalo al virus della Leucosi Bovina Enzootica. Nota II. Prova di Infezione Sperimentale. Acta Medica Veterinaria, v.29, p , PERSECHINO, A., D AMORE, L. Sulla recettività del bufalo al virus della Leucosi Bovina Enzootica. Nota III. Trasmissione dell infezione dal bufalo agli ovini. Atti della Società Italiana di Buiatria, v.16, p , PERSECHINO, A., OLIVA, G., D AMORE, L. About buffalo

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