ESTUDO CINÉTICO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR Saccharomyces cerevisiae IMOBILIZADO EM ALGINATO DE SÓDIO

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1 ESTUDO CINÉTICO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR Saccharomyces cerevisiae IMOBILIZADO EM ALGINATO DE SÓDIO 1 Larissa Nayhara S. Santana, 2 Patrícia T. Cordeiro, 3 Luís C. Oliveira-Lopes, 3 Eloízio J. Ribeiro 1 Bolsista de iniciação Científica PIBIC/ FAPEMIG/UFU, discente do curso de Engenharia Química 2 Mestre em Engenharia Química pela Universidade Federal de Uberlândia 3 Professor da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG 1,2,3 Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP ejribeiro@ufu.br RESUMO - Este trabalho introduz uma modificação em um biorreator com células de Saccharomyces cerevisae imobilizadas em partículas, avalia o seu desempenho e desenvolve estudos cinéticos da produção de álcool pela levedura imobilizada nesse biorreator. Os testes de fermentação utilizaram partículas com 3% de alginato de sódio submetidas a um tratamento com Al(NO 3 ) 3 o que levou a boa característica de estabilidade das mesmas. A configuração do biorreator investigada consiste de um reator de mistura operado em batelada, dotado de uma divisória que permite a passagem do meio líquido, mas impede a passagem das partículas. O processo é acoplado a um sistema de mistura projetado para funcionar como recirculador do meio líquido pelo sistema de partículas em suspensão, enquanto impede a flutuação dos pellets de células imobilizadas até máximo nível com perda de molhabilidade das partículas pelo meio líquido durante o processo fermentativo. Um estudo cinético visando descrever os perfis das concentrações de substrato e produto no reator e de células no interior dos pellets e no meio líquido é apresentado. Palavras-Chave: Saccharomyces cerevisae, fermentação alcoólica, imobilização de microrganismos, cinética da fermentação alcoólica. INTRODUÇÃO O álcool é um dos biocombustíveis que tem ganhado destaque na economia brasileira e apresenta posição estratégica no mercado tanto nacional quanto internacional. Trata-se de um produto renovável, limpo e extremamente importante pois contribui para a redução do efeito estufa. A matéria prima para a produção do etanol brasileiro é a cana-de-açúcar. Enquanto países como os EUA usam milho para a produção de álcool, o Brasil consegue obter o biocombustível através da fermentação da sacarose da cana-deaçúcar. Este processo é uma técnica dominada pelo Brasil, se comparada à desenvolvida pelos países desenvolvidos para a produção de etanol a partir de outras fontes renováveis, o álcool brasileiro custa até três vezes menos que o estrangeiro. Recentemente, a fermentação tem emergido como uma tecnologia fundamental e vital, como uma força integrante da biotecnologia moderna (UNICA, 2006) A literatura apresenta inúmeros modelos de biorreatores usados para a produção biotecnológica de etanol, entretanto, a configuração com células livres em batelada alimentada merece destaque especial quando se refere à utilização industrial desses sistemas de biorreatores. Não obstante, a utilização de esquemas com células imobilizadas na fermentação alcoólica possui vários aspectos desejados para a operação de fermentação: (i) o uso de altas concentrações celulares por unidade de volume do reator; (ii) facilita a reutilização dos biocatalisadores; (iii) minimiza tempos mortos e custos de separação; e (iv) confere maior estabilidade às células além de permitir uma operação contínua do reator. Diversos suportes são utilizados para imobilização: polímeros sintéticos, gel de poliacrilamida, polipropileno, resinas epóxi, polissacarídeos naturais (alginato de cálcio, kcarragena, pectina cítrica, agar), minerais (crisotila, alumina, terra diatomácea, rocha vulcânica, sílica porosa), vegetais (madeira, fibras de algodão, bagaço de cana) e metais (aço inoxidável). O aprisionamento de células em gel de alginato de sódio é a técnica mais amplamente utilizada para a imobilização de células viáveis, visto que a gelificação do alginato ocorre rapidamente na presença de íons de cálcio sem alterações drásticas na temperatura, ph e pressão osmótica, o que permite preservar a atividade e a viabilidade dos microrganismos imobilizados. Além disso, o alginato é um material VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

2 barato e facilmente encontrado (BATISTA et al. 1999). O objetivo desse trabalho consiste na investigação do processo de formação de partículas estáveis com células de levedura imobilizadas em alginato de cálcio, a investigação de um esquema modificado de reator sob recirculação de fluxo e o estudo cinético da fermentação alcoólica nesses biorreatores. MATERIAL E MÉTODOS Material A levedura utilizada nas fermentações foi uma cepa industrial, linhagem Y904, produzida por Mauri Brasil, utilizada por unidades industriais produtoras de etanol. O meio de cultura utilizado foi composto de glicose em concentrações variáveis de acordo com o experimento, extrato de levedura 6 g/l, KH 2 PO 4 5 g/l, MgSO 4.7H 2 O 1 g/l, NH 4 Cl 5 g/l, KCl 1 g/l e CaCl 2 0,5 g/l, e o ph inicial do meio foi corrigido para 4,5. Aspectos da imobilização das células Para a imobilização, uma massa de levedura hidratada, definida para cada experimento segundo um planejamento com concentração inicial de células na imobilização (X 0 ), nos níveis de 17g/L, 29,0g/L, 36 g/l, 43,0g/L e 68g/L e concentração inicial de substrato (S 0 ) nos níveis de 30,5g/L, 52,0g/L, 78,5g/L, 105 g/l e 148,5g/L. Após a hidratação, a suspensão de levedura era misturada a um gel de alginato de sódio a 3% m/v previamente preparado. Os estudos com alginato de sódio a 2% m/v levaram a partículas com característica de menor estabilidade (rompimento observável em condições de cisalhamento no experimento). Os pellets de gel foram obtidos pelo gotejamento da mistura alginato/células em uma solução de cloreto de cálcio previamente preparada na concentração de 30g/L sob agitação magnética, com um volume de 250 ml, em um béquer de 600 ml. Para o gotejamento da suspensão celular na solução de cloreto de cálcio utilizou-se uma bomba peristáltica modelo , da marca Cole-Parmer Instrument Company e uma ponteira de micropipeta 100 µl, conforme Figura 1. A altura da ponteira em relação à superfície da solução de cloreto de cálcio foi 11,5 cm, definida após várias tentativas, de modo a se obter partículas esféricas. O procedimento de imobilização seguiu metodologia descrita por Lim e Moss (1981). Os pellets após imobilização da levedura foram tratados com solução 0,3 molar de Al(NO 3 ) 3 por 5 minutos, conforme ROCCA et al (1995). As células imobilizadas foram armazenadas a 4 C em uma solução de cloreto de cálcio, para posterior utilização nas fermentações. Figura 1 - Foto do sistema utilizado para a imobilização de Saccharomyces cerevisae em alginato de sódio Aspectos da fermentação Vários esquemas de operação foram testados para se avaliar a estabilidade e eficiência do biorreator: (i) biorreator com partículas suspensas por agitação; (ii) reator tubular contínuo de leito fluidizado com retirada de CO 2 ; e (iii) Reator de mistura modificado com fluxo direcionado, conforme indicado na Figura 2. Devido a dificuldades operacionais decorrentes das configurações (i) e (ii), das quais se destacam: (a) flutuação de partículas para o nível máximo do biorreator, com diminuição de eficiência; (b) alta resistência à transferência de massa do CO 2 formado no pellets para o meio de fermentação, ocasionando o rompimento dos pellets de alginato; (c) rompimento do pellets em decorrência da agitação magnética. A opção (iii) foi então avaliada e mostrou ser uma alternativa de resposta a esses problemas. O reator utilizado foi um Minifermentador New Bruns adaptado com uma placa de acrílico perfurada, cujos orifícios apresentavam diâmetro de 2,5mm. Também foi adaptado um sistema para retirada de amostra de meio fermentado e um dispositivo para coletar amostras das partículas de células imobilizadas. As fermentações foram realizadas utilizando um volume inicial de meio de cultivo igual a 1,5 L, usando um volume de 90 ml de pellets, na temperatura de 32 C, controlada pela circulação de água proveniente de um banho termostático, e rotação de 1250 rpm. As fermentações foram conduzidas em condições de anaerobiose e foram acompanhadas determinando periodicamente a concentração de glicose pelo método do DNS, a concentração celular no meio e no interior dos pellets por espectrofotometria e a concentração de etanol por oxidação com dicromato de potássio e espectrofotometria. A concentração de células imobilizadas, ou seja, a concentração no interior do pellet foi quantificada em intervalos de 1 hora. Recolheu-se uma amostra de 4 pellets de alginato do fermentador e estes foram colocados em 10

3 ml de uma solução de citrato de potássio 4% (p/v), por um período de 2 horas, para que os mesmos fossem dissolvidos. Em seguida a solução foi centrifugada a rpm por 6 minutos. O sobrenadante foi descartado e o material sólido contido no frasco foi suspenso em água destilada e determinada a concentração celular por espectrofotometria a 650 nm. Condições de realização dos experimentos de imobilização Com o objetivo de se estudar a influência conjunta da concentração inicial de levedura no meio de imobilização (meio de gotejamento) e da concentração inicial de glicose nas fermentações, estas duas variáveis foram estudadas simultaneamente por meio de um planejamento composto central (PCC), conforme Tabela 1. Os níveis das variáveis foram fixados com base nos trabalhos de Najafpour (2004) e Batista (2005). eficiente do meio líquido pelo meio composto por partículas em suspensão na parte inferior do biorreator. Esta configuração de reator foi eficiente, tanto no que diz respeito à mistura do meio em fermentação, quanto na manutenção de estabilidade da levedura imobilizada. Para se avaliar a concentração de células nas partículas do sistema proposto foi desenvolvido um sistema para coleta dos pellets durante o processo de fermentação. Este sistema foi desenvolvido fixando uma mangueira de 1 cm de abertura na placa de acrílico, e utilizando uma seringa os pellets eram retirados do interior do reator. Esse dispositivo permitiu o acompanhamento do crescimento celular no interior dos pellets, além de verificar o aumento do diâmetro dos mesmos. O acompanhamento da concentração de etanol, glicose e células livres foi também efetuado durante os experimentos. Tabela 1 Níveis escolhidos para o planejamento composto central. VARIÁVEIS Concentraçã o inicial de células na imobilização (g/l) Concentraçã o inicial de substrato (g/l) CÓDIGO S NÍVEIS α +α X 0 29,0 43,0 36,0 17,0 60,8 S 0 52, ,5 30,5 148,5 Aos 10 ensaios previamente propostos pelo PCC, utilizando o sofwtare Statistic 5.0 foi adicionada mais uma réplica no ponto central. Como variáveis resposta foram escolhidas: Rendimento da Fermentação, Produtividade, Concentração de células nos pellets no meio. RESULTADOS E DISCUSSÃO Avaliação do biorreator modificado Após o estudo da eficiência de diversas configurações de reator no processo de fermentação com leveduras imobilizadas, a opção selecionada e proposto neste trabalho é a do biorreator modificado apresentado na Figura 2, denominado reator modificado com fluxo direcionado, que foi desenvolvido utilizando uma placa perfurada fixada no centro do reator, a fim de criar uma barreira física, fazendo com que os pellets, ao acumularem CO 2, continuassem em contato com o meio de fermentação, não se acumulando na parte superior do reator. Em cada uma das duas partes do reator, acima e abaixo da placa perfurada, foi projetada uma turbina de agitação mecânica que garantia uma recirculação Figura 2 - Reator utilizado em processo operando em batelada com direcionador de fluxo Estudo da eficiência de imobilização A eficiência de imobilização foi definida como sendo a razão entre a concentração de células livres no meio e a concentração de células imobilizadas durante o processo de fermentação. A eficiência de imobilização avaliada para fermentações com concentrações variáveis de glicose no meio fermentativo de 52 a 148 g/l é apresentada na Figura 3, para uma concentração inicial de levedura no meio de imobilização igual a 36g/L, esta concentração inicial foi definida pela análise da concentração máxima de células no meio encontrada para concentrações iniciais de células imobilizadas em torno de 40 g/l e concentrações iniciais de substrato em torno de 20 g/l. Foi então fixada a concentração inicial de

4 levedura no meio de imobilização como sendo o ponto central do Planejamento já que este é um valor próximo à 40 g/l. Após 10 horas de fermentação, o máximo valor obtido para a razão entre células livres e células imobilizadas foi de 0,35%. Isto mostra que o processo de imobilização foi bastante satisfatório no que diz respeito à retenção das células dentro dos pellets. O crescimento celular no meio externo aos pellets de levedura foi desprezível. operacionais no processo de imobilização foram concentração de células a serem imobilizadas, variável de acordo com o planejamento, concentração da solução de cloreto de cálcio igual a 30g/L, concentração da solução de nitrato de alumínio de 0,3 mol/l e concentração de alginato de sódio de 3% m/v. O diâmetro dos pellets obtidos utilizando uma concentração inicial de levedura de 36g/L foi medido utilizando um paquímetro. Na Tabela 2 são apresentados os resultados da média dos diâmetros e o desvio padrão. A Figura 5 apresenta a distribuição dos diâmetros das partículas em relação à média. Figura 3 - Análise da eficiência de imobilização dada pela razão existente entre células livres no meio e células imobilizadas A Figura 4 apresenta a imagem, em diversos ângulos, de pellets obtidos logo após o processo de imobilização conforme procedimento supracitado, utilizando alginato de sódio a 3%. Pode ser verificado que os mesmos são aproximadamente esféricos e com diâmetros bastante uniformes. Figura 4 Pellets com Saccharomyces cerevisae imobilizada em alginato de sódio a 3% Na obtenção de pellets esféricos, estudou-se o efeito de diversas variáveis na produção dos pellets, tais como altura de gotejamento, velocidade de gotejamento, marca de alginato, e tamanho da abertura utilizada durante o gotejamento da suspensão de imobilização, não foi avaliado a influência da agitação na obtenção dos pellets. Após vários testes, optou-se por uma configuração física que possibilita a formação de partículas com as características desejadas. As condições Figura 5 Distribuição de tamanhos dos pellets Foram feitos testes preliminares a fim de verificar a eficiência da imobilização utilizando uma concentração de alginato 2%, e foi observado o rompimento dos pellets em meio fermentativo, em shaker após 5 horas de fermentação. O meio de fermentação utilizado apresentava uma concentração inicial de glicose de 50 g/l, com uma concentração de células na suspensão de imobilização de 8,1 g/l. O alginato de sódio (C 6 H 7 O 6 Na) n utilizado nesse ensaio era da marca ISOFAR. Foi trocada a marca de alginato de sódio para a marca VETEC, fornecida na forma de grânulos, a fim de verificar a estabilidade, utilizando as mesmas concentrações anteriores. Neste ensaio não houve rompimento dos pellets até o consumo total do substrato pela fermentação. A partir desse momento foram feitos testes visando analisar a estabilidade das partículas de células imobilizadas em diversos meios de fermentação com concentrações maiores que 50 g/l, como 100 g/l e 130 g/l e observou-se uma grande formação de CO 2 durante o processo fermentativo, o que levava a um rompimento do pellet, provavelmente não mais devido à instabilidade do alginato de cálcio e sim à grande formação de CO 2 que exercia pressão sobre a parede do pellet. A partir dessas observações optou-se por utilizar uma concentração de alginato de 3 % visando maior dureza ao pellet. Rocca et al.,

5 (1995), verificou que um tratamento dos pellets com o íon Al 3+ por 5 minutos após a imobilização, garantia estabilidade e aumentava a resistência dos mesmos, sem interferir na transferência de massa. Os experimentos seguintes foram realizados utilizando a levedura imobilizada em partículas de gel de alginato de sódio a 3% m/v. Em alguns experimentos, os pellets foram tratadas com Al 3+ a 0,3 M, utilizando como fonte de íons Al 3+ uma solução de Al(NO 3 ) 3. Tabela 2 Análise das amostras de pellets Tamanho da Amostra Média (mm) Mínimo (mm) 80 4,20 3,40 ± 0,05 Maximo (mm) 4,80 ± 0,05 Desvio padrão 0,20 Estudo da influência simultânea das concentrações iniciais de levedura e de glicose no processo de imobilização Uma vez definidas as condições de imobilização e a configuração do reator a serem utilizadas, foi realizado um estudo da influência conjunta das concentrações iniciais de levedura na suspensão de imobilização e da concentração inicial de glicose no desempenho do processo de fermentação. Este estudo foi montado conforme um Planejamento Composto Central (PCC), em que as variáveis X 0 e S 0 foram estudadas, utilizando o software Statistic 5.0, e alguns dos perfis obtidos de concentração de substrato, de produto, de células livres e no interior dos pellets são apresentados nas Figuras 6 a 9. Tabela 3 Ensaios e respostas utilizados para o estudo do planejamento composto central Ensaio Níveis So Xo Respostas Rendimento Produtividade Glicose(g/L) Níveis Células (g/l) fermentação (g/l*h) Xpellets (g/l) Xmeio (g/l) ,491 2,27 70,598 0, ,286 2,13 65,234 0, ,399 3,27 96,962 0, ,282 2,54 75,706 0, α 30, ,388 1,65 69,689 0, α 148, ,387 3,76 96,128 0, ,5 -α 17 0,388 2,84 53,226 0, ,5 +α 60,8 0,441 3,64 115,368 0, , ,388 2,70 99,710 0, , ,334 2,45 100,300 0, , ,281 2,16 118,897 0,405 Figura 6 Perfis de concentração de pellets e de etanol no ensaio 1, S 0 = 52,0 g/l e X 0 = 29,0 g/l Figura 7 Perfis de concentração de pellets e de etanol no ensaio 3, S 0 = 52,0 g/l e X 0 = 43,0 g/l

6 Figura 8 Perfis de concentração de pellets e de etanol no ensaio 6, S 0 = 148,5 g/l e X 0 = 36,0 g/l Figura 9 Perfis de concentração de pellets e de etanol no ensaio 8, S 0 = 78,5 g/l e X 0 = 60,8 g/l Uma análise dos ensaios realizados revela que nas primeiras horas da fermentação, houve uma queda acentuada do açúcar, especialmente naquelas de mais baixa concentração de glicose, com pequeno crescimento e baixa formação de etanol. Em todos os experimentos, o crescimento celular no meio de fermentação foi muito baixo, especialmente nas primeiras horas da fermentação, o que sugere uma boa retenção das células no interior das partículas. ). Para se alcançar altos valores da concentração celular dentro dos pellets na imobilização, deve-se utilizar concentrações celulares iniciais superiores a 30 g/l, porém sempre favorecido pelas maiores concentrações iniciais de substrato. Portanto, fica evidenciado que a concentração inicial de substrato no meio de fermentação tem um efeito acentuado na concentração a ser alcançada dentro do pellet, viabilizando a operação numa grande faixa de operação. Isso provavelmente esteja relacionado com a velocidade de transferência de massa do substrato desde o meio líquido até o interior do pellet, que é favorecido pelo maior gradiente de concentração. Isso significa que na imobilização para um processo industrial pode-se começar com um inóculo de mais baixa concentração, pois ocorre grande crescimento dentro das partículas de células imobilizadas. O estudo realizado pelo Planejamento Composto Central (PCC) não foi decisivo no que diz respeito às melhores concentrações de células e de substrato no meio fermentativo com relação às respostas produtividade e rendimento da fermentação. Possivelmente uma ampliação do intervalo analisado possa ser necessária ou a análise de outras variáveis também deva ser incluída num novo estudo, porém o ponto de partida já foi realizado, uma vez que praticamente não são encontrados trabalhos deste formato na literatura consultada. Cinética da fermentação com levedura imobilizada A cinética de consumo de glicose, formação de etanol e crescimento celular no interior dos pellets foi analisada segundo 11 modelos cinéticos, conforme proposto por Birol (1998). Utilizando o software Scilab, estes modelos foram avaliados com o objetivo de verificar a adequabilidade dos mesmos para representar os ensaios realizados neste trabalho. Constatou-se que os modelos que melhor descreveram o sistema com células imobilizadas em alginato de sódio foram o modelo cinético de Monod e de Hinshelwood. O modelo descrevendo a variação da concentração do substrato é dado por 1 1 dp ds dt dx dt = em que as YX / S YP / S dt variações de concentração de células e produto são dadas na Tabela 4 para os modelos cinéticos selecionados dentre todas as avaliações efetuadas. Tabela 4 Modelos cinéticos selecionados As determinações paramétricas foram feitas utilizando o algoritmo de evolução diferencial (STORN e PRINCE, 1995) de forma a ajustar todos os experimentos realizados simultaneamente. O problema de sintonia de modelos foi representado por uma função objetivo quadrática representando o somatório do quadrado dos resíduos de todos os dados experimentais e os modelos cinéticos investigados. Os parâmetros da Tabela 5 são as soluções encontradas para um problema de minimização com precisão de 10-6, 15 membros da população e uma probabilidade

7 de cruzamento de 80% no algoritmo de evolução diferencial. Os parâmetros obtidos para a descrição dos ensaios são apresentados na Tabela 5. Tabela 5 - Valores dos parâmetros ajustados para Modelo proposto por Monod e Hinshelwood As Figuras (10)-(11) apresentam a comparação dos valores experimentais com aqueles previstos pelos modelos de Monod e Hinshelwood. Figura 10 Comparação de perfis experimentais e obtidos com o modelo de Monod para S 0 =148,5g/L Figura 11 Comparação de perfis experimentais e obtidos com o modelo de Hinshelwood para S 0 =148,5g/L CONCLUSÕES Os pellets de levedura imobilizada obtidos utilizando o alginato de sódio na concentração de 3% foram mais estáveis do que os obtidos com 2%. O tratamento dos pellets com Al(NO 3 ) 3 aumentou a estabilidade dos mesmos em relação à ruptura. A adição de CaCl 2 ao meio de cultura, contribuiu consideravelmente para melhoria da estabilidade dos pellets durante as fermentações. Foi desenvolvida uma nova configuração de reator, dotado de uma placa perfurada no interior do mesmo, visando minimizar os efeitos do acúmulo do CO 2, das forças de cisalhamento e outros efeitos externos e melhorar a eficiência de fermentação. Neste reator as fermentações foram conduzidas sem a observação de rompimento observável dos pellets. O estudo cinético mostrou um ajuste bastante robusto dos pontos experimentais, e os modelos que melhor se ajustaram (simultaneamente a todas condições investigadas) no processo conduzido foi o modelo de Monod e o modelo de Hinshelwood. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BATISTA, M.A., CARVALHO, W., SILVA, S.S. Imobilização de células de Cândida guilliermondii em gel de alginato de cálcio: Efeito do tempo de cura na viabilidade celular. In: Simpósio de Iniciação Científica, 3, BATISTA, M.A., Estudo da imobilização de células de Saccharomyces cerevisiae em gel de alginato de cálcio no processo de fermentação alcoólica. Dissertação (Mestrado) Programa de pós-graduação em Engenharia Química, Universidade Federal de Uberlândia, BIROL, G., DORUKER, P., KIDAR, B., ONSAN, Z.L., ULGEN, K. Mathematical description of ethanol fermentation by immobilized Saccharomyces cerevisiae. Process Biochemistry, v.33, n.7, p , NAJAFPOUR G., YOUNESI H., SYAHIDAH K. Ethanol fermentation in an immobilized cell reactor using Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology 92, , ROCCA, E., CAMESELLE. C., NUNEZ, M.J., LEMAS, J.M. Continuous ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae immobilized in Ca-Alginate beads hardened with Al3+, Biotechnology techniques, v.9, p ,1995. STORN, R., PRICE, K. Differential Evolution A Simple and Efficient Heuristicfor Global Optimization over Continuous Spaces, Journal of Global Optimization vol.11, pp , UNICA, União da Agroindústria Canavieira de São Paulo, acessado em 29/11/06 as 11h24m AGRADECIMENTOS À FAPEMIG e CNPq pelo apoio financeiro.