PREVALÊNCIA DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA NA REGIÃO NORTE FLUMINENSE ILIANI BIANCHI UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

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1 PREVALÊNCIA DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA NA REGIÃO NORTE FLUMINENSE ILIANI BIANCHI UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO CAMPOS DOS GOYTACAZES- RJ ABRIL

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3 PREVALÊNCIA DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA NA REGIÃO NORTE FLUMINENSE ILIANI BIANCHI Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal. Orientador: Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ ABRIL

4 PREVALÊNCIA DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA NA REGIÃO NORTE FLUMINENSE ILIANI BIANCHI Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal. Aprovada em de de Comissão examinadora: Prof. Cláudio de Moraes Andrade (Doutor, Microbiologia) - UFRRJ Prof. Eulógio Carlos Queiroz de Carvalho (Doutor, Anatomia Patológica) - UENF Prof a. Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira (Doutora, Microbiologia) - UENF Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos (Doutor, Microbiologia) UENF (Orientador)

5 Só existem dois dias no ano em que nada pode ser feito. Um se chama ontem e o outro se chama amanhã, portanto, hoje é o dia certo para amar, acreditar, fazer e, principalmente, viver. Dalai Lama ii

6 Dedico esta tese a vocês duas, que são tudo na minha vida: Carmorina, que é a melhor mãe do mundo, e Ivânea, que é mais que uma irmã. iii

7 AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar a você, meu Deus, que sempre esteve junto de mim para me defender, dentro de mim para me conservar, à minha frente para me guiar, ao meu lado para me defender, atrás de mim para me guardar e acima de mim para me abençoar. Muito obrigada! Ao Professor Carlos, pela verdadeira orientação, dedicação, paciência e grande amizade. Você é mais que um orientador, é um irmão. À Professora Sílvia, pelos momentos de alegria e pela coorientação. Ao Professor Cláudio de Moraes Andrade, pela grande ajuda com seu livro de técnicas de laboratório e pela sua presença na banca de defesa. Aos Professores Friederike Luise Mayen, Eulógio Carlos Queiróz de Carvalho (que me orientou desde a graduação e por quem tenho grande admiração), Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira e aos demais Professores do Laboratório de Sanidade Animal. Ao grande Professor Pedro Paulo Abílio Diniz, que sempre foi um modelo a ser seguido. Um agradecimento especial à FUNDENOR (Eduardo e Ângela) e à COOPERLEITE (Ramiro) pelo envio de materiais. Ao amigo Lério, pela grande e importantíssima colaboração, agradeço do fundo do coração. À equipe de Virologia: André, Dirlei, Raquel, Cleuber e Luiz Fernando. ii

8 Ao Marcelo Sales, que me ajudou e me aturou durante este trabalho de pesquisa. Obrigada pela ajuda nas saídas a campo. À mamãe, que, sempre, mesmo de longe, sentia tudo o que eu estava sentindo, nas horas tristes e alegres. Obrigada pelas milhares de orações que sempre fez para mim quando lhe pedia. À minha irmã, pelo carinho e preocupação que sempre teve comigo. Tenho muito orgulho de ter uma irmã assim como você, com tanta disposição e garra para trabalhar e ajudar a nossa família. Aos meus irmãos: Inácio, Ildeberto e Ildefonso, por acreditarem, confiarem em mim e, principalmente, pelos irmãotrocínios. Amo vocês! À Clarice, por cuidar do meu irmão Ildeberto, e por me dar um sobrinho (Alexandre), que, mesmo nos poucos encontros, me oferece muitos sorrisos. Ao meu pai, que, mesmo distante, sei que torce por mim. À Giselda, minha irmã preta, pelos choros que se transformaram em gargalhadas e vice-versa nesses dois anos. A sua amizade me fazia continuar. Às duas melhores amigas que alguém já pôde ter: Viviane e Gigi, gosto muito de vocês. Aos amigos(as) Lígia, Francimar, Isabel, Lara, Karime, Verônica, Claudia e Euler, pelo companheirismo nas festas, encontros para lanchar ou apenas trocar informações importantíssimas e urgentes. Ao grande amigo Dudu (Eduardo), que sempre foi meu apoio, principalmente nas horas difíceis. Ao Léo (Leonardo), Gina e Luciana que sempre estiveram dispostos a me ajudar. Vocês sempre estavam (e estão) me dando aquela força. Aos Pós-Graduandos do Sanidade Animal: Adriana, Alessa, Ana Bárbara, Ana Paula, Bianca, Cristiane, Flávia, Francimara, Guilherme, Jorgeamado, Ricardo (Jagatá), Ricardo e Príscila. Aos funcionários da Biblioteca, Coordenação Acadêmica e Coordenação da Pós-Graduação. E àqueles que me ajudaram direta e/ou indiretamente e não foram citados, minhas desculpas. Ao apoio financeiro da FENORTE/UENF. iii

9 BIOGRAFIA ILIANI BIANCHI, filha de David Bianchi e Carmorina Bonfá, nasceu em 27 de maio de 1976, na cidade de Linhares Espírito Santo. Em março de 1995, entrou para a Graduação em Medicina Veterinária na Universidade Estadual do Norte Fluminense, onde colou grau em janeiro de Foi adimitida em março de 2001 no Curso de Pós-Graduação em Produção Animal, Mestrado, Sanidade Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes RJ, submetendo-se à defesa de tese para conclusão do curso em abril de iv

10 CONTEÚDO RESUMO...xi ABSTRACT...xiii 1. INTRODUÇÃO OBJETIVOS REVISÃO DE LITERATURA Histórico Etiologia e propriedades gerais do vírus Epizootiologia Patogenia Manifestações clínicas Diagnóstico Prevenção e controle Importância econômica e sanitária MATERIAL E MÉTODOS Animais Detecção de anticorpos anti-vírus da leucose bovina Análise estatística RESULTADOS DISCUSSÃO...18 v

11 7. CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICES Apêndice A Ficha da propriedade Apêndice B Ficha dos animais Apêndice C Tampão de borato...31 vi

12 LISTA DE TABELAS Quadro 1. Prevalência do vírus da leucose bovina em diferentes Estados do Brasil...5 Tabela 1. Prevalência da infecção pelo vírus da leucose bovina determinada pelo teste de imunodifusão em gel de ágar, por idade dos animais na Região Norte Fluminense...15 Tabela 2. Prevalência dos animais infectados com o vírus da leucose bovina de acordo com a faixa etária...16 Tabela 3. Prevalência da leucose enzoótica bovina de acordo com o tipo de exploração do rebanho, nas 18 propriedades analisadas na Região Norte Fluminense...17 vii

13 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Teste de imunodifusão em gel de ágar com indicação das amostras positivas (em verde)...13 Gráfico 1. Número de animais soropositivos e soronegativos para o vírus da leucose enzoótica bovina na Região Norte Fluminense, de um total de 734 animais analisados...14 Gráfico 2. Prevalência do vírus da leucose enzoótica bovina por idade na Região Norte Fluminense...15 Gráfico 3. Prevalência da leucose enzoótica bovina por faixa etária na Região Norte Fluminense...16 Gráfico 4. Percentual de propriedades positivas e negativas frente ao vírus da leucose bovina, em um total de 18 propriedades analisadas na Região Norte Fluminense...17 Gráfico 5. Prevalência da leucose enzoótica bovina em diferentes Regiões do Brasil...19 viii

14 RESUMO BIANCHI, I., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; abril de 2003; Prevalência da Leucose Enzoótica Bovina na Região Norte Fluminense; Professor Orientador: Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos. De distribuição mundial, a Leucose Enzoótica Bovina (LEB) é uma doença causada por um retrovírus, subfamília Orthoretrovirinae e gênero Deltaretrovírus, que causa grandes perdas econômicas na pecuária bovina. Entretanto, na Região Norte Fluminense, a verdadeira situação do rebanho frente ao vírus da leucose bovina (VLB) é desconhecida. Para determinar a prevalência do VLB na região, foram testadas 734 amostras de soro sanguíneo bovino, utilizando-se o teste de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) utilizando com animais variando de 1 a 15 anos de idade. Das 734 amostras analisadas, 127 (17,30%) foram positivas ao vírus da leucose enzoótica bovina. A estratificação dos animais estudados em três faixas etárias demonstrou uma maior prevalência entre os de 11 a 15 anos (27,78%) seguidos pelos de 6 a 10 anos (19,68%) e pelos de 1 a 5 anos (11,01%). Esses resultados demonstram que a prevalência tende a aumentar proporcionalmente com a idade. Dos 18 rebanhos examinados, 14 foram positivos e apenas 4 foram negativos. Com os valores encontrados, podemos observar que o VLB está presente e disseminado na região Norte Fluminense. Dessa forma, é ix

15 extremamente necessária a implantação de medidas profiláticas visando ao controle e/ou eliminação da doença na região, minimizando, assim, as perdas econômicas associadas. Palavras-chave: Leucose Enzoótica Bovina, Prevalência e Retrovírus. x

16 ABSTRACT BIANCHI, I., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; march of 2003; Prevalence of Bovine Enzootic Leukosis in the Fluminense North Region; Guiding: Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos. Worldwide in distribution, Enzootic Bovine Leukosis (EBL) is one disease caused by a retrovirus of the Orthoretrovirinae subfamilie and Deltaretrovirus genus when caused economic losses to the livestock industry. However in the North Fluminense Region the true situation of the herd front bovine leukosis virus (BLV) is unknown. For determining the prevalence of BLV in region 734 bovine blood samples were tested, bovine of one to fifteen-year-olds, through the agar-gel immunodiffusion test (AGID). Out of the 734 sample analyzed 127/734 (17,30%) were positive the BVL. The animals were stratified into three different age groups, showed a prevalence of the 27,78% between from 11 to 15-year-olds, 19,68% between from 6 to 10-year-olds and 11,01% between from 1 to 5-year-olds. These results showed that the prevalence tends to increase proportionally as the years go by. Out of the 18 herds examined 14 (77,78%) were positive and only 4 were negative. These results showed that the BVL is widely spread within the North Fluminense Region and implanting control measures is extremely necessary. Key words: Bovine Enzootic Leukosis, Prevalence and Retrovirus. xi

17 12 1. INTRODUCÃO A Leucose Enzoótica Bovina (LEB) é uma enfermidade infecto-contagiosa causada por um vírus da família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae, gênero Deltaretrovirus. Um vírus RNA, envelopado, que mede de 80 a 120nm de diâmetro e que infecta preferencialmente os linfócitos B. A doença se manifesta de duas formas: linfocitose persistente e/ou linfossarcoma em bovinos adultos. Na linfocitose, o animal tem um aumento do número absoluto de linfócitos e essa leucocitose ocorre em 29% dos animais infectados com o Vírus da Leucose Bovina (VLB). O linfossarcoma ocorre em apenas 5% dos animais infectados com o VLB e seus sinais clínicos são variáveis, dependendo da localização dos tumores no organismo dos animais. Os linfonodos superficiais, em geral, apresentam-se aumentados de tamanho. O VLB acomete, naturalmente, bovinos, bubalinos, ovinos e capivaras, e, experimentalmente, caprinos, coelhos, chipanzés, cervídeos, gatos e suínos. A LEB ocorre, principalmente, em rebanho leiteiro com mais de quatro anos de idade. Essa observação pode estar relacionada a uma demorada soroconversão em alguns animais e também ao manejo nesse tipo de exploração. A infecção pelo VLB está distribuída mundialmente. No Brasil, a leucose já foi relatada em várias regiões e sua prevalência varia de região para região. A principal via de transmissão é a horizontal, através de agulhas e instrumentos cirúrgicos contaminados com sangue. A vertical ou transplacentária ocorre em menores proporções. 12

18 13 Uma vez infectados, os bovinos se tornam fonte de disseminação do VLB por toda sua vida. A LEB é responsável por importantes perdas econômicas como: queda na produção leiteira, aumento do intervalo entre partos e ainda restrições quanto às exportações e importações de bovinos afetados. O diagnóstico da LEB é feito por imunodifusão em gel de ágar (IDGA) e enzime-linked immunosorbent assay (ELISA). O teste diagnóstico oficial recomendado pela OIE ( Office International des Epizooties ) é o IDGA. Não existe tratamento para a LEB, porém medidas de profilaxia sanitária podem ser aplicadas, visando ao controle do VLB em plantéis afetados. Entretanto, para que medidas preventivas sejam introduzidas, é necessário saber a condição sorológica do rebanho frente à leucose enzoótica bovina. 13

19 14 2. OBJETIVOS Este projeto de pesquisa tem como objetivos determinar a prevalência da LEB na região Norte Fluminense, utilizando o teste de IDGA. Contribuir para a pecuária bovina da Região Norte Fluminense, realizando trabalho de extensão, orientando os produtores sobre como realizar um bom manejo dos seus animais para controlar a LEB, minimizando, assim, as perdas econômicas associadas. 14

20 15 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1. Histórico O primeiro relato publicado da LEB foi feito na Alemanha por LEISEREING (1871) apud OLSON e MILLER, O agente só foi descoberto por MILLER et al., 1969, através do isolamento e identificação por microscopia eletrônica. No Brasil, a doença foi citada, pela primeira vez, em 1943 por RANGEL e MACHADO apud BIRGEL JUNIOR et al., 1995, e LEITE et al., Mas o primeiro diagnóstico clínico da doença foi publicado por MERKT et al., 1959, apud LEITE et al., ALENCAR FILHO et al., 1982, apud BIRGEL JUNIOR et al., 1995, demonstraram a presença do vírus nas células linfocitárias, através da microscopia eletrônica, porém, o isolamento do vírus foi descrito, pela primeira vez no Brasil, por ANGELO et al. (1985). O VLB está distribuído mundialmente (ONUMA et al., 1989; JONHSON e KANEEN, 1991) e a sua introdução na América do Sul, provavelmente, se deu através da importação de bovinos contaminados vindos da Europa e dos EUA (BRAGA et al., 1998b). A prevalência do VLB varia de um país para outro e até mesmo entre as regiões e/ou estados de um mesmo país, como acontece no Brasil (BRAGA et al., 1998b, MODENA et al., 1984; ABREU et al., 1990; BIRGEL JÚNIOR et al., 1995 e MORAES et al., 1996), como demonstrado no quadro 1. 15

21 16 Local Prevalência Autor Acre 9,72% ABREU et al., 1990 Bahia 16,1% TÁVORA et al., 1990 Ceará 9,15% ABREU, 1993 Goiás 35,67% ANDRADE e ALMEIDA, 1991 Minas Gerais 70,87% LEITE et al., 1984 Pará 49,8% MOLNÁR et al., 1999 Paraná 18,33 KANTEK et al., 1982 Pernambuco 13,85% MELO, 1991 Rio de Janeiro Rio de Janeiro 53,25% 26,94% ROMERO e ROWE, 1981 CUNHA et al., 1982 Rio Grande do Sul 12,0% MORAES et al., 1996 Rondônia 23,02% ABREU et al., 1990 São Paulo 16,23% ARITA et al., 1992 Quadro 1. Prevalência do vírus da leucose bovina em diferentes Estados do Brasil Etiologia e propriedades gerais A LEB é causada por um vírus que, segundo o International Commitee on Taxonomy of Viruses (ICTV), está classificado na família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae, gênero Deltaretrovirus. O termo retro vem de reverso e é derivado da enzima transcriptase reversa encontrada no virion de todos os membros da família Retroviridae (BRAGA et al., 1998a e MURPHY et al., 1999). Esta enzima é responsável pela retrotranscrição de DNA de fita dupla a partir de RNA do vírus. O provírus DNA se integra pela ação da enzima integrase ao DNA cromossômico dos linfócitos B, causando a infecção (OLIVEIRA, 2000). O retrovírus é um vírus envelopado, a partícula viral completa mede de 80 a 120 nm, possui genoma diplóide formado por duas fitas idênticas de RNA simples, de polaridade positiva, inseridas num capsídeo de simetria icosaédrica (MURPHY et al., 1999). 16

22 17 O envelope viral possui projeções que são glicoproteínas de superfície responsáveis pela interação do vírus com a superfície dos linfócitos (FAVA, 1995 e BRAGA et al., 1998a). Dentre as principais proteínas virais, se destacam as gp51 e p24 (FAVA, 1995; BRAGA et al., 1998a e OLIVEIRA, 2000). Os retrovírus são inativados por solventes e detergentes lipídicos, como álcool, clorofórmio e éter. São também inativados a 56º C por 30 minutos e não resistem a ciclos repetidos de congelamento e descongelamentos (FENNER et al., 1993). Os retrovírus tendem a ser mais resistentes a raios ultravioletas e radiações X do que os outros vírus, provavelmente devido ao seu genoma diplóide (FENNER et al., 1993) Epizootiologia No Brasil, a LEB já foi demonstrada em vários Estados, entre eles: Acre, Bahia, Ceará, Goiás, Pará, Paraná, Pernambuco, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, Roraima e São Paulo (GARCIA LIMA, 1980; KANTEK et al., 1982; MODENA et al., 1983, LEITE et al., 1984 e BIRGEL JUNIOR et al., 1995). Acredita-se que a entrada do vírus da leucose bovina no Brasil se deu através de animais importados, o que continua acontecendo até hoje, como demonstraram BRAGA et al., O percentual de animais reagentes tende a aumentar proporcionalmente com a idade, como demonstraram BIRGEL JUNIOR et al., 1995, variando de 24,6% em animais de um a dois anos para 86,2% em animais com mais de seis anos de idade. Uma maior prevalência da LEB tem sido observada em rebanho leiteiro, principalmente nos altamente tecnificados com regime de criação intensiva. Isso se deve ao maior contato entre os animais e à grande utilização de aparelhos e equipamentos, que podem estar contaminados com sangue (principal fonte de infecção), facilitando a disseminação da doença (LORENTZ e STRAUB, 1987 apud FAVA, 1995 e VAN DER LAAN et al., 1999). Qualquer espécime biológico que contenha linfócitos infectados pode contaminar o animal. O sangue é a via mais comum de infecção, seguida pelo colostro e pelo leite (OLIVEIRA et al., 1999). 17

23 18 A idade média dos animais que desenvolvem o linfossarcoma é de cinco anos e acomete mais o gado leiteiro devido ao tipo de manejo (OLIVEIRA et al., 1999). Não há relatos na literatura que correlacionam a LEB a variáveis como idade, sexo e raça Patogenia Existem duas formas de transmissão do vírus da leucose bovina, a horizontal e a vertical (BRAGA et al., 1998a). A transmissão vertical pode ocorrer em vacas prenhes com o feto ainda no útero ou no canal do parto (MOULTON, 1990 e JAIN, 1993). O colostro e o leite também são vias de transmissão vertical (STRAUB et al., 1987 apud FAVA, 1995 e BIRGEL et al., 1982) A transmissão horizontal é mais freqüente (OLIVEIRA et al., 1994, BRAGA et al., 1998a) e ocorre principalmente por fômites contaminados com sangue, como: agulhas, seringas, luvas, instrumentos cirúrgicos, tatuadores e material utilizado para descorna (FAVA, 1995). Alguns autores aceitam a hipótese da contaminação pelo sêmen (LUCAS et al., 1980). Provavelmente, essa contaminação ocorre devido à presença de linfócitos infectados no fluido seminal, fato que ocorre muito nas doenças do trato genital (THURMOND e BURRIDGE, 1982 apud BRAGA et al., 1998a). A LEB também pode ser transmitida via inseto hematófago (BIRGEL JUNIOR et al., 1995; BRAGA et al., 1998b e VAN DER LANN et al., 1999). A premunição contra anaplasma e babesia também é uma via de disseminação do vírus quando os animais doadores estão infectados (FLORES et al., 1992, VAN DER LANN et al., 1999). A LEB é uma doença infecciosa de caráter crônico. Após a infecção pela LEB, os animais podem levar de três a vinte e quatro meses para que ocorra soroconversão (BIRGEL, 1982). Uma vez infectado, o animal torna-se fonte de infecção por toda sua vida. O vírus da LEB tem afinidade por linfócitos B. Uma vez infectados, esses linfócitos se infiltram nos tecidos linfóides do organismo do animal, produzindo, assim, o linfossarcoma (BRAGA et al., 1998a). Segundo SCHWARTZ et al. (1994), o 18

24 19 vírus da leucose enzoótica bovina também é capaz de infectar, em menores proporções, linfócitos T, monócitos e granulócitos Manifestações clínicas A maioria dos animais infectados não apresenta sinais clínicos característicos (VAN DER LAAN et al., 1999), entretanto, alguns animais podem desenvolver uma linfocitose persistente. As manifestações clínicas, decorrentes do linfossarcoma, vão depender da sua localização e a metástase pode comprometer vários órgãos (OLIVEIRA et al., 1999). Entre os animais clinicamente afetados, o principal sinal clínico observado é o aumento no tamanho dos linfonodos periféricos. Outras observações que têm sido relacionadas com a LEB em plantéis afetados são: perda de peso,diminuição na produção de leite, exoftalmia e anorexia (COELHO et al., 1998). Em alguns casos, pode ocorrer pico febril. O animal tem aumento dos linfonodos com comprometimento do coração, abomaso e intestino (OLIVEIRA et al., 1999). O curso da doença pode levar de algumas semanas a vários meses (OLIVEIRA et al., 1999) e a principal causa das mortes é a insuficiência cardíaca (JAIN, 1993). Uma vez contaminados, os animais tornam-se fonte de infecção permanente (VAN DER LAAN et al., 1999) Diagnóstico Até recentemente, o diagnóstico da LEB era feito através das manifestações clínicas baseando-se na presença do linfossarcoma e no aumento dos linfonodos. Posteriormente, com a observação das alterações hematológicas caracterizadas pela linfocitose, que ocorria na linfocitose persistente e no linfossarcoma, GÖTZE et al., 1954 apud FAVA, 1995, elaboraram uma chave leucométrica visando ao diagnóstico precoce da LEB, para, com isso, combatê-la sistemicamente. Depois do isolamento do vírus por MILLER et al., 1969, começaram as buscas por métodos diagnósticos mais eficazes para a LEB. 19

25 20 Hoje, existem vários métodos diagnósticos: leucograma (GARCIA et al., 1991), citologia (OLIVEIRA et al., 1999), histopatologia (COELHO et al., 1998), radioimunoensaio (RIE), fixação de complemento (FC) (MILLER E VAN DER MAATEN, 1974 apud FAVA, 1995), imunofluorescência (IF) (GARCIA LIMA, 1980), ELISA (SIMARD et al., 2000a) e IDGA (SIMARD et al., 2000b). A avaliação do leucograma não é muito utilizada. Apesar dessa técnica ser capaz de identificar uma linfocitose persistente, é preciso diferenciá-la de duas outras linfocitoses: aquela decorrente da passagem de linfócitos neoplásicos atípicos para o sangue, processo que acorre num linfossarcoma, e das linfocitoses transitórias não relacionadas ao vírus da leucose bovina. Para o diagnóstico da linfocitose persistente, temos que ter contagem de linfócitos em pelo menos duas amostras com intervalo mínimo de três meses entre elas (OLIVEIRA et al., 1999). O exame citológico é um método auxiliar para o diagnóstico da LEB. Ele é capaz de diferenciar um processo inflamatório de um processo neoplásico. Entretanto, é necessário que a massa neoplásica esteja instalada ou que os linfonodos estejam aumentados. Estes são os locais onde serão colhidos os materiais para a realização do exame (OLIVEIRA et al., 1999). O diagnóstico também pode ser feito por histopatologia. Em Uberlândia-MG, foi encontrada uma prevalência de 5,22% em animais abatidos com aumento dos linfonodos (COELHO et al., 1998). O RIE, que tem como fundamento a detecção de anticorpos, é um teste mais sensível, mas utiliza equipamentos altamente especializados, o que o torna dispendioso (MILLER E VAN DER MAATEN, 1974 apud FAVA, 1995). Dentre as técnicas disponíveis, a OIE recomenda o IDGA e o ELISA para o diagnóstico da LEB. O teste de IDGA tem uma sensibilidade menor que o ELISA, mas é o teste padrão adotado pela OIE, devido a sua simplicidade, praticidade e por suas vantagens econômicas. Este teste já foi utilizado com sucesso em programas de eliminação da doença em alguns países (OLIVEIRA et al., 1999). O IDGA detecta a presença de anticorpos, para as principais glicoproteínas do envelope viral, que é indicativo de infecção. O teste de imunodifusão foi desenvolvido por MILLER e OLSON (1972) apud FAVA, Eles utilizaram como antígeno o polipeptídeo p24, que depois foi substituído pela glicoproteína gp51 20

26 21 porque foi demonstrado que os animais infectados pelo VLB desenvolvem títulos de anticorpos mais elevados contra a gp51 (FAVA, 1995) Prevenção e controle Mundialmente, as medidas de controle da LEB estão baseadas na identificação e eliminação de animais soropositivos. Entretanto, a atitude a ser tomada num programa de controle depende da prevalência encontrada. A eliminação dos animais é viável quando a prevalência de soropositivos encontrada for baixa. Quando a prevalência for alta, deve-se separar os animais soropositivos dos animais soronegativos e mantê-los distantes o suficiente para evitar a possibilidade de transmissão do vírus via insetos hematófagos. É extremamente necessário ter cuidado nas práticas de manejo da fazenda, manipulando-se primeiro os animais soronegativos e depois os soropositivos, podendo, assim, controlar e/ou eliminar o VLB no rebanho (BRAGA et al., 1998a) Importância econômica e sanitária Nos últimos anos, a importância econômica da leucose vem aumentando (VAN DER LAAN et al., 1999). Apesar da LEB, na maioria das vezes, afetar os animais de uma maneira subclínica, as perdas econômicas relacionadas à leucose num plantel afetado são elevadas. Tem sido demonstrada uma queda significativa na produção de leite (BRENNER et al., 1989), restrições de comercialização no mercado internacional (JOHNSON e KANEENE, 1991 e BRAGA et al., 1997), aumento do intervalo entre os partos (BRENNER et al., 1989 e HEALD et al., 1992) e mortalidade dos animais (BRAGA et al., 1997). Muitos países exigem o teste sorológico negativo para a importação dos animais, inclusive o Brasil, mas não temos um programa oficial de controle da doença (BRAGA et al., 1997). 21

27 22 No Brasil, observou-se uma diminuição da produção leiteira em 11% (D ANGELINO et al., 1998) nos animais soropositivos para o VLB. Nos EUA, DA et al. (1993) estimaram uma perda econômica financeira de 86 milhões de dólares por ano, levando em conta fatores como diminuição da produção de leite e de gordura do leite em animais soropositivos por três anos consecutivos e que apresentavam linfocitose persistente. Além das perdas econômicas, uma outra questão que vem sendo objeto de estudos na virologia atual é o risco em potencial de transmissão do vírus a humanos e outros animais, nos quais a doença não ocorre naturalmente, já que as partículas virais têm sido encontradas no leite (OLIVEIRA, 2000), alimento básico na dieta de humanos e animais. 22

28 23 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Animais Foram colhidas 734 amostras de sangue bovino, provenientes de 18 propriedades localizadas na Região Norte Fluminense. O sangue foi colhido por punção da veia jugular ou da veia intramamária em tubos vacutiner de 10mL. No Laboratório de Sanidade Animal (LSA-CCTA/UENF), as amostras de sangue foram mantidas à temperatura ambiente até a dessoragem completa, em seguida centrifugadas a 600 x g por 5 minutos e os soros obtidos foram armazenados em eppendorf e congelados a 20º C até a realização do teste sorológico. Todos os animais foram protocolados em fichas individuais com informações sobre: idade, sexo, raça e manejo realizado na propriedade (Apêndices A e B) Detecção de anticorpos anti-vírus da leucose bovina O teste sorológico utilizado foi o imunodifusão em gel de ágar (IDGA), que consiste na verificação de anticorpos no soro. Foi utilizado um Kit comercial proveniente da Sanofi/França, que consta de soro controle positivo e antígeno gp51. Usamos gel de ágar noble a 1,2% com tampão borato ph 8,6 (Apêndice C), que foi distribuído em placas de Petri de 90mm de diâmetro. Em cada placa foram 23

29 24 cortados quatro rosetas, com um cortador próprio. Essas rosetas têm um poço central e seis poços laterais. No poço central, foram depositados 32µL do antígeno, nos dois poços da extremidade superior e inferior foram depositados 73µL do soro controle positivo, nos outros quatro poços foram depositados 73µL dos soros a serem testados e cada poço correspondendo a um animal (Figura 1). Após esse procedimento, as placas foram mantidas em temperatura ambiente a ± 25º C e, em seguida, feitas leituras com 24, 48 e 72 horas pós inoculação. Foram consideradas positivas as amostras que formaram uma linha de precipitação entre o antígeno e o soro testado (Figura 1) e negativa as amostras que não formaram a linha de precipitação. - antígeno - soro amostra - soro controle Figura 1: Teste de imunodifusão em gel de ágar com indicação das amostras positivas (em verde) Análise estatística A prevalência foi calculada através de uma binominal com intervalo de confiança de 95%. 24

30 25 5. RESULTADOS Das 734 amostras analisadas pelo teste de IDGA, 127 foram soropositivas ao VLB, demonstrando uma prevalência de 17,30% ± 1,4 no rebanho leiteiro da região (Gráfico1). 127 Número de animais soropositivos 607 Número de animais soronegativos Gráfico 1: Número de animais soropositivos e soronegativos para o vírus da leucose bovina na Região Norte Fluminense, de 734 animais analisados. A idade dos animais analisados variou de 1 a 15 anos, a maior prevalência encontrada foi entre o grupo de animais com 13 anos. Os valores encontrados em todas as idades estão demonstrados na tabela 1 e no gráfico 2. 25

31 26 Tabela 1: Prevalência da infecção pelo vírus da leucose bovina determinada pelo imunodifusão em gel de ágar, por idade dos animais na Região Norte Fluminense. Idade (anos) Total de animais analisados Nº animais positivos Prevalência % , , , , , , , , , , , , , , ,00 Total ,30 Prevalência (%) Idade (anos) 1 ano 2 anos 3 anos 4 anos 5 anos 6 anos 7 anos 8 anos 9 anos 10 anos 11 anos 12 anos 13 anos 14 anos 15 anos Gráfico 2: Prevalência do vírus da leucose bovina por idade na Região Norte Fluminense. De acordo com a faixa etária, encontramos uma maior prevalência nos animais de anos (27,78%), seguida pelos 26

32 27 animais de anos (19,68%) e pelos de 1-05 anos (11,01%) (Tabela 2 e Gráfico 3). Tabela 2: Prevalência dos animais de acordo com a faixa etária. Faixa Etária Total de animais Total de animais positivos Prevalência (%) 1-5 anos , anos , anos ,78 27,78% 11,01% 19,68% 1-5 anos 6-10 anos anos Gráfico 3: Prevalência da leucose enzoótica bovina por faixa etária na Região Norte Fluminense. Para determinar o status das propriedades analisadas, foi considerada positiva aquelas que apresentaram ao menos um animal soropositivo. Das dezoito propriedades analisadas, quatorze foram consideradas positivas e apenas quatro foram negativas (Gráfico 4). 27

33 28 22,22% Propriedades positivas Propriedades negativas 77,78% Gráfico 4: Percentual de propriedades positivas e negativas frente ao vírus da leucose bovina, em um total de 18 propriedades analisadas na Região Norte Fluminense. Dentre essas dezoito propriedades, 5 são de exploração exclusivamente de corte, 10 são de exploração exclusivamente leiteira e 3 são de exploração mista. Encontramos uma prevalência de 40%, 90% e 100%, respectivamente (Tabela 3). Tabela 3: Prevalência da leucose enzoótica bovina de acordo com o tipo de exploração do rebanho nas 18 propriedades analisadas na região Norte Fluminense. N de N de N de Prevalência Propriedades Propriedades Propriedades (%) Positivas Negativas CORTE LEITE MISTA

34 29 6. DISCUSSÃO Alguns pontos devem ser destacados e discutidos quando se fala de LEB, como: a variação da prevalência de acordo com as regiões, com a idade do animal, com o tipo de manejo e de exploração da propriedade. Comparando a prevalência encontrada em nosso trabalho de pesquisa (Gráfico 1), que foi de 17,30%, com os valores encontrados por outros autores em diferentes Regiões do Brasil, podemos observar como a prevalência varia de um Estado para outro. O valor encontrado (17,30%) foi maior que aqueles descritos por ABREU, 1990 no Acre (9,72%); por TÁVORA et al., 1990 na Bahia (16,1%); por ABREU et al., 1993 no Ceará (9,15%); por MELO, 1991 em Pernambuco (13,85%) e por MORAES et al., 1996 no Rio Grande do Sul (12,00%). Em contrapartida, foi menor que aqueles encontrados por ANDRADE E ALMEIDA, 1991 em Goiás (35,67%); por LEITE et al., 1984 em Minas Gerais (70,87%); por MOLNÁR et al., 1999 no Pará (49,8%); por ABREU et al., 1990 em Rondônia (23,02%); por BIRGEL JUNIOR et al., 1995 em São Paulo (49,2%) e por ROMERO e ROWE, 1981 e CUNHA et al., 1982 no Estado do Rio de Janeiro (53,25% e 26,94% respectivamente) (Gráfico 3). Essa variação da prevalência nos diferentes Estados provavelmente se dá devido à grande diversificação no tipo de manejo e exploração adotado pelas propriedades. 29

35 AC Acre Prevalência (%) CE AC RG PE BA NF RO RJ RJ GO SP PA MG RG Rio Grande do Sul PE Pernambuco BA Bahia NF Norte Fluminense RO Rondônia RJ Rio de Janeiro GO Goiás SP São Paulo PA Pará MG Minas Gerais Gráfico 5: Prevalência da leucose enzoótica bovina em diferentes Estados do Brasil e na Região Norte Fluminense. Observamos que a soropositividade para o VLB tende a aumentar conforme aumenta a idade dos animais (Gráfico 2). Os valores encontrados neste trabalho estão de acordo com os de ROMERO e ROWE, 1981, KANTEK et al., 1982, BIRGEL et al., 1983, TÁVORA, 1990, ANDRADE E ALMEIDA, 1991, MELO, 1991, FLORES et al., 1992, ABREU, 1993, BIRGEL JUNIOR, 1995, OLIVEIRA et al., Para uma melhor visualização desses resultados, dividimos os animais em 3 classes de faixas etárias (Tabela 2). A primeira com animais de 1-5 anos de idade, a segunda com animais de 6-10 anos de idade e a terceira com animais de anos de idade. Encontramos uma prevalência de 11,00%, 19,68% e 27,77%, respectivamente (Gráfico 3). Esse aumento da prevalência não está relacionado a uma maior susceptibilidade dos animais adultos ao VLB, mas provavelmente, a um maior número de exposição sofrida pelos animais, principalmente às formas de transmissão horizontal do vírus, tais como: vacinações, procedimento cirúrgicos, contato entre os animais. Além disso, outra possibilidade que deve ser considerada, em alguns casos, é uma demorada soroconversão de alguns animais. Ao analisarmos a situação de cada propriedade frente ao VLB, separadamente, observamos a situação preocupante da doença na região. Das 18 propriedades analisadas, 14 (77,78%) apresentavam ao menos um animal soropositivo (Gráfico 4). 30

36 31 Considerando o tipo de exploração das propriedades rurais, observamos uma prevalência de 40% naquelas com exploração exclusiva de corte, 90% nas de exploração exclusiva leiteira e 100% nas propriedades com exploração mista (Tabela 3). Esses resultados revelaram um fato curioso, já que a maior prevalência encontrada foi nas propriedades de exploração mista e não, como esperado, naquelas exclusivamente leiteiras. Esse fato pode ser explicado pelo fato de que, nessas propriedades, o manejo utilizado é o mesmo dos animais de exploração leiteira, os animais para corte e para leite são vacinados e manejados todos juntos, favorecendo, assim, a disseminação do VLB entre os animais. A prevalência encontrada nos animais de exploração leiteira pode estar relacionada ao manejo realizado nesse tipo de exploração, onde há um maior risco de transmissão do VLB via colostro, vacinações, drogas injetáveis e maior contato entre os animais. Nossos resultados estão de acordo com os resultados encontrados na literatura, observando-se uma maior prevalência da LEB, no Brasil, em Minas Gerais, onde a pecuária leiteira é predominante. LEITE et al., 1984, encontrou uma prevalência de 70,87%. 31

37 32 7. CONCLUSÕES A leucose enzoótica bovina está presente no rebanho bovino da região Norte Fluminense RJ; O vírus da leucose bovina está presente na maioria das propriedades na Região Norte Fluminense; A leucose enzoótica bovina tem uma maior prevalência nos rebanhos de exploração leiteira que nos de corte; Com a prevalência encontrada de 17,30%, é viável a implantação de medidas profiláticas, no intuito de controlar e/ou eliminar a leucose enzoótica bovina na Região; Para adotarmos medidas profiláticas para a leucose enzoótica bovina, é necessário um trabalho de extensão, conscientizando-se os produtores que, apesar da leucose enzoótica bovina ser uma doença predominantemente subclínica, causa grandes perdas econômicas; A identificação de animais soropositivos é o primeiro passo para a introdução de medidas de controle da leucose enzoótica bovina. Entretanto, não existe disponibilidade de kits de diagnóstico sorológico no Brasil, o que dificulta muito a introdução de medidas profiláticas. Dessa forma, fica clara a necessidade da produção de kits nacionais ou da liberação da importação de kits comerciais já existentes; É extremamente importante um levantamento geral no Estado do Rio de Janeiro, já que os resultados conhecidos são parciais e estão defasados 32

38 33 (1981 e 1982). Avaliando-se, assim, a situação da doença no Estado, tornar-se-ia possível a adoção de medidas profiláticas mais adequadas, visando ao controle e à eliminação da leucose enzoótica bovina. 33

39 34 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABREU, J.M.G. (1993) Leucose enzoótica dos bovinos. Prevalência de anticorpos séricos anti-vírus da leucose bovina em animais criados na bacia leiteira de Fortaleza, Estado do Ceará. Tese (Mestrado em Clínica Veterinária) - São Paulo- SP, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia USP, 75p. ABREU, V.L.V., SILVA, J.A, MODENA, C.M., MOREIRA, E.C. (1990) Prevalência da Leucose Enzoótica Bovina nos Estados de Rondônia e Acre. Arquivo Brasileiro Medicina Veterinária. 42: ANDRADE, J.R.A., ALMEIDA, M.M.R. (1991) Prevalência da leucose enzoótica bovina na bacia leiteira de Goiânia, Goiás. Hora Veterinária, Porto Alegre, 10(60): ANGELO, N,J.O., BIRGEL, E.H., HAGIWARA, M.K., BENESI, F.J., D ANGELINO, J.L., DAHME, H.W.P.F., CARVALHO, R.P.S. (1985) Isolamento do vírus da leucose bovina de animais com leucocitose persistente. In: 13º Congresso Brasileiro de Microbiologia, Anais...São Paulo, p.284. ARITA, G.M.M., GONÇALVES,C.D., SABER, A.F., GERMANO, P.M.L., DEAK, J.G., KOTAIT, I. (1992) Estudo Epidemiológico da Leucose Enzoótica dos Bovinos no Vale do Paraíba, São Paulo, Brasil. In: Reunião Anual do Instituto Biológico de 34

40 35 São Paulo, 5, Anais..., São Paulo: Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo, p.30. BRAGA, F.M.; VAN DER LAAN, C.W.; HALFEN, D.C., VIDOR, T. (1997) Avaliação de métodos de controle da infecção pelo vírus da leucose enzoótica bovina. Ciência Rural, Santa Maria, 27 (4): BRAGA, F.M.; VAN DER LAAN, C.W.; SCHUCH, L.F.; HALFEN, D.C. (1998a) Infecção pelo Vírus da Leucose Enzoótica Bovina (BLV). Ciência Rural, Rio Grande do Sul, 28 (1): BRAGA, A. C. ROSA, J.C.A., OLIVEIRA, L.G., RECKZIEGEL, P.E., TEIXEIRA, J.C.F., LISBOA, C.S. (1998b) Anticorpos contra o vírus da leucose bovina em animais da raça leiteira importados do uruguai. Pesquisa Agropecuária Gaúcha, 4(1): BIRGEL, E.H. (1982) Leucose linfática enzoótica dos bovines adultos. Aspectos clínicos e diagnósticos. In: BIRGEL, HE.H., BANESI, F.J. Patologia clínica veterinária. São Paulo: sociedade Paulista de Medicina Veterinária, p BIRGEL JÚNIOR, E.H.; DÄNGELO, J.; BENESI, J.; BIRGEL, E.H. (1995) Prevalência da infecção da leucose dos bovinos, em animais da raça Jersey, criados no Estado de São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira, 15(4): BRENNER, J., VAN-HAAM, M., SAVIR, D., TRAININ, Z. (1989) The implications of BLV infection in the productivity, reproductive capacity and survival rate of a dairy cow. Veterinary Immunology Imnupathology. 22: COELHO, H.E.,MERHI, S.A., REIS, D.O. (1998) Linfossarcoma em bovinos de Uberlândia - MG e região durante 20 anos ( ). Higiene Alimentar, 12(58):

41 36 CUNHA, R.G., TEIXEIRA, A.C., SOUZA, D.M. (1982) Antígenos do vírus da leucose bovina e anticorpos precipitantes em soros de bovinos. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 17(9): DA, Y., SHANKS, R.D., STEWART, J.A., LEWIN, H.A. (1993) Milk and fat decline in bovine leukemia virus-infected Holstein cattle with persistent lymphocytosis. Proceedings National Academy Science USA, 90: D ANGELINO, J.L., GARCIA, M., BIRGEL, E.H. (1998) Productive and reproductive performance in cattle infected with bovine leucosis virus. Journal Dairy Research, 65: FAVA, C.D. (1995) Leucose Enzoótica Bovina em Búfalos. Tese (Mestrado em Medicina Veterinária) - Jaboticabal-SP, Universidade Estadual Paulista UNESP, 79p. FENNER, J.F., GIBBS, E.P.J., MURPHY, F.A. (1993) Retroviridae. In: Veterrinary Virology. San Diego: Academic Press, p FLORES, E.F., WEIBLEN, R., OLIVEIRA, C., KREUTZ, L.C. (1992) Anticorpos contra o vírus da leucose bovina (VLB) em soro de bovinos provenientes da República Oriental do Uruguai. A Hora Veterinária, 68: 5-8. GARCIA LIMA, E. (1980) Contribuição para o estudo diagnóstico de leucemia bovina. Revista de Patologia Tropical, Goiânia, 9 (1-2): GARCIA, M., D ANGELINO, J.L., BENESI, F.J., BIRGEL, E.H., MARÇAL, W.S. (1991) Avaliação do leucograma de fêmeas da raça holandesa naturalmente infectadas pelo vírus da leucose bovina. Pesquisa Veterinária Brasileira. 11(3/4): HEALD, M.T.S.; WALTNER-TOEWS, D.; JACOBS, R.M.; McNAB, W.B. (1992) The Prevalence of anti-bovine Leukemia Vírus Antibodies in Dairy Cows and 36

42 37 Associations with farm Management Pratices, Prodution and Culling in Ontário. Preventive Veterinary Medicine, 14: JAIN, C.N. (1993) Essentials of Veterinary Hematology. Philadelphia: Lea & Febiger, p JOHNSON, R., KANEENE, J.B. (1991) Bovine leukemia virus. Part I. Descriptive epidemiology, clinical manifestations, and diagnostic tests. In: Compendium on continuing education of the practicing veterinarian. p KANTEK, C.E., KRUGER, E.R., WELTE, V.R. (1982) Infecção com o vírus da leucose enzoótica bovina em um lote de vacas produtoras de leite importadas do Uruguai. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, 3(4): LEITE, R.C., MODENA, C.M., MOREIRA, E.C., ABREU, J.J. (1984) Evolução Clínica da Leucose enzoótica Bovina. Arquivo Brasileiro Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, 36(1): LEITE, R.C.; LOBATO, Z.I.P.; CAMARGOS, M.F. (2001) Leucose Enzoótica Bovina. Revista do Conselho Federal de Medicina Veterinária, Brasília, ano VII(24): LUCAS, M.H., DAWSON, M., CHASEY, D. (1980) Enzootic bovine leucosis virus in semem. Veterinary Record, 106: 128. MELO, L.E.H. (1991) Leucose enzoótica dos bovinos: Prevalência Da infecção em rebanhos leiteiros criados no agreste meredional do Estado de Pernambuco. Tese (Mestrado em Patologia Bovina) - São Paulo-SP, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia USP, 104p. MILLER, J.M., MILLER, L.D., OLSON, C., GILLETTE, K.G. (1969) Virus-like particles in phytohemagglutinn-stimulated lymphocyte cultures with reference to bovine linfossarcoma, J. Naltl. Cancer Inst., Washigton, 43(6):

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44 39 OLIVEIRA, A.R., BARRETO, C.S.F., MARICHELLO, D., SANQUENTIN, W.M. (1997) Epidemiologia da leucose bovina: ocorrência de anticorpos em várias faixas etárias. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 19(6): OLIVEIRA, A.R., IKUNO,A.A., MUELLER, S.B.K., BARRETO, C.S.F., SAAD, V.M.(1994) Leucose bovina: ocorrência de anticorpos em bovinos de várias faixas etárias. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 16(2): OLSON, C., MILLER, J. (1987) History and terminology of enzootic bovine leucosis. In: BURNY, A., MAMMERICKX, M. (Eds.) Enzootic bovine leucosis and bovine leukemia virus. Boston: Martinus Nijhoff, p ONUMA, M. (1989) Diagnosis of bovine leucosis using monoclonal antibody against tumor-associated antigen of bovine leukemia cells. Folia Veterinária, 33(1): ROMERO, C.H., ROWE, C.A. (1981) Enzootic bovine leukosis virus in Brazil. Tropical. Animal. Health. Production., Edinburgh, 13(2): SCHWARTZ, I., BENSAID, A., POLACK, B., PERRIN, B., BERTHELEMY, M., LEVY, D. (1994) In vivo Leucocyte Tropism of Bovine Leukemia Virus in Sheep and cattle. Jornal of Virology, 68(7): SIMARD, C., RICHARDSON, S., DIXON, P., BÉLANGER, C., MAXWELL, P. (2000a) Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of bovine leukosis: comparison with the agar gel immunodiffusion test approved by the Canadian Food Inspection Agency. The Canadian Journal of Veterinary Research, 64: SIMARD, C., RICHARDSON, S., DIXON, P., KOMAL, J. (2000b) Agar gel immunodiffusion test for the detection of bovine leukemia virus antibodies: lack of trans-atlantic standardization. The Canadian Journal of Veterinary Research, 64:

45 40 TÁVORA, J.P.F. (1990) Prevalência da Infecção pelo Vírus da Leucose Bovina em Rebanhos Leiteiros Criados na Região do Pólo Itabuna, Estado da Bahia. Tese (Mestrado em Patologia Bovina) - São Paulo-SP, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP,. 106p. VAN DER LAAN, C.W., VIDOR, T., BRAGA, F.M., HALFEN, D., HÜBNER, DE O. (1999) Leucose enzoótica bovina em bovinos produtores de leite importados do Uruguay. Pesquisa Agropecuária Gaúcha, 5(1):

46 41 9. APÊNDICES 9.1. Apêndice A - Ficha da propriedade Data:...N.º da Fazenda:... Propriedade:... Localidade:... Gado de corte ( ) Gado de leite ( ) Quantidade de leite/dia:...separação do bezerro (idade):... Tipo de manejo Criação extensiva ( ) Criação semi-extensiva( ) Alimentação Ração ( ) Pasto ( ) Outros ( ) Água... Inseminação artificial ( ) Monta natural ( ) Vacina sim ( ) não ( ) Quais Tratamento contra endoparasitas sim ( ) não ( ) Tratamento contra ectoparasitas sim ( ) não ( ) Compra animais adultos ( ) ou pequenos ( ) Procedência dos animais:... Quarentena: sim ( ) não ( ) Quantos animais tem na propriedade:... Outras espécies: sim ( ) não ( ) Quais:... Comercialização: matadouro ( ) vende para outros proprietários ( ) Observações: Resultados: Apêndice B - Ficha dos animais Data:...N.º da Ficha:... 41

47 42 Propriedade:... Localidade:... Identificação do animal:... Raça:...Cor:...Idade:... Sexo: ( )macho ( )fêmea Gado de corte ( ) Gado de leite ( ) Quantidade de leite/dia:...separação do bezerro (idade):... Estado geral do animal:... Animal vacinado: sim ( ) não ( ) Quais vacinas:... Tratamento contra endoparasitas sim ( ) não ( ) Tratamento contra ectoparasitas sim ( ) não ( ) Obs.: MS-mestiça, H-holandesa, M-meses, A-anos, P-preta, B-branca, C-castanha, R-raiva, Brbrucelose, Ma-manqueira 9.3. Apêndice C Tampão de borato NaOH (hidróxido de sódio)...2g H 3 BO 3 (ácido bórico)...9g H 2 O (água miliq) ml 42