ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS E EPÍFITAS DA CULTURA DO MILHO ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ENDOPHYTIC AND

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1 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS E EPÍFITAS DA CULTURA DO MILHO ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ENDOPHYTIC AND EPIPHYTIC BACTERIA OF MAIZE Rafael de Mello Milani Everlon Cid Rigobelo Resumo Bactérias que habitam tecidos externos e internos de plantas sem lhes causarem prejuízos são conhecidas como seres epifíticos e endofíticos, respectivamente. Tais seres são promotores de crescimento em plantas, atuando diretamente no crescimento vegetal, ou agindo como agentes de controle biológico. Os inúmeros benefícios da ação de bactérias endofíticas e epifíticas incluem aumento na taxa de germinação de sementes, aumento na área foliar, altura da planta e diâmetro do caule, além desses é possível citar produção de fitohormônios, indução de resistência na planta hospedeira e biocontrole de pragas. A cultura do milho, pela sua importância agrícola, foi escolhida para o isolamento e a caracterização das bactérias endofíticas e epifíticas e possibilita a observação da sua atuação na planta hospedeira. O presente estudo visa o isolamento e a caracterização das bactérias promotoras de crescimento vegetal em cultura de milho, permitindo a observação de sua atuação e embasando posteriores estudos nessa área, que contribuirão para conhecimento e utilização das bactérias endofíticas e epifíticas na biotecnologia e produção agrícola. Dos 320 isolados a partir da citada cultura, 182 são epífitas e 138 são endofíticas. Através dos testes para solubilizadoras de fosfato, foram obtidas 117 epífitas e 76 endofíticas. Quanto à habilidade de fixar nitrogênio o resultado de epífitas e endofíticas foram de 97 e 56 respectivamente, sendo que deste total 80 colônias possuem ambas as habilidades, 53 epífitas e 27 endofíticas.."#"#! /01#$01#2 3"! "# Abstract Bacteria that inhabit external and internal tissues of plants without causing them damage are known as epiphytic and endophytic beings, respectively. Such beings are growth promoters in plants, acting directly on plant growth, or acting as biological control agents. The numerous

2 benefits of action of endophytic and epiphytic include increased seed germination rate, increased leaf area, plant height, stem diameter, in addition to these we can mention the production of phytohormones, resistance induction in plants and biocontrol pests. The maize crop, for its agricultural importance, was chosen for the isolation and characterization of endophytic and epiphytic bacteria and allows the observation of their performance on the host plant. This study aims the isolation and characterization of bacteria that promote plant growth in corn crop, allowing the observation of their performance and provide input further studies in this area, which will contribute to knowledge and use of endophytic and epiphytic in biotechnology and agricultural production. Of the 320 isolates from the aforementioned culture, 182 are epiphytes and 138 are endophytes. By testing for solubilizing phosphate were obtained 117 epiphytic and 76 endophytic. As the ability to fix nitrogen result of epiphytic and endophytic was 97 and 56 respectively, and of this total 80 colonies have both skills, 53 epiphytes and 27 endophytic. Keywords: Bacteria. Corn. Endophytic. Epiphytes. Growth. Promoters 1 Introdução Bactérias são habitantes comuns da superfície e dos tecidos internos da maioria das plantas, podendo apresentar diversos efeitos no organismo hospedeiro (KUKLINSKY- SOBRAL, 2004; PEDRINHO, 2009). Seres endofíticos e epífitos são bactérias e fungos não patogênicos que habitam os tecidos da planta, sendo possível sua diferenciação de acordo com seu habitat. As bactérias epífitas são aquelas que habitam a superfície vegetal e não são patogênicos (JACQUES e MORRIS, 1995; ANDREWS e HARRIS, 2000), podendo ser isoladas do rizoplano ou do filoplano (ANDREWS e HARRIS, 2000). Por outro lado, os seres considerados endofíticos, são aqueles que habitam o interior dos tecidos vegetais, mas sem lhes causar danos (PETRINI et al, 1989; AZEVDO et al, 2000; KUKLINSKY-SOBRAL et al, 2004), organismos estes que vivem pelo menos parte do seu ciclo de vida no interior da planta hospedeira (BALDANI et al, 2002; MANHÃES, 2014). Ambas as bactérias podem promover o crescimento vegetal por uma série de mecanismos, como a fixação biológica do nitrogênio (BALDANI et al, 2002), solubilização de fosfato inorgânico (KUKLINSKY-SOBRAL, 2004), produção fitohormônios (MARIANO e KLOEPPER, 2000; MANHÃES, 2014). Além da promoção do crescimento vegetal, os microrganismos epifíticos e endofíticos também podem atuar de outras formas, quais sejam: controle biológico de pragas, controle de fitopatógenos e produção de fármacos de interesse (CERIGIOLI, 2005). As bactérias promotoras de crescimento vegetal possibilitam aumento na taxa de germinação, formação de flores e desenvolvimento de órgãos (AMORIM e MELO, 2002).

3 O milho (Zea mays L.), planta alvo do estudo da interação bactéria-planta nesse trabalho, ocupa o terceiro lugar entre os cereais em área semeada e em produção global, sendo utilizado na alimentação humana, animal e na indústria (CERIGIOLI, 2005). No Brasil, o milho é um dos principais cereais cultivados, representando 40% da produção de grãos (FORNASIERI FILHO, 1992; CERIGIOLI, 2005). O nosso conhecimento dessa interação pode propiciar a utilização de bactérias epifíticas e endofíticas na produção agrícola (HALLMAN et al. 1997; KUKLINSKY- SOBRAL, 2004), portanto o estudo de tais bactérias que vivem associadas às plantas nos permite não apenas entender seu papel ecológico, mas também criam possibilidades para aplicações biotecnológicas dessas bactérias na promoção do crescimento vegetal (KUKLINSKY-SOBRAL, 2004). 2 Objetivo O objetivo do presente estudo consiste em isolar e caracterizar bactérias endofíticas e epifíticas promotoras de crescimento em milho, o que permitirá avaliar sua interação ecológica com a planta e propiciará estudo subsequente para a manipulação e trabalho dessas bactérias na promoção do crescimento vegetal. 3 Material e Métodos As bactérias epífitas e endofíticas foram isoladas segundo Kuklinsky-Sobral et al, Busca por bactérias epífitas e endofíticas solubilizadoras do mineral fosfato A solubilização do mineral fosfato foi realizada de acordo com Verma et al. (2001). Os isolados foram aplicados em ágar contendo fosfato inorgânico (sendo os constituintes em g l -1 : ágar, 15; glicose, 10; NH 4 Cl, 5; NaCl, 1; MgSO 4.7H 2 O, 1; Ca 3 (PO 4 ) 2, 0,8; ph 7,2) e incubados a 28ºC por até 48 horas. A solubilização do mineral fosfato é caracterizada por um halo claro em volta das colônias bacterianas com capacidade de solubilização do fosfato. Busca por bactérias epífitas e endofíticas que fixam nitrogênio

4 A habilidade de fixar o nitrogênio foi avaliada pela habilidade de crescer em meios semissólidos livres de nitrogênio NFb (DOBEREINER et al.,1995), um halo de crescimento bacteriano indica a capacidade de fixação do nitrogênio. Seleção de bactérias epifíticas e endofíticas produtoras de AIA A produção do ácido indol acético (AIA) será analisada usando a modificação do método qualitativo desenvolvido por Bric et al. (1991). Os isolados serão aplicados em 10% de ágar de tripicase alterada com 5 mm de L-triptofano, sobreposta com membrana de nitrocelulose (Amersham Pharmacia) e incubada a 28ºC por 24 horas. Após o crescimento bacteriano ocorrerá à remoção da membrana das placas e o tratamento com reagente de Salkowski (2% (w/v) 0,5 M FeCl 3 em 35% de ácido perclórico) por 15 minutos à temperatura ambiente, bactérias produtoras de AIA serão identificadas pela presença de um halo vermelho na membrana correspondente à posição do AIA da colônia produtora. 4 Resultados e Discussão Foram obtidos 320 isolados bacterianos através da metodologia de isolamento, destes 182 são epífitas sendo 102 de folhas, 49 do caule e 31 de raiz; e 138 são endofíticas das quais 59 de folhas, 72 de caule e 7 de raiz. Quando os isolados foram avaliados quanto à capacidade de solubilizar fosfato, foi observada a formação de halo indicador em 117 epífitas e 76 endofíticas. Já a habilidade de fixar nitrogênio foi observada em 97 epífitas e 56 endofíticas. Para posterior análise quanto às bactérias produtoras de ácido indol acético (AIA), foram selecionadas aquelas com capacidade de fixação de nitrogênio e solubilização de fosfato, desta seleção resultaram 80 isolados (53 epífitas e 27 endofíticas). O conhecimento da composição das espécies que vivem em associação com as plantas permitirá conhecermos como a associação bactéria-planta influencia nos processos biológicos e no ambiente, tornando-se fundamental maior estudo para esclarecimentos acerca da relação. Os resultados até o momento mostram alto número de bactérias vivendo associadas à plantas, e que parte da população bacteriana vivendo dessa associação possui mais de uma habilidade para realização dos processos biológicos do vegetal, favorecendo-o em muitos aspectos.

5 5 Conclusões Os benefícios das bactérias epífitas e endofíticas para os vegetais com os quais vive em associação são diversos, dentre as habilidades que promovem o crescimento vegetal, a solubilização de fosfato e a fixação de nitrogênio se destacam. As bactérias responsáveis por tais características são encontradas em todo vegetal, raiz, caule e folha, tanto epifiticamente quanto endofiticamente, e as possibilidades de estudos para melhor entendimento dessa relação e melhoramento agrícola, sem agressão ao ambiente, são promissora. 6 Apoio Financeiro Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. Referências Amorim, E.P.R., Melo, I.S. Ação antagônica de rizobactérias contra Phytophthora parasitica e P. citrophthora e seu efeito no desenvolvimento de plântulas de citros. Jaboticabal, SP: Revista Brasileira de Fruticultura, 24: Andrews, J. H., Harris, R. F. The ecology and biogeography of microorganisms on plant surfaces. Annual Review of Phytopathology, 38: Azevedo, J.L., Maccheroni, M. Jr, Pereira, J.O., and Araújo, W.L. Endophytic microrganisms: a review on insect control and recent advances on tropical plants. Electron J Biotechnol. [WWW document] URL Petrini, L.E., Petrini, O., and Laflamme, G. Recovery of endophytes of abiens balsamea from needles and galls of Paradiplosis tumifex. Phytoprotection 70: Baldani, J.I., Salles, J.F., Olivares, F.L. Bactérias endofíticas como vetores de genes de resistência a insetos. In: Nass, L.L., Valois, A.C.C., de Melo, I.S., Valadares-Inglis, M.C. (org.) Recursos Genéticos e Melhoramento - Microrganismos. 1 ed., Jaguaruna: Hortograph Produções Gráficas, p Bric, J.M., Bostock, R.M., and Silverstone, S. Rapid in situ assay for indoleacetic acid production by bacteria immobilized on a nitrocellulose membrane. Appl Environ Microbiol 57: Cerigioli, M. M. Diversidade de bactérias endofíticas de raízes de milho (Zea mays L.) e potencial para promoção de crescimento f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) Departamento de Genética e Evolução. Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2005.

6 Dobereiner, J., Baldani, V.L.D., e Baldani, J.I. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas. Brasília, DF: EMBRAPA Press Filho, D. F. A cultura do milho. FUNEP, Jaboticabal SP, Hallmann, J., Quadt-Hallmann, A., Mahaffee, W.F., and Kloepper, J.W. Bacterial endophytes in agricultural crops. Can J Microbiol 43: Jacques, M. A., Morris, C. E. A review of issues related to the quantification of bacteria from the phyllosphere. FEMS Microbiology Ecology, 18: Kuklinsky-Sobral, J., et al. Isolation and characterization of soybean-associated bacteria and their potential for plant growth promotion. Environmental Microbiology. v. 6, n. 12, p , Manhães, N. E. Bactérias promotoras do crescimento vegetal e substratos em Bromeliaceae e Cetaceae f. Dissertação (Mestrado em Produção Vegetal). Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Rio de Janeiro Mariano, R. L. R., Kloepper, J. W. Método alternativo de biocontrole; resistência sistêmica induzida por rhizobactérias. Revisão anual de patologia de plantas. v. 8, p Pedrinho, E. A. N. Isolamento e caracterização de bactérias promotoras de crescimento em milho (Zea mays L.) f. Tese (Doutorado em Microbiologia Agropecuária). Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal Verma, S.C., Ladha, J.K., and Tripathi, A.K. Evaluation of plant growth promotion and colonization ability of endophytic diazotrophs from deep water rice. J Biotechnol 91: