ESTUDO DA INFLUÊNCIA DAS CONCENTRAÇÕES DE NITROGÊNIO E FÓSFORO DO MEIO DE CULTIVO NO CRESCIMENTO DA MICROALGA Spirulina sp. LEB 18

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1 ESTUDO DA INFLUÊNCIA DAS CONCENTRAÇÕES DE NITROGÊNIO E FÓSFORO DO MEIO DE CULTIVO NO CRESCIMENTO DA MICROALGA Spirulina sp. LEB 18 T.R. CANAL 1, S.K.F. YAMAGUCHI¹, C.K. SOUZA¹, S.L.BERTOLI¹, L.F. CARVALHO 1 1 Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Tecnológicas, Departamento de Engenharia Química para contato: tais_r.c@hotmail.com RESUMO A microalga Spirulina tem sido estudada devido a sua biomassa apresentar alto valor protéico e digestibilidade. No cultivo de microalgas, os nutrientes presentes no meio podem alterar a composição da biomassa gerada. Em vista disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das variações dos nutrientes fosfato de potássio (K2HPO4) e nitrato de sódio (NaNO3), presentes no meio Zarrouk, na concentração celular de Spirulina sp. LEB 18. Foi utilizado planejamento experimental fatorial completo 2², variando os níveis de NaNO3 e K2HPO4, e como resposta a concentração máxima celular. A microalga foi cultivada em fotobiorreatores do tipo erlenmeyer de 2 L com volume útil de 1,8 L e mantida a 30 C com fotoperíodo de 12 h claro/escuro. A concentração da biomassa e ph foram determinados a cada 24 h. Os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre as concentrações máximas de biomassa e os valores de ph mantiveram-se entre os níveis adequados para o crescimento da microalga, em vista disso pode ser utilizada menor concentração dos reagentes que reduziria o custo do cultivo. 1. INTRODUÇÃO A busca de alternativas alimentares que possam diminuir o déficit nutricional existente em uma parcela significativa da população, a um custo acessível envolvem a pesquisa de novos processos e matérias-primas. Por outro lado, pesquisas inovadoras envolvendo a biotecnologia por meio da utilização de microrganismos ou enzimas para a produção de novos produtos, inclusive alimentos, estão revolucionando a sociedade moderna (Muliterno et al, 2005). O cultivo de microalgas há algumas décadas vêm aumentando e diversificando-se, devido ao avanço do conhecimento das técnicas de cultivo e aplicações comerciais para a biomassa gerada. O histórico dos cultivos de microalgas mostra claramente como a atividade vem crescendo e se diversificando pelo mundo (Lourenço, 2006).

2 A microalga Spirulina é muito estudada e utilizada para diversos fins, principalmente devido à sua composição química. Esta microalga pode apresentar em sua composição 38-70% de proteínas; 13-25% de carboidratos; 6-15% de lipídios e 6-9% de minerais (Henrikson, 1994; Colla et al., 2007; Madkour et al., 2012). O crescimento de microalgas é resultado da interação entre fatores biológicos, físicos e químicos. A composição bioquímica da biomassa das microalgas é determinada pela natureza de cada espécie algal e de fatores como a intensidade de luz, temperatura, ph, nutrientes e agitação do meio de cultivo (Miao; Wu, 2004). A Spirulina pode sofrer variação no crescimento de acordo com o meio de cultivo utilizado e as condições do meio externo e se cultivadas em meios otimizados podem duplicar a sua biomassa diariamente (Muliterno et al., 2005). A deficiência de nutrientes no meio pode fazer com que a microalga adapte seu metabolismo à nova condição. Em geral, as modificações no meio mudam a composição bioquímica da biomassa, principalmente a composição de proteínas, lipídeos e pigmentos (Campo et al., 2007). A manipulação das condições de cultivo pode estimular a biossíntese de compostos e, além disso, pode-se controlar estas variáveis a fim de diminuir os custos de processo. No cultivo de microalgas, a fonte de nutrientes consiste no segundo maior componente dos custos de produção (Vonshak, 1997). Outro fator importante no cultivo das microalgas é a agitação, a qual pode influenciar o crescimento celular. A agitação tem por finalidade impedir a formação de aglomerados celulares, garantindo incidência luminosa suficiente às células, permitir a captação de CO2 da atmosfera, facilitar a transferência de O2 da fase gasosa para o meio líquido e diminuir os gradientes gasosos no meio (Grima et al., 1996; Jimenez et al.,2003). Em vista disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das variações dos nutrientes fosfato de potássio e nitrato de sódio, presentes no meio Zarrouk, na concentração celular da microalga Spirulina sp. LEB MATERIAIS E MÉTODOS Neste trabalho foi utilizada a microalga Spirulina sp. LEB 18 cedida da Coleção do Laboratório de Engenharia Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande (FURG). Os cultivos foram realizados em fotobiorreatores do tipo erlenmeyer de 2 L, com volume útil de 1,8 L, com concentração inicial de inóculo de 0,1 g.l -1 e mantidos a 30 C. A aeração foi realizada por meio de ar comprimido e a iluminação feita com a utilização de lâmpadas fluorescentes fornecendo iluminância de 2000 Lux, com fotoperíodo de 12 h claro/escuro. Para a realização dos ensaios foi utilizado o meio Zarrouk (Zarrouk, 1966), conforme composição apresentada na Tabela 1.

3 Tabela 1 Composição do meio Zarrouk Componente Quantidade (g.l -1 ) NaHCO3 16,80 K2HPO4 0,50 NaNO3 2,50 K2SO4 1,00 NaCl 1,00 MgSO4.7H2O 0,20 CaCl2 0,04 FeSO4.7H2O 0,01 EDTA 0,24 A5* 1 ml.l -1 B6** 1 ml.l -1 Fonte: Zarrouk *Composição Solução A5: 2,86 g/l de H3BO3; 1,81g/L de MnCl2.4H2O; 0,222g/L de ZnSO4.7H2O; 0,079g/L de CuSO4. 5H2O; 0,015g/L de NaMoO4. **Composição Solução B6: 22,96 mg/l de NH4VO3; 96 mg/l de K2Cr2(SO4)4.24H2O; 47,85 mg/l de NiSO4.7H2O; 17,94 mg/l de Na2WO4.2H2O; 61,1 mg/l de TiOSO4.H2SO4.8H2O; 43,98 mg/l de CO(NO3)2.6H2O.

4 Para avaliação da influência dos nutrientes fosfato de potássio (K2HPO4) e nitrato de sódio (NaNO3) sobre a concentração máxima celular foi realizado Planejamento Experimental Fatorial Completo 2² com triplicata no ponto central.o fosfato de potássio (fonte de fósforo) variou entre 1,5 g e 4,5 g e o nitrato de sódio (fonte de nitrogênio) variou entre 0,1 g e 0,9 g, conforme Tabela 2. Tabela 2 Níveis reais e codificados das variáveis fosfato de potássio (K2HPO4) e nitrato de sódio (NaNO3). Variável (g.l -1 ) Níveis Codificados K2HPO4 1,50 3,00 4,50 NaNO3 0,10 0,45 0,90 A concentração de biomassa foi determinada diariamente através da medida de densidade ótica em espectofotômetro a 670 nm (Costa et al., 2002), utilizando uma relação pré-estabelecida (curva padrão) entre a massa seca de biomassa e a absorbância. O ph foi determinado diariamente por meio de phmetro digital. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO As curvas de crescimento da microalga Spirulina sp. LEB 18 dos experimentos podem ser visualizadas na Figura 1. De acordo com esta figura, pode-se observar que as curvas de crescimento apresentaram-se semelhantes para os diferentes experimentos realizados, ocorrendo uma fase de adaptação nos experimentos 1 (Figura 1a), 2 (Figura 1b) e 4 (Figura 1d) nos dois primeiros dias, seguidos por uma fase exponencial até o 15 dia. Este mesmo comportamento não foi observado no experimento 3 (Figura 1c), onde não houve fase de adaptação, sendo observado crescimento celular desde o início do cultivo, com fase exponencial até o 15 dia, indicando que a microalga se adaptou às novas condições de cultivo. Já os experimentos 5, 6 e 7 (Figura 1e) apresentaram fase de adaptação até o terceiro dia de cultivo, sendo posteriormente observada fase exponencial até o 14 dia.

5 (a) (b) (c) (d) (e) Figura 1 Concentração de biomassa dos experimentos (a) 1 (1,50 g.l -1 de K2HPO4 e 0,10 g.l -1 de NaNO3), (b) 2 (1,50 g.l -1 de K2HPO4 e 0,90 g.l -1 NaNO3), (c) 3 (4,5 g.l -1 K2HPO4 e 0,10 g.l -1 de NaNO3), (d) 4 (4,5 g.l -1 K2HPO4 e 0,90 g.l -1 de NaNO3) e (e) 5 (3,0 g.l -1 K2HPO4 e 0,45 g.l -1 de NaNO3 ) ( ), 6 (3,0 g.l -1 K2HPO4 e 0,45 g.l -1 de NaNO3) ( ) e 7 (3,0 g.l -1 K2HPO4 e 0,45 g.l -1 de NaNO3) ( ). O ph dos cultivos realizados de Spirulina sp. LEB 18 mantiveram-se entre 9,83 e 10,02, permanecendo na faixa descrita por Vonshak (1997) como sendo adequada para o crescimento da microalga. Observa-se que, quanto maior o tempo de cultivo, maior o valor de ph, pois à medida que o microrganismo se desenvolve, seu metabolismo torna o meio mais alcalino. No final do tempo de cultivo, nota-se uma tendência à estabilização do ph, provavelmente, devido a redução do

6 crescimento da microalga. Segundo Rodrigues (2008), o aumento do ph com o crescimento celular pode ser explicado pelo consumo da fonte de carbono durante o cultivo. A Tabela 3 apresenta os níveis dos nutrientes seguidos pelos valores da concentração máxima de biomassa de cada experimento, os quais foram utilizados na análise estatística visando verificar se houve ou não diferença significativa nas concentrações máximas de biomassa obtida nos diferentes experimentos. De acordo com esta tabela e Figura 2, não foram observadas diferenças significativas (p>0,05) entre as concentrações máximas de biomassa da microalga Spirulina sp. LEB 18, indicando que a microalga se adaptou as diferentes condições nutricionais nos cultivos. Desta forma, os cultivos podem ser realizados utilizando-se as menores concentrações dos reagentes sem detrimento no crescimento celular e com menores gastos na produção. Segundo Colla et al (2007) a produtividade da microalga permanece inalterada sob variação a concentração de nitrato de sódio no intervalo de 0,625 g.l -1 a 2,5 g.l -1 ; mantendo-se o cultivo a 30 C. Esses estudos demonstraram que a quantidade desse composto pode ser reduzida para aproximadamente 25% da concentração aplicada no meio de Zarrouk, sem perdas e com uma diminuição no custo de produção. Neste trabalho, verificou-se que a concentração de até 0,10 g.l -1 não prejudicaria o crescimento da microalga Spirulina sp. LEB 18. Pois de acordo com Sassano et al. (2007), em condições mínimas de nitrogênio no meio de cultivo, a microalga degrada ficocianina, que é utilizada como fonte reserva de nitrogênio. Tabela 3 Concentração máxima de biomassa (Xmáx) dos cultivos realizados de acordo com planejamento fatorial completo 2² com triplicata no ponto central. Experimento K2HPO4 (g.l -1 ) NaNO3 (g.l -1 ) Xmáx (g.l -1 ) 1 1,50 (-) 0,10 (-) 0,35 2 1,50 (-) 0,90 (+) 0,36 3 4,50 (+) 0,10 (-) 0,35 4 4,50 (+) 0,90 (+) 0,28 5 3,00 (0) 0,45 (0) 0,28 6 3,00 (0) 0,45 (0) 0,25 7 3,00 (0) 0,45 (0) 0,26

7 K 2 HPO 4 -, K 2 HPO 4 by NaNO 3 -, NaNO 3 -, p=,05 Figura 2 Diagrama de efeito das variáveis fosfato de potássio e nitrato de sódio sobre a concentração celular máxima da microalga Spirulina sp. LEB CONCLUSÃO Com os resultados obtidos, foi possível observar que a variação do fosfato de potássio e do nitrato de sódio, nos níveis estudados, não mostrou influência significativa em relação a concentração celular obtida para os diferentes experimentos. Assim, pode ser utilizada menor concentração dos reagentes sem diminuição no crescimento celular, o que pode diminuir os custos de cultivo da microalga Spirulina sp. LEB REFERÊNCIAS CAMPO, J. A. D.; GONZÁLEZ, M. G.; GUERRERO, M. G. Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology, v.74, p , COLLA, L. M.; REINEHR, C. O.; REICHERT, C.; COSTA, J. A. V. Production of biomass and nutraceutical compounds by Spirulina platensis under different temperature and nitrogen regimes. Bioresource Technology, v. 98, p , 2007.

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