MICROSPOROGÊNESE DE NOVE ACESSOS DE SYZYGIUM CUMINI (L.) MYRTACEAE ORIUNDOS DO RIO GRANDE DO SUL BRASIL

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1 MICROSPOROGÊNESE DE NOVE ACESSOS DE SYZYGIUM CUMINI (L.) MYRTACEAE ORIUNDOS DO RIO GRANDE DO SUL BRASIL MICROSPOROGENESIS OF NINE ACCESS OF SYZYGIUM CUMINI (L.) SKEELS) MYRTACEAE FROM RIO GRANDE DO SUL BRAZIL Andrea Pinto Loguercio 1, Alice Battistin 2 RESUMO O objetivo deste estudo foi caracterizar o comportamento da microsporogênese, bem como analisar a possível presença de variabilidade genética, dentro dos parâmetros em estudo, entre nove acessos de Syzygium cumini. Dos nove acessos, todos localizados no Rio Grande do Sul, foram coletados 20 botões florais em cada um, fixados em solução de etanol-ácido acético (3:1), corados com carmim propiônico 2%. Analisaram-se as fases da meiose, que demonstraram o pareamento cromossômico, a separação dos homólogos e a formação das tétrades. Foi calculado o Índice Meiótico (IM) e o percentual de viabilidade do pólen. Os dados foram comparados pelo Teste t bilateral. Nos nove acessos de S. cumini a meiose foi regular, com a formação de 11 bivalentes em diacinese e/ou metáfase I. O menor valor do Índice Meiótico foi de 91,41% e de pólen viável 93,19%. Pelos dados analisados constatou-se a estabilidade meiótica da microsporogênese tratando-se de plantas sem problemas quanto a formação de gametas masculinos. Palavras-Chave: meiose, pólen, tétrades, jambolão ABSTRACT The aim of this study was to characterize the behavior of microsporogenesis and to analyze possible presence of genetic variability, by the parameters in study, between nine accesses of Syzygium cumini. In the nine accesses deiving from Rio Grande do Sul, had been collected 20 flower buds of the nine accesses, and fixed in etanol-acetic acid solution (3:1) and stained by 2% propionic carmine. Phases, like homologous separation, chromosomal pairing and tetrads formation had been analyzed. The Meiotic Index (MI) and the pollen viability percentage had been calculated. The statistical analysis was carried through bilateral t test. In the nine accesses of S. cumini, meiosis was regular, with formation of 11 bivalents in 1. Eng. Agr. Dra. Em Agronomia, UERGS, Viamão RS, andrea-loguercio@uergs.edu.br. 2. Dra. Pesquisadora. FEPAGRO, Porto Alegre, RS. batti@terra.com.br

2 Logércio, A.P. & Battistin, A. 96 diakinesis and/or metaphasis I. The smaller percentile of normal tetrads was of 91,41% and the pollen 93,19%. The analysed data showed meiotic stability of microsporogenesis, and the plants don t presented problems to male gametes formation. Key words: meiosis, pollen, tetrads, jambolan. INTRODUÇÃO O jambolão (Syzygium cumini (L.) Skeels) é uma planta da família Myrtaceae, subfamília Myrtoidae, oriunda da Ásia tropical, sendo encontrado facilmente como floresta nativa desde as planícies ao sul do Himalaia até a Oceania, África e Havaí. Tem como sinonímia os nomes de Eugenia jambolana Lam., Myrtus cumini L., Syzygium jambolanum (Lam.) DC e Eugenia cumini Druce (MORTON, 1987; MARCHIORI & SOBRAL, 1997). No Brasil, o jambolão tem sido cultivado como planta ornamental e o chá de suas folhas é normalmente usado por pacientes diabéticos (SILVA NETO et al., 1987; TEIXEIRA et al., 1990; SOARES et al., 2000). Embora seja uma planta exótica, está bem adaptada em seu ecossistema natural apresentando características de planta heliófita (REIS & MARIOT, 2002). Para SHELDON et al. (1997), considerando-se o valor das plantas medicinais não apenas como recurso terapêutico, mas como fonte econômica, torna-se importante estabelecer ações voltadas para o desenvolvimento de pesquisas botânicas, genéticas e agronômicas acerca dessas espécies, visando sua utilização pelo homem, e a preservação de seus ecossistemas. Sendo assim, um dos aspectos de maior relevância para a sustentabilidade desses ecossistemas, quando se pretende manejar as espécies, é a manutenção da diversidade biológica e a conservação genética. Estas formam-se de uma série de ações coordenadas que culminam com a manutenção de um conjunto de indivíduos representativos da variabilidade genética de uma espécie. Trata-se de uma atividade complexa, que envolve diversas abordagens de estudo, dentre as quais a caracterização genética do indivíduo e também de seus caracteres reprodutivos (FANTINI et al., 1992; NODARI & GUERRA, 2002). Cada cromossomo ou par de cromossomos representa um papel decisivo no desenvolvimento de um indivíduo. Por isso, o número de cromossomos e as variantes que cada um deles apresenta, dentro de uma espécie, são dados importantes para a determinação da posição filogenética e

3 97 Microsporogênese... taxonômica das espécies (COVAS & SCHNACK, 1946; GUERRA, 1988; SINGH, 1993). A citogenética vegetal no Brasil está muito voltada para as plantas cultivadas com interesse econômico. Existe, no entanto, um crescente interesse por outras espécies, tanto de valor medicinal quanto ornamental (GUERRA, 1990; LOVATTO & BATTISTIN, 1997; PEDROSA et al e PAGLIARINI, 2000). O número cromossômico básico proposto para a família Myrtaceae é de n=11 (RAVEN, 1975). Segundo MORTON (1987), em algumas subfamílias esse número pode ser de 11 ou 12. PEDROSA et al. (1999), estudando 33 espécies de angiospermas em Pernambuco, Brasil, dentre as quais cinco pertencentes à família Myrtaceae, encontraram 2n=22 para três espécies de Eugenia e Psidium guajava L., e 2n=44 para Syzygium jambos (L.) Alston, relatado como tetraplóide por GOLDBLATT (1988) e por GOLDBLATT & JOHNSON (1996). É uma espécie popularmente conhecida como jambo-do-pará com muita semelhante, morfológica ao S. cumini (L.) Skeels. Segundo YAN (2001), estudos citológicos em Myrtaceae mostraram que a grande maioria dos gêneros têm como base n=11 e que variações poliplóides são comuns na tribo Myrtoideae. Para S. cumini (L.) Skeels, o número cromossômico descrito é de n=11 (SANDHU & MANN, 1988). O comportamento meiótico de um organismo exerce papel decisivo em sua estabilidade evolutiva, devido à complexidade dos fenômenos mecânicos, bioquímicos e genéticos envolvidos. A meiose é uma das fontes de variabilidade genética utilizadas pelos organismos para sua adaptação ao meio ambiente e, conseqüente, perpetuação através da descendência. O modo de atuação dos genes é muito amplo, determinando várias irregularidades em todas as fases de divisão (SINGH, 1993). Segundo PAGLIARINI (2000), o grau de fertilidade das plantas é demonstrado pelo comportamento meiótico, sendo a formação de gametas funcionais controlada por genes que garantem um processo meiótico normal. Entretanto, os genes podem sofrer mutações, ocasionando irregularidades que comprometem a fertilidade dos indivíduos. As mutações meióticas que afetam o pareamento cromossômico são importantes, pois podem levar à esterilidade total ou à formação de

4 Logércio, A.P. & Battistin, A. 98 indivíduos poliplóides e aneuplóides. Desse modo, a determinação da viabilidade do pólen, para PEÑALOZA (1995), é fundamental na investigação das causas da infertilidade das plantas, assim como para o conhecimento do potencial de reprodução de uma população e dos problemas de fertilidade que possam ocorrer. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o comportamento da microsporogênese e analisar a possível presença de variabilidade genética dentro dos parâmetros em estudo, entre nove acessos de Syzygium cumini (L.) Skeels. MATERIAL E MÉTODOS Foram usados botões florais e exemplares de nove acessos de Syzygium cumini, localizados nos municípios gaúchos de: Santa Maria (Parque Itaimbé e Jardim Botânico da UFSM), Pelotas, Porto Alegre, Restinga Seca, Cachoeira do Sul, Silveira Martins, Itaara e Bento Gonçalves. Os exemplares foram identificados e classificados no Laboratório de Botânica Sistemática da Universidade Federal de Santa Maria. O comportamento meiótico da microsporogênese foi analisado em botões florais coletados nos locais de origem de cada acesso, no período de floração da espécie (final de outubro a início de dezembro para as regiões Sul e Central do Estado do Rio Grande do Sul latitude aproximada 30ºS). O material coletado foi fixado em solução de etanol-ácido acético (3:1) por 24 a 72 horas, sob refrigeração. A seguir, o material foi transferido para solução de álcool 70% e mantido na geladeira até a confecção das lâminas, as quais foram preparadas através de esmagamento das anteras em solução de carmim propiônico 2%. As analises da meiose foram feitas nas fases mais significativas reveladoras do pareamento dos cromossomos, da separação dos homólogos e da formação das tétrades. No estudo das tétrades, todas aquelas que apresentaram números diferentes de quatro foram consideradas células com anormalidades. O índice meiótico (IM), foi calculado seguindo a fórmula proposta por LOVE (1949), onde: IM = número de tétrades normais/número total de tétrades analisadas x 100. As amostras de acessos com IM superior a 90% foram consideradas meioticamente estáveis. Para análise da viabilidade do pólen, foram selecionados, ao acaso, cinco botões de cada acesso, no mesmo estágio de amadurecimento. A

5 99 Microsporogênese... metodologia utilizada foi a mesma da microsporogênese. As anteras foram coradas com carmim acético 2%. Sob microscopia ótica (400x), foi feita a contagem de seis campos aleatórios por lâmina, avaliando-se cerca de grãos de pólen em cada acesso. O pólen classificado como normal foi aquele que continha o protoplasma corado e distribuído regularmente. Em todas as análises realizaramse cinco repetições em cada acesso avaliado. Foi realizada a análise estatística dos parâmetros viabilidade do pólen e índice meiótico, dos nove acessos, pelo Teste t bilateral, para comparação de duas médias, com variância populacional desconhecida, comparando-se os acessos dois a dois. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos nas análises das fases da meiose na microsporogênese e da viabilidade do pólen estão registrados nas Tabelas 1 e 2. As associações dos cromossomos em bivalentes na diacinese, as tétrades e a viabilidade do pólen estão representados nas Figuras 1A, 1B e 1C. Em todos os acessos avaliados (Tabela 1), tanto na meiose I como na meiose II, o percentual de células normais está contido entre 88,46% a 100%. Nos nove acessos estudados, a meiose foi regular, ocorrendo a formação de 11 bivalentes (11II) em diacinese e/ou metáfase I (Fig.1A). Houve apenas 3,22% de disjunção irregular dos cromossomos, na anáfase e/ou telófase I tais células, ao invés de segregarem 11 para cada pólo celular, apresentaram ou A irregularidade aumentou no decorrer da divisão meiótica, ocorrendo em 7,05% das células na disjunção da meiose II. A percentagem de tétrades normais, expressa através dos valores do Índice Meiótico (Tabela 1 e Figura 1B), foi considerada alta, registrando-se o dado mais baixo no acesso VIII (Silveira Martins), com 91,41% e o maior, no acesso II (Cachoeira do Sul), com 97,48%. Em todos os acessos, a baixa percentagem de anormalidades aconteceu com células em tríades e díades estas em número bastante reduzido. A amplitude de variação do IM foi de 1,32% entre os nove acessos analisados. Dentre esses, o maior desviopadrão foi observado em Silveira Martins (grupo VIII), com ± 0,724 pontos percentuais, e o menor em Cachoeira do Sul (grupo II), com ± 0,115 pontos percentuais. Diferenças

6 Logércio, A.P. & Battistin, A. 100 significativas na análises estatística do parâmetro índice meiótico foram observadas somente na comparação das duplas de acessos II V, II VI, II VII e II VIII. Todos os acessos, no entanto, apresentaram valores bastante altos, o que demonstra um patamar evolutivo em conjunto, em relação ao IM dos nove acessos estudados. Estudos futuros, com plantas oriundas de um maior número de locais, servirão para elucidar se essa característica é encontrada em outros grupos genéticos ou se é típica das populações aqui avaliadas. De acordo com NASCIMENTO JÚNIOR et al. (1990), a identificação de alterações genéticas entre as populações, dentro de uma espécie em estudo, é um aspecto básico nos programas de melhoramento vegetal. Plantas cujos índices meióticos estejam acima de 90% podem ser consideradas normais quanto ao comportamento meiótico (LOVE, 1949), podendo serem utilizadas tanto em programas de melhoramento quanto nos de preservação da espécie. AUGUSTIN et al. (2000), em trabalho com aveia no Rio Grande do Sul, encontraram índices meióticos variando de 90% a 99%, e poucas anormalidades nas diferentes fases da meiose. Os estudos de CAVALCANTE et al. (2000) acerca da viabilidade do pólen de Citrus registraram diversas anormalidades meióticas, as quais, segundo os autores, já haviam sido descritas previamente em outras populações da mesma espécie. Os pesquisadores, no entanto, encontraram índices meióticos variando de 90% a 94,1%, muito superiores aos relatados previamente, enquanto a fertilidade do pólen apresentou um valor médio de 80% na maioria das plantas estudadas. PAGLIARINI (2000) relatou que os eventos citológicos da gametogênese são controlados por um grande número de genes, que atuam desde a fase prémeiótica até a pós-meiótica, e que mutações nesses genes causam anomalias capazes de afetar a fertilidade das espécies. Durante a avaliação do comportamento meiótico em espécies vegetais de interesse agronômico, medicinal ou ornamental, a autora detectou anormalidades que afetaram a fertilidade e levaram até mesmo à total macho-esterilidade, em alguns casos. Na Tabela 2 estão relacionados os resultados obtidos na análise de viabilidade dos grãos de pólen observados em nove acessos de S. cumini no Rio Grande do Sul (Fig.1C).

7 101 Microsporogênese... O percentual de viabilidade do pólen foi alto para todas os acessos avaliados. Os índices médios variaram entre 93,19% e 96,65% dos grãos de pólen viáveis, encontrando-se a maior amplitude no acesso I (desvio-padrão = ±3,96) e a menor no acesso II (desviopadrão = ±0,75). Os valores médios da viabilidade foram comparados em dupla através do Teste t para comparação de duas médias com variância populacional desconhecida. Observando-se diferenças significativas entre as duplas de acessos II IV, II V, II VI, II VII, II IX, III VII, III IX e IV VII. O parâmetro viabilidade do pólen é reflexo das condições de desenvolvimento da parte reprodutiva masculina da planta, uma vez que o pólen viável é um conjunto de gametas masculinos normais, aptos para fertilização. Apesar das diferenças entre os acessos, todos apresentaram coeficientes acima de 93%, demonstrando não existirem problemas reprodutivos dos gametas masculinos. As ocorrências concordam com os estudos de outros autores, já que muitas plantas angiospermas produzem elevado percentual de pólen viável, embora nem todo o pólen seja utilizado na fertilização (BATTISTIN, 1983; SENFF et al., 1992, COELHO & BATTISTIN, 1998; MATTOS et al., 1999; BIONDO & BATTISTIN, 2001). Segundo PEÑALOZA (1995), a determinação da viabilidade do pólen é fundamental na investigação das causas de infertilidade das plantas, assim como para o conhecimento do potencial de reprodução de uma espécie e dos problemas de fertilidade que possam ocorrer. CONCLUSÕES Os nove acessos estudados de S. cumini possuem microsporogênese de comportamento normal, com Índice Meiótico acima de 91% e com alta viabilidade de pólen (>93%). As diferenças durante os eventos da meiose I, da meiose II, da formação de tétrades e da viabilidade do pólen refletem a ocorrência de variabilidade genética dentro da espécie. REFERÊNCIAS AUGUSTIN, L. et al. Agronomic, cytogenetic, and isoenzymatic characterizations of oat somaclones. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v.23, n.3, p , 2000.

8 Logércio, A.P. & Battistin, A. 102 BATTISTIN, A. Morfologia floral e biologia da reprodução de cinco espécies de Centrosema (DC.) BENTH. (Leguminosae Papilionoideae) p. Tese (Doutorado em Agronomia) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, São Paulo. BIONDO, E.; BATTISTIN, A. Comparação da eficiência de diferentes corantes na estimativa da viabilidade de pólen em espécies dos gêneros Eriosema (DC.) G. DON e Rhyncosia LOUR (Leguminosae Faboideae), nativas na região sul do Brasil. Bioikos, Campinas, v.15, n.1, p.39-44, CAVALCANTE, H.C. et al. Meiotic behavior and pollen fertility in an openpillinated population of Lee mandarin [Citrus clementina x (C. paradisii x C. tangerina)]. Scientia Horticulturae, Amsterdam, v.86, n.1, p , COELHO, L.G.M.; BATTISTIN, A. Meiotic behavior of Adesmia DC. (Leguminosae Faboideae) species native to Rio Grande do Sul, Brazil. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v.21, n.3, p , COVAS, G.; SCHNACK, B. Numero de cromosomas en la región del Cuyo (República Argentina). Revista Argentina de Agronomia, Buenos Aires, v. 13, n. 3, p , FANTINI, A.C. et al. Sustained yield management in tropical forest: a proposal based on the autoecology of species. Sellowia, Itajaí, v.42/44, p.25-33, GOLDBLATT, P. (ed.). Index to plant chromosome numbers St. Louis: Missouri Botanical Garden, s. p. GOLDBLATT, P.; JOHNSON, D.E. (ed.). Index to plant chromosome numbers St. Louis: Missouri Botanical Garden, s. p. GUERRA, M.S.A situação da citotaxonomia de angiospermas nos trópicos e, em particular, no Brasil. Acta Botanica Brasilica, São Paulo, v.4,n.2, p.75-86, GUERRA, M. S. Introdução à citogenética geral. Rio de Janeiro: Guanabara, p.

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11 105 Microsporogênese... Tabela 1 Análise da microsporogênese em nove acessos de Syzygium cumini (L.) Skeels, coletados no Rio Grande do Sul nos anos de 2001 e LOCALIDADE / ACESSO Restinga Seca / I Cachoeira do Sul / II Santa Maria (UFSM) / III Itaara / IV Pelotas / V Porto Alegre / VI Santa Maria (Itaimbé) / VII Silveira Martins / VIII Bento Gonçalves / IX Associação Diacinese / Metáfase I MEIOSE I Disjunção Anáfase I / Telófase I Metáfase II MEIOSE II Disjunção Anáfase II / Telófase II TÉTRADES N* N** % N* N** % N* N** % N* N** % N* N** , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,57 IM N* = N.º de células normais N** = N.º de células com anormalidades %= Percentual de células normais IM= Índice Meiótico

12 Logércio, A.P. & Battistin, A. 106 Tabela 2 Estimativa da viabilidade do pólen em nove acessos de S. cumini (L.) Skeels, coletados no Rio Grande do Sul, nos anos de 2001 e LOCALIDADE ACESSO VIABILIDADE DO PÓLEN N.º VIÁVEIS N.º INVIÁVEIS % RESTINGA SECA I ,45 CACHOEIRA DO SUL II ,19 SANTA MARIA JD. BOT. UFSM III ,91 ITAARA IV ,17 PELOTAS V ,71 PORTO ALEGRE VI ,24 SANTA MARIA PQ. ITAIMBÉ VII ,65 SILVEIRA MARTINS VIII ,33 BENTO GONÇALVES IX ,24 Figura 1 Microsporogênese em acessos de S. cumini (L.) Skeels: A) Diacinese; B) Grãos de pólen Viável (esquerda) e inviável (direita) e C) Tétrades. Aumento 1000x.