Aplicações da Biotecnologia na Agricultura

Transcrição

1 Aplicações da Biotecnologia na Agricultura Cultura de Células e Tecidos Anticorpos Monoclonais e Sondas de Ácidos Nucléicos para diagnóstico Engenharia genética de plantas para a introdução de novas características Mapeamento de genes Genômica

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3 Usos da Transformação de Plantas A. Testar a função de genes ou partes de genes B. Modificar a expressão de genes endógenos - Desligar genes - Aumentar a expressão - Modificar a expressão C. Mover genes entre organismos

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5 Tecnologia Multidisciplinar Biologia Celular cultura de tecidos Biologia Molecular clonagem, estrutura e função de genes Melhoramento desenvolvimento e testes de produtos Direito- temas regulatórios Marketing aceitação pública

6 Requerimentos para produção de plantas transformadas A. DNA a ser introduzido 1. gene marcador 2. promotor (constitutivo ou induzido), região codificadora e sítio de poliadenilação B. Cultura de células e protocolo de regeneração C. Método de introdução do DNA na célula D. Prova da transformação da planta

7 Produção de Plantas Transgênicas Isolar e clonar o gene de interesse Adicionar segmentos de DNA para iniciar ou aumentar expressão do gene Introduzir a construção gênica em células de plantas (transformação) Seleção de células ou tecidos transformados Regeneração de plantas

8 Isolamento de genes 86 Genomas microbianos: Archaea - 16 espécies Bacteria - 70 espécies 42 Genomas de eucariontes: Completos - 8 espécies Em andamento - 35 espécies

9 Seqüenciamento de DNA GENEBANK já incorporou seqüências de mais de organismos Período de um ano - 4,6 milhões de novas seqüências

10 Construíndo vetores: genes, promotores, terminadores e marcadores

11 Enzimas de restrição Nathaus, Smith, Arber 1971,

12 Engenharia Genética Berg, Boyer, Cohen 1973

13 Estrutura molecular do gene Terminador Região codificadora Região promotora Específicos hnrna mrna CCAAT TATA Gerais Gppp Gppp Exon Exon Exon Intron Exon Exon ORF Translação Exon Poly A Poly A

14 Construção de vetores para transformação ACC oxi Kpn I SacI HindIII BamHI pibi 11 35S e + 35S pr Hind III SacI ACC oxi KpnI EcoRI NcoI 35S polya BamHI pibi 21 35S promoter T-Border HindIII ACC oxi 35S 35S polya promoter EcoRI pibi 23 bar 35S polya T-Border

15 Promotores mais comumente utilizados Promotores constitutivos CaMV 35S : expressão de genes exógenos em dicots. Ubiquitin: promotor constitutivo em monocots. Promotores Orgão/ tecido específico Vicilina, glutenina: específicos para expressão em sementes -amilase: aleurona de cereais Patatin: tubérculos de batata RuBisCo: tecido clorofilado

16 Promotores induzidos e expressão transiente Alguns transgenes têm impacto negativo; portanto transcrição somente quando necessário. Indução de macho-esterilidade para produção de híbridos Genes de resistência a doenças quando patógeno aparecer Atraso na expressão de genes quando interfere com desenvolvimento inicial da planta Induzido: alcool desidrogenase Etanol Transiente: Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV)

17 FATORES INFLUENCIANDO A TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS Protocolo de cultura de tecidos Fisiologia do explante Método de introdução do DNA Genes marcadores e indicadores Protocolo de seleção

18 Cultura de Tecidos Microprogação Cultura de células Variação somaclonal Cultura de haplóides Transformação Sementes artificiais Híbridos Interespecíficos Resgate de embriões Fusão de protoplastos

19 PROTOCOLOS DE CULTURA DE TECIDOS Protoplastos Calos Meristemas Brotos adventícios Embriões somáticos

20 CULTURA DE CALOS

21 MERISTEMA

22 BROTOS ADVENTÍCIOS

23 BROTOS ADVENTÍCIOS (Citrus spp.)

24 EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA (C. arabica)

25 MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO

26 CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS EM MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS Reprodutibilidade Eficiência Rapidez Baixo custo Simplicidade Ampla aplicação

27 Transformação via vetor natural Agrobacterium tumefaciens rhizogenes

28 Agrobacterium Bactéria de solo Transferência natural de DNA para plantas, causando doença Substituição de DNA da bactéria (T-DNA) por DNA de interesse Agrobacterium transferirá novo DNA

29 Agrobacterium tumefaciens

30 Transformação via vetor natural Bactéria com o Ti -plasmídio Infecção de plantas feridas e transferência do DNA para as células Ti -plasmídio (responsável pela virulência) Indução pelo T-DNA de: 1 - crescimento independente de hormônios, 2 - síntese de opinas (compostos de carbono e N dos quais a bactéria se alimenta Planta com agrobactérias vivendo em galhas

31 Transferência de DNA da Agrobacterium

32 Transformação via vetor natural

33 AGROBACTERIUM Vantagens Método bastante conhecido e estudado Eficiente Plantas com limitado número de transgenes

34 AGROBACTERIUM Desvantagens Genótipo-específico (plantabactéria) Monocot X Dicot Dependência do sistema de regeneração

35 MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA PROTOPLASTO Eletroporação Transferência de DNA via química Microinjeção

36 MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA ELETROPORAÇÃO Vantagens Rápido e eficiente Grande controle das condições experimentais Desvantagens Bio-Rad Necessidade de protoplastos Custo equipamento

37 MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA MICROINJEÇÃO

38 MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA Parede Celular Intacta Vácuo Biobalística Vortex (fibras) Sonicação Embebição de sementes Eletroforese

39 Infiltração de DNA à vácuo

40 BIOBALÍSTICA Antes Tubo de aceleração Disco de ruptura Macrocarrier PDS-1000/He Bio-Rad Partículas + DNA Tela Tecido vegetal Depois

41 Parâmetros Físicos Velocidade das partículas Tipo de partícula Propelente e vácuo Precipitação do DNA

42 Parâmetros Biológicos Fisiologia do explante Tamanho e densidade das células Parede celular Osmolaridade

43 Vantagens Diversos protocolos de cultura de tecidos Não exige vetores especializados Transformação de organelas Rapidez e simplicidade Desvantagens Equipamento especializado Integração múltipla de transgenes Variabilidade do processo

44 Métodos utilizados para transformação Peg + Eletrop. 7% Outros 7% Biolística 21% Agrobacterium 65%

45 Seleção de Plantas Transgênicas

46 GENES MARCADORES E INDICADORES Indicadores Marcadores -Glucuronidase Luciferase GFP Antocianina NPT II bar - glufosinato BXN - bromoxinil EPSPS - glifosato ALS - sulfonilureias, imidazolinonas

47 Identificação e seleção de explantes Genes indicadores gus A - glucuronidase gfp proteína de fluorescência verde

48 Genes marcadores Imidazolinonas - AHAS

49 Genes marcadores Glifosato - EPSPS

50 Explantes em meio seletivo Crescimento e enraizamento Transferência para solo em condições controladas

51 Aclimatação Casa-de-vegetação