MÉTODO DE WADE PARA ORGANISMOS ÁCIDORRESISTENTES

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1 MÉTODO DE WADE PARA ORGANISMOS ÁCIDORRESISTENTES FIXAÇÃO: Formalina a 10%, neutra, tamponada, ou Solução de Zenker. TÉCNICA: Cortes em parafina com 6 micrômetros. SOLUÇÃO DE DESPARAFINAÇÃO Terebentina retificada (C10H 6)... 2 partes Petrolato líquido pesado (óleo mineral, parafina líquida)... 1 parte Terebintina é um solvente orgânico, inflamável. Seus vapores podem irritar a pele e os olhos, causar danos aos sistemas respiratório e nervoso central, quando inalados, e insuficiência renal quando ingerida, etc. SOLUÇÃO DE CARBOL-NOVA FUCSINA Nova fucsina, Magenta III (C.I )... 0,5 grama Fenol, cristais fundidos (C6H5OH)... 5,0 mililitros Etanol a 100%... 10,0 mililitros Água destilada para completar o volume até mililitros A fucsina é tóxica e irritante e o fenol é tóxico, corrosivo e irritante. Evite inalá-los, ingeri-los, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE ÁCIDO SULFÚRICO A 5% Ácido sulfúrico concentrado (H2SO 4)... 5,0 mililitros Água destilada... 95,0 mililitros O ácido sulfúrico é corrosivo, oxidante e tóxico. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas ou quaisquer partes do corpo. Mantenha longe de fontes de calor. ACRESCENTE O ÁCIDO NA ÁGUA E NÃO O CONTRÁRIO. CUIDADO! REAÇÃO EXOTÉRMICA! SOLUÇÃO DE PERMANGANATO DE POTÁSSIO A 1% Permanganato de potássio (KMnO 4)... 1,0 grama Água destilada mililitros O permanganato de potássio é oxidante e tóxico. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas ou quaisquer partes do corpo. Mantenha-o longe de fontes de calor. SOLUÇÃO DE ÁCIDO OXÁLICO A 2% Ácido oxálico (C2H2O 4)... 2 gramas Água destilada mililitros O ácido oxálico é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele e outras partes do corpo, e com a roupa. SOLUÇÃO DE VAN GIESON MODIFICADA Fucsina ácida (C.I )... 0,01grama Ácido pícrico [(NO 2) 3 C 6 H 2 OH]... 1,0 grama A fucsina é tóxica e irritante. O ÁCIDO PÍCRICO (2,4,6-Trinitrofenol) é PERIGOSAMENTE REATIVO E EXPLOSIVO. Evite abalos, choques, fagulhas, e o contato com calor, pele, mucosas, e a roupa, além da inalação. Pode causar irritação e sensibilização. PROCEDIMENTO (Utilize lâmina controle) 1. Solução de desparafinação, duas trocas, 5 minutos cada. 2. Drene, limpe o excesso de fluido, deixe secar até ficar opaco, e coloque na água. 3. Solução de carbol- nova fucsina durante a noite. 4. Lave em água por 2 minutos. 5. Solução de formol a 37%-40%, (P.A. = para análise), por 5 minutos. Os bacilos tornam-se azuis. Os cortes podem tornar-se azuis ou permanecerem avermelhados.

2 Nota: A qualidade da formalina é crítica. Fite especificou, particularmente, formalina recentemente redestilada, porém a qualidade do reagente (P.A. = para análise) é muito mais conveniente e inteiramente confiável. A cor azul do bacilo é permanente. Se suspeitar-se que não há total demonstração dos bacilos por este método, a etapa 1 pode ser prolongada por 4 a 6 horas para a restauração dos bacilos pobremente corados. 6. Lave em água corrente por 2 minutos. 7. Solução de ácido sulfúrico por 1 minuto e, após, lave bem em água corrente por 5 minutos. 8. Solução de permanganato de potássio por 3 minutos. Enxágue em água de torneira. 9. Solução de ácido oxálico para descorar, por 30 a 60 segundos e, então, lave completamente em água corrente. Use solução de ácido oxálico a 5% para os espécimens que não descoraram de modo correto. 10. Solução modificada de van Gieson por 3 minutos. 11. Desidrate rapidamente em etanol a 95%, etanol absoluto, e clarifique em xileno, duas passagens em cada. 12. Monte com resina e lamínula. RESULTADOS Bacilos ácidorresistentes... azul ultramarinho escuro, ou azul escuro. Elementos do tecido conjuntivo... vermelho. Fundo... amarelado. REFERÊNCIA Wade, H.W. Amer. J. Path. 28: 157, Luna, L.G. (ed.) - Manual of Histological Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. New York, McGraw-Hill Book Company, 1968, pp

3 MÉTODO DE FITE PARA BACTÉRIAS ÁCIDORRESISTENTES FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada. SECÇÕES: Parafina, 6 micrômetros. SOLUÇÃO DE ÓLEO DE AMENDOIM-XILENO Óleo de amendoim... 1 parte. Xileno... 2 partes. SOLUÇÃO DE CARBOL-FUCSINA DE ZIEHL-NEELSEN Fenol, cristais fundidos (C6H5OH)... 2,5 mililitros. Etanol absoluto... 5 mililitros. Fucsina básica (C.I )... 0,5 grama. Água destilada mililitros. BIOSSEGURANÇA: A fucsina básica é tóxica e irritante e o fenol é tóxico, corrosivo e irritante. Evite inalá-los, ingeri-los, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE ÁLCOOL-ÁCIDO A 1% a Ácido clorídrico (HCl)... 1 mililitro. Álcool etílico (etanol) a 70% mililitros. O ácido clorídrico (HCl) é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO ESTOQUE DE AZUL DE METILENO Azul de metileno (C.I )... 1,4 grama. Etanol a 95% mililitros. SOLUÇÃO DE TRABALHO DE AZUL DE METILENO Solução estoque de azul de metileno mililitros. Água de torneira mililitros. PROCEDIMENTO 1. Desparafinar os cortes nas lâminas através de 2 trocas, de 2 minutos cada, em solução de óleo de amendoim-xileno. 2. Deixar os cortes secarem ao ar por 15 minutos. O filme de óleo remanescente prevenirá a retração e os danos aos cortes. b 3. Core na solução filtrada de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen por 30 minutos. 4. Lave em água de torneira por 10 minutos. 5. Diferencie os cortes na solução de álcool-ácido a 1% até que fiquem rosa-pálidos. 6. Lave em água corrente por 3 minutos. 7. Contracore na solução de trabalho de azul de metileno por 30 segundos a 1 minuto. 8. Enxágue, em água de torneira, o excesso de solução de trabalho de azul de metileno. c 9. Desidrate os cortes rapidamente, através de 2 trocas cada, em etanol a 95% e etanol absoluto. 10. Clarifique em xileno; 2 trocas de 2 minutos cada. 11. Monte em meio resinoso.

4 RESULTADOS d Bacilos da lepra e outros ácidorresistentes... vermelho. Fundo... azul-pálido. a A solução de álcool-ácido a 1% é preferível à solução de ácido sulfúrico a 1%, usada como descolorizadora no procedimento original. b O filme (fina camada) de óleo de amendoim se distribui mais uniformemente quando os cortes são secos ao ar, do que quando as secções são secadas com papel absorvente. Este último método pode também danificar os cortes. c Se a coloração pelo azul de metileno ficar muito clara, a identificação de outros elementos teciduais pode ficar difícil. Os cortes que são corados muito levemente com o azul de metileno podem perder a cor ao serem enxaguados com a água. Um fundo bem corado em azul irá adequadamente demonstrar os outros elementos teciduais sem obscurecer os bacilos ácidorresistentes. d Embora outros bacilos ácidorresistentes sejam corados, esta coloração é usada primariamente para a demonstração dos bacilos da lepra (Mycobacterium leprae). REFERÊNCIA FITE, G.L.; CAMBRE, P.J. & TURNER, M.H. - Procedure for demonstrating lepra bacilli in paraffin sections. Arch. Pathol., 43: 624, 1947.

5 MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN PARA BACTÉRIAS ÁCIDORRESISTENTES Modificação da AFIP FIXAÇÃO: Qualquer tecido bem fixado. SECÇÕES: Parafina, 4 a 6 micrômetros. SOLUÇÃO DE CARBOL-FUCSINA DE ZIEHL-NEELSEN Fenol, cristais fundidos (C6H5OH)... 2,5 mililitros. Etanol absoluto... 5 mililitros. Fucsina básica (C.I )... 0,5 grama. Água destilada mililitros. Filtre antes de usar. BIOSSEGURANÇA: A fucsina básica é tóxica e irritante e o fenol é tóxico, corrosivo e irritante. Evite inalá-los, ingeri-los, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE ÁLCOOL-ÁCIDO A 1% Ácido clorídrico (HCl)... 1 mililitro. Álcool etílico (etanol) a 70% mililitros. O ácido clorídrico (HCl) é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO ESTOQUE DE AZUL DE METILENO Azul de metileno (C.I )... 1,4 grama. Etanol a 95% mililitros. SOLUÇÃO DE TRABALHO DE AZUL DE METILENO Solução estoque de azul de metileno mililitros. Água de torneira mililitros. PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate os cortes, nas lâminas, até a água destilada. 2. Core os cortes na solução de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen, recém-filtrada, por 30 minutos. 3. Lave bem em água corrente de torneira. 4. Descolorize as secções na solução de álcool-ácido a 1% até que fiquem rosa-pálidas. a 5. Lave completamente em água corrente por 8 minutos. 6. Contracore, mergulhando uma lâmina de cada vez, na solução de trabalho de azul de metileno. b c As secções devem ficar azul-pálidas. A coloração excessiva irá mascarar os bacilos. 7. Lave em água de torneira e, a seguir, em água destilada. d 8. Desidrate rapidamente em etanol a 95% e etanol absoluto, 2 trocas cada, e clarifique em xileno, 2 trocas de 2 minutos cada. 9. Monte em meio resinoso. RESULTADOS Bacilos ácidorresistentes...vermelho vivo. Eritrócitos...amarelo-alaranjado. Outros elementos tissulares... azul. a O descolorizador preferido é a solução de álcool-ácido a 1%. A solução de ácido sulfúrico a 1% é a usada no procedimento original.

6 b Os cortes podem ser contracorados em grupos, ao invés de o serem um a um, como o afirmado no procedimento original. c Evite uma contracoloração insuficiente com a solução de trabalho de azul de metileno, pois as outras estruturas teciduais podem não ser demonstradas. d O enxágue na água de torneira diferencia o azul de metileno da solução de trabalho. É possível que uma lavagem excessiva retire o contracorante, tornando o fundo subcorado.

7 FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada. SECÇÕES: Parafina, 4 a 8 micrômetros. COLORAÇÃO ÁCIDORRESISTENTE (Modificada para forno de micro-ondas) SOLUÇÃO DE CARBOL-FUCSINA DE ZIEHL-NEELSEN Fenol, cristais fundidos (C6H5OH)... 2,5 mililitros. Etanol absoluto... 5 mililitros. Fucsina básica (C.I )... 0,5 grama. Água destilada mililitros. Filtre antes de usar. BIOSSEGURANÇA: A fucsina básica é tóxica e irritante e o fenol é tóxico, corrosivo e irritante. Evite inalá-los, ingeri-los, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE ÁLCOOL-ÁCIDO A 1% Ácido clorídrico (HCl)... 1 mililitro. Álcool etílico (etanol) a 70% mililitros. O ácido clorídrico (HCl) é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO ESTOQUE DE AZUL DE METILENO Azul de metileno (C.I )... 1,4 grama. Etanol a 95% mililitros. SOLUÇÃO DE TRABALHO DE AZUL DE METILENO Solução estoque de azul de metileno mililitros. Água de torneira mililitros. PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate os cortes nas lâminas até a água destilada. 2. Coloque as lâminas na solução de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen, no forno de micro-ondas, o o com a sonda térmica ajustada para 93,3 C (200 F). 3. Deixe as lâminas permanecerem na solução quente por 5 minutos. 4. Enxágue em água de torneira. 5. Mergulhe na solução de álcool-ácido a 1% e, a seguir, enxágue repetidamente em água de torneira até que as secções fiquem rosa-pálidas. 6. Core na solução de trabalho de azul de metileno por 30 segundos. 7. Enxágue em água de torneira. 8. Desidrate, clarifique, e monte em meio resinoso. RESULTADOS Bacilos ácidorresistentes... vermelho. Fundo... azul. REFERÊNCIA HAFIZ, S.; SPENCER, R.C.; LEE, M.; GOOCH, H.& DUERDEN, B.I.- Use of microwaves for acid and alcohol fast staining. J. Clin. Pathol., 38: 1073, 1985.