PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3-INDOLACÉTICO IN VITRO POR BACTÉRIAS RHIZOBIACEAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL

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1 PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3-INDOLACÉTICO IN VITRO POR BACTÉRIAS RHIZOBIACEAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL Celso Pinto Soares-Junior 1 ; Claudia Cristina Garcia Martin-Didonet 2. 1 Bolsista PBIC/UEG, graduando do Curso de Ciências Biologicas, UnUCET Anápolis-UEG 2 Orientador, docente do Curso de Farmácia e Ciências Biologicas, UnUCET Anápolis-UEG RESUMO O ácido indolacético (AIA) é um hormônio vegetal do grupo das auxinas que apresenta um papel fundamental no enraizamento e crescimento apical dos vegetais através de estímulos tanto na elongação celular quanto a divisão e diferenciação celular. As bactérias diazotróficas presentes no solo habitam as raízes das plantas e atuam como promotoras do crescimento vegetal, umas das maiores influências diretas proporcionadas por estes microorganismos é a produção de reguladores do crescimento vegetal como o hormônio AIA. Esta possibilidade pode ser explorada na determinação da interação de planta/bactéria para utilização no aumento da produção de algumas plantas cultivadas como o arroz. Assim o objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade de bactérias isoladas de raiz de plantas de arroz da família Rhizobiaceae, na produção de ácido indolacético. Foram testadas 23 bactérias que foram crescidas em meio batata líquido em presença e ausência de triptofano (0,5mM.L -1 ) por 10 dias na ausência de luz. A dosagem do AIA foi realizada qualitativa e quantitativamente a partir da reações colorimétrica com o reagente de Salkowski. Na ausência de triptofano as bactérias testadas não produziram AIA qualitativamente. Já as bactérias crescidas na presença de triptofano, 39% sintetizaram AIA qualitativamente e 67% quantitativamente. Das 23 bactérias testadas 9 não apresentaram produção de AIA; 6 produziram mais de 10 ug de AIA por ml de meio e 8 isolados, abaixo de deste valor médio de produção foi de 8,02 ug.ml -1. Pelos resultados as bactérias testadas da família Rhizobiaceae apresentam a capacidade de sintetizarem AIA, a partir de triptofano como precursor, podendo ser consideradas como prováveis promotores do crescimento vegetal, apesar de maiores estudos serem necessários. Palavras-chave: bactérias diazotróficas, ácido indolacético, Rhizobiaceae. 1

2 1 INTRODUÇÃO As rizobactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPR-Plant growth-promoting rhizobacteria) são microorganismos que ocorrem nos solos e que colonizam as raízes das plantas e estimulam o crescimento vegetal. (KLOEPPER & SCHROTH, 1981; KLOEPPER et al., 1991). As rizobactérias estão entre os grupos de bactérias mais estudados e de grande potencial para utilização na agricultura, representando um subgrupo diverso que colonizam as raízes (ZAGO; DE-POLLI; RUMJANRK, 2000). Bactérias da família Rizobiaceae são bem caracterizadas e utilizadas como inoculantes em plantas leguminosas cultivadas como soja, mas pouco conhecida em associação com gramíneas (CHAGAS-JUNIOR, 2007). A capacidade de estimular o crescimento vegetal apresentada por esses organismos tem sido atribuída a mecanismos diretos tais como a fixação do nitrogênio, produção de fitohormônios e indiretos como antagonismo em relação à patógenos levando, conseqüentemente, ao aumento na taxa de germinação, crescimento das raízes e parte aérea, número de folhas e flores, área foliar e rendimento de culturas (SILVEIRA, 2001; MARIANO et al., 2004; SOUZA; 2001). Se pelo menos uma destas atividades forem observadas para uma rizobactéria ela tem sido considerada promotora de crescimento vegetal (PATTEN & GLICK, 1996). Fitohormônios são substâncias que influenciam os processos fisiológicos, controlando o crescimento da planta. Algumas linhagens conhecidas como diazotrofos podem colonizar o interior da planta sem causar danos aparentes a seus hospedeiros, e possibilitam benefícios de diversas formas. Muitos diazotrofos endofíticos podem produzir fitohormônios, e são conseqüentemente capazes de promover o crescimento de planta (PATTEN & GLICK, 1996; MARCHIORO, 2005). Os mecanismos propostos para os efeitos benéficos causados por rizobactérias PGPR incluem a síntese de fitohormônios de plantas como ácido 3-indolacético (AIA) que regulam o crescimento em plantas (LOPER & SCHROTH, 1986). Uma das auxinas encontrada nas bactérias é o ácido indolacético que pode atuar de várias maneiras nas plantas. O principal efeito da auxina é promover o crescimento de raízes e caules, através do alongamento das células recém-formadas nos meristemas. Esse efeito depende, no entanto, da concentração do hormônio. Em alguns tecidos as auxinas controlam a divisão celular (TAIZ & ZEIGER, 2004; MARCHIORO, 2005). Algumas espécies de rizobium já foram observadas associadas á plantas de arroz e estas foram caracterizadas quanto à produção de ácido indolacético indicando que este grupo 2

3 de microorganismo pode atuar como promotor de crescimento vegetal quando associadas a esta gramínea (BISWAS et al., 2000). No Brasil esta associação é pouco investigada bem como a capacidade de produção de fitohormônios deste grupo de bactéria associado ao arroz. O objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade de produção do ácido indolacético (AIA) de bactérias da família Rhizobiaceae isoladas de raízes de plantas de arroz. 2 MATERIAL E MÉTODOS Vinte e um isolados de plantas de arroz da coleção de microrganismos do Laboratório de Bioquímica, Universidade Estadual de Goiás, e mais duas estirpes de referência (BR 322 e BR520, Rhizobium tropici), cedidas pela Embrapa Soja (Londrina, PR), foram selecionados para os testes in vitro. Os ensaios de seleção de estirpes de bactérias produtoras de ácido indolacético (AIA) foram realizados em meio batata líquido (DOBEREINER et al., 1995) com e sem triptofano (0,5mM.L -1 ) como precursor (LOPER & SCROTH,1986) e as culturas foram crescidas por 10 dias. Depois estas com foram centrifugadas a 3000 rpm por 30 min. e o sobrenadante utilizado para a dosagem. A análise qualitativa de AIA foi determinada misturando-se 500 ul do sobrenadante com 500 ul de ácido de reagente Salkowski (0,5M solução de FeCl 3 em 7,9M de H 2 SO 4 ) permanecendo ao abrigo da luz por 30 minutos. O desenvolvimento da cor rosa indica a produção de IAA qualitativo. A análise quantitativa de IAA foi determinada utilizando o método de Loper & Scroth (1986) com cultivo das bactérias utilizando triptofano como precursor (0,5 mm.l -1 ). A densidade ótica da reação foi determinada a 540nm em espectrofotômetro. A curva de concentração obteve-se utilizando AIA padrão em concentração de 0,5 a 10 ug/ml. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Das 23 culturas crescidas em meio batata líquido sem a presença de triptofano como meio precursor, nenhuma realizou a síntese do fitohormônio ácido indolacético, pois quando submetidas ao reagente de Salkowski não indicaram a cor rósea. O AIA é estruturalmente relacionada ao aminoácido triptofano, indicando este aminoácido como provável precursor. Muitos estudos têm demonstrado que os vegetais convertem triptofano em AIA através de várias rotas (TAIZ & ZEIGER, 2004). 3

4 O triptofano é um conhecido precursor de AIA, sua adição em meios de cultura promove aumento da síntese, mas pode haver vias independentes de triptofano. (ZAKHAROVA et al.,1999). Pelos dados obtidos o AIA foi sintetizado somente quando o triptofano foi adicionado ao meio de cultivo, indicando que estas bactérias podem utilizar a via de síntese do AIA utilizando este aminoácido. Esta transformação pode ser realizada por microrganismos que produzem uma conversão oxidativa quando o triptofano se encontra em presença de peroxidases e de radicais livres (MARCHIORO, 2005; ZAKHAROVA et al, 1999). Das bactérias crescidas em meio líquido com a presença do triptofano como meio precursor, 39% foram capazes de sintetizar AIA qualitativamente. Sendo submetidas a quantificação por espectrofotometria, 61% das bactérias testadas apresentaram a presença de AIA (Figura 1). As bactérias 53, 54, 67, 71 80, 127, 132, 156 e o padrão BR520 não produziram AIA em nenhum teste. Já os isolados, 31, 40, 65, 129, 131, não sintetizaram AIA qualitativamente, contudo apresentaram a produção de AIA quando submetidos ao teste quantitativo. Estas produziram 2,69, 0,52, 0,33, 3,0, e 1,23 ug por ml de meio respectivamente, indicando a maior sensibilidade do método espectrofotométrico usando o regente de Salkowlski para a determinação de AIA. Das estirpes padrão somente a BR322 foi capaz de sintetizar AIA (9,58 ug.ml -1 ), em meio com triptofano. A média de produção de AIA das 21 bactérias testadas foi de 8,02 ug.ml -1, sendo o isolado 25B o que produziu a maior quantidade de AIA (19,02 ug.ml -1 ) e o isolado 40 o que produziu menor quantidade (0,5 ug.ml -1 ) (Figura 1). A produção observada esta acima dos limites observados por Hungria & Araújo (1994) de 0,3 a 5,95 ug.ml -1 para Bradyrhizobium um dos gêneros de rizobium e bem menor do que o observado por MARCHIORO (2005) utilizando Rhizobium tropici com produção de até 25 ug.ml -1. A produção de AIA observada para as bactérias testadas esta dentro do esperado, pois cada isolado vai apresentar diferentes produções. Ainda há alguns rizóbios que não são capazes de produzir AIA como o Bradyrhizobium japonicum (HUNGRIA & ARAÚJO 1994). A produção de concentrações de AIA não muito elevadas é preferível pois este é um fitohormônio e em concentrações muito elevadas pode ter efeito negativo sobre o crescimento e até atuar como um herbicida como o 2,4,diclorofenilacético (2,4-D) uma conhecida auxina sintética (TAIZ & ZEIGER, 2004). Assim os resultados indicam que as bactérias testadas podem ser promissoras na promoção de crescimento vegetal e para observar este efeito testes em plantas deverão ser realizados. 4

5 4. CONCLUSÃO Houve capacidade de bactérias isoladas de raiz de plantas de arroz, da família Rhizobiaceae, na produção de AIA a partir de triptofano. Das 21 bactérias testadas 9 não apresentaram produção de AIA; 6 produziram mais de 10 ug de AIA por ml de meio e 8 isolados, abaixo de deste valor. O valor médio de produção de AIA foi de 8,02 ug.ml -1 para as bactérias produtoras de AIA. O método quantitativo apresentou maior sensibilidade na detecção da presença de ácido indolacético do que o quantitativo. Figura 1-Concentração de AIA ug/ml sintetizados pelos isolados crescidos em meio batata líquido com triptofano (0,5mM..L -1 ). 5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA BISWAS, J. C.; LADHA, J. K.; DAZZO, F. B.; YANNI, Y. G.; ROLFE, B. G. Rhizobial inoculation influences seedling vigor and yield of rice. Agronomy Journal, v. 92, p , CHAGAS-JUNIOR, Características Agronômicas e Ecológicas de Rizóbios Isolados de Solos Ácidos e de Baixa Fertilidade da Amazônia, Tese apresentada ao Programa Multiinstitucional de Pós-Graduação em Biotecnologia do Convênio UFAM-INPA, 2007 DÖBEREINER, J.; BALDANI, V.L.D.; BALDANI,J.I. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas. Brasília : EMBRAPA-SPI :Itaguaí HUNGRIA, M. ; ARAÚJO,R. Manual de métodos empregados em estudos de microbiologia agrícola. EMBRAPA-CNPAF- Goiânia, GO, 542p,

6 KLOEPPER, J. W.; SCHROTH, M. N. Relationship of in vitro antibiosis of plant growthpromoting rhizobacteria to plant growth and the displacement of root microflora. Phytopathology, v.71, p , KLOEPPER, J. W.; ZABLOTOWICZ, R. M.; TIPPING, E. M. ; LIFSHITZ, R. In: The Rhizosphere and Plant Growth. Eds. KEISTER, K. L. & CREGAN, P. B.,Kluwer, Dordrecht, The Netherlands, p LOPER, J. E. ; SCHROTH, M. N. Influence of bacterial sources of indole-3-acetic acid on root elongation of sugar beet. Phytopathology, v.76, p , MARCHIORO,L.,E.,T., Produção de Ácido Indol Acético e Derivados por Bactérias Fixadoras de Nitrogênio,2005, p.75 Curitiva MARIANO, R.L.R.;SILVEIRA, E.B.; ASSIS, S.M.P.;GOMES,A.M.A.;NASCIMENTO A.R.P.; DONATO,V.M.T.S.; Importância de bactérias promotoras de crescimento e de biocontrole de doenças de plantas para uma agricultura sustentável; Anais da Academia Pernambucana de Ciência Agronômica v. 1, p ,, Recife, PATTEN, C. AND B. R. GLICK. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid. Can. J. Microbiol. vol.42, p , SILVEIRA, E.B Bactérias promotoras de crescimento de plantas e biocontrole de doenças. Pp In: R. Barros & S.J. Michereff. Proteção de plantas na agricultura sustentável. Recife, Imprensa Universitária da UFRPE. SOUZA, M. L. de. Utilização de microrganismos na agricultura. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Brasília, n. 21, p , TAIZ, L. ; ZEIGER,E. Fisiologia Vegetal. 3ª ed.. Porto Alegre: Artmerd, 2004, p.719 ZAGO,V.C.P; DE-POLLI, H.; RUMJANEK N. G.. Pseudomonas spp. Fluorescentes Bactérias Promotoras de Crescimento de Plantas e Biocontroladoras de Fitopatógenos em Sistemas de Produção Agrícola Seropédica: Embrapa Agrobiologia, p.32,2000. ZAKHAROVA, E.A.; SHCHERBAKOV, A.A.; BRUDNIK, V.V.;SKRIPKO, N.G.; BULKHIN, N.S.; IGNATOV, V.V. Biosynthesisof indole-3-acetic acid in Azospirillum brasilense: insights fromquantum chemistry. European Journal of Biochemistry, v.259, p ,