CARACTERIZAÇÕES MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE ACESSOS DE PIMENTA (Capsicum chinense Jaqc.)

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL CARACTERIZAÇÕES MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE ACESSOS DE PIMENTA (Capsicum chinense Jaqc.) Francisco Joaci de Freitas Luz Orientadora: Profa. Dra. Leila Trevizan Braz Co-Orientadora: Profa. Dra. Eliana G. de Macedo Lemos Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias do Campus de Jaboticabal - UNESP, para obtenção do Título de Doutor em Agronomia - área de concentração em Produção Vegetal Jaboticabal São Paulo - Brasil 2007

2 L979 c Luz, Francisco Joaci de Freitas Caracterizações morfológica e molecular de acessos de pimenta (Capsicum chinense jaqc.)/francisco Joaci de Freitas Luz jaboticabal, 2007 xi, 70 f. : il. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2007 Orientadora: Leila Trevizan Braz Banca examinadora: Maria Helena de Souza Goldman, Arlete Marchi Tavares de Melo, João Carlos de Oliveira e Lúcia Maria Carareto Alves Bibliografia 1. Capsicum chinense Jacq 2. Morfologia-pimenta. 3. Marcadores moleculares. 4. Diversidade genética. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação. Unesp, Campus de Jaboticabal

3 iii DADOS CURRICULARES DO AUTOR FRANCISCO JOACI DE FREITAS LUZ sagitariano, nascido em 21 de dezembro de 1960, no município de Fortaleza, Estado do Ceará, é Engenheiro Agrônomo formado pela Escola de Agronomia da Universidade Federal do Ceará (UFC), em dezembro de 1984, na qual obteve o título de Mestre em agosto de Em abril de 1987 ingressou na Embrapa Roraima como pesquisador, cargo que ocupa até a presente data. Em março de 2003 iniciou o curso de doutorado em Agronomia (Produção Vegetal) na Unesp FCAV em Jaboticabal SP.

4 iv Luz do sol Que a folha traga e traduz Em verde de novo Em folha, em graça, em vida em força, em luz Céu azul que venha até onde os pés Tocam na terra e a terra inspira e exala seus azuis Reza, reza o rio, Córrego pro rio, rio pro mar Reza correnteza, roça a beira a doura areia Marcha um homem sobre o chão Leva no coração uma ferida acesa Dono do sim e do não Diante da visão da infinita beleza Finda por ferir com a mão essa delicadeza coisa mais querida A glória da vida Luz do sol Que a folha traga e traduz Em verde de novo Em folha, em graça, em vida, em força, em luz. (Caetano Veloso)

5 v A Deus e ao planeta Terra, Aos meus pais Seu Zezim (in memoriam) e Dona Ondina (in memoriam), Aos irmãos Josemir, Jocélio, Ondina Maria, Jocildo, Joacilo e Viviane, Aos meus filhos Térence, Júlia e Ramon, A Ana Lia, ex-companheira de tantos anos, A Valéria Cristina e Marize pelo carinho e atenção, Aos tantos amigos de aqui, de Fortaleza e de Roraima, Pela força e brilho nesta caminhada. DEDICO

6 vi AGRADECIMENTOS A Deus, pelo privilégio da vida. Aos meus pais e irmãos, por terem me dado tanto crédito. Às Profas. Dras. Leila Trevizan Braz e Eliana Gertrudes de Macedo Lemos, pela orientação, e pela confiança em mim depositada. À Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária), por ter concedido o privilégio de participar de seu programa de pós-graduação. Aos Professores Dra. Maria Helena de Souza Goldman (USP Ribeirão Preto), Dra. Lúcia Maria Carareto Alves (Unesp Jaboticabal), Dr. João Carlos de Oliveira (Unesp Jaboticabal) e à Pesquisadora Dra. Arlete Marchi Tavares de Melo (IAC Campinas) Aos Profs. Drs. Arthur Bernardes, Maria Lídia Stipp Paterniani, Antônio Góes e João Carlos de Oliveira, pelas importantes sugestões no Exame de Qualificação, as quais contribuíram para o aperfeiçoamento deste trabalho. Aos amigos embrapianos Luciano Bianchetti, Sabrina Carvalho e Cláudia Silva pelo incentivo e auxílio científico para a realização dessa tese. Ao Prof. Dr. Rinaldo César de Paula, pelo valioso auxílio na análise e interpretação de dados. À pós-doutoranda Ester Wickert pelos valiosos esclarecimentos na ánalise dos dados filogenéticos. Aos professores da FCAV - UNESP, Leila Trevizan, Janete Desidério, Sônia Zingaretti, Durvalina, Coutinho, Mário Benincasa, Arthur Bernardes, com quem tive aulas, tendo aprimorado meu aprendizado. Aos amigos contemporâneos da pós-graduação pelos momentos felizes da convivência científica e da descontração: Gisele, Gilmara, Geraldo, Leílson, Edvan, Márkilla, Ítalo, Renata, Renato, Anderson, Caciana, Rodrigo, Luciano, Teuni, Geisa, Letícia, Hamilton e Renata, Eliseu, Natanael, Benassi, Bráulio, Duda, Adriana, Ana Paula, Carol, Marco Aurélio, Juliana, Luís Gatieri, Norton, Pablo, Tagli, Mariângela, Diego, Aurélio, Rosinha

7 vii Aos funcionários da Horta do Setor de Olericultura e Plantas Aromático- Medicinais, João, Inauro, Sílvio e Cláudio; do Laboratório de Bioquímica de Microorganismos e Plantas do Departamento de Tecnologia, João Carlos; do Departamento de Produção Vegetal, Nádia, Sidnéia, Wagner e Marizinha e da Pós- Graduação, especialmente Valéria e Karina, pela amizade e o pronto atendimento a tantos pleitos. Aos amigos da Embrapa Roraima pelo pronto auxílio nas horas de aperto e pela amizade fraterna. A Reinaldo Imbrózio e Herundino Ribeiro Filho, amigos e incentivadores da pesquisa na Amazônia. Aos amigos Jaiminho, Jesualdo, Priscila e Geovani pelo apoio e amizade. Aos amigos eternos Geraldo Costa de Oliveira Filho e Pedro Hélio Estevam Ribeiro, colhidos tão cedo de uma vida profícua de dedicação à Agronomia. Agradeço aos indígenas, ribeirinhos e pequenos agricultores de Roraima, guardiões da riqueza dos recursos genéticos vegetais da Amazônia e a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

8 viii SUMÁRIO Página RESUMO... SUMMARY x xi CAPÍTULO 1. CONSIDERAÇÕES GERAIS INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Importância econômica das pimentas Origem e evolução Classificação botânica e características peculiares às pimentas Melhoramento genético Conservação da diversidade genética de C. chinense na Amazônia Caracterizações morfológica e molecular REFERÊNCIAS CAPÍTULO 2. CARACTERIZAÇÃO DE ACESSOS DE C. chinense POR MEIO DE DESCRITORES MORFOLÓGICOS RESUMO INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 46

9 ix CAPÍTULO 3. CARACTERIZAÇÃO DE ACESSOS DE C. chinense COM MARCADORES MOLECULARES faflp RESUMO INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS CAPÍTULO 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS - O USO DE MARCADORES MORFOLÓGICOS E MOLECULARES NA CARACTERIZAÇÃO DE ACESSOS DE PIMENTA Capsicum chinense Jacq REFERÊNCIAS... 69

10 x CARACTERIZAÇÕES MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE ACESSOS DE PIMENTA (Capsicum chinense Jaqc.) RESUMO Com o objetivo de ampliar o conhecimento sobre uma coleção de pimentas da Embrapa Roraima, foram realizadas caracterizações morfológica com descritores do IPGRI e molecular com marcadores faflp, de 58 acessos de Capsicum chinense. Os resultados da avaliação morfológica detectaram que, 39% dos acessos não se agruparam e entre os mesmos observou-se uma dissimilaridade de até 70%, com 50% de média. A caracterização molecular revelou uma dissimilaridade média de 22,3% entre os acessos levando à conclusão de que há uma pequena variabilidade genética entre os acessos, considerando o genoma como um todo. Os resultados demonstraram que as diferenças morfológicas estariam baseadas apenas em uma parte do genoma das pimentas, focada em características visíveis e mensuráveis pelo ser humano. Por outro lado, a variação observada a partir do DNA genômico por meio do marcador molecular utilizado não foi suficiente para ratificar as diferenças morfológicas observadas. Ambas as formas de caracterizar os acessos foram úteis e necessárias para o conhecimento dos mesmos, revelando informações valiosas para estratégias de conservação e uso das pimentas da Amazônia. Palavras-Chave: descritores morfológicos, diversidade genética, marcadores moleculares

11 xi 6 MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF PEPPER (Capsicum chinense Jacq.) ACCESSIONS SUMMARY In order to raise the knowledge about a pepper collection from Embrapa Roraima, IPGRI morphological descriptors and faflp molecular marker were used to characterize 58 acessions of Capsicum chinense, contributing with information about the diversity of those plants. The results of morphological evaluation showed that 39% of the accessions did not group together and it also detected a great dissimilarity among the accessions, reaching values above 70%, with a 50% medium. The molecular characterization showed an average dissimilarity of 22,3%, indicating little genetic variability on the collection evaluated, considering the total genome of the plants. These results demonstrate that variation detected by morphological descriptors would be related to only a small part of pepper genome, focusing on human visible and measurable traits. The variation observed directly on the genome by the molecular marker used was not sufficient to confirm the morphological differences observed among the accessions. Both ways of characterizing the accessions were useful and necessary to their knowledge, revealing valuable information for conservation strategies and the use of amazon peppers. Keywords: morphological descriptors, genetic diversity, molecular markers

12 1 CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS 1 INTRODUÇÃO As pimentas do gênero Capsicum são a principal especiaria originária do continente americano (MAISTRE, 1964) sendo cultivadas atualmente em regiões tropicais e temperadas de todo o mundo, como especiaria ou hortaliça (HEISER, 1979). Constituem um grupo muito peculiar pelo seu sabor, doce ou picante e por estimular as funções digestivas, sendo parte da dieta de um quarto da população do planeta nas formas de pó, seca ou em conservas (TEIXEIRA, 1996). As formas doce ou levemente pungentes são preferidas nos Estados Unidos e na Europa. As pimentas picantes têm maior importância econômica no mundo, especialmente no continente asiático (MARTIN et al., 1979). As comunidades humanas da América devem ter encontrado nas pimentas um aditivo interessante para sua dieta, despertando fortemente sua procura e coleta. Com importância alimentícia inferior a outras plantas, como milho e mandioca. As pimentas apresentam papel relevante em cerimônias religiosas e lendas de muitas culturas indígenas americanas (HEISER, 1979). Registros arqueológicos sugerem que as pimentas já eram consumidas por populações pré-colombianas entre a anos a.c. nas regiões andinas do Peru e a anos a.c. no México (NUEZ-VIÑALS et al., 1998). A partir de estudos de microfósseis de amido encontrados em sítios arqueológicos espalhados das Bahamas ao Sul do Peru, datados de anos antes da presença européia no continente americano, PERRY et al. (2007), relataram que o cultivo de pimentas era praticado na América juntamente com o milho. Relatos de expedições realizadas por Oviedo e Valdez (1547), Acosta (1590), Garcilaso de La Veja (1609) e Cobo (1653) ao novo mundo, citadas por PICKERSGILL (1969), afirmaram que as pimentas eram usadas na alimentação (frutos e folhas), em rituais religiosos, na medicina e em um rudimentar sistema monetário praticado pelos Incas.

13 2 No Brasil, Hoehne (1937), citado por BIANCHETTI (1996), comentou sobre a importância que os indígenas davam às pimentas, segundo relatos de exploradores da costa brasileira (Hans Staden, 1556; André Thevet, 1556; Gabriel Soares de Souza, 1587), ressaltaram que o uso das pimentas era largamente difundido à época do descobrimento, fazendo crer que existia uma certa similaridade no modo como as pimentas eram usadas a Oeste e Leste da América do Sul, gerando indícios de possíveis contatos por meio de migrações humanas. Em toda a Amazônia, o consumo de pimentas é muito comum, especialmente associado à utilização de peixes na dieta, uma forte tradicão regional. Em Roraima, o uso de pimentas, embora de tradição centenária, foi registrado inicialmente em trabalhos datados do início do século XX, pelo etnólogo Koch-Grünberg, que citava o uso das pimentas entre as etnias indígenas locais nas formas de caldo e salsa de frutos frescos (BARBOSA et al., 2002). Apesar da espécie Capsicum chinense, ser encontrada fartamente no Norte e em parte do Sudeste do país, há pouca disponibilidade de informação científica sobre sua morfologia e outros caracteres que possam torná-las de grande valor em programas de melhoramento. Esse trabalho teve como objetivo avaliar acessos de pimenta da espécie C. chinense, através de descritores morfológicos para o gênero Capsicum e marcadores moleculares utilizando a técnica de faflp. Os resultados fornecerão subsídios para a seleção de genitores com características agronômicas superiores, além de facilitar a identificação de acessos duplicados em bancos de germoplasma e coleções de trabalho. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Importância econômica das pimentas Segundo ADAMS (2006), a FAO relatou para o ano de 2003, que a produção mundial é liderada pela China, com 8,2 milhões de toneladas anuais com área cultivada

14 3 de hectares, seguida do México com 2 milhões de toneladas em uma área de hectares. Dentre as espécies cultivadas, C.annuum é a mais conhecida e a que apresenta maior importância econômica e distribuição mundial (PICKERSGILL, 1969). No Brasil são cultivados anualmente cerca de 13 mil ha de pimentas e pimentões, gerando uma produção estimada em 280 mil toneladas, sendo ha, ocupados com pimentas doces e picantes (REIFSCHNEIDER et al., 1998; HENZ, 2004), sem contudo haver informação fidedigna sobre o volume produzido. Esses dados sugerem, quando comparados com o tamanho da área cultivada na China, que, embora haja uma tradição de cultivo e consumo de pimentas no Brasil, independentemente de sua importância como centro de dispersão de espécies como C. baccatum e C. chinense, a produção no país apresenta pouca relevância no cenário mundial das pimentas. Esse quadro possivelmente está sendo revertido pela importância recente que as pimentas alcançam como umas das poucas hortaliças nacionais exportadas e pela sua associação com pequenas agroindústrias de conserva. Informações mais atuais da Embrapa Hortaliças dão conta da produção anual de 75 mil toneladas de pimentas em uma área de cerca de ha em todo o país, sendo, Minas Gerais, São Paulo, Rio Grande do Sul e Bahia os principais produtores (PANORAMA RURAL, 2006). Na tentativa de atualizar os dados de comercialização de pimentas no Estado de São Paulo, a CEAGESP, maior entreposto comercial de hortaliças da América Latina, registrou para o ano de 2004, um total comercializado de 3.864,67 toneladas (LUZ et al., 2006). Tamanha discrepância entre a estimativa de produção e o que efetivamente é registrado comprovam a alta informalidade na comercialização e a exiguidade de registros estatísticos sobre essa cultura. O cultivo de pimentas, segundo a Embrapa Hortaliças, desde o preparo do solo até a colheita, gera de três a quatro empregos diretos, com uma renda bruta que oscila entre R$ 4 e 12 mil/ha/ano (PANORAMA RURAL, 2006). Como boa parte da produção é processada em pequenas e médias agroindústrias, esses valores tendem a ser bem maiores, tanto em termos de emprego de mão-de-obra, quanto de geração de renda.

15 4 2.2 Origem e evolução O centro de origem das pimentas são as Américas (REIFSCHNEIDER, 2000), destacando-se as regiões tropicais. Para MARTIN et al. (1979) o centro de origem de C. annuum é o México e C. frutescens estaria distribuído amplamente nas Américas tropical e sub-tropical. C. baccatum teria a América do Sul como centro de dispersão e C. pubescens, conhecida popularmente como rocoto provavelmente foi dispersada a partir dos Andes. C. chinense estaria dispersa em toda a América tropical, sendo a espécie mais comum na Amazônia (HEISER, 1979). A Amazônia é reconhecida como importante centro secundário de espécies domesticadas de Capsicum sendo C. chinense, provavelmente, a mais importante espécie cultivada a Leste dos Andes. A área de maior diversidade é a bacia Amazônica sendo os indígenas desta região, os responsáveis pela domesticação da espécie (REIFSCHNEIDER, 2000). Por sua vez, PICKERSGILL (1971) também aponta a Amazônia como provável centro de diversidade da espécie de pimenta C. chinense. Embora com registros de cultivo muito antigo nas Américas, HEISER (1979) relatou que o cultivo das pimentas começou de forma independente em muitas áreas, empregando diferentes progenitores selvagens. A domesticação resultou em mudanças nos frutos, particularmente, que eram pequenos, eretos, decíduos e vermelhos e se tornaram maiores, pendentes, não decíduos e com uma grande diversidade de cores. Frutos doces só assumiriam maior importância posteriormente. 2.3 Classificação botânica e características peculiares às pimentas Segundo BOSLAND & VOTAVA (1999) a mais recente descrição taxonômica das pimentas é a seguinte: Reino: Plantae Divisão: Magnoliophyta

16 5 Classe: Magnoliopsida Ordem: Solanales Família: Solanaceae Gênero: Capsicum A Tabela 1 apresenta as espécies de Capsicum descritas atualmente. Destas, apenas cinco são reconhecidas como domesticadas, de acordo com REIFSCHNEIDER (2000). Tabela 1. Espécies de Capsicum reconhecidas atualmente. Espécies C. annuum C. baccatum var. aviculare var. baccatum var. annuum* var. pendulum* C. buforum C. campylopodium C. cardenasii C. chacoense C. chinense* C. ciliatum C. coccineum C. cornutum C. dimorphum C. dusenii C. eximium C. frutescens* var. tomentosum C. galapagoense C. geminifolium C. hookerianum C. lanceolatum C. leptopodum C. minutiflorum C. mirabile C. parviflorum C. praetermissum C. pubescens* C. schottianum C. scolnikianum C. tovarii var. flexuosum C. anomalum** C. villosum C. brevifolium*** Fonte: adaptada de IBPGR (1983), citado por BOSLAND & VOTAVA (1999);* espécies domesticadas; ** espécie separada em seção chamada Tubocapsicum; *** espécie separada em seção chamada Pseudoacnistus.

17 6 O nome da espécie, Capsicum chinense, conferido pelo físico holandês Kikolaus von Jacquinomist surgiu de um equívoco, quando este considerava ser a espécie originária da China, mesmo que à época, fosse sabido que todas as espécies de Capsicum eram originárias do hemisfério ocidental (BOSLAND & VOTAVA, 1999). A espécie apresenta originalmente a seguinte descrição botânica, segundo SMITH & HEISER (1957): Capsicum sinense Jacques (sinônimo de C. chinense), Hort. Vind., 3:38, t. 67, Plantas com 45 a 76 cm de altura. Folhas e ramos essencialmente glabros, raramente com denso e pequena pubescência, folhas ovadas a ovado-lanceoladas de 10,5 cm, largas, macias ou rugosas, de tonalidades verde claro a escuro. As flores aparecem de 3 a 5 por nó, exceto em plantas depauperadas. O pedicelo é pendente, raramente ereto, relativamente curto e grosso na antese. Cálice sem dentes com forte constrição na base e raramente sem constrição. Corola verdeamarelada ou raramente esbranquiçada, medindo de 0,5 a 1,0 cm de comprimento. Anteras azuis, púrpuras ou amareladas (Figura 1). Os frutos variam de 1,0 a 12,0 cm de comprimento, com formas variáveis, de esféricas a alongadas, pouco ou muito enrugados, de cores salmão, laranja, amarela, vermelha ou marrom (Figura 2). A margem da semente é sempre ondulada e raramente suave. Figura 1. Flores com anteras lilás e amarelas de Capsicum chinense Figura 2. Frutos de Capsicum chinense.

18 7 Diversos autores concordam que a principal distinção morfológica entre C. chinense e as demais espécies cultivadas, além da coloração da corola, é a presença de constrição anelar localizada no cálice em sua união com o pedicelo (NUEZ-VIÑALS, 2003; CARVALHO et al., 2003). A Figura 3 mostra a ocorrência da constrição anelar supracitada. Ausência de constrição Cálice com constrição anelar Figura 3. Cálice com apresentação de constrição anelar (direita) exclusiva da espécie Capsicum chinense. Os componentes principais, responsáveis pelo sabor picante e também pelas atividades biológicas atribuídas às pimentas, são os capsaicinóides (até 1% na matéria seca do fruto), sendo a capsaicina e a dihidrocapsaicina os mais importantes (Figura 4). Destacam-se ainda o teor de carotenóides, associados à cor vermelha, e a presença de ácido ascórbico. (SIMÕES et al., 2004). Os capsaicinóides são produzidos em um tecido interno denominado placenta, ao longo do qual são dispostas as sementes. Capsaicina Dihidrocapsaicina Figura 4. Estruturas químicas da capsaicina e dihidrocapsaicina.

19 8 WAGNER (2003), afirmou que, segundo trabalhos relacionados ao tipo de herança genética na determinação da pungência e o número de enzimas que participam da via biossintética da capsaicina, seria lógico esperar a ocorrência de um complexo poligênico responsável pela expressão desse caráter, cuja base genética possui como elementos principais, a existência de dois locos com ação epistática duplodominante, responsáveis não apenas pela pungência, mas também pela presença de moduladores que causam variação contínua na sua expressão. A autora ainda ressalta haver uma forte contribuição do fator ambiental sobre a expressão dessa característica em Capsicum. 2.4 Melhoramento genético O ser humano primitivo das Américas foi o primeiro a selecionar variedades de pimenta, a partir de ancestrais silvestres, ou a realizar intercâmbio de germoplasma. O conhecimento atual dessa cultura, que sempre fez parte da dieta dos silvícolas americanos adquiriu extremamente relevância na culinária do velho mundo, especialmente no continente asiático. No Brasil, apesar do uso comum, algumas espécies de Capsicum são desconhecidas ou ainda não caracterizadas morfológico e agronomicamente, o que, segundo BIANCHETTI (1996) representa um material genético que pode potencialmente ser empregado em programas de melhoramento. O melhoramento das pimentas é similar aquele utilizado com outras solanáceas. A espécie pode ser cruzada facilmente. A busca de variedades resistentes a doenças, principalmente viroses tem sido o alvo preferencial dos melhoristas de Capsicum. Maior ênfase tem sido dada aos tipos doces em comparação aos pungentes. Híbridos F 1, plantas haplóides e poliplóides, e inclusive, plantas apresentando macho-esterilidade citoplasmática são ferramentas reais ou potenciais a disposição dos melhoristas de pimentas. A base genética do Gênero Capsicum não é tão estreita como em muitas

20 9 outras culturas e um grande número de variedades tropicais ainda não foi explorado (HEISER, 1979). As pimentas do gênero Capsicum são diplóides (2n = 24 cromossomos) e autógamas, embora a polinização cruzada realizada por abelhas e outros insetos possa chegar a 40%, bem acima dos 5% registrados em condições normais (MARTÍN et al., 1979). Esses autores relataram que, embora haja um forte apelo para o melhoramento visando resistência a viroses e outras doenças, considerável interesse tem sido expresso na busca de novas cultivares tendo os frutos como foco principal (tamanho, forma, teor de capsaicina, cor, firmeza, teor de vitamina, uniformidade da maturação), além da adaptação da planta para colheita mecânica. O melhoramento de pimentas no Brasil nunca atingiu a relevância dada à outra espécie de Capsicum, o pimentão. Segundo REIFSCHNEIDER (2000), as pimentas mais plantadas no Brasil são consideradas variedades botânicas ou grupos varietais, com frutos bem definidos. As diferenças existentes dentro desses grupos estão relacionadas às diferentes fontes de obtenção de sementes. A cultivar Agronômico 11, tipo Americana e a cultivar Ubatuba, tipo Cambuci seriam exceções, por serem resultados de um programa de melhoramento desenvolvido pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Programa em andamento na Embrapa Hortaliças busca o desenvolvimento de cultivares de pimenta picante do tipo Jalapeño, para processamento industrial. 2.5 Conservação da diversidade genética de C. chinense na Amazônia Somente a partir do final do século passado, esforços de países caribenhos e latinos foram iniciados no sentido de resguardar a riqueza em diversidade genética de Capsicum ainda encontrada com populações tradicionais, como ribeirinhos, índios e pequenos agricultores (HERNANDEZ, 2002; CARVALHO et al., 2003; ADAMS, 2004).

21 10 Para HOYT (1992), é essencial que, para a sobrevivência do ser humano na Terra, sejam envidados esforços na conservação dos recursos genéticos, de modo a torná-los disponíveis para programas de melhoramento que visem à produção de culturas novas e melhoradas, com as quais se poderá contar no futuro. CASALI & COUTO (1984) afirmaram que a maior diversidade de C. chinense, estaria na bacia amazônica, muito embora, sejam raras as ações regionais para conservação dessa espécie. A coleta de morfotipos e a conservação em bancos de germoplasma, além de pequenas coleções de trabalho, aliadas à conservação in situ realizada informalmente por populações tradicionais da região, são, atualmente, as atividades conservacionistas realizadas com o germoplasma de pimentas da Amazônia. Programas estruturados de conservação genética e melhoramento não existem, devido à dispersão e a exiquidade de grupos de pesquisa, aliados à dificuldade de locomoção natural de uma região tão vasta e carente de vias convencionais de transporte. 2.6 Caracterizações morfológica e molecular Embora o Brasil seja reconhecido como habitat natural de várias espécies silvestres de pimentas do gênero Capsicum, ainda há pouco conhecimento biológico e ecológico dessas espécies. Por exemplo, na Amazônia, C. chinense é muito utilizada pela população local, mas há poucas referências científicas sobre a morfologia e a variabilidade existente dessa espécie. Uma solução importante seria a caracterização morfológica aliada à molecular de indivíduos da população de C. chinense, uma vez que esse estudo é capaz de fornecer as informações sobre os acessos silvestres e domesticados para o uso em programas de melhoramento genético. Para ARRIEL (2004), apesar dos caracteres morfológicos serem amplamente usados na caracterização da diversidade, a combinação com os marcadores moleculares poderia fornecer um quadro mais completo para o agrupamento de genótipos e o planejamento de cruzamentos no melhoramento genético vegetal. Baseando-se na morfologia floral, PICKERSGILL (1977) relatou que a caracterização morfológica de acessos tem sido utilizada por anos como a forma mais

22 11 usual de estudar a variabilidade genética das pimentas. PICKERSGILL (1988) relatou que apenas com base na morfologia floral, pode ser constatado que as espécies C. frutescens, C. chinense e C. annuum estão agrupadas e distantes da espécie C. baccatum. BIANCHETTI (1996) estudando aspectos morfológicos, ecológicos e biogeográficos de 10 taxa de Capsicum nativos do Brasil, ressaltou que características ecológicas e morfológicas, em conjunto, são importantes para a discriminação de diferentes categorias de domesticação das pimentas. TEIXEIRA (1996), estudando aspectos morfológicos e moleculares de acessos silvestres e domesticados de Capsicum do Brasil, concluiu que a análise molecular apresentou maior contribuição para a discriminação dos acessos em relação à caracterização morfológica. As relações evolutivas entre e dentro das espécies de Capsicum foram investigadas por meio de marcadores morfológicos, citogenéticos e moleculares, demonstrando sempre, segundo CORONA-TORRES et al. (2000), que o nível de variação entre as pimentas domesticadas seria menor que entre as espécies silvestres. Para KONSTANTINOV et al. (2005), aplicações possíveis de marcadores moleculares em coleções de germoplasma incluem: identificação e verificação de velhos e novos acessos coletados, detecção de duplicatas, análise de pureza genética, análise de diversidade genética, construção de coleções de base e seleção de genes de interesse agronômico. Além disso os marcadores moleculares poderiam ser usados para monitoramento da viabilidade e mudanças genéticas decorrentes de armazenagem em baixa temperatura por longo tempo e avaliação da estrutura e função do genoma em processos evolucionários nas plantas cultivadas. Tradicionalmente, a caracterização de pimentas é feita com descritores morfológicos estabelecidos pelo IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute). Mais recentemente, estudos relacionados com a análise da diversidade genética e a evolução do grupo das pimentas estão sendo realizados com base não só na morfologia da planta, mas, na citologia e no DNA genômico. Tais estudos, em geral,

23 12 têm ratificado a identificação prévia das espécies por meio da morfologia floral (PRINCE et al., 1995). As informações geradas pelos marcadores moleculares têm tornado possível adquirir conhecimentos adicionais sobre a estrutura e organização do genoma das plantas, como também sobre a evolução desses genomas vegetais através da análise filogenética (CERVERA et al., 1996). Para KARP et al. (1996), dentre os marcadores moleculares de DNA mais usados, pode-se destacar, polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphisms), DNA polimórfico amplificado ao acaso (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA), polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism), minissatélites também conhecidos como número variável de seqüências repetidas umas após as outras (VNTR - Variable Number of Tandem Repeats), microssatélites também conhecidos como sequências simples repetidas (SSR - Simple Sequence Repeats) ou sequências curtas repetidas umas após as outras (STR - Short Tandem Repeats) e a região amplificada de sequência caracterizada (SCAR - Sequence Characterized Amplified Region). Marcadores AFLP constituem uma tecnologia recente, que, segundo FERREIRA & GRATTAPAGLIA (1998) combina a especificidade, resolução e poder de amostragem da digestão com enzimas de restrição com a velocidade e praticidade de detecção dos polimorfismos via PCR (Polymerase Chain Reaction - Reação de Polimerase em Cadeia). O uso da metodologia inclui a identificação de genótipos (fingerprinting), o mapeamento genético localizado e a construção de mapas genéticos em plantas cultivadas. O AFLP permite a obtenção de grande número de marcas informativas, identifica alelos homozigotos ou heterozigotos, gera padrões de bandeamento reprodutíveis e permite uma grande cobertura genômica (até 100 bandas por gel), sendo considerados bons marcadores para mapeamento, identificação de genótipos e cálculo de distância genética (VOS et al., 1995).

24 13 3 REFERÊNCIAS ADAMS, H. The regional hot pepper germoplasm collection. Disponível em: < Acesso em 01 de março de ADAMS, H. Hot pepper production in the CARICOM sub-region. Disponível em: < Acesso em 10 de setembro de ARRIEL, N. H. C. Diversidade genética em gergelim (Sesamum indicum L.) a partir de marcadores moleculares (RAPD) e caracteres morfológicos e agronômicos. 2004, 114 f. Tese (Doutorado em agronomia) Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias: Jaboticabal, BARBOSA, R. I.; LUZ, F. J. de F.; NASCIMENTO FILHO, H. R.; MADURO, C. B. Pimentas do gênero Capsicum cultivadas em Roraima, Amazônia brasileira. I. Espécies domesticadas. Acta Amazônica, v. 32, p , BIANCHETTI, L. B. Aspectos morfológicos, ecológicos e biogeográficos de dez táxons de Capsicum (Solanaceae) ocorrentes no Brasil f. Dissertação (Mestrado em Botânica) - Universidade de Brasília: Departamento de Botânica do Instituto de Ciências Biológicas: Brasília, BOSLAND, P. W.; VOTAVA, E. J. Peppers: vegetable and spice Capsicums, New York: CABI Publishing, p CARVALHO, I. C. de C.; BIANCHETTI, L. de B.; BUSTAMANTE, P. G.; SILVA, D. B. da. Catálogo de germoplasma de pimentas e pimentões (Capsicum spp.) da Embrapa

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29 18 CAPÍTULO 2 - CARACTERIZAÇÃO DE ACESSOS DE C. chinense POR MEIO DE DESCRITORES MORFOLÓGICOS RESUMO A Amazônia é reconhecida como provável centro de diversidade de pimentas da espécie Capsicum chinense, sendo essa hortaliça muito comum na culinária local. Apesar de importante para a região, poucas são as referências científicas sobre a morfologia e a variabilidade existente nessa espécie publicadas. A caracterização morfológica de populações cultivadas e silvestres da espécie, fornecerão informações valiosas para uso em programas de melhoramento genético. Foram caracterizados 58 acessos de pimentas provenientes de uma coleção de trabalho mantida pela Embrapa Roraima, a partir da aplicação de 61 descritores morfológicos para Capsicum, estabelecidos pelo IPGRI, com algumas alterações. A análise dos dados foi feita pelo Programa Genes, seguido pelo agrupamento e a comparação dos valores obtidos a partir do complemento aritmético do índice de dissimilaridade de COLE-RODGER. Foi gerada uma matriz de dissimilaridade, que originou por meio do método hierárquico do vizinho mais próximo, o dendrograma com seis agrupamentos e grande número de acessos não agrupados, 39% do total. Observou-se uma dissimilaridade média de 50% com valores acima de 70% para alguns morfotipos, demonstrando haver uma alta variabilidade entre os mesmos, considerando os descritores morfológicos analisados Palavras-Chave: diversidade genética, morfologia, Capsicum chinense Jacq.

30 19 1 INTRODUÇÃO As pimentas constituem um grupo muito peculiar pelo seu sabor, doce ou picante e por estimular as funções digestivas, sendo parte da dieta de um quarto da população do planeta (TEIXEIRA, 1996). O continente americano é reconhecido como o centro de origem das pimentas, mais especificamente em suas regiões tropicais (REIFSCHNEIDER, 2000). O gênero Capsicum possui de 20 a 25 espécies silvestres e cinco espécies domesticadas (McLEOD et al., 1983). A Amazônia é apontada por PICKERSGILL (1971) como provável centro de diversidade da espécie C. chinense, que é objeto desse trabalho. No Brasil, algumas espécies de pimentas silvestres e domesticadas não estão devidamente caracterizadas, representando um material genético, com grande potencial para emprego em programas de melhoramento (BIANCHETTI, 1996). Baseando-se na morfologia floral, PICKERSGILL (1977) relatou que a caracterização morfológica de acessos tem sido utilizada por anos como a forma mais usual de estudar a variabilidade genética das pimentas. Relatou ainda, que, apenas com base na morfologia floral, pode ser constatado que as espécies C. frutescens, C. chinense e C. annuum estão agrupadas e distantes da espécie C. baccatum. A descrição de Capsicum chinense foi revisada a partir de materiais oriundos das Américas Central e do Sul, analisados por SMITH & HEISER (1957). Inicialmente a espécie denominava-se Capsicum sinense Jacques (1776). As plantas analisadas pelos revisores apresentavam entre 1,5 a 2,5 m de altura, folhas e ramos glabros, três a cinco flores por nó, pedicelos declinados, raramente eretos, constrição curta e grossa na base do cálice, corola amarelo-esverdeada, raramente branca, de 0,5 a 1,0 cm de comprimento, anteras azuis, púrpuras ou amarelas, frutos variando de 1,0 a 12,0 cm de comprimento com formato esférico a alongado, de cor alaranjada, salmão, vermelha. Essa descrição confirma a grande possibilidade de variantes morfológicos dentro da espécie, o que confere com a grande quantidade de morfotipos existentes para C. chinense.

31 20 A caracterização morfológica dos organismos corresponde à base de todo e qualquer estudo, uma vez que a primeira determinação de um ser começa pelo seu fenótipo, ou seja, pela sua aparência geral do ponto de vista morfológico (CHIES & LONGHI-WAGNER, 2003). O uso de descritores para caracterização permite uma discriminação rápida e fácil entre fenótipos. Características morfológicas de alta herdabilidade podem ser facilmente observados com os olhos e são igualmente, expressas em ambientes variados (IPGRI, 1995). Para ARRIEL (2004), na maioria das espécies, tradicionalmente, os estudos de caracterização e divergência genética têm sido baseados em marcadores morfológicos e caracteres quantitativos. Os caracteres morfoagronômicos, apesar de fácil monitoramento, dependem do desenvolvimento da planta e podem ser influenciados pelo ambiente (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Para ARRIEL (2004), as variáveis relacionadas a aspectos morfológicos e estruturais da planta apresentam mais de uma categoria, e apesar de se atribuirem valores numéricos a cada categoria distinta, estas, não podem ser agrupadas. O que levaria à dificuldade na avaliação da dissimilaridade entre os genótipos quando dados de natureza diferentes estão envolvidos. Nesses casos, COLE-RODGERS et al., (1997) propuseram uma forma simples de estimar a dissimilaridade para um conjunto de variáveis multicategóricas, em que o índice de similaridade pode ser estabelecido em função da concordância e discordância, permitindo uma análise combinada, que envolve todas as características consideradas, qualitativas e quantitativas. O uso de dados multicategóricos, como o método hierárquico do vizinho mais próximo foi usado por SUDRÉ et al. (2006) para inferir a divergência genética de 59 acessos de Capsicum, resultando na obtenção de 16 grupos distintos, o que, segundo os autores, comprovaria a eficácia desse método para agrupar os acessos com pequena distância genética entre si. A coleta de dados multicategóricos é uma prática mais econômica e demanda menos tempo em relação a dados moleculares. SUDRÉ et al. (2005) estudando técnicas multivariadas aplicadas para avaliar a divergência genética a partir de caracteres morfoagronômicos entre 56 acessos de Capsicum spp., concluíram que o método hierárquico do vizinho mais próximo foi

32 21 adequado para realizar o agrupamento de diferentes espécies e até mesmo de variedades de pimentas dentro da mesma espécie botânica. A variabilidade genética observada nos genótipos da coleção, segundo os autores, foi suficiente para indicar o uso dos acessos avaliados em programas de melhoramento. Embora o Brasil seja reconhecido como habitat natural de várias espécies silvestres de pimentas do gênero Capsicum, ainda há pouco conhecimento biológico e ecológico sobre essas espécies. Por exemplo, na Amazônia, C. chinense é muito utilizada pela população local, mas há poucas referências científicas sobre a morfologia e a variabilidade existente nessa espécie. Uma solução importante seria a caracterização morfológica de populações cultivadas e silvestres da espécie, fornecendo informações valiosas para uso em programas de melhoramento genético. Segundo PICKERSGILL (1997), a diversidade genética entre as várias espécies domesticadas de Capsicum tem sido pouco explorada e ainda está longe de ser esgotada. Esse trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética através de marcadores morfológicos de morfotipos de C. chinense provenientes de uma coleção de Capsicum da Embrapa Roraima. Os resultados fornecerão subsídios para a seleção de genitores com características agronômicas superiores, além de facilitar a identificação de acessos duplicados na referida coleção. 2 MATERIAL E MÉTODOS O plantio dos acessos foi realizado em casa de vegetação na horta do Setor de Olericultura e Plantas Aromático-Medicinais da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (UNESP - FCAV), Campus de Jaboticabal, São Paulo. O município fica situado a 21 o S de Latitude e 48 o W de Longitude, com altitude de 595 m e o clima, segundo a classificação de Köppen, de transição entre os tipos Cwa (quente, com inverno seco) e Aw (tropical, com inverno seco). O solo utilizado para o plantio foi do tipo Latossolo Vermelho Eutrófico de textura argilosa. O resultado da análise química do solo consta na Tabela 1. O preparo do solo foi feito de modo convencional,

33 22 com uma aração, uma gradagem para destorroamento e a formação de canteiros com rotoencanteirador. A adubação de plantio por hectare foi de: 160 kg de P 2 O 5, 3 kg de zinco, 1 kg de boro e 10 kg de enxofre. Adubações com 40 kg de N e 120 kg de K 2 O, foram parceladas em quatro aplicações iguais, uma no plantio e três em cobertura aos 30, 45 e 60 dias após o transplantio. Tabela 1. Análise química do solo da área experimental. UNESP - FCAV, PH em M.O. P resina K + Ca 2+ Mg 2+ H + Al SB CTC V CaCl 2 g/dm 3 mg/dm 3 mmol c /dm 3 % 6, , Os acessos utilizados estão relacionados na Tabela 1. A semeadura foi realizada em bandejas de poliestireno expandido com 128, células mantida em estufa sob cobertura plástica. Aos 60 dias da semeadura, cinco plantas de cada acesso foram transplantadas para casa de vegetação, obedecendo ao espaçamento de 1 m entre plantas para o mesmo acesso e 1,5 m entre as fileiras simples e entre os diferentes acessos. Seguindo metodologia relatada por CARVALHO et al. (2003), utilizaram cinco plantas de cada acesso para a caracterização. Visando à obtenção de genótipos mais homogêneos, foi realizada autofecundação de dez flores para cada planta no estágio imediatamente anterior à antese, conseguindo-se, pelo menos cinco frutos de cada planta, sendo selecionados ao acaso 10 frutos para a continuidade do procedimento de caracterização morfológica. Na fase de maturação, foram coletados os frutos, devidamente fotografados e com suas sementes extraídas manualmente e secadas em temperatura ambiente, à sombra, por 72 horas. As sementes foram embaladas em sacos de papel com identificação do acesso e conservadas em câmara fria a 4 o C, após serem acondicionadas em sacos aluminizados hermeticamente fechados.

34 23 Tabela 2. Identificação de 58 acessos de pimenta (Capsicum chinense) da coleção da Embrapa Roraima Código Nome popular Procedência Lat N/S Long W Código Nome popular Procedência Lat N/S Long W RR 001 Murupi laranja, alongada, PA Uiramutã 04 o 35' 44" N 60 o 10' 04" RR 112 Murupi vermelha, alongada, PM Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 003 Canaimé vermelha, triangular, PA Uiramutã 04 o 35' 44" N 60 o 10' 04" RR 123 Olho de mutum vermelha, triangular, PB Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 006 P. cheiro amarela, retangular, PA Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 125 P. vermelha alongada, PA Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 011 Malaguetão vermelho, alongado, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 127 Olho de Mutum vermelha, arredondada, PA Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 019 P. vermelha, campanulada, doce Caroebe 00 o N 59 o 41' 44" RR 134 P. vermelha, triangular, PA Mucajaí 02 o 25' 48'' N 60 o 54' 00'' RR 021 Murupi salmão, alongada, PB Mucajaí 02 o 25' 48'' N 60 o 54' 00'' RR 139 P. vermelha, alongada, doce Mucajaí 02 o 25' 48'' N 60 o 54' 00'' RR 026 Peão Vermelha, triangular, doce Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 144 Prikanka vermelha, triangular, PM Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 029 P. de Mesa salmão, triangular, PB Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 422 P. Bode vermelha, achatada, PB Brasília/DF 15 o 50' 16'' N 47 o 42' 48'' RR 033 P. de Cheiro amarela, alongada, PB Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 432 P. Bode laranja, achatada, PM Brasília/DF 15 o 50' 16'' N 47 o 42' 48'' RR 036 Murupi salmão, alongada, PB Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 442 P. cumari do Pará amarela, triangular, PA Brasília/DF 15 o 50' 16'' N 47 o 42' 48'' RR 039 P. Murici salmão, triangular, PA Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 452 Curupira vermelha, alongada, PM Mucajaí 02 o 25' 48'' N 60 o 54' 00'' RR 040 P. varmelha, triangular, doce Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 472 Murupi vermelha, alongada, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 041 P. de Cheiro vermelha, triangular, PM Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 482 Murupi amarela, alongada, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 042 P. de Passarinho amarela, Arredondada, PA Cantá 02 o 36' 37" N 60 o 35' 51" RR 492 Peão grande vermelha, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 044 Malaguetão vermelha, alongada, PA Cantá 02 o 36' 37" N 60 o 35' 51" RR 502 Peão de cheiro vermelha, triangular, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 047 Olho de Carangueijo laranja, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 512 Peão amarela, triangular, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 048 Olho de Cará amarela, triangular, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 522 Espora de galo laranja, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 049 Olho de mutum vermelha, campanulada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 532 Olho de peixe amarela, arredondada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 051 P. de Cheiro vermelha, campanulada, doce Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 542 P. de cheiro vermelha, arredondada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 058 P. amarela, triangular, PA Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 552 Olho de peixe amarela, arredondada, PA Amajari 03 o 39' 08" N 61 o 22' 14" RR 062 P. de Cheiro vermelha, alongada, PM Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 562 Peão amarela, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 063 Murupi salmão, alongada, PA Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 572 Peão de cheiro amarela, campanulada, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 066 P. laranja, alongada, PB Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 582 Olho de peixe amarela, arredondada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 076 Pimenta vermelha, alongada, doce Bonfim 03 o 21' 35'' N 59 o 50' 00'' RR 592 P. de cheiro vermelha, alongada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 077 P. Canaimé, vermelha, campanulada, PA Bonfim 03 o 21' 35'' N 59 o 50' 00'' RR 612 Murupi amarela, alongada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 079 Olho de peixe laranja, triangular, PA Bonfim 03 o 21' 35'' N 59 o 50' 00'' RR 622 Olho de peixe laranja, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 108 P. cheirosa vermelha, triangular, PM Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 632 Olho de peixe amarela, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 110 Malaguetão vermelha, triangular, PA Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 652 Malaguetão laranja, alongada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 111 Olho de peixe salmão, arredendada, PA Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 662 P. de cheiro vermelha, triangular, doce Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" PA: pungência alta; PM: pungência média; PB: pungência baixa A caracterização morfológica foi realizada segundo descritores para Capsicum, estabelecidos pelo IPGRI (1995), com algumas alterações sugeridas por CARVALHO et al. (2003), de modo a tornar mais acessível e prática a tomada de dados. Os descritores utilizados, devidamente numerados, e os valores associados aos mesmos estão descritos abaixo: PLÂNTULA 1. Cor do hipocótilo: 1 ( ) branca; 2 ( ) verde; 3 ( ) roxo

35 24 2. Pubescência do hipocótilo: 1 ( ) esparsa; 2 ( ) intermediária; 3 ( ) densa 3. Cor da folha cotiledonar: 1 ( ) verde clara; 2 ( ) verde; 3 ( ) verde escura; 4 ( ) violeta clara; 5 ( ) violeta; 6 ( ) violeta escura (roxa); 7 ( ) variegada; 8 ( ) amarela; 9 ( ) outra 4. Forma da folha cotiledonar: 1 ( ) deltóide; 2 ( ) ovada; 3 ( ) lanceolada; 4 ( ) elongada-deltóide PLANTA E CAULE 5. Cor do caule (haste): 1 ( ) verde; 2 ( ) verde com estrias violeta; 3 ( ) violeta 6. Presença de antocianina nodal (planta toda, adulta): 1 ( ) verde; 3 ( ) violeta claro; 5 ( ) violeta; 7 ( ) violeta escuro (roxo) 7. Forma do caule (haste): 1 ( ) cilíndrico; 2 ( ) anguloso; 3 ( ) chato; 8. Pubescência do caule (planta adulta, excluindo-se os dois primeiros nós antes da copa): 3 ( ) esparsa; 5 ( ) intermediária; 7 ( ) densa 9. Altura da planta (cm) plantas com frutos amadurecendo: 1 ( ) < 25; 2 ( ) 25-45; 3 ( ) 45-65; 4 ( ) 66-85; 5 ( ) > Hábito de crescimento da planta medida quando 50% dos frutos estiverem maduros: 3 ( ) prostrado; 5 ( ) intermediário (compacto); 7 ( ) ereto; 9 ( ) outro 11. Comprimento do dossel (largura da copa - cm) medido imediatamente após a primeira colheita, no ponto mais largo: 1 ( ) até 80; 2 ( ) ; 3 ( ) ; 4 ( ) > Comprimento da haste (altura do caule - cm) altura da primeira bifurcação, medido imediatamente após a primeira colheita: 1 ( ) até 15; 2 ( ) 15 30; 3 ( ) 30 50; 4 ( ) > Diâmetro da haste (cm) medida da parte média da haste abaixo da primeira bifurcação, tomada imediatamente após a primeira colheita: 1 ( ) até 1; 2 ( ) 1 2; 3 ( ) 2 3; 4 ( ) > Densidade da ramificação: 3 ( ) esparsa; 5 ( ) intermediária; 7 ( ) densa

36 Brotação abaixo da primeira bifurcação: 1 ( ) ausente; 3 ( ) esparsa; 5 ( ) intermediária; 7 ( ) densa 16. Densidade da folhagem média de 5 plantas maduras: 3 ( ) esparsa; 5 ( ) intermediária; 7 ( ) densa FOLHAS: Todas as medidas foram tomadas quando em 50% das plantas os primeiros frutos começaram a amadurecer. Média de 10 folhas maduras retiradas dos ramos da planta. 17. Cor da folha: 1 ( ) amarela; 2 ( ) verde clara; 3 ( ) verde; 4 ( ) verde escura; 5 ( ) violeta clara; 6 ( ) violeta (roxa); 7 ( ) mesclada; 8 ( ) verde com antocianina 18. Forma da folha: 1 ( ) deltóide; 2 ( ) ovalada; 3 ( ) lanceolada 19. Margem da lâmina: 1 ( ) inteira; 2 ( ) ondulada; 3 ( ) ciliada 20. Pubescência da folha: 3 ( ) esparsa; 5 ( ) intermediária; 7 ( ) densa 21. Comprimento da folha madura (cm): 1 ( ) até 5; 2 ( ) >5 a 10; 3 ( ) > 10 a 15; 4 ( ) acima de Largura da folha madura - parte mais larga (cm): 1 ( ) até 3; 2 ( ) >3 a 6; 3 ( ) > 6 a 9; 4 ( ) acima de 9 FLORES: medidas com flores totalmente abertas nas primeiras florações 23. Dias para o florescimento medido da semeadura até que pelo menos metade das plantas tivessem no mínimo, uma flor aberta: 1 ( ) até 30; 2 ( ) 31 60; 3 ( ) 61 90; 4 ( ) acima de Número de flores por axila: 1 ( ) uma; 2 ( ) duas; 3 ( ) três ou mais; 4 ( ) muitas com entrenó curto; 5 ( ) uma e duas; 6 ( ) uma, duas e três ; 7 ( ) duas e três; 8 ( ) duas, três e quatro 25. Posição da flor medida na antese: 3 ( ) pendente; 5 ( ) intermediária; 7 ( ) ereta; 9 ( ) todas; 11 ( ) intermediária e ereta; 13 ( ) intermediária e pendente

37 Cor da corola: 1 ( ) branca; 2 ( ) amarelo clara; 3 ( ) amarela; 4 ( ) amarelo esverdeada; 5 ( ) outra 27. Forma da corola: 1 ( ) rotada; 2 ( ) campanulada; 3 ( ) intermediária 28. Comprimento da corola (cm) média de 10 pétalas dissecadas: 1 ( ) < 1,5; 2 ( ) 1,5 2,0; 3 ( ) > 2,0 29. Cor da antera observada no botão, antes da antese: 1 ( ) branca; 2 ( ) amarelo clara; 3 ( ) azul clara; 4 ( ) azul; 5 ( ) violeta (roxa); 6 ( ) amarelo com mancha azul clara 30. Cor do filamento observado logo na antese: 1 ( ) branco ; 2 ( ) amarelo; 3 ( ) verde; 4 ( ) azul; 5 ( ) violeta claro; 6 ( ) violeta (roxo); 7 ( ) azul violeta 31. Posição do estigma em relação à antera após a completa antese. Média de 5 estigmas de flores de 5 plantas ao acaso: 3 ( ) inserto (abaixo das anteras); 5 ( ) mesmo nível; 7 ( ) excerto (acima das anteras); 9 ( ) mesmo nível e excerto; 11 ( ) inserto e mesmo nível; 13 ( ) inserto e excerto 32. Pigmentação do cálice: 0 ( ) ausente; 1 ( ) presente 33. Margem do cálice: 1 ( ) inteira; 2 ( ) intermediária; 3 ( ) dentada 34. Constrição anelar do cálice observada na junção do cálice e do pedicelo na maturação completa do fruto: 0 ( ) ausente; 1 ( ) presente FRUTOS: tomados com frutos maduros na primeira colheita. 35. Dias para frutificação medido a partir do transplante quando 50 % das plantas estavam com frutos maduros nas primeira e segunda bifurcações: 1 ( ) até 60; 2 ( ) 61 a 90 ; 3 ( ) 91 a 120; 4 ( ) acima de Manchas ou estrias de antocianina tomados logo antes da maturação: 0 ( ) ausente; 1( ) presente 37. Cor do fruto no estádio intermediário tomado logo antes da maturação: 1 ( ) branco; 2 ( ) amarelo; 3 ( ) verde; 4 ( ) laranja; 5 ( ) violeta ; 6 ( ) violeta escuro (roxo); 7 ( ) amarelo esverdeado; 8 ( ) verde amarelado; 9 ( ) branco amarelado; 10 ( ) marrom; 11 ( ) três cores - especificar

38 Posição dos frutos: 3 ( ) pendente; 5 ( ) intermediária; 7 ( ) ereta; 9 ( ) todas; 11 ( ) pendente e intermediária; 13 ( ) pendente e ereto; 15 ( ) intermediária e ereta 39. Duração da frutificação ou carregamento da planta número de dias da primeira colheita até a última duração da frutificação: 1 ( ) até 150; 2 ( ) > 150 a 180; 3 ( ) acima de Cor do fruto no estádio maduro: 1 ( ) branco; 2 ( ) amarelo limão; 3 ( ) amarelolaranja pálido; 4 ( ) amarelo-laranja; 5 ( ) laranja pálido; 6 ( ) laranja ; 7 ( ) vermelho claro; 8 ( ) vermelho; 9 ( ) vermelho- escuro; 10 ( ) violeta; 11 ( ) marrom; 12 ( ) preto; 13 ( ) amarelo; 14 ( ) amarelo pálido; 15 ( ) salmão 41. Forma do fruto: 1 ( ) alongado; 2 ( ) arredondado; 3 ( ) triangular; 4 ( ) campanulado; 5 ( ) retangular (em bloco); 6 ( ) outro 42. Comprimento do fruto (cm) média do comprimento de 10 frutos maduros na segunda colheita: 1 ( ) até 1; 2 ( ) > 1 a 2 ; 3 ( ) > 2 a 4; 4 ( ) > 4 a 8; 5 ( ) > 8 a 12; 6 ( ) acima de largura do fruto (cm) medida na parte mais larga de 10 frutos maduros na segunda colheita: 1 ( ) até 1; 2 ( ) > 1 a 2,5 ; 3 ( ) > 2,5 a 5; 4 ( ) > 5 a 8; 5 ( ) acima de Massa de fruto (g) média da massa de 10 frutos maduros na segunda colheita: 1 ( ) até 1; 2 ( ) > 1 a 2 ; 3 ( ) > 2 a 4; 4 ( ) > 4 a 8; 5 ( ) > 8 a 12; 6 ( ) acima de Comprimento do pedúnculo (cm) média do comprimento de 10 pedúnculos na segunda colheita: 1 ( ) até 2; 2 ( ) > 2 a 4 ; 3 ( ) > 4 a 6; 4 ( ) acima de Espessura da parede do fruto (mm) média de 10 frutos maduros na segunda colheita, medido no ponto de maior largura: 1 ( ) até 1; 2 ( ) > 1 a 2 ; 3 ( ) > 2 a 3; 4 ( ) > 3 a 4; 5 ( ) > 4 a 5; 6 ( ) acima de Ombro do fruto na inserção do pedicelo: 1 ( ) agudo; 2 ( ) obtuso; 3 ( ) truncado; 4 ( ) cordato; 5 ( ) lobado 48. Pescoço na base do fruto: 0 ( ) ausente; 1 ( ) presente 49. Formato da ponta do fruto média de 10 frutos: 1 ( ) pontiagudo; 2 ( ) truncado (blunt); 3 ( ) afundado; 4 ( ) afundado com ponta

39 Apêndice na ponta do fruto: 0 ( ) ausente; 1 ( ) presente 51. Corrugação na seção transversal do fruto média de 10 frutos, medido há 1/3 do final do pedicelo: 3 ( ) levemente corrugado; 5 ( ) intermediário; 7 ( ) corrugado 52. Número de lóculos tomado de 10 frutos: 1 ( ); 2 ( ); 3 ( ); 4 ( ); 5 ( ) 53. Superfície do fruto: 1 ( ) liso; 2 ( ) semi-rugoso; 3 ( ) rugoso; 4 ( ) liso com estrias; 5 ( ) semi-rugoso com estrias 54. Persistência do fruto maduro em relação ao pedicelo: 3 ( ) pouco persistente; 5 ( ) intermediário; 7 ( ) persistente 55. Comprimento da placenta: 1 ( ) < ¼ do comprimento do fruto; 2 ( ) de ¼ a ½ do comprimento do fruto; 3 ( ) > ½ do comprimento do fruto 56. Pungência: 1 ( ) doce; 2 ( ) pungência baixa; 3 ( ) pungência média; 4 ( ) pungência alta 57. Aroma: 1 ( ) baixo; 2 ( ) médio; 3 ( ) alto SEMENTES 58. Superfície da semente: 1 ( ) lisa; 2 ( ) rugosa; 3 ( ) corrugada 59. Tamanho da semente (média de 10 sementes selecionadas ao acaso): 1 ( ) pequena até 3mm; 2 ( ) intermediária de 3 a 4mm; 3 ( ) grande acima de 4mm 60. Número de sementes por fruto - média de 10 frutos de 10 plantas selecionados ao acaso: 1 ( ) < 20; 2 ( ) 21-50; 3 ( ) > Segregação: 0 ( ) ausência de segregação; 1 ( ) frutos com formatos diferentes; 2 ( ) plantas com e sem entre-nós curtos; 3 ( ) frutos com cores diferentes; 4 ( ) fruto e planta com e sem; antocianina; 5 ( ) flores com cores diferentes; 6 ( ) frutos com posições diferentes; ( ) frutos com formatos e cores diferentes. A análise dos dados, o agrupamento pelo método do vizinho mais próximo e a geração do dendrograma foram realizados pelo Programa Genes (CRUZ, 2001). A análise de divergência entre os acessos, segundo os caracteres morfológicos descritos acima, foi realizada após o agrupamento e a comparação dos diferentes valores obtidos

40 29 a partir do complemento aritmético do índice de dissimilaridade de acordo com COLE- RODGER et al. (1997), citados por CRUZ & CARNEIRO (2003), baseando-se na seguinte expressão: D 1 d ii = C 1 + D 1 + D 2 C 2 + D 2 D v +. + = C v + D v v j = 1 D j C j + D j em que: d ii : valor que expressa a percentagem de dissimilaridade considerando a coincidência de valores das variáveis multicategóricas para cada par de acessos; C j : número de concordância entre categorias para a j-ésima variável multicategórica; D j : número de discordância entre categorias para a j-ésima variável multicategórica. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da avaliação dos descritores morfológicos aplicados aos acessos de pimenta são apresentados na Tabela 3.

41 30 Tabela 3. Valores dos descritores para Capsicum estabelecidos pelo IBPGR (1995), com alterações sugeridas por CARVALHO et al. (2003). Acessos Descritores

42 31 Continuação da Tabela 3 Acessos Descritores (continuação) A partir desses dados, foi gerada uma matriz de dissimilaridade, Tabela 4. Com base nos dados dessa matriz foi gerado por meio do método hierárquico do vizinho

43 32 mais próximo, o dendrograma com os agrupamentos constantes na Figura 3, onde, no eixo X, estão representadas as percentagens das distâncias entre os acessos e, no eixo Y, estão representados os 58 acessos. A maior dissimilaridade foi de 78%, entre os acessos 632 e 019Foram formados seis agrupamentos: grupo 1 - acessos 422 e 432; grupo 2 - acessos 026 e 048; grupo 3 - acessos 003 e 039; grupo 4 - acessos 502, 562, 512, 144; grupo 5 - acessos 019, 041, 077, 662, 029, 139, 001, 021, 066, 612, 062, 652, 472, 482, 572, 112, 063; grupo 6 acessos 532, 582, 552, 079, 622, 047, 042 e 111; os acessos 492, 033, 049, 040, 108, 592, 134, 127, 051, 442, 123, 006, 058, 110, 542, 076, 036, 011, 452, 522, 125, 044 e 632 aparecem na árvore de forma isolada.

44 33 Tabela 4. Divergência genética entre 58 acessos de C. chinense a partir de descritores morfológicos. UNESP - FCAV, , ,473 0, ,473 0,491 0, ,386 0,429 0,546 0, ,281 0,500 0,419 0,528 0, ,492 0,375 0,473 0,546 0,536 0, ,439 0,429 0,564 0,528 0,322 0,358 0, ,579 0,572 0,528 0,528 0,632 0,457 0,518 0, ,386 0,340 0,546 0,400 0,369 0,334 0,447 0,358 0, ,536 0,304 0,419 0,473 0,483 0,483 0,465 0,483 0,518 0, ,518 0,393 0,473 0,491 0,429 0,536 0,375 0,429 0,554 0,429 0, ,369 0,483 0,600 0,528 0,264 0,404 0,411 0,375 0,615 0,386 0,536 0, ,518 0,447 0,528 0,619 0,608 0,554 0,500 0,554 0,590 0,518 0,393 0,661 0, ,643 0,554 0,491 0,600 0,554 0,661 0,518 0,608 0,429 0,554 0,572 0,447 0,554 0, ,518 0,411 0,528 0,600 0,625 0,572 0,429 0,572 0,608 0,518 0,429 0,572 0,572 0,322 0, ,465 0,375 0,419 0,510 0,483 0,429 0,322 0,483 0,536 0,429 0,340 0,447 0,483 0,393 0,608 0, ,554 0,358 0,437 0,510 0,447 0,483 0,375 0,518 0,518 0,429 0,465 0,483 0,536 0,554 0,554 0,500 0, ,397 0,483 0,528 0,455 0,369 0,351 0,474 0,527 0,544 0,386 0,590 0,447 0,439 0,643 0,643 0,661 0,536 0, ,404 0,411 0,364 0,546 0,457 0,404 0,447 0,518 0,597 0,457 0,483 0,429 0,474 0,590 0,536 0,554 0,447 0,429 0, ,449 0,465 0,528 0,437 0,474 0,492 0,474 0,562 0,492 0,422 0,608 0,518 0,439 0,518 0,536 0,518 0,429 0,518 0,397 0, ,404 0,465 0,455 0,473 0,500 0,411 0,474 0,422 0,447 0,447 0,447 0,590 0,536 0,358 0,518 0,429 0,340 0,465 0,579 0,465 0, ,386 0,465 0,473 0,473 0,474 0,369 0,518 0,447 0,422 0,404 0,483 0,536 0,544 0,554 0,625 0,590 0,411 0,518 0,404 0,439 0,299 0, ,536 0,500 0,455 0,491 0,465 0,536 0,572 0,608 0,518 0,518 0,572 0,465 0,536 0,590 0,429 0,643 0,500 0,465 0,375 0,518 0,429 0,447 0, ,449 0,554 0,528 0,510 0,439 0,386 0,439 0,439 0,527 0,439 0,536 0,447 0,404 0,518 0,500 0,643 0,447 0,554 0,414 0,562 0,466 0,439 0,474 0, ,625 0,447 0,546 0,691 0,697 0,608 0,500 0,590 0,643 0,608 0,465 0,536 0,679 0,375 0,625 0,286 0,465 0,536 0,661 0,554 0,572 0,500 0,625 0,679 0, ,528 0,564 0,437 0,491 0,455 0,437 0,491 0,491 0,564 0,510 0,528 0,510 0,455 0,582 0,564 0,528 0,491 0,419 0,419 0,364 0,419 0,491 0,473 0,419 0,437 0, ,500 0,536 0,546 0,419 0,447 0,554 0,572 0,518 0,447 0,465 0,518 0,447 0,429 0,518 0,447 0,483 0,465 0,572 0,465 0,554 0,375 0,483 0,465 0,447 0,447 0,500 0, ,554 0,518 0,437 0,655 0,625 0,500 0,518 0,608 0,483 0,554 0,447 0,625 0,643 0,322 0,608 0,411 0,483 0,500 0,572 0,572 0,483 0,465 0,500 0,661 0,625 0,375 0,564 0, ,386 0,465 0,400 0,491 0,483 0,340 0,422 0,509 0,447 0,393 0,572 0,518 0,411 0,625 0,518 0,554 0,447 0,500 0,351 0,411 0,316 0,474 0,340 0,483 0,457 0,643 0,455 0,386 0, ,536 0,375 0,455 0,582 0,536 0,483 0,429 0,411 0,608 0,518 0,500 0,429 0,554 0,554 0,572 0,447 0,500 0,447 0,572 0,447 0,500 0,429 0,518 0,465 0,518 0,554 0,437 0,597 0,643 0, ,491 0,546 0,528 0,546 0,600 0,455 0,564 0,691 0,528 0,546 0,637 0,600 0,600 0,710 0,655 0,655 0,600 0,483 0,473 0,510 0,528 0,582 0,546 0,491 0,510 0,728 0,546 0,582 0,746 0,473 0, ,625 0,518 0,437 0,582 0,625 0,661 0,411 0,625 0,536 0,554 0,465 0,518 0,661 0,465 0,483 0,518 0,447 0,351 0,554 0,500 0,500 0,483 0,518 0,572 0,625 0,483 0,582 0,518 0,429 0,500 0,590 0, ,509 0,554 0,546 0,564 0,422 0,474 0,518 0,447 0,597 0,562 0,625 0,465 0,351 0,679 0,536 0,625 0,608 0,554 0,422 0,544 0,492 0,608 0,562 0,483 0,474 0,625 0,510 0,429 0,590 0,429 0,554 0,582 0, ,432 0,483 0,564 0,510 0,404 0,316 0,439 0,422 0,474 0,351 0,465 0,429 0,422 0,536 0,500 0,572 0,518 0,518 0,414 0,474 0,414 0,509 0,439 0,483 0,311 0,679 0,364 0,483 0,643 0,404 0,447 0,510 0,572 0, ,600 0,473 0,473 0,491 0,600 0,528 0,455 0,528 0,673 0,564 0,510 0,582 0,564 0,600 0,637 0,619 0,455 0,382 0,437 0,582 0,510 0,528 0,455 0,455 0,564 0,564 0,455 0,582 0,510 0,546 0,437 0,637 0,473 0,528 0, ,518 0,500 0,528 0,582 0,518 0,572 0,393 0,429 0,518 0,465 0,500 0,429 0,429 0,483 0,465 0,518 0,447 0,474 0,554 0,518 0,483 0,465 0,500 0,590 0,500 0,536 0,473 0,518 0,500 0,518 0,500 0,715 0,457 0,608 0,465 0, ,518 0,518 0,582 0,546 0,465 0,590 0,465 0,465 0,572 0,483 0,483 0,411 0,500 0,536 0,483 0,554 0,447 0,439 0,518 0,518 0,590 0,554 0,572 0,518 0,483 0,590 0,473 0,500 0,590 0,536 0,536 0,661 0,492 0,536 0,483 0,582 0, ,554 0,393 0,510 0,491 0,554 0,500 0,429 0,554 0,518 0,411 0,393 0,518 0,590 0,518 0,608 0,411 0,358 0,369 0,572 0,518 0,590 0,536 0,572 0,608 0,679 0,483 0,582 0,554 0,483 0,518 0,536 0,625 0,474 0,643 0,500 0,600 0,544 0, ,579 0,554 0,473 0,437 0,518 0,518 0,615 0,579 0,465 0,518 0,590 0,590 0,572 0,625 0,518 0,590 0,518 0,483 0,474 0,518 0,422 0,579 0,465 0,500 0,650 0,590 0,491 0,411 0,518 0,439 0,661 0,582 0,536 0,643 0,544 0,582 0,465 0,554 0, ,483 0,447 0,455 0,419 0,527 0,474 0,457 0,544 0,492 0,386 0,500 0,518 0,509 0,518 0,608 0,536 0,483 0,465 0,397 0,457 0,311 0,474 0,386 0,483 0,518 0,518 0,473 0,500 0,590 0,334 0,536 0,510 0,447 0,632 0,483 0,546 0,500 0,554 0,572 0, ,316 0,465 0,419 0,491 0,509 0,316 0,393 0,483 0,422 0,334 0,554 0,554 0,474 0,554 0,608 0,465 0,393 0,358 0,386 0,369 0,369 0,358 0,369 0,518 0,527 0,554 0,419 0,518 0,536 0,304 0,500 0,419 0,518 0,579 0,439 0,528 0,536 0,500 0,500 0,447 0, ,527 0,447 0,546 0,655 0,562 0,509 0,483 0,483 0,527 0,579 0,483 0,518 0,615 0,536 0,625 0,483 0,447 0,411 0,544 0,562 0,544 0,429 0,474 0,483 0,562 0,429 0,582 0,572 0,465 0,554 0,447 0,710 0,483 0,579 0,527 0,437 0,518 0,554 0,483 0,590 0,492 0, ,457 0,393 0,437 0,473 0,544 0,422 0,375 0,393 0,509 0,386 0,447 0,411 0,492 0,518 0,554 0,483 0,375 0,465 0,492 0,509 0,439 0,393 0,369 0,500 0,492 0,536 0,491 0,518 0,500 0,465 0,358 0,582 0,500 0,579 0,404 0,364 0,447 0,536 0,411 0,483 0,474 0,404 0, ,536 0,429 0,455 0,582 0,572 0,518 0,483 0,483 0,590 0,536 0,465 0,500 0,572 0,536 0,643 0,608 0,429 0,411 0,447 0,554 0,572 0,483 0,483 0,429 0,518 0,500 0,528 0,518 0,554 0,518 0,465 0,600 0,518 0,536 0,572 0,328 0,536 0,483 0,483 0,500 0,500 0,465 0,411 0, ,536 0,447 0,455 0,546 0,643 0,536 0,411 0,661 0,590 0,536 0,483 0,572 0,554 0,518 0,608 0,483 0,500 0,429 0,554 0,411 0,554 0,536 0,554 0,447 0,554 0,518 0,491 0,608 0,572 0,554 0,483 0,510 0,536 0,643 0,554 0,455 0,572 0,608 0,465 0,679 0,518 0,500 0,500 0,483 0, ,590 0,500 0,455 0,564 0,679 0,536 0,465 0,590 0,518 0,572 0,429 0,536 0,661 0,375 0,572 0,375 0,411 0,554 0,625 0,518 0,536 0,465 0,483 0,590 0,625 0,375 0,637 0,465 0,447 0,500 0,518 0,710 0,411 0,590 0,536 0,600 0,608 0,608 0,375 0,572 0,518 0,483 0,447 0,429 0,518 0, ,518 0,411 0,546 0,473 0,483 0,536 0,447 0,536 0,500 0,465 0,465 0,483 0,554 0,411 0,518 0,465 0,411 0,465 0,500 0,518 0,483 0,483 0,447 0,465 0,500 0,518 0,510 0,375 0,447 0,500 0,536 0,582 0,483 0,554 0,483 0,510 0,447 0,429 0,572 0,500 0,518 0,500 0,483 0,483 0,518 0,554 0, ,608 0,536 0,582 0,637 0,697 0,572 0,608 0,554 0,590 0,572 0,572 0,625 0,661 0,393 0,715 0,393 0,483 0,536 0,661 0,554 0,536 0,518 0,536 0,679 0,679 0,358 0,619 0,500 0,340 0,625 0,643 0,710 0,572 0,608 0,661 0,637 0,554 0,572 0,500 0,483 0,572 0,518 0,518 0,465 0,536 0,536 0,340 0, ,457 0,375 0,437 0,528 0,544 0,369 0,393 0,429 0,422 0,404 0,429 0,500 0,562 0,554 0,572 0,500 0,465 0,439 0,422 0,474 0,457 0,411 0,404 0,518 0,544 0,518 0,528 0,554 0,447 0,465 0,465 0,572 0,474 0,509 0,422 0,437 0,474 0,527 0,386 0,536 0,492 0,386 0,369 0,264 0,322 0,447 0,447 0,500 0, ,474 0,447 0,510 0,564 0,590 0,447 0,386 0,509 0,500 0,447 0,429 0,518 0,536 0,483 0,572 0,375 0,375 0,429 0,509 0,500 0,474 0,351 0,465 0,518 0,544 0,447 0,528 0,500 0,536 0,369 0,411 0,600 0,518 0,608 0,492 0,510 0,518 0,500 0,483 0,544 0,439 0,286 0,465 0,358 0,411 0,483 0,375 0,483 0, ,582 0,546 0,455 0,600 0,710 0,546 0,582 0,691 0,528 0,600 0,491 0,600 0,691 0,400 0,582 0,419 0,491 0,582 0,655 0,564 0,637 0,473 0,564 0,564 0,637 0,455 0,655 0,510 0,455 0,600 0,528 0,619 0,510 0,710 0,600 0,637 0,619 0,582 0,437 0,546 0,564 0,528 0,510 0,437 0,510 0,491 0,237 0,473 0,346 0,528 0, ,404 0,483 0,528 0,582 0,422 0,351 0,411 0,483 0,492 0,404 0,608 0,447 0,351 0,679 0,590 0,572 0,465 0,429 0,457 0,457 0,457 0,518 0,527 0,429 0,439 0,661 0,491 0,554 0,661 0,429 0,518 0,419 0,625 0,439 0,422 0,655 0,536 0,608 0,518 0,536 0,492 0,369 0,527 0,509 0,608 0,483 0,572 0,590 0,625 0,474 0,465 0, ,369 0,500 0,510 0,546 0,509 0,422 0,536 0,518 0,386 0,404 0,518 0,572 0,509 0,554 0,500 0,608 0,500 0,572 0,386 0,492 0,386 0,429 0,281 0,411 0,457 0,643 0,564 0,429 0,518 0,358 0,554 0,582 0,518 0,509 0,386 0,510 0,554 0,572 0,536 0,608 0,509 0,439 0,439 0,439 0,536 0,518 0,447 0,483 0,608 0,334 0,483 0,596 0, ,572 0,411 0,473 0,691 0,661 0,572 0,447 0,572 0,572 0,608 0,411 0,500 0,679 0,393 0,536 0,393 0,411 0,411 0,608 0,554 0,608 0,483 0,608 0,590 0,608 0,250 0,600 0,536 0,411 0,608 0,483 0,619 0,393 0,590 0,590 0,528 0,500 0,483 0,411 0,572 0,572 0,536 0,358 0,447 0,411 0,465 0,447 0,500 0,483 0,429 0,465 0,491 0,679 0, ,679 0,608 0,619 0,655 0,786 0,733 0,661 0,697 0,679 0,733 0,572 0,661 0,768 0,554 0,679 0,572 0,572 0,661 0,715 0,643 0,661 0,572 0,643 0,643 0,625 0,465 0,764 0,643 0,536 0,750 0,733 0,691 0,554 0,715 0,733 0,655 0,697 0,750 0,590 0,590 0,661 0,643 0,518 0,643 0,572 0,625 0,518 0,643 0,536 0,590 0,.661 0,582 0,715 0,59 0, ,429 0,536 0,400 0,455 0,518 0,411 0,465 0,500 0,447 0,465 0,590 0,572 0,572 0,500 0,518 0,518 0,465 0,340 0,358 0,375 0,304 0,322 0,322 0,375 0,554 0,518 0,346 0,411 0,447 0,393 0,465 0,510 0,411 0,536 0,483 0,400 0,518 0,554 0,536 0,447 0,429 0,340 0,447 0,447 0,483 0,429 0,500 0,518 0,518 0, ,528 0,483 0,411 0,483 0, ,500 0,465 0,510 0,491 0,393 0,500 0,429 0,304 0,518 0,447 0,429 0,340 0,393 0,554 0,536 0,572 0,393 0,536 0,554 0,572 0,536 0,393 0,518 0,483 0,304 0,572 0,510 0,411 0,661 0,500 0,429 0,691 0,518 0,483 0,358 0,564 0,393 0,465 0,554 0,625 0,500 0,554 0,411 0,429 0,500 0,590 0,518 0,500 0,625 0,483 0,5 0,582 0,429 0,483 0,572 0,625 0,518 1

45 G 6 G 5 G 4 G 3 G 2 G Figura 2. Dedrograma de dissimilaridade genética entre 58 acessos de Capsicum chinense,obtido pelo método hierárquico do vizinho mais próximo. (G 1 = grupo 1; G 2 = grupo 2; G 3 = grupo 3; G 4 = grupo 4; G 5 = grupo 5 e G 6 = grupo 6).

46 O primeiro grupo é composto dos acessos 422 (bode vermelha) e 432 (bode amarela), ambos provenientes de Brasília DF, conforme a figura 3. Neste grupo, em 44 descritores avaliados ocorreu uma coincidência de valores observados, demonstrando haver uma alta similaridade entre esses dois morfotipos com frutos de cor vermelha e laranja e ambos de formato achatado. As plantas apresentaram caule verde, cilíndrico com antocianina nodal, pubescência esparsa, altura acima de 85 cm e hábito de crescimento ereto, com densidades de ramificação e folhagem esparsas. A floração iniciou-se entre 61 e 90 dias após a semeadura, com duas e três flores por axila, com posições intermediária, ereta e pendente A corola é amarelo-clara, com comprimento de até 2 cm e estigma posicionado no mesmo nível ou acima das anteras. O tempo de frutificação iniciou-se aos 60 dias, seguindo até 150 dias após o transplantio. Os frutos apresentaram manchas ou estrias antes da maturação, sendo sempre pendentes, de formato achatado com comprimento variando de 1 a 2 cm e a largura até 2,5 cm, massa variando de 2 a 4 g, com paredes com espessura de 3 a 4 mm, sem pescoço, com ápice afundado. Apresentaram corrugação leve ou intermediária na seção transversal e dois e três lóculos. Os frutos são intermediários a persistentes em relação ao pedúnculo. O aroma é baixo e a pungência é variável de baixa a média. As sementes apresentaram superfície lisa e rugosa, com tamanho intermediário, variando de 3 a 4 milímetros. Figura 3. Acessos 422 e 432 de C. chinense, respectivamente.

47 O grupo 2 é composto dos acessos 026 (peão vermelho) e 048 (olho-de-cará amarela), figura 4. Observou-se nesse grupo que, 42 descritores apresentaram valores coincidentes, o que demonstra uma alta similaridade entre os dois morfotipos de frutos vermelho e amarelo, ambos de formato triangular. Em relação à procedência, o acesso 026 foi coletado no município de Alto Alegre - RR e o 048, em Pacaraima - RR. Nesse grupo as plantas apresentaram caule verde, cilíndrico com antocianina nodal violeta escuro, pubescência esparsa, altura entre 66 e 85 cm e hábito de crescimento intermediário. A floração iniciou-se entre 61 e 90 dias após a semeadura, com duas e três flores por axila, a corola é amarelo-clara ou esverdeada, com comprimento de até 2 cm e estigma posicionado acima das anteras. A frutificação iniciou-se aos 60 dias, seguindo até 150 dias após o transplantio. Os frutos são sempre pendentes, de formato triangular com comprimento variando de 1 a 2 cm e a largura até 2,5 cm, massa variando de 1 a 2 g, não apresentaram pescoço, com ápice pontiagudo ou truncado. Apresentaram corrugação leve ou corrugada na seção transversal e três lóculos. Os frutos são persistentes em relação ao pedúnculo. O aroma variou de baixo a alto, sem pungência para o acesso 026 e co mpungência média para o 048. As sementes apresentaram superfície lisa e tamanho intermediário, variando de 3 a 4 milímetros. Figura 4. Acessos 026 e 048 de C. chinense respectivamente. O acesso 026 apresentou segregação para coloração de frutos, conforme mostrado na Figura 5. Figura 5. Acesso de Capsicum chinense 026 segregado.

48 O grupo 3 é composto dos acessos 003 (canaimé) e 039 (pimenta murici), figura 6. Observou-se neste grupo que 44 descritores apresentaram coincidência nos valores obtidos, demonstrando haver uma alta similaridade entre esses dois morfotipos de frutos diferentes, um de cor vermelha e outro salmão, ambos de formato triangular. Em relação à procedência o acesso 003 foi coletado no município de Uiramutã - RR e o 039 em Rorainópolis - RR. Nesse grupo, as plantas apresentaram caule verde, cilíndrico com pubescência esparsa, altura entre 66 e 85 cm, hábito de crescimento intermediário e ereto. A floração iniciou-se entre 61 e 90 dias após a semeadura, com duas flores eretas por axila, a corola é amarelo-clara, com comprimento de até 2 cm e estigma posicionado acima das anteras. A frutificação iniciou-se entre 60 e 90 dias seguindo até 150 dias após o transplantio. Os frutos são sempre pendentes, de formato triangular com comprimento variando de 2 a 4 cm e a largura até 2,5 cm, massa variando de 2 a 4 g, não apresentaram pescoço e o ápice é truncado. Apresentaram corrugação intermediária na seção transversal e dois a três lóculos. O aroma variou de médio a alto e a pungência foi alta. As sementes apresentaram superfície lisa e tamanho intermediário, variando de 3 a 4 milímetros. Figura 6. Acessos 003 e 039 de C. chinense, respectivamente. No grupo 4, observou-se que para 49 descritores ocorreu uma coincidência entre os acessos acima de 75% demonstrando haver uma alta similaridade entre os mesmos. Neste grupo estão incluídos três morfotipos conhecidos como peão, representados pelos acessos 502 (peão de cheiro vermelha), 512 (peão amarela), 562 (peão amarela),

49 e 144 (prikanka vermelha) também de formato triangular, figura 7. Em relação à procedência os três popularmente conhecidos como peão são originados do município de Pacaraima - RR e o 144 foi coletado em Alto Alegre - RR. Nesse grupo as plantas apresentaram, em sua maioria, caule verde, cilíndrico com antocianina nodal violeta claro e pubescência intermediária, altura acima de 85 cm, hábito de crescimento intermediário. A floração iniciou-se entre 61 e 90 dias após a semeadura, a corola é amarelo-clara a esverdeada, com comprimento de até 2 cm e estigma posicionado acima das anteras. A frutificação iniciou-se aos 60 dias seguindo até 150 dias após o transplantio. Os frutos foram sempre pendentes, de formato triangular com comprimento variando de 2 a 4 cm e a largura até 2,5 cm, massa variando de 2 a 4 g. A maioria dos frutos apresentou corrugação intermediária na seção transversal e dois lóculos. O aroma variou de médio a alto e a pungência variou de média a alta. As sementes apresentaram superfície lisa, tamanho de intermediário a grande, variando de 3 a mais de 4 milímetros. Figura 7. Acessos 144, 502, 512 e 562 de C. chinense, respectivamente. Para o grupo 5, com maior número de acessos agrupados (17), observou-se que, para 24 descritores ocorreu uma coincidência entre os acessos acima de 75%. Esse índice mostra que o grupo apresenta uma similaridade abaixo dos demais. Nesse agrupamento está incluída a maior parte das pimentas conhecidas como murupi, representadas pelos acessos 001 (murupi laranja), 021 (murupi salmão), 063 (murupi salmão), 112 (murupi vermelha), 472 (murupi vermelha), 482 (murupi amarela) e 612 (murupi amarela), com formato alongado, figura 8.

50 Figura 8. Acessos 001, 021, 063, 112, 472, 482 e 612 de C. chinense, respectivamente. Também no grupo 5 estão incluídas as pimentas de cheiro, representadas pelos acessos 041 (pimenta-de-cheiro vermelha), 062 (pimenta-de-cheiro vermelha) e 662 (pimenta-de-cheiro vermelha), figura 9. Figura 9. Acessos 041, 062 e 662 de C. chinense, respectivamente. Os demais acessos do grupo, 019 (pimenta vermelha), 029 (pimenta de mesa salmão), 066 (pimenta laranja), 077 (canaimé), 139 (pimenta vermelha), 572 (peão de cheiro amarela) e 652 (malaguetão laranja), estão ilustrados na figura 10. Figura 10. Acessos 019, 029 e 066, 077, 139, 572 e 652 de C. chinense, respectivamente. Em relação à procedência não há qualquer ligação entre os morfotipos desse grupo, que são originados dos municípios roraimenses de Uiramutã, Caroebe, Mucajaí, Alto Alegre, Rorainópolis, Boa Vista, Bonfim e Pacaraima. Nesse grupo as plantas apresentaram, em sua maioria, caule verde, pubescência esparsa, com altura acima de 85 cm, hábito de crescimento variando de intermediário a ereto. A floração iniciou-se

51 entre 61 e 90 dias após a semeadura, a corola é amarelo-clara a esverdeada, com comprimento de até 2 cm e estigma posicionado acima das anteras. A frutificação iniciou-se aos 60 dias seguindo até 150 dias após o transplantio. O comprimento dos frutos predominante ficou acima dos 4 cm e a largura até 2,5 cm e o peso variou de 2 a 12 g. A maioria dos frutos apresentou pescoço na base, sendo pontiagudo no ápice e apresentando corrugação na seção transversal e três lóculos. O aroma variou de baixo a alto e a pungência variou de sem pungência a alta. As sementes são de tamanho intermediário a grande, variando de 3 a mais de 4 milímetros. Neste grupo foi observada segregação de coloração e formato dos acessos 001, com frutos laranja mais escuro com ápice truncado (esquerda) e mais claro com ápice pontiagudo, conforme a Figura 11. Acesso 029 normal com frutos vermelho mais intenso e formato triangular (esquerda) e mais vermelho ligeiramente mais claro, com formato alongado, conforme a Figura 12. Os acessos 062, 077, 112 e 139 apresentaram segregação com ligeira modificação no formato de frutos, como mostra a Figura 13. Figura 11. Acesso de Capsicum chinense 001 normal e segregado, respectivamente. Figura 12. Acesso de Capsicum chinense 029 normal e segregado, respectivamente.

52 Acesso 062 Acesso 077 Acesso 112 Acesso 139 Figura 13. Acessos 062, 077, 112 e 139 de Capsicum chinense normais e segregados, respectivamente. No grupo 6 observou-se que, para 44 descritores ocorreu uma coincidência nos valores obtidos acima de 75%, demonstrando haver uma alta similaridade no grupo, onde se encontram as pimentas conhecidas como olho-de-peixe ou similar, em alusão ao tamanho pequeno dos frutos. Nesse grupo estão incluídos os acessos 042 (pimenta de passarinho), 047 (olho-de-caranguejo), 079 (olho-de-peixe laranja), 111 (olho-de-

53 peixe salmão), 532 (olho-de-peixe amarela), 552 (olho-de-peixe amarela), 582 (olho-depeixe amarela) e 622 (olho-de-peixe laranja), figura 14. As flores apresentaram corola medindo até 1,5 cm, sempre eretas, frutos pequenos de até 2 cm de comprimento, pesando até 2 g, com formatos arredondados ou triangular, de coloração predominante amarela, quando maduro, picantes e aromáticos, e de sementes pequenas, medindo em sua maioria menos de 3 milímetros. Em relação à procedência não há qualquer ligação entre os morfotipos deste grupo, que são originados dos municípios roraimenses de Cantá, Rorainópolis, Amajari, Bonfim e Pacaraima. Figura 14. Acessos 042, 047, 079, 111, 532, 552, 582 e 622 de Capsicum chinense, respectivamente. Conforme a figura 2, os seguintes acessos não agruparam: 006 (pimenta-decheiro amarela), 011 (malaguetão), 033 (pimenta-de-cheiro amarela), 036 (murupi salmão), 040 (pimenta vermelha), 044 (malaguetão), 049 (olho-de-cará amarela), 051 (pimenta-de-cheiro vermelha), 058 (pimenta amarela), 076 (pimenta vermelha), 108 (pimenta cheirosa vermelha), 110 (malaguetão), 123 (olho-de-mutum vermelha), 125 (pimenta vermelha), 127 (olho-de-mutum vermelha), 134 (pimenta vermelha), 442 (pimenta cumari do Pará), 452 (curupira), 492 (peão grande vermelha), 522 (espora-degalo laranja), 542 (pimenta-de-cheiro vermelha), 592 (pimenta-de-cheiro vermelha), 632 (olho-de-peixe amarela). A figura 15 ilustra os frutos dos acessos acima

54 Figura 15. Acessos 006, 011, 033, 036, 040, 044, 049, 051, 058, 076, 108, 110, 123, 125, 127, 134, 442, 452, 492, 522, 542, 592 e 632 de Capsicum chinense, respectivamente. Avaliando a dissimilaridade entre os acessos, conforme a Tabela 4, observou-se que os maiores índices de dissimilaridade (acima de 0,7 ou 70%) foram observados entre os seguintes acessos: 632 com 019 (0,786), 041 (0,768), 108 (0,764), 112 e 432 (0,750), 021, 036 e 123 (0,733), 051, 134, 592 e 652 (0,715); 125 com 111 (0,746), 079 (0,728), 422 (0,715), 042, 492, 532 e 552 (0,710); 582 com 019 e 134 (0,70); 044 com 552 (0,715); 582 com 19 e 134 (0,710). De acordo com esses resultados, os acessos 632 e 125 são os que apresentaram maiores divergências entre os 58 acessos avaliados. No dendrograma da Figura 2, observa-se que estes acessos estão isolados, não se agrupando com os demais. O acesso 452 (curupira), considerado de ocorrência silvestre não se agrupou aos demais, muito embora não fosse incluído entre os materiais com maiores percentuais de dissimilaridade, mostrando haver provável relação de similaridade deste com os outros acessos. O acesso 632 (olho-de-peixe) apresentou os maiores percentuais de dissimilaridade, alcançando 78% em relação ao acesso 019 (pimenta vermelha campanulada), 76% em relação aos acessos 041 (pimenta de cheiro vermelha) e 108 (pimenta cheirosa vermelha) e 75% em relação aos acessos 112 (murupi vermelha) e

55 (bode laranja), demonstrando não haver qualquer relação de cor com semelhança entre os morfotipos de pimenta. O acesso 125, pimenta vermelha de frutos grandes, alongados e plantas eretas, apresentou alta dissimilaridade (74%) em relação ao acesso 111, olho-de-peixe salmão, de frutos arredondados, pequenos e planta prostrada, mostrando que materiais muito diferentes foram separados corretamente. Os menores índices de dissimilaridade (abaixo de 30%) foram observados entre os seguintes acessos: 062 com 066 (0,29) e 652 (0,30); 482 com 112 (0,30) e 472 (0,28); 003 com 039 (0,30); 019 com 041 (0,26); 029 com 662 (0,30); 066 com 612 (0,28); 079 com 622 (0,25); 502 com 562 (0,26); 422 com 432 (0,29) e 532 com 582 (0,23). Todos esses acessos aparecem agrupados no dendrograma da Figura 1. A maior similaridade (77%) foi observada entre os acessos 532 e 582 (olho-depeixe amarela, procedentes de Pacaraima - RR), atestando que muito provavelmente esses dois acessos são iguais. Os acessos 079 e 622, com 75% de similaridade também devem ser os mesmos. Os acessos 019 e 041, ambos com frutos vermelhos, de formato triangular apresentaram 74% de similaridade e demonstram estar muito próximos geneticamente. Os acessos 066 (pimenta laranja alongada) e 612 (murupi amarela), com similaridade de 72% também devem ser os mesmos materiais. A origem dos locais de coleta só foi efetiva para agrupar os acessos do grupo 1 (422 e 432), provenientes de Brasília - DF, o que não se observou com o acesso 442, de igual procedência. Nos demais grupos o local de coleta não apresentou relação com o agrupamento dos acessos. A similaridade entre os acessos 422 (bode vermelha) e 432 (bode laranja) é bastante alta, alcançando 71%, muito embora, em algum momento de sua evolução a característica cor de fruto foi alterada, mas sem resultar em maior diferenciação entre esses acessos. Nos grupos 1, 2, 3, 4 e 5 a característica cor foi irrelevante para o agrupamento. Apenas no grupo 6, houve coincidência da cor amarela entre todos os acessos. Em relação à pungência apenas os grupos 3, 4 e 6 apresentaram semelhança entre os acessos dentro de cada grupo para esse descritor. O grupo 5 apresentou acessos doces e picantes em vários níveis. No grupo 2, observou-se uma variação para pungência, com o acesso 026 sendo doce e o 048, picante médio. Esses

56 resultados contraditórios mostram que essa característica não foi tão relevante para o agrupamento dos acessos. O formato dos frutos parece ser o descritor mais efetivo para o agrupamento dos acessos. Os acessos dos grupos 1, 2, 3 e 4 apresentaram igual formato de fruto. No grupo 5, dos 17 acessos agrupados, 11 apresentaram frutos de formato alongado e no grupo 6, de 8 acessos, cinco apresentaram frutos de formato arredondado. Essa característica parece ser uma das mais diferenciadoras considerando os frutos dos acessos avaliados. Os nomes populares também parecem ter uma influência no agrupamento feito por descritores morfológicos. No grupo 1, foram agrupadas as duas pimentas conhecidas como bode, no grupo 5, foram agrupadas a maioria das pimentas murupi e no grupo 6, a maioria daquelas conhecidas como olho-de-peixe. Esses resultados reforçam o valor da sabedoria popular na identificação de recursos genéticos vegetais. Os resultados atestam que o uso de descritores morfológicos com aplicação de variáveis multicategóricas avaliadas pelo método hierárquico do vizinho mais próximo mostrou-se adequado ao estudo da divergência genética entre acessos de pimenta da espécie C. chinense, o que já havia sido demonstrado por SUDRÉ et al. (2005; 2006), com germoplasma de pimentas do gênero Capsicum. O grande número de acessos não agrupados, 39% do total, e a dissimilaridade acima de 70% para muitos morfotipos demonstra haver uma alta variabilidade entre estes, considerando os descritores morfológicos analisados. A variedade de cores, formato, níveis de pungência e arquitetura de plantas observadas com os diferentes morfotipos de C. chinense encontrados em Roraima, já por si, demonstram haver uma variabilidade genética alta, o que deve ser melhor explorado em programas de melhoramento e indicam a necessidade de se realizarem esforços para conservação dessa diversidade, corroborando a afirmação de PICKERSGILL (1997), de que a diversidade genética entre as várias espécies domesticadas de Capsicum tem sido pouco explorada e ainda está longe de ser esgotada. A segregação para formato e cor observada em vários acessos faz supor que alguns desses materiais ainda se encontram em um processo preliminar de domesticação, o que confere com o modo de

57 conservação e cultivo da grande parte das pimentas cultivadas em Roraima, que, à exceção de alguns morfotipos de pimenta de cheiro, são encontrados apenas em pequenas hortas de fundo de quintal e roças indígenas. 4 CONCLUSÕES 1 Descritores morfológicos são adequados para caracterizar a diversidade genética de C. chinense; 2 O uso do método hierárquico do vizinho mais próximo foi efetivo para agrupar os diferentes morfotipos de pimenta avaliados; 3 Características associadas à cor do fruto e ao local de procedência do acesso apresentaram menor associação com dissimilaridade que o formato do fruto; 4 Existe uma grande variabilidade entre os acessos avaliados, o que potencializa seu uso em programas de melhoramento genético. 5 REFERÊNCIAS ARRIEL, N. H. C. Diversidade genética em gergelim (Sesamum indicum L.) a partir de marcadores moleculares (RAPD) e caracteres morfológicos e agronômicos. 2004, 114 p. Tese (Doutorado em agronomia) Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias: Jaboticabal, BIANCHETTI, L. B. Aspectos morfológicos, ecológicos e biogeográficos de dez táxons de Capsicum (Solanaceae) ocorrentes no Brasil p. Dissertação de Mestrado - Universidade de Brasília.

58 CHIES, T. T. de S.; LONGHI-WAGNER, H. M. Polimorfismo morfológico. IN: GENÉTICA E EVOLUÇÃO VEGETAL. Organizado por Loreta Brandão Freitas e Fernanda Bered. Porto Alegre, Editora da UFRGS, P COLE-RODGERS, P.; SMITH, D. W.; BOSLAND, P. W. A novel statistical approach to analyze genetic resource evaluation using Capsicum as an example. Crop Science, Madison, v. 37, p , CARVALHO, I. C. de C.; BIANCHETTI, L. de B.; BUSTAMANTE, P. G.; SILVA, D. B. da. Catálogo de germoplasma de pimentas e pimentões (Capsicum spp.) da Embrapa Hortaliças. Brasília: Embrapa Hortaliças, (Embrapa Hortaliças, documentos, 49). 49p. CRUZ, C. D. Programa Genes: versão Windows; aplicativo computacional em genética e estatística. Viçosa: Imprensa Universitária, 2001, 648p. CRUZ, C. D.; CARNEIRO, P. C. S. Modelos biométricos aplicados ao melhoramento genético: v. 2, Viçosa: UFV, Imprensa Universitária, 2003, 585p. FERREIRA. M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3 a ed. Brasília: EMBRAPA CENARGEN, p. IBPGR. Descriptors for Capsicum (Capsicum spp.) International Board for Plant Genetic Resources. IRome, Italy p. MCLEOD, M. J.; GUTTMAN, S. I.; ESHBAUGH, W. H. Peppers (Capsicum). In: TANKSLEY, S. D.; ORTON, T. J. (Ed.). Isozymes in plant genetics and breeding. Amsterdam: Elsevier Science Publishers, Part B. p

59 PICKERSGILL, B. Relationships betweeen weedy and cultivated forms in some species of chilli peppers (genus Capsicum). Evolution, v. 25, p , Chromossomes and evolution in Capsicum. In: Pochard, E. (Ed) Capsicum 77. INRA Montfavet-Avignon, France p Genetic resources and breeding of Capsicum spp. Euphytica, v. 96, p , REIFSCHNEIDER, F. J. B. (Org.) Capsicum: pimentas e pimentões no Brasil. Brasília: Embrapa Comunicação para Transferência de Tecnologia. Embrapa Hortaliças, p. SMITH, P. G.; HEISER, C. B. Taxonomy of Capsicum chinense Jacq. and the geographic distribuition of the cultivated Capsicum species. Bulletim of the Torrey Botanical Club, v. 84, n. 6, p , SUDRÉ, C.P.; CRUZ, C. D.; RODRIGUES R.; RIVA E. M.; AMARAL JÚNIOR, A.T.; SILVA, D. J. H.; PEREIRA, T. N. S.. Variáveis multicategóricas na determinação da divergência genética entre acessos de pimenta e pimentão. Horticultura Brasileira, v. 24, p , SUDRÉ, C. P.; RODRIGUES, R; RIVA E. M.; KARASAWA, M.; AMARAL JÚNIOR, A. T. Divergência genética entre acessos de pimenta e pimentão utilizando técnicas multivariadas. Horticultura Brasileira, v. 23, n. 1, p , TEIXEIRA, R. Diversidade em Capsicum: análise molecular, morfoagronômica e química p. Dissertação de Mestrado - Universidade Federal de Viçosa.

60 CAPÍTULO 3 - CARACTERIZAÇÃO DE ACESSOS DE Capsicum chinense COM MARCADORES MOLECULARES faflp RESUMO - No Estado de Roraima, há uma grande diversidade de pimentas da espécie Capsicum chinense, que é tradicionalmente utilizada na culinária amazônica e representa uma fonte de renda importante para os olericultores locais. A caracterização desse recurso genético tende a fornecer informações úteis para programas de conservação e melhoramento genético da espécie. A técnica de faflp é uma ferramenta útil para a caracterização molecular de recursos genéticos, identificando materiais duplicados e fornecendo informações filogenéticas relevantes. Esse trabalho teve como objetivo caracterizar acessos de pimenta da espécie C. chinense oriundos de uma coleção de trabalho da Embrapa Roraima, por meio de marcadores moleculares faflp. A partir de plantas cultivadas em casa de vegetação foi extraído o DNA de 58 acessos de pimenta para aplicação dos marcadores, empregando-se a combinação de iniciadores EcoRI (AGG/ACG) e MseI (CAC/CAA). Os dados foram analisados pelos programas GeneScan 3.1 e Genotyper 2.5. Para análise da matriz de dissimilaridade, foi utilizado o programa PAUP 4.0, e o dendrograma foi obtido pelo método de agrupamento do vizinho mais próximo. Os resultados comprovaram a eficácia do marcador faflp para caracterização de germoplasma de pimentas, revelando a formação de dois grandes grupos e três acessos isolados. Não foi observada correlação entre similaridade genética e nomes populares ou procedência dos acessos. A dissimilaridade entre os acessos variou de 2 a 47,9%, com média de 22,3%, demonstrando a existência de variabilidade genética e a existência de prováveis duplicatas na coleção avaliada. Palavras-chave: Capsicum chinense, Amazônia, diversidade genética, filogenia.

61 INTRODUÇÃO Dentre as pimentas do gênero Capsicum, predomina na Amazônia brasileira a espécie C. chinense, popularmente conhecida como murupi, de cheiro e olho-de-peixe. Em um inventário de pimentas cultivadas em Roraima, BARBOSA et al. (2002) constataram a predominância de C. chinense naquele Estado amazônico onde, para um total de 163 acessos levantados, 76,7% eram da espécie acima citada. PICKERSGILL (1971) relataram que a região amazônica é o provável centro de diversidade dessa espécie de pimenta. Apesar da diversidade genética e da importância do uso tradicional desse recurso fitogenético entre comunidades autóctones e urbanas da Amazônia, poucos são os estudos científicos dedicados aos inúmeros morfotipos de pimenta encontrados na região. Tradicionalmente, a caracterização de pimentas é feita com descritores morfológicos estabelecidos pelo IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute). Mais recentemente, estudos relacionados com a análise da diversidade genética e a evolução do grupo das pimentas estão sendo realizados, com base não apenas na morfologia da planta, mas também na citologia e no DNA genômico. Tais estudos, em geral, têm ratificado a identificação prévia das espécies por meio da morfologia floral (PRINCE et al., 1995). Esses autores recomendaram o uso de marcadores moleculares RFLP e RAPD para delinear a diversidade genética de cultivares dentro da espécie Capsicum annuum. PRINCE et al. (1992) utilizaram marcadores moleculares RFLP para avaliar distâncias genéticas entre acessos mexicanos de Capsicum, concluindo, após a análise de agrupamento, que há uma separação clara entre os acessos do Norte e os do Sul daquele país. Marcadores moleculares RAPD foram usados por BUSO et al. (2001), para avaliar a relação genética entre espécies silvestres do gênero Capsicum coletadas na Mata Atlântica e espécies cultivadas de pimenta, cujos resultados indicaram uma alta similaridade entre acessos da espécie C. chinense e, no geral, uma baixa similaridade entre as espécies silvestres e as cultivadas, além de relatarem, que o arranjo dos acessos dentro de cada grupo de espécie cultivada parecia refletir os dados de origem,

62 revelando uma provável estruturação geográfica. A denominação popular também foi relatada pelos autores como confusa para um acesso relacionado como pimenta malagueta, tipo associado à espécie C. frutescens que, segundo a análise molecular estaria no grupo da espécie C. baccatum. Estimando as relações genéticas de 34 diferentes cultivares de C. annuum com marcadores moleculares AFLP, a partir de dez combinações diferentes de iniciadores (primer) E-AGG/M-CAC, PARAN et al. (1998), obtiveram 489 produtos de amplificação, com 65 bandas polimórficas para o marcador AFLP, concluindo que os primers para AFLP foram efetivos quanto à habilidade de detectar polimorfismo em pimentas. Em uma matriz de distância genética construída com dez dos cultivares testados, os autores observaram padrões similares de relações entre os acessos, com o agrupamento conjunto de acessos com frutos não pungentes e grandes, separados dos grupos de três pimentas picantes e com maior divergência para um tipo perene. As distâncias genéticas variaram de 0,02 entre os acessos mais similares a 0,05 para os mais distantes. Segundo esses autores, as informações geradas poderiam ser de utilidade no mapeamento genômico de Capsicum ou no melhoramento genético do gênero. Marcadores moleculares RAPD e AFLP foram utilizados por LANTERI et al. (2003) para avaliar a diversidade genética dentro e entre cinco populações de variedades locais de C. annuum, concluindo que o marcador AFLP fora mais confiável, à medida que proporcionou uma menor faixa de variação entre as combinações de primers para a detecção de variabilidade genética. LOAIZA-FIGUEROA et al. (1989) estudando as relações evolutivas entre 180 acessos de Capsicum do México por meio de eletroforese enzimática, relataram que a distância genética média para acessos domesticados seria de 22,34%. TOQUICA et al. (2003), em estudo sobre a diversidade genética de germoplasma de Capsicum spp. coletados na Colômbia, utilizaram marcadores moleculares AFLP e concluiram que o grupo da espécie C. chinense apresentou valores baixos de diversidade genética, com média de 75% de similaridade. Segundo os autores, esses baixos valores de diversidade genética podem ser atribuídos a um provável

63 estreitamento da base genética nesse grupo de pimentas, que fora domesticado em comunidades indígenas, não representando espécies silvestres, ou ao reduzido número de locais de coleta. Para KOCHIEVA & RYZHOVA (2003), o uso de marcadores AFLP mostrou-se adequado para detecção de polimorfismo em cultivares de C. annuum, no entanto, esses autores argumentaram haver uma certa dificuldade na busca de marcadores para o gênero Capsicum, já que seu genoma mantém-se altamente conservado nos acessos cultivados em relação às formas silvestres, o que induziria à baixa variabilidade genética entre as formas cultivadas. Utilizando a combinação de dois pares de iniciadores, relataram a obtenção de 101 marcas polimórficas, com distâncias genéticas variando de 0,021 a 0,072, concluindo que houve pouca variação entre as cultivares avaliadas e que, a partir do agrupamento das mesmas, não se observou associação entre os grupos formados e algumas características morfológicas, como cor e forma dos frutos e resistência a doenças. Germoplasma de diversos gêneros de plantas foram caracterizados com marcadores AFLP para estimar a diversidade genética, como no caso de 36 acessos de maracujá amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa), onde foram detectadas 123 bandas polimórficas a partir dos iniciadores AAG-CAT e AAG-CTG. Os autores constataram ampla variação da distância genética entre os acessos, com valores variando de 6,5 a 49,6%, equivalentes a 8 e 61 marcas polimórficas, respectivamente. Também constataram a não formação de estruturação geográfica (GANGA et al., 2004). HAN et al. (2001) relataram que, através do uso do marcador AFLP, a distância genética média entre duas espécies de lírio peruano (Alstroemeria umbellata e A. pelegrina) foi de apenas 26%, o que seria aceitável como variação intraespecífica. Marcadores faflp foram utilizados para caracterizar genótipos de melão (Cucumis melo) permitindo observar uma grande variação entre os acessos e, por meio da análise dos coeficientes de similaridade, puderam separar acessos conhecidos popularmente pela mesma denominação, que mostraram-se geneticamente diferentes (GIOVANNI et al., 2003).

64 Em espécies arbóreas, FREITAS et al. (2005) utilizaram o marcador genético AFLP para estimar a variabilidade genética de uma população de Myracrondruon urundeuva, encontrando grande número de bandas polimórificas (total de 137) e identificando três grupos entre as progênies avaliadas, o que, segundo os autores ilustraria a alta variabilidade genética dentro das progênies. Esse trabalho teve como objetivo realizar a caracterização de acessos de pimenta da espécie C. chinense provenientes da coleção da Embrapa Roraima por meio da técnica de faflp, com a obtenção de informações detalhadas do agrupamento dos mesmos, contribuindo para seu uso em programas de melhoramento genético, com vistas a aumentar a produção e a diversidade de cultivares disponíveis aos produtores da região amazônica. 2 MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi realizado nos Laboratórios de Bioquímica de Microorganismos e Plantas do Departamento de Tecnologia e de Micropropagação do Departamento de Produção Vegetal, com material vegetal oriundo de plantas cultivadas em casa de vegetação na horta do Setor de Olericultura e Plantas Aromático-Medicinais da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (UNESP - FCAV), Campus de Jaboticabal, São Paulo. Os acessos de pimenta da espécie C. chinense foram provenientes da coleção da Embrapa Roraima. Dados de passaporte dos 58 acessos utilizados encontram-se na Tabela 1. A extração de DNA genômico dos tecidos vegetais foi realizada segundo FERREIRA & GRATTAPAGLIA (1998). O material vegetal utilizado para extração de DNA consistiu de folhas tenras de cada acesso, sem manchas ou perfurações, lavadas em água corrente e maceradas em nitrogênio líquido, sendo armazenadas em recipientes hermeticamente fechados e acondicionadas em freezer a 20 o C.

65 Tabela 1. Identificação de 58 acessos de pimenta (Capsicum chinense) da coleção da Embrapa Roraima Código Nome popular Procedência Lat N/S Long W Código Nome popular Procedência Lat N/S Long W RR 001 Murupi laranja, alongada, PA Uiramutã 04 o 35' 44" N 60 o 10' 04" RR 112 Murupi vermelha, alongada, PM Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 003 Canaimé vermelha, triangular, PA Uiramutã 04 o 35' 44" N 60 o 10' 04" RR 123 Olho de mutum vermelha, triangular, PB Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 006 P. cheiro amarela, retangular, PA Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 125 P. vermelha alongada, PA Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 011 Malaguetão vermelho, alongado, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 127 Olho de Mutum vermelha, arredondada, PA Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 019 P. vermelha, campanulada, doce Caroebe 00 o N 59 o 41' 44" RR 134 P. vermelha, triangular, PA Mucajaí 02 o 25' 48'' N 60 o 54' 00'' RR 021 Murupi salmão, alongada, PB Mucajaí 02 o 25' 48'' N 60 o 54' 00'' RR 139 P. vermelha, alongada, doce Mucajaí 02 o 25' 48'' N 60 o 54' 00'' RR 026 Peão Vermelha, triangular, doce Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 144 Prikanka vermelha, triangular, PM Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 029 P. de Mesa salmão, triangular, PB Alto Alegre 02 o 53' 45'' N 61 o 29' 51'' RR 422 P. Bode vermelha, achatada, PB Brasília/DF 15 o 50' 16'' N 47 o 42' 48'' RR 033 P. de Cheiro amarela, alongada, PB Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 432 P. Bode laranja, achatada, PM Brasília/DF 15 o 50' 16'' N 47 o 42' 48'' RR 036 Murupi salmão, alongada, PB Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 442 P. cumari do Pará amarela, triangular, PA Brasília/DF 15 o 50' 16'' N 47 o 42' 48'' RR 039 P. Murici salmão, triangular, PA Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 452 Curupira vermelha, alongada, PM Mucajaí 02 o 25' 48'' N 60 o 54' 00'' RR 040 P. varmelha, triangular, doce Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 472 Murupi vermelha, alongada, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 041 P. de Cheiro vermelha, triangular, PM Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 482 Murupi amarela, alongada, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 042 P. de Passarinho amarela, Arredondada, PA Cantá 02 o 36' 37" N 60 o 35' 51" RR 492 Peão grande vermelha, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 044 Malaguetão vermelha, alongada, PA Cantá 02 o 36' 37" N 60 o 35' 51" RR 502 Peão de cheiro vermelha, triangular, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 047 Olho de Carangueijo laranja, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 512 Peão amarela, triangular, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 048 Olho de Cará amarela, triangular, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 522 Espora de galo laranja, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 049 Olho de mutum vermelha, campanulada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 532 Olho de peixe amarela, arredondada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 051 P. de Cheiro vermelha, campanulada, doce Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 542 P. de cheiro vermelha, arredondada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 058 P. amarela, triangular, PA Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 552 Olho de peixe amarela, arredondada, PA Amajari 03 o 39' 08" N 61 o 22' 14" RR 062 P. de Cheiro vermelha, alongada, PM Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 562 Peão amarela, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 063 Murupi salmão, alongada, PA Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 572 Peão de cheiro amarela, campanulada, PM Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 066 P. laranja, alongada, PB Boa Vista 02 o 49' 11'' N 60 o 40' 24" RR 582 Olho de peixe amarela, arredondada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 076 Pimenta vermelha, alongada, doce Bonfim 03 o 21' 35'' N 59 o 50' 00'' RR 592 P. de cheiro vermelha, alongada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 077 P. Canaimé, vermelha, campanulada, PA Bonfim 03 o 21' 35'' N 59 o 50' 00'' RR 612 Murupi amarela, alongada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 079 Olho de peixe laranja, triangular, PA Bonfim 03 o 21' 35'' N 59 o 50' 00'' RR 622 Olho de peixe laranja, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 108 P. cheirosa vermelha, triangular, PM Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 632 Olho de peixe amarela, triangular, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 110 Malaguetão vermelha, triangular, PA Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 652 Malaguetão laranja, alongada, PA Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" RR 111 Olho de peixe salmão, arredendada, PA Rorainópolis 00 o 56' 46" S 60 o 25' 05" RR 662 P. de cheiro vermelha, triangular, doce Pacaraima 04 o 25' 53" N 61 o 08' 47" PA: pungência alta; PM: pungência média; PB: pungência baixa Pesou-se 0,15 g do material previamente macerado de cada amostra, ao qual foram adicionados 700 L de tampão de extração composto de: 2% CTAB; NaCl 1,4 M; 0,2% 2-mercaptoetanol; 20 mm EDTA; 100 mm TRIS-Cl-pH 8,0; 1% polivinil pirrolidona); promoveu-se agitação em vórtex e incubação em banho-maria, à 65 o C, por 30 minutos, deixando resfriar em temperatura ambiente; em seguida, foram adicionados 600 L de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1), sendo os tubos agitados por inversão durante 5 minutos, até formar uma mistura homogênea; o material foi então centrifugado à x g por 5 minutos, à 25ºC; posteriormente o sobrenadante foi transferido para um novo tubo, ao qual foi adicionado volume de isopropanol correspondente a 2/3 do volume do sobrenadante, sendo o material submetido à nova centrifugação, a x g por 10 minutos, após o que foi retirado o isopropanol e realizadas duas lavagens do sedimento com etanol 70% (1mL, durante 5 minutos) e uma lavagem com etanol 95% (1mL, por 2 minutos); retirou-se o máximo de etanol e o

66 material foi deixado para secar ao ar. O sedimento foi ressuspendido em 100 L de TE (10 mm detris Cl ph 8,0 + 1mM de EDTA) contendo 10 l/ml de RNAse, os tubos incubados a 37ºC por 60 minutos, retirando-se, posteriormente, 4 L da solução, acrescentando 96 L de água milliq e levando-se então as amostras para quantificação dos DNAs, realizada em biofotômetro (Eppendorf), medindo-se a absorbância em contraste com uma amostra de água (branco), nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm. Em seguida, preparou-se uma solução de trabalho de 10 L, concentração de 50 ng/ L de DNA, para iniciar as análises com a técnica de marcador molecular faflp. A método para obtenção dos marcadores faflp visando à detecção de polimorfismo nos materiais utilizados, seguiu o protocolo AFLP PLANT MAPPING PROTOCOL (1997), da Applied Biosystems, conforme as etapas seguintes: a. Digestão do DNA: de acordo com a leitura no biofotômetro, calculou-se, para cada amostra, a quantidade necessária de DNA a ser utilizada. Foi preparada uma solução, contendo 1,25 L de tampão React 1 (Invitrogen), 5 U de EcoRI (0,5 L) e 1,5 U de MseI (0,3 L), colocando-se 2,05 L dessa solução em cada amostra de 10 L de DNA. As amostras foram para o termociclador, por 14 horas a 37ºC, e 10 minutos a 65ºC; b. Ligação dos adaptadores: retiraram-se 3,67 L da reação de digestão (DNA digerido) e foram acrescentados 1 L de tampão T4 DNA ligase, 0,5 L de T4 DNA ligase, 0,33 L do adaptador para o corte da MseI e 0,33 L do adaptador para o corte da EcoRI (ambos adaptadores previamente anelados a 95ºC por 5 minutos). As amostras foram incubadas em termociclador por 2 horas a 20ºC. Logo em seguida realizou-se a diluição (10x) do DNA, pipetando-se 45 L de água para cada DNA ligado; c) Amplificação pré-seletiva: retiraram-se 2 L da reação diluída, preparadas a partir das reações de digestão e ligação dos adaptadores, acrescentaram-se 0,5 L da mistura dos iniciadores pré-seletivos AFLP EcoRI (AGG/ACG) e MseI (CAC/CAA) e 7,5 L de AFLP Core Mix (Taq DNA polimerase; MgCl 2 ; tampão PCR; dntp PE Applied Biosystems Foster City CA), colocando-se as amostras no termociclador por 2

67 horas, após o que fez-se nova diluição (20x), adicionando-se 20 L de água em cada amostra, totalizando 30 L; d) Amplificação seletiva: retiraram-se 1,5 L da reação de amplificação préseletiva diluída e acrescentaram-se 8,9 L do mix contendo, para cada amostra, 7,5 L do AFLP Core Mix, 0,7 L do primer AGG/ACG -EcoRI marcado por fluorescência e 0,5 L do primer não marcado CAC/CAA MseI, selecionados após teste anterior com 12 pares de primers escolhidos dentre as 64 combinações possíveis. As amostras permaneceram no termociclador por 2 horas; e) Eletroforese no seqüenciador: preparou-se uma mistura contendo 1,5 L de formamida deionizada (HDF), acrescida de 0,9 L de blue dextran e 0,3 L do padrão interno de peso molecular GeneScan-500 ROX marcado por fluorescência com a coloração vermelha. Utilizou-se 1,5 L de DNA, adicionando-se 1,6 L dessa mistura, sendo as amostras levadas para o termociclador por 5 minutos a 95ºC. Foi aplicado 1,5 L de cada amostra em gel 5% (Longer-Ranger), com 36 cm de comprimento, onde a eletroforese foi desenvolvida durante 3 horas, a volts, usando TEB 1X (Tris 0,089M; ácido bórico 0,089M, EDTA 0,002M) como tampão de corrida no equipamento ABIPRISM TM 377 DNA Sequencer (PE Applied Biosystems ). O padrão interno de peso molecular Gene Scan-500 ROX, usado no faflp, possui 15 fragmentos com os seguintes tamanhos em pares de bases (pb): 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490 e 500. Após a amplificação, os dados foram obtidos através do programa GeneScan Analysis Software (Applied Biosystems ). Foi construída uma tabela binária, analisando ausência e presença de cada banda, codificada por 0 e 1, respectivamente, com o auxílio do Genotyper DNA Fragment Analysis Software (Applied Biosystems ), comparando então os materiais com suas respectivas plantas matrizes. Utilizando-se o programa Paup (Paup 4.0b10), construiu-se uma matriz de distância pelo índice de NEI & LI (1979). Foi obtido um dendrograma para observação da distância genética entre os acessos, pelo método de agrupamento do vizinho mais próximo, através do

68 programa Mega 2 (KUMAR et al., 2004), que também permitiu o cálculo das distâncias genéticas média entre os acessos e seus agrupamentos. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Um total de 137 bandas polimórficas variando entre 50 e 490 pares de base foi observado para os pares de iniciadores (primers) EcoRI/MseI (AGG/CAC 96 e ACG/CAA - 41), conforme análise de gel exemplificado na Figura 1. Esse resultado está muito acima do total de 65 bandas polimórficas obtidas por PARAN et al. (1998) com a espécie C. annuum. O mesmo número de bandas polimórficas (137 no total) foi relatado por FREITAS et al. (2005) com a espécie arbórea Myracrondruon urundeuva e ficou acima das 123 bandas polimórficas relatadas por GANGA et al. (2005) para Passiflora edulis f. flavicarpa. O número de marcas polimórficas encontrado demonstra a existência de variabilidade genética entre os acessos avaliados, corroborando com a tese de PICKERSGILL (1971), de que a região amazônica seria o centro de diversidade de C. chinense. Considerando o número de bandas polimórficas, a dissimilaridade entre os diferentes acessos variou de 0,020 (2%), equivalentes a duas bandas, entre os acessos 492 (peão grande vermelha) e 522 (espora de galo laranja) em relação ao acesso 622 (olho de peixe laranja), todos provenientes da cidade de Pacaraima, a 0,479 (47,9%) equivalentes a 45 bandas entre os acessos 125 (pimenta vermelha, da cidade de Alto Alegre) e 036 (murup, da cidade de Rorainópolis). Os resultados que apontam a pouca dissimilaridade entre os acessos 492 e 522 / 622 mostraram que nomes populares, isoladamente, não seriam bons indicadores para associação com diversidade genética. BUSO et al. (2001) relataram resultado semelhante quando se associou o nome popular à semelhança genética. Esses casos comprovam a utilidade de marcadores moleculares faflp, no sentido de esclarecer dúvidas em relação ao agrupamento de morfotipos de pimenta levando-se em conta apenas o nome popular que, na maioria das vezes, está relacionado ao formato, cor e pungência dos frutos.

69 pb 450 pb 400 pb 350 pb 340 pb 300 pb 250 pb 200 pb 160 pb 150 pb 139 pb 100 pb 75 pb 50 pb Figura 1. Figura 5. Padrão de bandas de fragmentos de DNA amplificados por faflp, utilizando-se o par de primer AGG- CAC marcados com fluorescência Joe, para acessos de C. chinense. O padrão de tamanho molecular interno ROX-500 está representado por bandas de 50 a 500 pb (bandas em vermelho). UNESP, Jaboticabal, SP, No caso dos acessos mais distantes (125 e 036), o marcador faflp acompanhou as diferenças de origem e morfológica, mostrando uma ampla divergência entre um acesso proveniente do Noroeste de Roraima (125), pimenta vermelha alongada de pungência alta, e outro do Sul do Estado (036), pimenta murupi salmão, também alongada, de pungência baixa. A partir de matriz de dissimilaridade, Tabela 2, foi feita análise de agrupamento dos acessos apresentada no dendrograma na Figura 2, permitindo a comparação entre os mesmos segundo suas distâncias genéticas. Foi observada a formação de dois grupos e três acessos isolados. A dissimilaridade entre os acessos variou de 2 a 47,9%, com média de 22,3%, demonstrando a existência de variabilidade genética e a existência de prováveis duplicatas na coleção avaliada. Esses resultados estão muito