UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
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1 0 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO Desenvolvimento de métodos rápidos de preparo de amostras para especiação química de arsênio em alimentos por LC-ICP-MS e avaliação das concentrações e do metabolismo em arroz Bruno Lemos Batista Ribeirão Preto 2012
2 1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO Desenvolvimento de métodos rápidos de preparo de amostras para especiação química de arsênio em alimentos por LC-ICP-MS e avaliação das concentrações e do metabolismo em arroz Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Toxicologia para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Toxicologia Orientado: Bruno Lemos Batista Orientador: Prof. Dr. Fernando Barbosa Júnior *Versão corrigida da Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Toxicologia em 27/06/2012. A versão original encontra-se disponível na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto USP*. Ribeirão Preto 2012
3 BATISTA, B. L. Desenvolvimento de métodos rápidos de preparo de amostras para especiação química de arsênio em alimentos por LC-ICP-MS e avaliação das concentrações e do metabolismo em arroz 2 DOUTORADO FCFRP-USP 2012
4 3 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. Ficha Catalográfica Batista, Bruno Lemos Desenvolvimento de métodos rápidos de preparo de amostras para especiação química de arsênio em alimentos por LC-ICP-MS e avaliação das concentrações e do metabolismo em arroz. Ribeirão Preto, p.:il; 30cm. Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP - Área de Concentração: Toxicologia. Orientador: Prof. Dr. Fernando Barbosa Júnior 1.Especiação 2.Arsênio 3.Arroz 4.Tecidos 5.LC/ICP-MS/ESI-MS 6.Fitoquelatinas 1. Gbdivers, Orbitrap analyzer. Em:
5 4 FOLHA DE APROVAÇÃO Bruno Lemos Batista Desenvolvimento de métodos rápidos de preparo de amostras para especiação química de arsênio em alimentos por LC-ICP-MS e avaliação das concentrações e do metabolismo em arroz Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Toxicologia para obtenção do Título de Doutor em Ciências Área de Concentração: Toxicologia Orientador: Prof. Dr. Fernando Barbosa Júnior Aprovado em: Prof Dr. Instituição: Assinatura Prof Dr. Instituição: Assinatura Prof Dr. Instituição: Assinatura Prof Dr. Instituição: Assinatura Prof Dr. Instituição: Assinatura
6 5 As oportunidades são únicas. Já ancorado na Antártica, ouvi ruídos que pareciam de fritura. Pensei: Será que até aqui existem chineses fritando pastéis? Eram cristais de água doce congelada que faziam aquele som quando entravam em contato com a água salgada. O efeito visual era belíssimo. Pensei em fotografar, mas falei pra mim mesmo - Calma, você terá muito tempo para isso... Nos 637 dias que seguiram o fenômeno não se repetiu. As oportunidades são únicas. Amyr Klink Passados dois meses de tantas histórias, comecei a pensar no sentido da solidão. Um estado interior que não depende da distância... nem do isolamento; um vazio que invade as pessoas... E que a simples companhia ou presença humana não pode preencher. Solidão foi a única coisa que eu não senti, depois que parti... nunca... em momento algum. Estava, sim, atacado de uma voraz saudade. De tudo e de todos, de coisas e de pessoas que há muito tempo não via. Mas a saudade às vezes faz bem ao coração. Valoriza os sentimentos, acende as esperanças e apaga as distâncias. Quem tem um amigo, mesmo que um só, não importa onde se encontre, jamais sofrerá de solidão; poderá morrer de saudade... mas não estará só! Amyr Klink
7 6 Dedicatória A Deus, meu guia, em quem tenho muita fé e que está sempre a me proteger, Aos e aos meus incríveis pais, Pedro e Noemia, E às pessoas que acreditam na educação como único meio de revolucionar uma sociedade.
8 7 Agradecimentos À Deus, que é a vontade de cada um estar feliz e que sempre nos mostra isso em nossos caminhos. Aos meus pais Pedro Batista Filho e Noemia Maria Lemos Batista, amigos incondicionais, inspiradores. Fontes de sabedoria e espiritualidade. Exemplos experiência de vida que me guia. Aos meus irmãos Talles e Camila pela amizade, carinho e apoio. À minha sobrinha Cecília por proporcionar alegria a minha família e sorrisos de um tio em Aberdeen. Às minhas tias, Joana Lemos e Maria José Lemos, pelo apoio e à minha cunhada Daviana, por nos presentear com a preciosa Cecília. A todos os meus amigos, Bruno Alves, Jairo Lisboa, Samuel Ferreira, Gustavo Barcelos, Denise Grotto, Maria Carneiro, Letícia Nacano, Rodolfo Freitas, Letícia Costa, Vanessa Souza, Murilio Pazin, e Juliana Souza, por me apoiarem nessa caminhada. Aos especiais amigos Bruno Alves Rocha e Jairo Lisboa Rodrigues. À uma pessoa especial, Daniele Jacomini, que me acompanhou e apoiou em grande parte dessa jornada. Ao meu Orientador Dr. Fernando Barbosa Junior pela dedicação e confiança no trabalho de seus alunos. Ao Dr. Samuel Simião de Souza, pelos ensinamentos, amizade e apoio fundamentais para o meu crescimento e desenvolvimento deste trabalho.
9 8 A Vanessa pela dedicação ao Laboratório de Toxicologia e Essencialidade de Metais. Aos integrantes do grupo TESLA (Trace Element Speciation Laboratory: University of Aberdeen, School of Natural and Computing Sciences, Department of Chemistry) Dr. Jörg Feldmann, Dra. Andrea Raab, Dra. Eva Krupp, Dr. Adrien Mestrot, Dra. Sabine Freitag e Dr. Kenneth Amayo e do Plant and Soil Science (University of Aberdeen) Dr. Adam Price, Dra. Meher Nigar e Dr. Gareth Norton, pelo apoio nos estudos desenvolvidos no período de estágio deste doutoramento no Reino Unido (Escócia, Aberdeen), e por todos os ensinamentos, amizade e confiança. A todos (antigos e novos) integrantes do Laboratório de Toxicologia e Essencialidade de Metais. Aos funcionários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, em especial à Ana Lúcia, Rosemary e Rosana, pela atenção e dedicação ao Programa de Pós-graduação em Toxicologia. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro concedido a esse estudo.
10 i RESUMO Batista, B. L. Desenvolvimento de métodos rápidos de preparo de amostras para especiação química de arsênio em alimentos por LC-ICP-MS e avaliação das concentrações e do metabolismo em arroz f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, O arsênio é um dos mais tóxicos elementos químicos e reconhecidamente carcinogênico. Ele pode ser encontrado em alimentos basicamente em 5 formas: arsenobetaína (AsB), dimetil-arsênio (DMA), monometil-arsênio (MMA), arsenato (As 5+ ) e arsenito (As 3+ ), sendo estas duas últimas (As-i) as mais tóxicas. Assim, é de suma importância a utilização da especiação química de As para avaliação dos reais riscos associados à ingestão de alimentos contaminados. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivos o desenvolvimento de um método para separação das espécies de As por LC e detecção por ICP-MS; extrações quantitativas das espécies de As de tecidos animais e em grãos de arroz; aplicação dos métodos em amostras de alimentos consumidos no Brasil; e estudo do metabolismo do As em diferentes cultivares de arroz. O método desenvolvido para a extração das espécies de As em tecidos animais (ovo, músculos de ave, peixe e boi, etc.) utilizou apenas metanol (10%v/v) e ácido nítrico (2%v/v) como extratores e 2 minutos de sonicação, mostrando recuperação quantitativa do analito (>88%, n=3) pela análise dos materiais de referência (CE278, DOLT-3, DORM-3 e SRM NIST 1577). No entanto, para a análise de arroz, apenas ácido nítrico 2%v/v foi utilizado como extrator, possibilitando uma recuperação quantitativa (>94%, n=6), quando da análise do material de referência (NIST Rice Flour 1568a). Para a separação cromatográfica foram avaliadas diversas colunas, das quais a troca aniônica (Hamilton PRP-X100 ) foi utilizada em todos os experimentos. A aplicação dos métodos na análise de alimentos diversos consumidos no Brasil mostrou uma grande variação nas concentrações das diferentes espécies do arsênio em músculos, ovos e, especialmente, no arroz. Devido as altas concentrações de As encontradas em amostras de arroz comercializadas no Brasil (em vários casos com predominância das espécies mais tóxicas, As 3+ e As 5+ ) e ao grande consumo deste alimento no país e no mundo, foi também realizado um estudo de metabolismo do As em 6 diferentes cultivares. O foco deste estudo foi a síntese de fitoquelatinas (PCs), compostos não peptídicos produzidos por plantas expostas a elementos tóxicos, e sua influência no fator de transferência (TF) do As solo-grãos. O TF do As, assim como a concentração das PCs, variaram em relação aos cultivares (genótipos) estudados. Além disso, as PCs mostraram ter uma forte correlação positiva entre si e com a concentração de As-i nos grãos, bem como uma correlação negativa do TF do As raízes-grãos. Portanto, os métodos desenvolvidos demonstraram fácil aplicação em rotina para avaliação toxicológica dos alimentos em relação às espécies de As e, finalmente, o estudo de metabolismo do As pela planta do arroz pode contribuir para escolha de cultivares que o absorvam menos, reduzindo sua ingestão frente ao consumo de arroz. Palavras chave: especiação, arsênio, arroz, tecidos, LC/ICP-MS/ESI-MS, fitoquelatinas.
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