UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS RIO CLARO

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1 unesp UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS RIO CLARO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (Área de Zoologia) MEDIADORES COMPORTAMENTAIS E COMUNICAÇÃO QUÍMICA DA VESPA EUSSOCIAL BASAL Mischocyttarus (Monocyttarus) cassununga VON IHERING, 1903 (HYMENOPTERA, VESPIDAE, MISCHOCYTTARINI) ANDRÉ SUNAO NISHIUCHI MURAKAMI Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em em Ciências Biológicas. Março

2 unesp UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS RIO CLARO MEDIADORES COMPORTAMENTAIS E COMUNICAÇÃO QUÍMICA DA VESPA EUSSOCIAL BASAL Mischocyttarus (Monocyttarus) cassununga VON IHERING, 1903 (HYMENOPTERA, VESPIDAE, MISCHOCYTTARINI) ANDRÉ SUNAO NISHIUCHI MURAKAMI Orientadora: Profa. Dra. SULENE NORIKO SHIMA Co-orientador: Dr. SIDNEI MATEUS Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em em Ciências Biológicas. Março

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4 ÍNDICE AGRADECIMENTOS... ii RESUMO... 6 ABSTRACT... 9 INTRODUÇÃO Tribo Mischocyttarini Hierarquia social Morfofisiologia colonial Comunicação química através dos hidrocarbonetos cuticulares Justificativas OBJETIVO MATERIAIS E MÉTODOS Identificação das fases do desenvolvimento colonial RESULTADOS Estudo comportamental da organização social em M. cassununga Análise morfofisiológica das fêmeas de Mischocyttarus cassununga Estudo dos hidrocarbonetos cuticulares em Mischocyttarus cassununga DISCUSSÃO Hierarquia social de dominância em Mischocyttarus cassununga Aspectos comportamentais da divisão de trabalho em Mischocyttarus cassununga. 146 Análise geral do perfil cuticular das fêmeas de Mischocyttarus cassununga Análise do perfil cuticular das fêmeas nas colônias de Mischocyttarus cassununga. 153 Análise do perfil cuticular das fêmeas de acordo com status social na ontogenia colonial em Mischocyttarus cassununga, considerando a hierarquia social, os aspectos comportamentais e os parâmetros morfofisiológicos CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE

5 i À minha querida família, a minha vivência, meu aprendizado, meu esforço, e todo o meu amor Dedico

6 ii AGRADECIMENTOS O aprendizado é uma constante cercada pelas inconstâncias da vida...onde o aprender a agradecer talvez seja a forma mais bela de agradecimento. Dessa forma, nem mais nem menos, eu agradeço profundamente... À minha orientadora, Profa. Dra. Sulene Noriko Shima, pelo exemplo de profissionalismo e ética dentro da área acadêmica e científica; Ao meu co-orientador, Dr. Sidnei Mateus, pelo apoio e incentivo neste trabalho; À CAPES, pelo financiamento desta pesquisa; Ao meu colega, Túlio Nunes, que me acolheu em Ribeirão Preto e me ensinou muito sobre a magia dos hidrocarbonetos cuticulares; Ao meu amigo, Ivan César Desuó, que me auxiliou e colaborou muito nas análises estatísticas; Aos meus amigos, Guilherme Gomes, Lye Otani, Akio Miyoshi, Vanessa Cristina de Oliveira e Vanderlei Conceição Costa Filho, pela preocupação, carinho e amizade eterna; Aos meus colegas, amigos e professores do Programa de pós-graduação em Zoologia do Instituto de Biociências da UNESP de Rio Claro, pela vivência e companheirismo diários; Às famílias Desjardins e Brienza (Valéria Desjardins Brienza, Hernani Brienza, Bruna Desjardins Brienza e Maurício Desjardins), pelo respeito, admiração e educação de sempre; Às famílias Nishiuchi e Murakami (Taeko Nishiuchi, Seishi Nishiuchi, Elizabeth Eiko Nishiuchi, Ubirajara Nishiuchi, Seiro Nishiuchi, Tsuruko Murakami, Taro Murakami, Eiko Murakami Ienaga, Sérgio Ienaga, Rubens Murakami Ienaga, Edson Murakami Ienaga e demais entes queridos), pela união e pela admiração constantes; À minha querida família (Minha mãe Kiyoko Nishiuchi Murakami, meu pai Sussumu Murakami, minha irmã Tatiana Hitomi Murakami e minha noiva Paula Desjardins Brienza), por tudo aquilo que representa o ato mais nobre de um ser humano, e pode, simplesmente, ser traduzido em poucas palavras...amor em tudo o que se faz!

7 RESUMO 5

8 6 Resumo Mischocyttarus cassununga é uma vespa eussocial basal ou de fundação independente, endêmica de região neotropical e que apresenta características particulares na organização social e outros aspectos bionômicos relacionados às castas comportamentais. O objetivo do trabalho foi investigar a importância dos hidrocarbonetos cuticulares na comunicação química de uma população dessa espécie. Através de observações comportamentais, verificação do estado morfofisiológico (dissecção) e análise química (Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa ) foi possível estudar a relação entre o perfil químico do indivíduo e seu status social na colônia. Os resultados mostraram a presença de um grande número de compostos cuticulares (88 substâncias), de cadeia longa que variaram de 16 a 36 átomos de carbono. Dentre estes compostos que puderam ser detectados e identificados, os predominantes foram os alcanos ramificados (metilalcanos e dimetilalcanos), seguidos pelos alcanos lineares e etilalcanos, o que sugere uma alta complexidade dos hidrocarbonetos na espécie em estudo. Os hidrocarbonetos encontrados nos perfis cuticulares das fêmeas estudadas aparentemente apresentam uma função colônia-específica, assim como

9 7 provavelmente devem estar sinalizando o estado reprodutivo do indivíduos na colônia. As análises realizadas de diversas maneiras também mostraram que os parâmetros tais como inseminação e desenvolvimento ovariano provavelmente justificam melhor as diferenças nas proporções de determinadas substâncias no perfil cuticular dentro da organização social de Mischocyttarus cassununga. Analisar as possíveis diferenças dos perfis cuticulares considerando a influência conjunta de todos parâmetros fisiológicos também possibilita o entendimento da função química dos hidrocarbonetos, assim como aproxima mais a situação de estudo da realidade, uma vez que controlar tais variáveis fisiológicas é uma tarefa difícil ou quase impossível. Além disso, pouco se sabe sobre como os insetos sociais percebem as diferenças destes compostos. Conclusivamente, embora o trabalho apresente fortes indícios da utilização dos hidrocarbonetos cuticulares na espécie estudada, somente através de estudos futuros poderemos comprovar o seu papel como sinalizador do status da fêmea na organização social da colônia.

10 ABSTRACT 8

11 9 Abstract Mischocyttarus cassununga is a eusocial basal wasp with independent foundation from Neotropical areas, and which displays peculiar characteristics about the social organization and other bionomic aspects related to behavioral castes. In this study, we investigated the importance of cuticular hydrocarbons in the chemical communication for one population of this species. through behavioural observation, morphophysiological verification and chemical analysis (Gas Chromatography - Mass Spectrometry = GC MS) it was possible to study the relation between the cuticular profile of the individuals and their social status in colony. The results showed the presence of a large number of long-chain cuticular compouds (88 substances) ranging from 16 to 36 carbon atoms. Among the compounds which were found, the predominant were branched alkanes (methylalkanes and dimethylalkanes), followed by linear alkanes and ethylalkanes, suggesting a complex mixtures of hydrocarbon. The cuticular hydrocarbon profile of females showed a colony-specific function, and should probably signal the reproductive status of individuals in the colony. The analysis that was carried out in various ways, also showed that parameters such as insemination and ovarian development are

12 10 probably explaining better the differences in the proportions of certain substances in the cuticular profile within the social organization of Mischocyttarus cassununga. To analyze the possible differences of cuticular profiles, considering the combined influence of all physiological parameters, also allows understanding the function of hydrocarbon chemistry, as well as closer study of the situation in reality, since control such physiological variables is difficult or almost impossible. Furthermore, little is known about how social insects perceive the differences of these compounds. Conclusively, although this work presents strong evidence of the use of cuticular hydrocarbons in this species, only through future studies we can confirm its role as an indicator of individual status in the social organization of the colony.

13 INTRODUÇÃO 11

14 12 Introdução 1.1. Tribo Mischocyttarini Mischocyttarus cassununga é uma vespa de fundação independente pertencente à tribo Mischocyttarini (CARPENTER, 1993), a qual encontra-se representada somente pelo gênero Mischocyttarus. Este é o maior grupo de vespas sociais com 245 espécies nominais atualmente reconhecidas em nove subgêneros (SILVEIRA, 2000, 2008), e encontram-se distribuídas quase que exclusivamente na América do Sul (RICHARDS, 1978). Apenas duas espécies ocorrem no sul e oeste da América do Norte (GADAGKAR, 1991). Nas vespas eussociais basais, os ninhos podem ser fundados independentemente, ou seja, por uma única fêmea (haplometrose ou fundação solitária) ou por associação de algumas fêmeas (pleometrose) (RICHARDS & RICHARDS, 1951; RICHARDS, 1971; JEANNE, 1972; RICHARDS, 1978; JEANNE, 1980; GADAGKAR, 1991; TURILLAZZI & WEST- EBERHARD, 1996). Estes vespídeos também são caracterizados por apresentar colônias relativamente pequenas de ciclo curto (raramente mais do que 100 vespas adultas presentes), por diferenças morfológicas externas praticamente inexistentes entre as castas rainha e

15 13 operária, e conseqüente flexibilidade no papel social que os insetos adultos podem adotar (CHANDRASHEKARA & GADAGKAR, 1991; GADAGKAR, 1991). Apesar de ser constituído por uma grande diversidade de espécies, o gênero Mischocyttarus tem sido pouco estudado. Entre as espécies, sem dúvida, M. drewseni tem sido a mais amplamente estudada (JEANNE, 1970, 1972; ARAUJO, 1980; JEANNE & CASTELLÓN BERMUDEZ, 1980; GIANNOTTI & TREVISOLI, 1993; e NODA, 2005), onde o trabalho de Jeanne (1972), considerado clássico, tem sido usado para se fazer análises comparativas quanto aos vários aspectos da biologia social, como por exemplo, o hábito de nidificação, ciclo de vida, construção e arquitetura de ninho, relações de trofaláxis, hierarquia social e mecanismos de defesa. Em relação às outras espécies do gênero mencionado existem as seguintes publicações principais: M. flavitarsis (LITTE, 1979); M. mexicanus (LITTE, 1977; HERMAN & CHAO, 1984 a, b); M. immarginatus (GORTON, 1978); M. labiatus (LITTE, 1981); M. angulatus e basimaculus (ITÔ, 1984); M. extinctus (RAPOSO-FILHO & RODRIGUES, 1983 a, b); M. atramentarius (SILVA & OLIVEIRA, 1989); M. mastigophorus (O DONNELL, 1998b), M. cerberus styx (GIANNOTTI, 1998, 1999; NODA et al., 2001; SILVA, 2002, 2008; TOGNI & GIANNOTTI, 2006, 2010; COSTA-FILHO et al., 2011); M. (Monogynoecus) montei (ZABBOTTO & SHIMA, 1998; OLIVEIRA, 2003, 2007; SAKAMOTO, 2000). Em relação à Mischocyttarus cassununga, existem os estudos de Machado & Wiendl (1976); Simões, Gobbi & Batarce (1985); Gobbi & Simões (1988); Giannotti & Fieri (1991); Giannotti & Silva (1993); Prezoto & Nascimento (1999); Digiampietri Filho & Shima (1998); Prezoto et al. (2004); Murakami & Shima (2006, 2009); Murakami (2003, 2007); Murakami et al. (2009); e de Murakami & Shima (2010). Nestes trabalhos e naqueles acima citados, a maior ênfase tem sido dada à biologia da nidificação, aspectos da organização social, morfologia

16 14 externa e interna, dinâmica populacional, comportamento trófico, defesa, dominância e subordinação. A espécie eussocial basal estudada constitui-se num excelente material de trabalho, já que a ausência de um invólucro recobrindo o favo (como ocorre na grande maioria dos Epiponini) e locais de nidificação em geral bem acessíveis ao observador, permitem coleta de dados com facilidade Hierarquia social De forma geral, quando duas vespas se encontram sobre o favo elas se interagem com um comportamento característico dependendo da espécie e da estabilidade da hierarquia (RÖSELER, 1991). Conseqüentemente, as interações de dominância e subordinação formam uma importante parte na organização social das vespas eussociais basais (PARDI, 1948), e possibilitam a caracterização de determinado táxon. Nas vespas do gênero Mischocyttarus o estabelecimento da hierarquia semelhantemente ocorre com base em agressões físicas entre os indivíduos da colônia, e as posições hierárquicas podem ser afetadas por outros fatores tais como a nutrição e o desempenho na divisão de trabalho (O DONNELL, 1998b; MARKIEWICZ & O DONNELL, 2001). Embora exista a tendência em padronizar o tipo característico das interações entre dois indivíduos de determinado grupo ou grupos, as interações nas vespas do gênero Mischocyttarus, a princípio, apresentam um padrão relativamente moderado de agressividade, ou seja, ocorrem sem a presença de injúrias sérias que causam a morte de um dos indivíduos. Diferentemente do gênero Polistes, onde os comportamentos agonísticos e lutas violentas são freqüentemente observados (PARDI, 1948; WEST-EBERHARD, 1969), e da subfamília Stenogastrinae, onde os encontros ocorrem sem violência e parecem ser mais decisivos na determinação da relação social do que em outros grupos (SAKAGAMI & YAMANE, 1990;

17 15 YAMANE et al., 1990). Dentro do presente grupo em questão, M. drewseni (JEANNE, 1972) destaca-se por apresentar níveis de agressividade entre os indivíduos bastante semelhantes ao de Polistes dominulus e Polistes versicolor (Tribo Polistini). No contexto social da colônia, o termo dominância significa tanto dominância social quanto dominância reprodutiva, ou seja, a competição pela dominância social é equivalente à competição pela dominância reprodutiva, uma vez que, quando uma fundadora alcança a posição social de dominante concomitantemente torna-se a principal poedeira da colônia (PARDI, 1948; JEANNE, 1972; LITTE, 1977, 1979; GADAGKAR, 1980; LITTE, 1981; PRATTE, 1989; CHANDRASHEKARA & GADAGKAR, 1991; RÖSELER, 1991; TINDO et al. 1997; TINDO & DEJEAN, 1998). Dessa forma, a estabilidade da hierarquia depende principalmente da capacidade reprodutiva da fêmea fundadora dominante e da manutenção do seu status social de dominância. Pesquisas realizadas sobre M. cassununga na região de Rio Claro têm mostrado que a hierarquia é bastante estável (MURAKAMI, 2003; MURAKAMI & SHIMA, 2006; MURAKAMI, 2007; MURAKAMI & SHIMA, 2009; MURAKAMI & SHIMA, 2010) quando comparada com outras espécies do mesmo gênero M. drewseni (NODA, 2005), M. cerberus styx (NODA et al., 2001; SILVA, 2002; COSTA-FILHO et al., 2011) e M. montei (OLIVEIRA, 2003, 2007). Consequentemente, a rainha desta espécie apresenta uma grande longevidade (=elevada duração da capacidade reprodutiva) obtendo o controle do seu status social durante todo o ciclo de desenvolvimento da colônia Morfofisiologia colonial Nas vespas eussociais basais a diferenciação morfológica de castas não ocorre. Essa distinção se dá a nível comportamental de forma que os indivíduos mais dominantes se

18 16 especializam em determinadas tarefas, enquanto que os subordinados em outras (JEANNE, 1986; GIANNOTTI, 1992; KEEPING, 2000). Em uma revisão, O Donnell (1998) relata que os aspectos comportamentais e fisiológicos (inseminação, desenvolvimento ovariano e quantidade de corpo gorduroso) podem ser utilizados para distinguir rainha e operária. Ainda segundo este autor, a determinação de castas nas vespas sociais pode ocorrer durante a fase imatura (período préimaginal) pela diferenciação nutricional durante o desenvolvimento larval, ou após a emergência da fêmea (fase pós-imaginal) pela nutrição diferencial na vida adulta, a qual pode influenciar a sua capacidade e o seu estado reprodutivo na colônia. De acordo com Marchal (1896; 1897 apud WILSON, 1971) a divergência entre as castas nos Vespinae é baseada na discriminação nutricional durante o crescimento das larvas. Este mesmo sistema está presente nas vespas eussociais basais, portanto, a castração nutricional durante o período larval resulta em um adulto com ovário não desenvolvido (HUNT, 1994, 1996), cujas operárias são indivíduos subordinados os quais devem investir grande parte do tempo e energia em viagens de forrageamento (WILSON, 1971). Os estudos têm mostrado que as interações agonísticas levam ao estabelecimento de uma hierarquia, onde o rank social é positivamente relacionado com o grau de sucesso reprodutivo direto do indivíduo na colônia (PARDI, 1948; JEANNE, 1972; LITTE, 1977, 1979; GADAGKAR, 1980; LITTE, 1981; PRATTE, 1989; CHANDRASHEKARA & GADAGKAR, 1991; TINDO et al. 1997; TINDO e DEJEAN, 1998). Portanto, o estabelecimento desta hierarquia resulta em uma vantagem para os indivíduos dominantes os quais obtêm o controle social afetando a divisão de trabalho dentro do grupo, assim como freqüentemente evitam atividades de risco ou elevado gasto de energia comportamental (MARKIEWICZ & O DONNELL, 2001).

19 17 As vespas eussociais basais têm sido um importante objeto de estudo para analisar o relacionamento do comportamento social com a fisiologia (MARKIEWICZ & O DONNELL, 2001). Nestes vespídeos, a posição social da fêmea depende freqüentemente e fortemente da sua fisiologia reprodutiva (PARDI, 1948; RÖSELER; RÖSELER & STRAMBI, 1985), ou seja, o estado de dominância do indivíduo aparentemente inicia uma resposta fisiológica direta que afeta o desenvolvimento do ovário (WHEELER, 1986). Resumindo, o desempenho da hierarquia de tarefas acompanha a hierarquia de dominância (JEANNE, 1991). Os estudos sobre as vespas eussociais basais mostram que a rainha é a fêmea inseminada com mais elevado grau de desenvolvimento ovariano, e tipicamente domina todas as outras fêmeas em grande parte monopolizando a reprodução enquanto evita tarefas de alto custo energético tais como a atividade forrageira (JEANNE, 1972; PARDI, 1948; STRASSMANN & MEYER, 1983 e O DONNELL, 1998a;. Entretanto, de acordo com Gobbi (1977), apesar das diferenças no repertório comportamental entre rainhas e operárias eussociais primitivas, cada fêmea é uma rainha em potencial, tendo condições de desenvolvimento ovariano. Dessa forma, é muito comum ocorrer uma inibição ovariana das subordinadas pelas rainhas funcionais ou dominantes (GOBBI, 1977; RICHARDS & RICHARDS, 1951; PARDI, 1948). A ausência de inseminação, tem sido freqüentemente usada como um critério para a distinção das rainhas e operárias em vespas sociais (RICHARDS & RICHARDS, 1951; SHIMA, YAMANE & ZUCCHI, 1994, 1996a, b; SHIMA et al., 1998; O DONNELL, 1998a; SHIMA et al., 2000). O corpo gorduroso, tido como o principal tecido de reserva de nutrientes e de substâncias energéticas, também tem ajudado no entendimento sobre a distinção entre as castas, rainha e operária (PAES DE OLIVEIRA, 2005). Segundo Wheeler (1994), a variação da fisiologia nutricional (corpo gorduroso= precursor do desenvolvimento do oócito, o qual apresenta intensa atividade metabólica, especialmente na produção de vitelogenina durante a

20 18 postura das fêmeas) e do desenvolvimento ovariano podem ser determinados pela diferença na realização da tarefa. Este autor ainda descreve que, em um contexto social, a ovogênese pode ser influenciada por vários outros fatores importantes para sua regulação tais como: nutrição, acasalamento, clima e outros indivíduos da mesma espécie (WHEELER, 1996). Pesquisas recentes realizadas nas espécies ocorrentes na região do Campus Universitário da UNESP de Rio Claro (M. cassununga - MURAKAMI, 2003; MURAKAMI & SHIMA, 2006; MURAKAMI, 2007; MURAKAMI & SHIMA, 2009; MURAKAMI et al., 2009; M. drewseni - NODA, 2005; M. montei - OLIVEIRA, 2003, 2007 e M. cerberus styx - SILVA, 2002, 2008; COSTA-FILHO et al., 2011) mostram que as diferenças morfológicas externas são mínimas entre as castas reprodutivas e não reprodutivas. Por outro lado, as análises através da dissecção revelam o surpreendente fato da presença de mais de uma fêmea com ovário bem desenvolvido e inseminada em qualquer período da ontogenia colonial de M. cassununga, M. cerberus styx e M. montei. Tal ocorrência, principalmente em M. cassununga, a qual apresenta certas particularidades (hierarquia social bastante estável e alta longevidade da rainha na colônia) em relação às outras duas espécies presentes no Campus da Unesp, Rio Claro, SP, nos motivou a dar continuidade na pesquisa Comunicação química através dos hidrocarbonetos cuticulares Dentro da organização social da colônia, o relacionamento entre os indivíduos ocorre sob regras precisas, onde cada indivíduo se comporta de maneira particular em relação aos outros membros da sua colônia, dependendo da sua casta. Portanto, estes indivíduos devem ser capazes de detectar sinais químicos específicos de modo a reconhecerem a casta para os quais os mesmos pertencem, assim como identificar individualmente os companheiros de um mesmo ninho, e diferenciar os intrusos ou invasores (LORENZI et al., 1997, SINGER & ESPELIE, 1997). Estes sinais químicos, os quais apresentam um papel significante no

21 19 reconhecimento dos indivíduos na colônia, são determinados por componentes genéticos (RATNIEKS, 1991; PAGE et al., 1991; ARNOLD et al., 1996) e ambientais (RATNIEKS, 1991; GAMBOA, 1996). Howard & Blomquist (2005) relatam que um grande problema tem sido identificar os sinais pelos quais os indivíduos de uma colônia mantêm seus status e reconhecem os status de seus companheiros. Entre a ampla variedade de sinais químicos, os compostos não voláteis, conhecidos como hidrocarbonetos cuticulares, apresentam a sua importância nas pesquisas sobre semioquímicos utilizados no processo de reconhecimento (LORENZI et al., 1997). Dessa forma, além de proteger os insetos da dessecação, estes compostos que apresentam relativamente elevado peso molecular (não voláteis), também são considerados sinais primários no sistema de reconhecimento de insetos sociais (SINGER, 1998; HOWARD & BLOMQUIST, 2005). Por não serem altamente voláteis, os insetos são capazes de percebê-los através do contato direto ou a curta distância, por exemplo, através da antenação (LORENZI et al., 1997). Dentre os diversos grupos de vespas eussociais basais pertencentes às Subfamilias Stenogastrinae e Polistinae, os estudos sobre a chave de reconhecimento químico têm se concentrado nas espécies do gênero Polistes. Estes estudos têm mostrado que as colônias de algumas espécies apresentam uma composição colônia-específica dos hidrocarbonetos: Espelie & Hermann (1990) em Polistes annularis, Espelie et al. (1990) e Layton et al. (1994) em P. metricus, Bonavita-Courgoudan et al. (1991) em P. dominulus. Em adição, Singer (1998) relata que pesquisas usando técnicas analíticas têm revelado que a composição dos hidrocarbonetos nos insetos sociais pode ser específica da colônia e das castas. Isto foi verificado de fato em algumas espécies mencionadas acima (P. metricus por ESPELIE et al., 1990 e LAYTON et al., 1994; P. dominulus por BONAVITA-COURGOUDAN et al., 1991; P. satan por TANNURE-NASCIMENTO et al., 2007). Embora se saiba que os

22 20 hidrocarbonetos não são os compostos exclusivos encontrados na cutícula das vespas, uma vez que complexas misturas de subtâncias polares protéicas podem também estar envolvidas na comunicação (SLEDGE et al., 2001; DAPPORTO et al., 2008), a maior parte dos estudos ainda concentram seus esforços no papel dessas substâncias apolares na comunicação química social. Conforme Pfenning et al. (1983) e Gamboa et al. (1986), os compostos químicos que mediam o reconhecimento podem ser aprendidos pela vespa e/ou adquiridos do favo após poucas horas da sua emergência. Segundo pesquisas mais recentes, além da mistura de hidrocarbonetos sob o favo ser a mesma da cutícula dos indivíduos da colônia (ESPELIE et al., 1990; ESPELIE & HERMANN, 1990), as vespas adultas e as larvas também apresentam perfis similares nos hidrocarbonetos cuticulares (PANEK & GAMBOA, 2000). Entretanto, uma variação entre os perfis individuais pode existir refletindo a diferenciação reprodutiva entre os membros de uma colônia. Estudos em Polistes dominulus têm mostrado que os hidrocarbonetos cuticulares também são usados como sinais da atividade ovariana em fêmeas reprodutivas (SLEDGE et al. 2001; SLEDGE et al., 2004; DAPPORTO et al., 2005). Visto que o gênero eussocial basal Mischocyttarus, endêmico das Américas, também pode ser considerado um grupo modelo para se estudar a evolução do comportamento social nos vespídeos, seria interessante investigar a organização colonial sob o aspecto bioquímico, tanto de M. cassununga, quanto das outras do mesmo grupo também presentes no Campus da Unesp, Rio Claro, SP, local onde o presente estudo foi realizado. Tal trabalho torna-se bastante viável, uma vez que espécies como M. cassununga, M. cerberus styx, M. montei e M. drewseni, como já relatado, são relativamente abundantes na região de Rio Claro. Além disso, com a ajuda deste método de estudo será possível investigar a relação de parentesco entre os indivíduos que compõem a colônia em M. cassununga, e verificar se todas as fêmeas

23 21 inseminadas, com potencial reprodutivo durante a ontogenia colonial desta espécie, estão produzindo prole 2n Justificativas Diversos fatores tornam a espécie M. cassununga um excelente material de trabalho. Além do contraste existente entre diversidade taxonômica do grupo e abundância relativa das colônias com a ausência de conhecimentos sobre vários aspectos bionômicos (ex. determinação de castas, regulação social), esta espécie eussocial basal aparentemente possui características intermediárias entre espécies mais basais de Vespidae (ex. Polistes e algumas espécies de Mischocyttarus) e as mais derivadas (algumas Epiponini). Desse modo, a realização desta pesquisa traz benefícios para entendimento de importantes aspectos dentro do estudo comportamental e evolutivo, como por exemplo, os fatores envolvidos no padrão de organização social da espécie e o número de rainhas na colônia (monoginia característico das vespas eussociais basais, ou poliginia presente nas vespas eussociais derivadas). E, por fim, a comum ocorrência desta espécie de vespa eussocial basal na região, a ausência de um invólucro recobrindo o favo (como ocorre na grande maioria dos Epiponini), a presença de baixo número de indivíduos por colônia, e locais de nidificação em geral bem ascessíveis ao observador que permitem coleta de dados com facilidade, nos motiva enormemente realizar estudos sobre ela. Até o presente momento, diversas questões sobre a biologia comportamental da vespa eussocial basal, M. cassununga, foram esclarecidas e melhor entendidas através dos projetos realizados durante a Iniciação Científica e Mestrado. Entretanto, apesar do êxito alcançado e do conhecimento adquirido, a necessidade de um estudo mais abrangente nos motiva a explorar melhor os aspectos bionômicos inerentes a esta espécie. Os trabalhos anteriores

24 22 mostraram que a hierarquia social na colônia é bastante estável, onde a rainha apresenta grande longevidade e mantém o controle social através de sua agressividade. Os conflitos hierárquicos são praticamente inexistentes nesta espécie, o que indica a importância da presença e da eficácia de um mecanismo de sinalização química durante o reconhecimento individual na colônia. Embora exista tal indício, o conhecimento sobre este mecanismo tanto na espécie quanto no gênero é ausente. Um outro aspecto interessante refere-se ao pouco entendimento da relação entre os mecanismos do comportamento de dominância e a fisiologia reprodutiva. Os resultados anteriores também revelaram a presença de mais de uma fêmea inseminada e com ovário bem desenvolvido na colônia desta espécie. Em M. cassununga não há indícios da presença de um sistema de sinalização através da variabilidade fenotípica, como revelado em algumas espécies de Polistes (P. fuscatus, P. dominulus e P. satan). Nestas espécies existe uma diferenciação na pigmentação facial (clípeo) e foi demonstrado que isto tem relação com o status social na colônia (P. fuscatus por TIBBETTS, 2002; P. dominulus por TIBBETTS & DALE, 2004; P. satan por TANNURE-NASCIMENTO et al., 2008). Na espécie P. satan, ainda foi demonstrado que existe uma associação entre os sinais visuais e químicos (TANNURE-NASCIMENTO et al., 2008). Diferentemente, em M. cassununga todos os indivíduos são praticamente idênticos (Figura 1), diferindo apenas em algumas regiões do metassoma (MURAKAMI et al., 2009). Em adição, esta espécie aparentemente nidifica em locais mais protegidos e com baixa luminosidade (Figura 2 observações pessoais). Consequentemente, tais características nos levam a questionar sobre importância dos hidrocarbonetos cuticulares na sinalização do estado reprodutivo das fêmeas dentro da organização social.

25 23 Os estudos sobre os hidrocarbonetos cuticulares têm sido realizados em algumas espécies de vespas eussociais basais na subfamilia Stenogastrinae, algumas espécies de Ropalidia (Subfamilia Polistinae) e principalmente sobre espécies do gênero cosmopolita Polistes na subfamilia Polistinae. Ao mesmo tempo, pesquisas mais recentes realizadas no Campus da UNESP de Rio Claro com espécies do gênero Mischocyttarus, endêmico das Américas, têm mostrado a importância e a necessidade desse tipo estudo. Dando uma continuidade na investigação desta espécie, tanto do ponto de vista comportamental, morfofisiológico como bioquímico, poderíamos entender melhor as suas particularidades em relação às outras também comumente encontradas na região e relativamente bem estudadas, tais como M. drewseni, M. cerberus styx e M. montei. Enfim, estudar espécies de Mischocyttarini, do ponto de vista comparativo, é fundamental, para entendermos não apenas os padrões de organização social de suas espécies, os quais a princípio vêm mostrando variação dentro do gênero e tribo mas, também, os mecanismos envolvidos na determinação de castas deste grupo de vespas eussociais basais.

26 24 Figura 1: Perfis faciais das fêmeas de acordo com o ranking social da hierarquia de uma das colônias estudadas (N7) em Mischocyttarus cassununga.

27 25 Figura 2: Exemplos de locais de nidificação das colônias de Mischoyttarus cassununga presentes no Campus da Unesp de Rio Claro.

28 OBJETIVO 26

29 27 Objetivo O presente projeto teve como objetivo principal estudar a espécie M. cassununga do ponto de vista comportamental, morfofisiológico e bioquímico, dando continuidade ao entendimento sobre a sua organização e regulação social ao longo da ontogenia colonial. Dessa forma o estudo baseou-se nos seguintes itens principais: A) Investigação do mecanismo de reconhecimento individual através dos padrões de dominância entre os indivíduos que compõem a hierarquia social. B) Identificação qualitativa e quantitativa dos componentes químicos (hidrocarbonetos) que constituem o perfil cuticular e que puderam ser encontrados e identificados em uma população desta espécie. C) Investigar se o perfil cuticular está ou não está sendo utilizado no processo de reconhecimento e sinalização inter e intra-colonial.

30 28 D) Examinar se o perfil químico do pedúnculo (suporte do ninho) apresenta uma similaridade com o perfil químico geral da sua corresponde colônia, ou seja, se ele é ou não colônia-específico. E) Analisar se existe ou não uma variação individual no perfil destes compostos cuticulares conforme a ontogenia colonial (durante as subfases pré-macho e pósmacho), considerando os aspectos comportamentais e morfofisiológicos. F) Encontrar respostas para algumas questões que permaneceram em aberto durante o trabalho de mestrado através da análise química dos indivíduos, como por exemplo, a comum presença de mais de uma fêmea inseminada durante quase todo o desenvolvimento da colônia.

31 MATERIAIS E MÉTODOS 29

32 30 Materiais e Métodos A pesquisa foi realizada utilizando-se doze (12) colônias de uma população de Mischocyttarus (Monocyttarus) cassununga presentes no campus da UNESP de Rio Claro, SP. Este estudo foi desenvolvido predominantemente na Universidade Estadual Paulista (UNESP) e, num segundo momento, concomitantemente no campus da USP, Ribeirão Preto, SP. Do total de doze colônias na fase de pós-emergência, sete (7) colônias foram estudadas na subfase pré-macho e cinco (5) colônias na subfase pós-macho (Tabela 1). As observações foram feitas em indivíduos previamente marcados com tinta acrílica utilizada para aeromodelismo, atóxica e de rápida secagem. O estudo comportamental foi efetuado através de observações diretas a olho nu, e durante um período de aproximadamente 8 horas em cada uma das colônias.

33 31 Tabela 1: Fase e subfase do ciclo biológico, colônia e período de observação das colônias de Mischocyttarus cassununga estudadas no presente trabalho. Fase Subfase Colônia N o Indivíduos Data (Mês/Ano) EC AM AQ Pós-emergência Pré-macho N Junho/2009 N Setembro/2010 N Agosto/2010 N Fevereiro/2010 N Abril/2010 N Maio/2010 N Maio/2010 Pós-macho N5a Setembro/2010 N5b Setembro/2010 N Agosto/2009 N Novembro/2009 N Outubro/2009 EC- Estudo comportamental; AM- Análise mofofisiológica; AQ- Análise química -- ausência de indivíduos (não foi realizado o estudo) a) Identificação das fases do desenvolvimento colonial As fases da ontogenia da colônia foram identificadas a partir de mapeamentos dos ninhos que permitiram acompanhar o número de imaturos (ovos e larvas) e maturos (adultos) presentes. Tais mapeamentos foram feitos periodicamente e, dependendo da condição biológica apresentada pela colônia, foi diário. As subfases do desenvolvimento colonial consideradas neste projeto foram: Pré-macho e pós-macho durante a fase de pós-emergência. Com esta seqüência ontogenética foi possível acompanhar a história comportamental e morfofisiológica de M. cassununga durante o período de produção das gerações de fêmeas

34 32 adultas e, início da fase reprodutiva ou de produção de machos, o quais ocorrem após a fundação do ninho e estabelecimento da hierarquia social na fase de pré-emergência. b) Itens comportamentais observados b.1.) Interações físicas entre os indivíduos adultos durante o estabelecimento e manutenção da hierarquia social na colônia Baseado em estudos mais detalhados sobre os compostamentos de dominância e subordinação realizados em outras vespas eussociais basais (PARDI, 1948 em Polistes dominulus (=gallicus); WEST-EBERHARD, 1969 em P. canadensis e P. fuscatus; JEANNE, 1972 em Mischocyttarus drewseni; LITTE, 1977 em M. mexicanus; LITTE, 1979 em M. flavitarsis; LITTE, 1981 em M. labiatus; ITÖ, 1984 em M. angulatus e M. basimacula; SAKAGAMI & YAMANE, 1990 em Parischnogaster mellyi e Liostenogaster vechti; GIANNOTTI, 1992 em Polistes (Aphanilopterus) lanio lanio, e PREZOTO et al., 2004 em Mischocyttarus cassununga), pretendeu-se estabelecer os padrões de dominância e subordinação em Mischocyttarus cassununga, para posteriormente relacioná-los com os demais aspectos a serem estudados. Dessa maneira, os atos comportamentais preliminarmente considerados foram: Atos de dominância: (1) Ameaçar ataque físico (agressão)- ficar em posição de ataque; (2) Perseguir- perseguir outra vespa na tentativa de dominar fisicamente; (3) Morder (agredir fisicamente)- morder com as mandíbulas na região da cabeça, mesossoma, metassoma ou asa; (4) Agarrar- prender outro indivíduo com as mandíbulas para dominá-lo; (5) Apalpar com as antenas- tocar o corpo de outra fêmea com as antenas sem agressão física; (6) Imobilizarsubir e permanecer um tempo em cima de outro indivíduo; (7) Solicitar alimento de outro indivíduo.

35 33 Atos de subordinação: (8) Permanecer imóvel e curvado para baixo durante a ameaça ou agressão; (9) Afastar ou desviar- se distanciar para evitar ataque físico; (10) Esquivar- sair rapidamente de perto da dominante e/ou sair do ninho antes ou após agressão; (11) Doar alimento a outro indivíduo antes de sofrer agressão. Após a coleta dos dados em campo, a freqüência total de comportamentos de dominância e subordinação apresentadas pelas fêmeas foi quantificada, o que possibilitou a determinação da hierarquia social de dominância em cada uma das colônias estudadas. A escala da hierarquia social em cada uma das colônias foi determinada pelo Índice de Dominância (Id) de cada indivíduo em sua respectiva colônia, com base em Prenmath et al. (1990). De acordo com Souza et al. (2011), este é o melhor índice para se construir uma hierarquia de dominância nesta espécie. n m n n p n Id = Bi + bji + 1 / Li + lji + 1 i=1 j=1 i=1 i=1 j=1 i=1 Bi corresponde ao número de vezes (freqüência total) que um indivíduo x domina os outros membros da colônia; bji é a freqüência total que indica quantas vezes os indivíduos dominados por x dominam os outros membros da colônia; 1 to m indicam o número total de indivíduos dominados por x; Li é a freqüência total que indica quantas vezes o indivíduo x foi dominado por outros membros da colônia; lji é a freqüência total que indica quantas vezes os indivíduos dominados por x foram dominados por outros membros da colônia; e 1 to p indica o número total de indivíduos que dominaram o x. b.2) Com base em nossos estudos anteriores sobre a mesma espécie, os demais comportamentos exibidos pelas fêmeas da espécie foram observados: - (12) Postura de ovos (se possível, uma vez que este comportamento não é realizado com muita frequência) - (13) Cuidado com a prole através da inspeção da células

36 34 - (14) Obtenção e ingestão de alimento a cada retorno da atividade de forrageamento das fêmeas subordinadas - (15) Ingestão de alimento por trofaláxis ou trofalaxia (larva-adulto) - (16) Oofagia - (17) Atividade forrageadora (coleta de polpa vegetal e alimento: líquido e sólido) - (18) Distribuição de alimento para as larvas no ninho - (19) Aplicação de substâncias secretoras no ninho através do ato de esfregar a região ventral do gáster no ninho Também considerou-se os demais aspectos observados nas fêmeas da espécie: - (20) Frequência de permanência em repouso nos espaços do favo (frente, lateral e atrás) no ninho pelas fêmeas da colônia Tais comportamentos sem dúvida ajudaram na distinção comportamental e fisiológica entre as fêmeas mais bem colocadas no ranking da hierarquia e as fêmeas subordinadas típicas durante o estabelecimento e manutenção do ranking social. Foi dada ênfase sobre o comportamento (16), uma vez que este pode fazer parte do processo de comunicação química. c) Análises morfofisilógicas Para a realização desta análise, todos os indivíduos das colônias foram previamente conservadas em freezer. Tal procedimento não incluiu a fixação em Dietrich por 72 horas devido a possibilidade e ao interesse de um estudo futuro de DNA de todos os indivíduos coletados. Posteriormente, todos os indivíduos foram dissecados e submetidos às seguintes análises: Idade relativa: A idade relativa dos indivíduos foi determinada através da verificação da pigmentação dos apódemas transversos dos tergitos (Figura 3). Este método tem sido muito

37 35 utilizado em vespas da tribo Epiponini verificando-se os apódemas transversos dos esternitos (RICHARDS, 1971, 1978; SHIMA et al., 1994, 1996a, b, 1998, 2000; NOLL & ZUCCHI, 2000; NASCIMENTO et al., 2003; NODA et al., 2003; DESUÓ et al., 2009). Desta maneira adotou-se as seguintes colorações: Cor Preta- fêmeas relativamente mais velhas; Cor castanho escuro- fêmeas velhas; Cor castanho claro- fêmeas jovens; Cor amarela- fêmeas relativamente mais jovens. Desenvolvimento ovariano: Investigou-se a condição do desenvolvimento ovariano de M. cassununga de todas as fêmeas acordo com as subfases pré-macho e pós-macho na fase de pós-emergência de acordo com os padrões já definidos para esta espécie (MURAKAMI e SHIMA, 2006) (Figura 4). Presença de espermatozóides armazenados na espermateca: O conteúdo foi verificado pela opacidade apresentada e, também, pela presença de uma massa compacta arredondada, a qual pode ser perfeitamente visualizada através da película transparente da estrutura (Figura 5). Em caso de dúvida, uma lâmina foi preparada e a espermateca levemente pressionada por uma lamínula e observada ao microscópio. Esse método há muito vem mostrando ser eficiente para discriminar as fêmeas inseminadas das não inseminadas (v. SHIMA- MACHADO, 1983, SHIMA 1991, SHIMA et al. 1994, 1996 a,b, 1998, 2000, 2003, NODA et al. 2003). Quantidade relativa de corpo gorduroso: A análise foi feita usando parâmetros relativos tais como, muita quantidade (cerca de 100% cobrindo todos os órgãos internos), quantidade moderada (cerca de 50%) e pouca quantidade (bem abaixo de 50%). Não foi possível montar uma figura representativa dos padrões de quantidade de corpo gorduroso presente nas fêmeas. Desenvolvimento da glândula de Van der Vecht: Este órgão apresenta suma importância na defesa da colônia contra formigas, uma vez que a secreção é responsável pela repelência de formigas da colônia (VECHT, 1968; TURILAZZI, 1979; POST & JEANNE, 1980;

38 36 JEANNE et al., 1983). A análise foi feita usando parâmetros relativos tais como: glândula bastante desenvolvida (algumas vezes com secreção), glândula moderadamente desenvolvida (sem secreção) e glândula pouco desenvolvida (Figura 6). Esta, aliada às duas anteriores irá permitir a comparação do estado fisiológico do indivíduo com o seu histórico comportamental. Figura 3. Idade relativa (cor preta: fêmeas mais velhas, cor castanho escuro: fêmeas relativamente velhas, cor castanho claro: fêmeas relativamente jovens e cor amarela: fêmeas mais jovens) de acordo com a pigmentação dos apódemoas transversos do terceiro tergito em Mischocyttarus cassununga. Seta vermelha: Região com pigmentação.

39 37 Figura 4. Padrão de desenvolvimento ovariano em Mischocyttarus cassununga (A: muito bem desenvolvido, B e C: bem desenvolvido, D: moderadamente desenvolvido, E: pouco desenvolvido. Adaptado de Murakami & Shima (2006).

40 38 Figura 5. Espermatecas inseminada (esquerda) e não inseminada (direita) de Mischocyttarus cassununga. Seta vermelha: Espermatecas (formato sacular). A B C D Figura 6: Glândula de Van der Vecht muito desenvolvida (A), moderadamente desenvolvida (B e C) e pouco desenvolvida sem secreção (D). Seta vermelha: Glândula de Van der Vecht.

41 39 d) Análise química Após as observações etológicas, todas as colônias em cada uma subfases foram coletadas, onde todos os indivíduos foram colocados separadamente em frascos de vidros ou tubos eppendorf (1,5 ml) e permaneceram em freezer até o momento de extração dos compostos cuticulares. Amostras adicionais: Os ninhos e os indivíduos machos das colônias coletadas também foram postos em frasco separado à mesma temperatura para a análise química das células (da parte externa e do seu conteúdo: ovos, larvas e pupas) e do pedúnculo. Os compostos cuticulares de cada um dos indivíduos foram extraídos por meio de banho solvente apolar (hexano à l) por 1 minuto. As amostras foram analisadas em um sistema de Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa no laboratório de Química Orgânica, da Faculdade de Farmácia de Ribeirão Preto da USP, com a colaboração do doutorando Túlio Nunes e sob a responsabilidade do Dr. Sidnei Mateus e do Prof. Dr. Ronaldo Zucchi do Departamento de Biologia, Setor de Ecologia e Evolução, da Faculdade de Filosofia, Ciência e Letras da USP de Ribeirão Preto. Para a correta identificação dos compostos cuticulares foram realizadas comparações dos espectros de massa com a biblioteca Wiley e com dados de íons diagnósticos presentes na literatura. Todo o processo de identificação dos hidrocarbonetos foi realizado com o auxílio do programa GCMS solutions for Windows (Shimadzu corporation). Alguns compostos não puderam ser identificados devido à baixa concentração em que foram encontrados. Substâncias presentes em um ou dois indivíduos amostrados dentro de sua respectiva colônia, foram representadas como Traços nas tabelas de concentrações relativas. Nestes casos, adotou-se um valor padronizado referente a 0,001, uma vez que não podemos afirmar com exatidão a presença ou ausência de um deteminado composto na amostra analisada.

42 40 A concentração desses compostos foi calculada a partir da área sob o pico. Para se evitar erros na composição dos dados amostrais (AITCHISON, 1986), a área de cada pico apontado pelo cromatograma foi transformado de acordo com a seguinte fórmula: Z = ln [A p / g (A p ) ] Onde A p é a área do pico, g (A p ) é a média geométrica do pico em cada grupo de fêmeas e Z é a área transformada do pico. e) Análise Estatística e.1) Análise sobre os dados comportamentais Foi utilizado o teste não-paramétrico de correlação de postos de Spearman para verificar o grau de associação entre o índice de dominância (Id) e algumas variáveis comportamentais (ZAR, 1999). Dessa maneira, investigou-se a existência de uma correlação entre o Id x Frequência individual do ato de inspecionar as células (Comportamento 13, v. MATERIAIS E MÉTODOS), Id x Frequência individual do ato de esfregar o gáster sobre o ninho (Comportamento 20), Frequência individual do ato de inspecionar as células x Frequência individual do ato de esfregar o gáster sobre o ninho, entre o Id x Frequência da atividade de forrageamento (Comportamento 17) do indivíduo, e entre o Id x Frequêncial total de comportamentos intranidais realizados pela fêmea na colônia. Esta análise ajudou a entender melhor a organização social da espécie dentro da colônia, ao mesmo tempo que, possibilitou a separação das fêmeas em grupos por padrões comportamentais. Além disso, o histórico comportamental dos indivíduos, aliado aos diversos parâmetros morfofisiológicos considerados neste estudo, permitiu investigar os perfis cuticulares detalhadamente através das análises multivariadas (Análises Discriminantes), na tentativa de se entender o real significado dos hidrocarbonetos nesta espécie.

43 41 e.2) Análise sobre os dados químicos Devido a quantidade elevada do número de picos (88) detectados na espécie, foi necessária a realização de uma prévia filtragem dos dados transformados com base nas concentrações relativas. Conforme já mencionado, substâncias ausentes na maior parte dos indivíduos de um grupo foram excluídas das análises estatísticas. Além disso, antes da transformação das concentrações relativas dos compostos cuticulares, os compostos cuja concentração relativa foi menor que 1% foram desconsiderados na análise discriminante (KATHER et al., 2011). Após a transformação das concentrações relativas das substâncias detectadas pelo GC- MS (v. Item d) (Análise química), os perfis químicos cuticulares dos indivíduos foram comparados de diversas maneiras através da análise discriminante stepwise (ZAR, 1999), de acordo com os grupos experimentais formados (Tabela 2). Também foi realizada uma MANOVA (p < 0,05) para verificar se existe uma diferença significativa entre estes grupos experimentais comparados. As comparações através da análise discriminante, as quais podem ser vistas na tabela 2, foram realizadas para: 1ª) Verificar a possível existência de um perfil cuticular específico em cada uma das colônias estudadas, ou seja, a existência de uma sinalização através de hidrocarbonetos colônia-específicos. Justificativa da análise: Diversos trabalhos têm demonstrado a função colônia-específica dos hidrocarbonetos em espécies de Polistes, Stenogastrinae e Ropalidia marginata. Como exemplos podemos citar os trabalhos de Espelie et al. (1990), Layton et al. (1994), Bonavita-Courgoudan et al. (1991) e Tannure-Nascimento et al. (2007) em espécies de Polistes, de Cervo et al. (1996) e Cervo et al. (2002) em Stenogastrinae, e de Bhadra et al. (2010) em Ropalidia marginata;

44 42 2 a ) e 3 a ) Comparar os espectros dos hidrocarbonetos presentes (e que puderam ser identificados) nos pedúnculos dos ninhos com o perfil químico da respectiva colônia. Justificativa da análise: Alguns trabalhos têm investigado a composição química dos hidrocarbonetos presentes sobre o pedúnculo do ninho e têm mostrado que a proporção destas substâncias podem ser similares ou não com o perfil colonial (ESPELIE et al., 1990; ESPELIE & HERMANN, 1990; SINGER et al, 1992); 4 a ) Verificar a existência de uma diferença nos perfis das fêmeas de acordo com as posições ocupadas na hierarquia social, ou seja, conforme a hierarquia de dominância. Justificativa da análise: O termo dominância significa tanto dominância social quanto reprodutiva (PARDI, 1948; RÖSELER, 1991), e na grande maioria da espécies eussociais basais, esta competição é realizada através do contato físico entre os membros da colônia. Este sistema de determinação hierárquica já foi comprovado na espécie em estudo (MURAKAMI, 2003; MURAKAMI & SHIMA, 2006; MURAKAMI, 2007; MURAKAMI & SHIMA, 2009; 2010; PREZOTO et al., 2004); 5 a ) Investigar se a diferença dos perfis cuticulares na hierarquia social também ocorre conforme a ontogenia colonial (pré-macho x pós-macho). Justificativa da análise: Embora a hierarquia linear seja altamente estável na espécie estudada (MURAKAMI, 2003; MURAKAMI & SHIMA, 2006, 2009), durante a ontogenia colonial pode ocorrer uma leve alteração dos postos hierárquicos entre os indivíduos, e sem ocorrência de agressões (MURAKAMI, 2007); 6 a ) Encontrar uma possível diferença no perfil químico entre os padrões comportamentais das fêmeas dominantes (fêmeas mais dominantes e outras hierarquicamente superiores, as quais permanecem mais tempo na colônia), fêmeas forrageadoras típicas (que passam grande parte do tempo longe do ninho forrageando), e fêmeas subordinadas mais inativas. Justificativa da análise: A realização do trabalho dentro da colônia é influenciada

45 43 pelas interações de dominância entre todos os indivíduos co-específicos (entre a dominante reprodutiva e subordinadas, assim como entre todas as subordinadas) (PARDI, 1948; JEANNE, 1972; LITTE, 1977; CHANDRASHEKARA & GADAGKAR, 1991; JEANNE, 1991; O DONNELL, 1998a, b). 7 a ) Comparar estes mesmos grupos de fêmeas foram separados de acordo com as subfases pré-macho e pós-macho, e desse modo, verificar uma possível variação dos perfis químicos conforme a ontogenia da colônia. Justificativa da análise: Segundo Strassmann (1983), em ninhos maiores e com mais indivíduos, a capacidade da rainha de dominar fisicamente todas as subordinadas diminui, e em tais casos, algum grau de controle é perdido. Em Polistes fuscatus, conforme Reeve & Gamboa (1983), nestes casos, a rainha aumenta sua atividade para manter o controle, foca sua atenção em alguns indivíduos, os quais, por sua vez, regulam a atividade de outros subgrupos de adultos na colônia. Estes reguladores subsidiários podem ocupar um elevado posto hierárquico e, até mesmo, dividir uma certa reprodução individual. Em M. cassununga, o número de fêmeas potencialmente reprodutivas aumenta na subfase pós-macho, embora a fêmea poedeira dominante não seja o único indivíduo inseminado na colônia durante a subfase pré-macho (MURAKAMI, 2007; MURAKAMI et al., 2009); 8 a ) Verificar um padrão de odor específico existêncial entre fêmeas inseminadas e não inseminadas (reprodutivas x não reprodutivas) (*Ver observação); 9 a ) Identificar uma possível diferença do perfil cuticular conforme os padrões de desenvolvimento ovariano (status social) das fêmeas desta espécie (*Ver observação); 10 a ) Verificar a existência de uma possível diferença nos perfis químicos cuticulares de acordo com a idade relativa (ontogenia individual) das fêmeas (*Ver observação); 11 a ) Detectar uma possível diferença dos perfis cuticulares das fêmeas de acordo com o desenvolvimento da glândula de Van der Vecht (*Ver observação);